«МУ 4.2.2831-11. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика сапа. Методические указания» (утв. Роспотребнадзором 14.01.2011) <Письмо> Роспотребнадзора от 14.01.2011 N 01/245-1-32 «О перечне эндемичных территорий по клещевому вирусному энцефалиту в 2010 г.» Приказ Роспотребнадзора от 12.01.2011 N 2 «О сборе показателей и данных социально-гигиенического мониторинга за 2010 год»
Документ введен в действие с 14 января 2011 года. Текст документа
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
14 января 2011 года
Дата введения —
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА САПА
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУ 4.2.2831-11
- Методические указания разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора.
- Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
- Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 14 января 2011 г.
- Введены впервые.
- Область применения
1.1. Методические указания предназначены для специалистов как в системе органов, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, так и в системе лечебно-профилактических организаций независимо от их организационно-правовой формы и формы собственности. 1.2. В методических указаниях определены порядок забора, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на сап, материала из объектов окружающей среды, подозрительного на контаминацию возбудителем данного заболевания.
2. Нормативные ссылки
2.1. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)». М., 2003. 2.2. Санитарные правила СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности». М., 1996. 2.3. МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I — II групп патогенности». М., 2004. 2.4. МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». М., 2004. 2.5. МУ 3.5.5.1034-01 «Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I — IV групп патогенности, при исследованиях методом ПЦР». М., 2001. 2.6. Методические рекомендации «Лабораторная диагностика, лечение и профилактика сапа». Волгоград, 1995. 2.7. Практическое руководство «Специфическая индикация патогенных биологических агентов». М., 2006. 2.8. Практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней». М., «Медицина», «Шико», 2009.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Аг антиген А-ПХ авидин-пероксидаза хрена Ат антитело АСК аминосалициловая кислота Г + Ц гуаниновые и цитидиновые нуклеотиды ЕД единица действия ЖМАС жидкая минимальная среда с антибиотиками ИПК иммунопероксидазный конъюгат ИФА иммуноферментный анализ КББ карбонатно-бикарбонатный буфер МПГА (МПГБ) мясо-пептонный агар (бульон) с глицерином МПК минимальная подавляющая концентрация МФА метод флуоресцирующих антител НКС нормальная кроличья сыворотка НЛС нормальная лошадиная сыворотка НЦМ (НЦФ) нитроцеллюлозная мембрана (фильтр) ОП оптическая плотность ППН показатель повреждения нейтрофилов ПЦР полимеразная цепная реакция РА реакция агглютинации РИА радиоиммунный анализ РКоА реакция коагглютинации РНГА реакция непрямой гемагглютинации РСК реакция связывания комплемента РТГА реакция торможения непрямой гемагглютинации ТИФА (М) твердофазный иммуноферментный анализ (метод) ТМБ тетраметилбензидин ТСА (ТСБ) триптиказосоевый агар (бульон) ФБР + Т фосфатный буферный раствор + Твин-20 ЦФБР цитратно-фосфатный буферный раствор ЭД эритроцитарный диагностикум
3. Общие сведения
Сап — зоонозная инфекция, протекающая у человека в острой септической и хронической формах со специфическими поражениями кожи, слизистых оболочек, мышц, суставов и внутренних органов. Основным резервуаром инфекции в естественных условиях являются преимущественно однокопытные — лошади, ослы, мулы, а также верблюды и дикие хищники семейства кошачьих. В настоящее время сап у лошадей отмечается в Монголии, Турции, Иране, Ираке, Китае, Индии, Индонезии и на Филиппинах. В России существует опасность заноса инфекции из-за рубежа. Источником инфекции для людей служат животные, обычно лошади. Заражение происходит через выделения больного животного: носовой секрет и отделяемое кожных язв, реже — содержимое кишечника, моча, молоко. Восприимчивость людей к сапу оценивается неоднозначно. С одной стороны, в начале прошлого века количественное соотношение больных лошадей и имевших к ним отношение людей измерялось как 200 — 400 к 1, на основании чего делался вывод о высокой видовой устойчивости человека к этой инфекции. С другой стороны, соотношение хронических и острых форм заболевания у лошадей составляет 9:1, а среди людей — 1:1, что предполагает более высокую чувствительность людей к сапу. Основной путь заражения в естественных условиях — контактный (80% случаев): через кожу верхних и нижних конечностей, лица и шеи, значительно реже — через слизистые оболочки верхних дыхательных путей и конъюнктиву глаз. Фактически сап является профессиональной болезнью. В прошлом сапом заболевали конюхи, ветеринары, работники конских боен. Описаны случаи внутрилабораторных заражений ветеринарных и медицинских работников, известны случаи заболевания после повреждения кожи при вскрытии трупов больных сапом. Считается, что аэрозоли культур высоко инфекциозны для человека. Большинство описанных случаев заражения сапом в лабораторных условиях связано с проникновением возбудителя через дыхательные пути. При анализе профессиональных случаев заболеваний микробиологов, работающих с особо опасными инфекциями, B. mallei ставят в один ряд с возбудителями чумы и туляремии. В последнее время описаны 2 случая внутрилабораторного заражения (по одному в США и в России), в одном случае заболевание закончилось летальным исходом, в другом — потребовало длительного комплексного лечения химиопрепаратами. Передача от человека к человеку спорна, хотя в литературных источниках начала XX века описаны отдельные случаи таких заражений — при уходе за больными людьми и животными без специальных мер предосторожности. Возбудитель сапа Burkholderia mallei относится к патогенным представителям рода Burkholderia (выделен в автономную таксономическую единицу в 1992 г. из представителей 2-й группы pРНК-ДНК гомологии обширного таксономически аморфного рода Pseudomonas), вызывает тяжелое инфекционное заболевание у человека и довольно широкого круга животных. В экспериментальных условиях наиболее чувствительными к сапу животными являются кошки, золотистые хомячки и морские свинки. Кролики мало восприимчивы к сапу. Белые мыши и крысы — высокорезистентны. Возбудитель сапа — неподвижная (атрих) тонкая полиморфная палочка, прямая или несколько изогнутая, с закругленными концами, размером 0,4 x 3 — 5 мкм. Наряду с типичными клетками могут встречаться очень короткие коккобациллярные (в молодых культурах), булавовидные и ветвящиеся формы (в старых культурах). Спор и капсул возбудитель сапа не образует. B. mallei относительно устойчива во внешней среде: в подсохших выделениях больных микроб сохраняет жизнеспособность до трех месяцев, в воде и различных гниющих субстратах — до месяца. При нагревании взвеси чистой культуры возбудитель сапа погибает при 60 °C через 2 ч и более, при кипячении — в течение нескольких минут. Хлорная известь (2% раствор) вызывает гибель B. mallei через несколько мин., 1% едкий натр — через 1 ч. Возбудитель сапа обладает устойчивостью к пенициллинам, полимиксинам, ванкомицину, хиноксидину и диоксидину, что используется в качестве дифференциального теста.
4. Материал для исследования, отбор и транспортирование проб
Вся работа с исследуемым материалом, подозрительным на зараженность возбудителем мелиоидоза, проводится в соответствии с требованиями по безопасности работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (санитарными правилами СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» и СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности», а также методическими указаниями МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности»). Идентификация возбудителя сапа предусматривает выделение возбудителя (или антигенов) из объектов исследования и определения специфических антител в крови людей и животных. Схема и последовательность бактериологических и иммунологических этапов представлены ниже (рис. 1).
Исследуемый Кровь больного материал (серология) (бактериология)
ПЦР РА
МФА РСК
Бактериоскопия ТИФА Грамотрицательные
палочки
МПГА (ТСГА) МПГА Биопроба с ингибиторами (ТСГА) Золотистые хомячки (21 день)
Рис. 1. Этапы идентификации Burkholderia mallei
Примечание: Постановка, оценка реакций и расшифровка сокращений — по тексту.
Исследование на сап начинается одновременно бактериологическим, биологическим и серологическим методами. С момента поступления материала проводят бактериоскопию мазков в световом и люминесцентном микроскопах, бактериологическое исследование, направленное на выделение культуры сапного микроба, биологическое исследование, как дополнительное для выделения «чистой» культуры, и серологическое исследование нативного материала для выявления видоспецифического антигена или специфических антител. Материалом для исследования от людей и животных с подозрением на сап могут быть выделения из носа, отделяемое язв, пунктаты лимфоузлов, мокрота, испражнения. Материал по возможности должен быть исследован до начала лечения химиотерапевтическими препаратами. При вскрытии трупов животных берут для анализа кусочки органов (селезенка, печень, легкое), лимфатических узлов, кровь, костный мозг. При длительном транспортировании в стационарные бактериологические лаборатории рекомендуется пользоваться средами с ингибиторами (п. 5.1). Заключение бактериолога дается на основании бактериоскопического, бактериологического и серологического исследований.
5. Методы исследования материала
5.1. Бактериологический метод
Для выделения возбудителя сапа используют мясопептонный агар и бульон pH 6,8 — 7,0 с 4% глицерина (МПГА, МПГБ). Можно использовать агар на основе гидролизата казеина, а также питательный агар и триптиказосоевый агар (Difco, США). При использовании «загрязненного» материала (что подтверждается микроскопией) используют среду с ингибиторами:
пептон 6,0 г дрожжевой экстракт 3,0 г NaCl 5,0 г ванкомицин 0,01 г глицерин 40,0 г полимиксин B 0,01 г кристаллвиолет 0,002 г агар 12,0 г мясная вода pH 6,8 до 1 л
Исследуемый материал высевают на три чашки агаровой среды и 3 пробирки бульона с последующим высевом на плотную среду, инкубируют в течение 48 — 72 ч при температуре 37 °C. Учет производят ежедневно. Возбудитель сапа вырастает в виде слабовыпуклых колоний с ровным краем, серого цвета (RS-вариант). В отличие от B. pseudomallei для B. mallei морфологическая диссоциация не характерна, хотя отдельные колонии бывают сморщенные (R-) или слизистые (M-).
5.2. Биологический метод
Биологический метод эффективен для диагностики острого сапа, выделить же возбудитель этим методом при хроническом течении сапа чаще всего не удается. В данном случае более эффективными могут быть иммунологические исследования и выделение L-форм возбудителя сапа. Для постановки биопробы при диагностике сапа используют золотистых хомячков или морских свинок. Кусочки органов животных или людей измельчают в физиологическом растворе. Экстракт в объеме 0,5 мл вводят подкожно в область бедра биопробным животным. При исследовании «чистого» материала (подозрительные колонии на МПГА) животных можно заражать внутрибрюшинно. Срок наблюдения за биопробными животными — до 21 сут., в типичных случаях падеж и выделение «чистой» культуры происходят в первые 10 сут. после инфицирования. Для интраперитонеального заражения желательно брать самцов, у которых развивается феномен Штрауса. Этот феномен может быть ориентиром для вскрытия животных. Однако следует иметь в виду, что наблюдаемый гнойный периорхит не специфичен и может быть вызван другими микроорганизмами. Павших или забитых больных животных вскрывают и исследуют бактериологически для выделения «чистой» культуры. С этой целью из их органов делают высевы на обычные питательные среды и параллельно на среду с ингибиторами.
5.3. Иммунологические методы исследования
Специфическая индикация сапа
Метод флуоресцирующих антител (МФА). МФА — широко используемый метод экспресс-обнаружения возбудителя сапа в различных объектах исследования. Он позволяет получать предварительный ответ в течение 1 — 2 ч от момента начала исследования, а также идентифицировать возбудитель сапа на этапах ускоренного и классического лабораторного анализа биологически обогащенного материала.
Для выявления возбудителя сапа с помощью МФА используют иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сапные моноклональные сухие. Препарат в рабочем разведении взаимодействует только с бактериями сапа и не окрашивает клетки близкородственного возбудителя мелиоидоза. При работе с чистыми
4 культурами типичных штаммов возбудителя сапа он позволяет выявлять 5 x 10
4 5 м.к./мл, в бактериальных смесях — 5 x 10 — 1 x 10 м.к./мл, в объектах
4 5 внешней среды — 5 x 10 — 5 x 10 м.к./мл в зависимости от характера исследуемого объекта, его обсемененности посторонней микрофлорой. На этапе экспресс-анализа используют МФА с контрастированием неспецифического свечения микрообъектов. При идентификации чистых культур микроорганизмов контрастирование не требуется. Мазки из проб внешней среды и из материала от больных и умерших людей и животных (до и после концентрирования) готовят на тонких обезжиренных предметных стеклах, высушивают на воздухе и фиксируют в 96%-ном этиловом спирте в течение 30 мин. Окрашивание мазков-препаратов проводят смесью равных объемов флуоресцирующих сапных моноклональных антител и альбумина, меченного родамином, содержащей каждый из ингредиентов в рабочих разведениях, указанных на ампулах. Результаты взаимодействия поверхностно локализованных антигенов возбудителя сапа с антителами, меченными флуоресцеинизотиоцианатом, регистрируют с помощью люминесцентного микроскопа, оценивая яркость свечения и его цвет по общепринятой шкале регистрации результатов МФА, а также форму, размеры и локализацию флуоресцирующего объекта исследования. В мазках-препаратах из объектов внешней среды и смывах с поверхности питательных сред, на которых производили накопление микроорганизмов, бактерии сапа, окрашенные специфическими иммуноглобулинами, расположены хаотично, в виде изолированных прямых или изогнутых ярко светящихся палочек, изредка соединенных в цепочки, состоящие из 4 — 8 фрагментов. Вследствие характерного для возбудителя сапа полиморфизма возможно обнаружение длинных, средних, коротких палочек, кокко- или нитеподобных форм бактерий. В мазках-отпечатках из органов и тканей животных короткие толстые палочки расположены беспорядочно, иногда группами, внеклеточно, редко внутри лейкоцитов, клеток паренхиматозных органов или соединительной ткани. На этапе экспресс-анализа нативного материала обнаружение единичных (не менее 10) клеток в 25 — 30 полях зрения, обладающих специфическим свечением, является основанием для выдачи ориентировочного положительного ответа. Отрицательный результат МФА свидетельствует либо об отсутствии возбудителя сапа в исследуемом объекте, либо о том, что концентрация бактерий в данной пробе ниже улавливаемой с помощью МФА. Твердофазный иммуноферментный метод (ТИФМ). ТИФМ — один из наиболее чувствительных методов обнаружения возбудителя сапа в различных объектах исследования. В отличие от МФА он позволяет выявлять как бактерии, так и растворимые антигены возбудителя сапа. По чувствительности ТИФМ в 10 — 20 раз превосходит МФА, в 30 раз — РНГА. При использовании ТИФМ для поиска возбудителя сапа обязательным является этап предварительного обеззараживания проб 1%-ным формалином.
Перспективным является дот-вариант ИФА, варианты которого применяют как
4 6 для обнаружения возбудителя сапа (1 x 10 — 1 x 10 м.к./мл), так и выявления специфических антител в исследуемых сыворотках. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). При поиске сапных бактерий и их антигенов объектами исследования являются все перечисленные выше образцы проб. Особенности подготовительного этапа заключаются в том, что все пробы переводят в жидкую фазу в соответствии с общепринятыми методиками. Исследуемые образцы обеззараживают нейтральным формалином, добавляя его в пробы до 4% концентрации (0,2 мл на 2 мл пробы). Затем пробы прогревают при 56 °C в течение 30 мин. В пробирки с инактивированным материалом вносят 50%-ную взвесь формалинизированных эритроцитов из расчета 0,05 мл на 1 мл пробы для истощения материала и устранения возможных неспецифических взаимодействий ингредиентов РНГА. Смесь тщательно встряхивают, выдерживают при 37 °C в течение 15 мин. и центрифугируют при 2000 — 3000 об./мин. в течение 10 мин. Надосадочную жидкость используют для постановки РНГА с диагностикумом эритроцитарным сапным и мелиоидозным иммуноглобулиновым сухим на основе поликлональных антител или диагностикумом эритроцитарным сапным и мелиоидозным моноклональным сухим на основе моноклональных иммуноглобулинов. РНГА с иммуноглобулиновым ЭД применяют на этапах экспресс- и ускоренного анализа проб и идентификации чистых культур. Учет результатов РНГА производят через 1,5 — 2,0 ч и 24 ч. Предварительный ответ о наличии искомого антигена может быть дан через 1,5 — 2,0 ч от момента постановки реакции.
Серодиагностика сапа
Обнаружение специфических антител имеет существенное значение для постановки правильного диагноза и начала своевременного лечения. Поиск антител в сыворотках больных сапом людей и животных желательно осуществлять в парных сыворотках, полученных с интервалом 2 — 3 недели. Нарастание титров специфических антител подтверждает правильность предварительного диагноза. Основными методами выявления сывороточных антител являются РНГА и ТИФМ. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Постановку РНГА осуществляют с использованием диагностикума эритроцитарного для выявления антител к возбудителям мелиоидоза и сапа антигенного жидкого. С помощью РНГА с сапным антигенным ЭД возможно обнаружение специфических антител в сыворотках крови больных животных. Антигенный эритроцитарный диагностикум взаимодействует также с антителами сывороток больных мелиоидозом людей. С целью подтверждения специфичности РНГА одновременно с ней ставят реакцию торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА). Специфичным считают результат РНГА, если различия в титрах РНГА и РТНГА достигают 16 — 32 и более раз. Для выявления антител можно применять трехкомпонентную реакцию нейтрализации антигена (РНАг) с иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом. Выбор гемагглютинационного теста зависит от цели конкретного этапа работы и от наличия соответствующего эритроцитарного диагностикума (ЭД). Твердофазный иммуноферментный метод (ТИФМ). Необходимый набор реагентов для выполнения анализа: — полистироловый планшет разборный для иммуноферментного анализа однократного применения; — сапной антиген для сенсибилизациии планшетов; — 0,05 М карбонатно-бикарбонатный буфер, pH 9,5 (КББ); — 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 0,05 М КББ, pH 9,5, для блокирования свободных сайтов неспецифического связывания на пластике; — 0,1 М фосфатно-солевой буферный раствор, pH 7,2 (ФБР), на основе которого готовят раствор для отмывания пластин, раствор для приготовления разведений исследуемых сывороток и раствор рабочего разведения конъюгата, добавляя детергент Твин-20 до 0,05% по объему; — детергент Твин-20;
— антивидовой иммунопероксидазный конъюгат (ИПК) или препарат на основе протеина А; — цитратно-фосфатный буферный раствор, pH 5,0 (ЦФБР); — хромоген тетраметилбензидин (ТМБ), 10 мг, растворяют в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО); — 3%-ный раствор перекиси водорода, приготовленный ex tempore;
- субстратно-индикаторная смесь (ЦФБР + ТМБ + H O ): ТМБ, растворенный
2 2 в ДМСО, используют для приготовления раствора 1:100 в ЦФБР, затем добавляют 3%-ный раствор перекиси водорода в соотношении 1:100, приготовленная ex tempore;
- 0,2 М раствор серной кислоты (стоп-реагент);
+
- заведомо положительная контрольная сыворотка (К );
_
- отрицательная контрольная сыворотка (К ). Непрямой вариант метода Для выполнения исследования сыворотки используют непрямой вариант ТИФМ. Объем реагентов на всех этапах постановки реакции составляет 100 мкл. В лунки планшета вносят приготовленный раствор антигена с концентрацией 10 мкг/мл (по белку) в 0,05 М КББ, pH 9,5. Сенсибилизацию планшета антигеном проводят в холодильнике при 4 °C в течение 18 — 24 ч. Затем раствор антигена удаляют, планшет подсушивают в течение 1 — 2 мин. и трехкратно промывают ФБР + Т. Свободные сайты неспецифического связывания на пластике блокируют с помощью 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 0,05 М КББ, pH 9,5, в течение 30 мин. при 37 °C и вновь отмывают планшет. В лунки твердой фазы вносят подготовленные разведения исследуемой сыворотки (1:400, 1:800 и т.д.) в ФБР + Т. Инкубацию проводят при 37 °C в течение 1 ч. После трехкратного отмывания несвязавшихся компонентов реакции в лунки пластины вносят антивидовой конъюгат в рабочем разведении, планшет помещают в термостат при 37 °C на 45 — 60 мин. После этого планшет промывают 4 — 5 раз и в лунки вносят субстратно-индикаторную смесь. Пластины выдерживают при комнатной температуре в темном месте в течение (25 +/- 5) мин. Появление голубого окрашивания содержимого лунок различной интенсивности свидетельствует о прохождении реакции фермент-субстрат. Реакцию останавливают с помощью стоп-реагента, внося во все лунки планшета по 100 мкл 0,2 М раствора серной кислоты. Окраска хромогена меняется с голубой на желтую. Интенсивность окрашивания в лунках пластины пропорциональна содержанию специфических антител в лунке. Результаты учитывают на микропланшетном фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 450 нм.
Титром антител считают то наибольшее разведение пробы, значение ОП
450 которого равно или превышает значения 2 x ОП контроля конъюгата (КК). При этом ОП в лунках контроля субстратной смеси (КС) не должна превышать
450 0,2.
Необходимые контроли:
- реакция с заведомо положительной сывороткой с известным титром
+ антител (К );
_
- контроль неспецифической сорбции конъюгата (КК ): в сенсибилизированные антигеном лунки (две лунки) вносят только ИПК в рабочем разведении и проявляют субстратом;
_
- контроль субстрата (КС ): в сенсибилизированные антигеном лунки (две лунки) вносят только рабочий раствор субстратной смеси, содержимое лунки должно оставаться без изменений. Дот-вариант иммуноферментного анализа. В качестве твердой фазы реакции используют нитроцеллюлозные мембраны (НЦМ) с диаметром пор 0,22 или 0,45 мкм.
На мембрану наносят взвесь формалинизированных клеток возбудителя сапа
9 в концентрации 1 x 10 м.к./мл в 0,1 М трис-HCl буфере (pH 8,0), затем чашку Петри с НЦМ перемещают в холодильник при 4 °C на 18 — 24 ч. Перед использованием НЦМ подсушивают и обрабатывают 3 — 5%-ным раствором БСА в течение 40 — 45 мин. при 37 °C. Отмывают на шуттеле двукратно по 3 мин. ФБ-Т или 0,85%-ным раствором NaCl. Исследуемую сыворотку наносят в центр расчерченных квадратов. Необходимые разведения готовят на 0,1 М трис-HCl буфере (pH 8,0) с Твином-20. Инкубируют 45 — 60 мин. при 37 °C. Отмывают по 2 мин. двукратно. После этого НЦМ погружают в рабочий раствор антивидового ИПК на 1 ч при 37 °C. Заключительное отмывание проводят 4 раза по 2 мин. Для проявления реакции в качестве субстратной смеси используют раствор О-дианизидина: 10 мл 0,1 М трис-HCl буфера, pH 8,0, 1 мл 0,1%-ного О-дианизидина на метиловом спирте плюс 0,1 мл 0,3%-ной перекиси водорода. Результаты учитывают визуально через 15 — 20 мин. При положительном результате на полоске НЦМ проявляются коричневые пятна. Метод флуоресцирующих антител (МФА). Для обнаружения специфических антител в сыворотках крови больных сапом возможно использование непрямого МФА в одном из двух вариантов: 1) Уиллера и Кунса; 2) Гольдвассера и Шепарда с добавлением комплемента. Основным ограничением для его воспроизведения в практических лабораториях является отсутствие стандартных мазков-препаратов референтного штамма возбудителя сапа. Реакция агглютинации (РА). РА используют при серологическом обследовании больных или подозреваемых в заболевании сапом лошадей, а также лиц, по роду своей деятельности контактирующих с ними. Методика постановки РА традиционна. При этом учитывают, что РА не позволяет дифференцировать сап и мелиоидоз. По значимости РА является методом выбора в диагностике острых форм заболевания. Ограничением для ее широкого применения является отсутствие стандартных коммерческих образцов антигенов возбудителя сапа, необходимых для получения сопоставимых результатов в различных лабораториях. Реакция связывания комплемента. Основным методом серодиагностики, особенно в ветеринарной практике, считают РСК. В РСК используют стандартный антиген (ГОСТ 17405-72). Схема постановки реакции традиционная. Диагностическим титром считают 1:20 и более. Дифференциация сапа и мелиоидоза по результатам РСК невозможна. Оценивая состояние дел в вопросе серодиагностики сапа и перспективы ее совершенствования следует отметить, что она затруднена из-за значительного количества ложноположительных и ложноотрицательных результатов в международно рекомендованных тестах. Основную проблему этого явления можно связать с низкой чувствительностью и специфичностью РСК и ТИФМ, апробированных с обычно используемыми антигенами, т.е. с препаратами грубой очистки из целых микробных клеток. Дальнейшая перспектива разработки и совершенствования серологических тестовых наборов связана с хорошо охарактеризованными индивидуальными антигенами, обсуждаемыми в свете последних достижений молекулярной биологии в части B. mallei и близкородственного возбудителя мелиоидоза.
5.4. Молекулярно-генетические методы исследования
В качестве альтернативных способов выявления и идентификации возбудителя сапа в последнее время все более активно используют молекулярно-генетические методы, в первую очередь реакцию амплификации (ПЦР, полимеразную цепную реакцию). ПЦР используют для экспресс-диагностики при исследовании биологического материала, взятого от человека с целью выявления у него ДНК B. mallei и ее количественной оценки; для специфической индикации возбудителя сапа в объектах окружающей среды и пищевых продуктах; в качестве ускоренного предварительного теста при выполнении культурального и биологического методов исследования и для идентификации культур; для генотипирования штаммов с целью определения их происхождения, а также определения эпидемиологической значимости изолятов на основании выявления генетических маркеров патогенности, антибиотикоустойчивости, прогнозирования течения инфекционного заболевания и оценки эффективности проводимой терапии. Обеззараживание проб для исследования методом ПЦР. Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) возбудителем сапа, проводится следующим способом: к исследуемому образцу добавляют мертиолат натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01%) и прогревают его при 56 °C в течение 30 мин. Затем 100 мкл образца переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинизотиоцианата и инкубируют 15 мин. при 65 °C. Обработанные таким образом пробы считаются обеззараженными, и всю последующую работу проводят, как с незаразным материалом. Выделение ДНК. ДНК из проб материала выделяют с помощью коммерческих наборов для выделения ДНК в строгом соответствии с прилагаемой инструкцией. Работу проводят согласно требованиям противоэпидемического режима, используя одноразовую пластиковую посуду в боксах II — III классов биологической безопасности. ПЦР осуществляют с помощью амплификационных тест-систем, зарегистрированных в установленном порядке в соответствии с прилагаемыми инструкциями, полученные амплификаты (при использовании классического варианта ПЦР) анализируют электрофоретически или на детекторе флуоресценции (при использовании гибридизационно-флуоресцентного варианта ПЦР), в т.ч. ПЦР в формате реального времени. Выделение ДНК из проб почвы и воды проводится путем гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой ДНК методом нуклеосорбции (в соответствии с прилагаемыми инструкциями к коммерческим наборам). Для выделения ДНК возбудителя сапа из крови используют метод выделения такой же, как и для экстракции и очистки ДНК из почвы. За исключением того, что перед этапом подсушивания осадок ДНК дополнительно промывают ацетоном. При исследовании секционного материала часть биоптата (печень, селезенка, легкое, сердце) массой около 30 мг гомогенизируют в лизирующем растворе на основе 6 М гуанидинизотиоцианата и инкубируют 15 мин. при 65 °C, затем добавляют 300 мкл фенола, забуференного Tris-HCl, pH 8,0. После перемешивания на вортексе инкубируют в течение 30 мин. при температуре 65 °C. Обработанные таким образом пробы считаются обеззараженными, и всю последующую работу проводят, как с незаразным материалом. Проведение ПЦР для специфической индикации и идентификации возбудителя сапа. Выявление ДНК возбудителя сапа методом полимеразной цепной реакции проводят классическим способом с электрофоретическим учетом результатов реакции амплификации в агарозном геле, а также флуоресцентной детекцией в режиме реального времени или по «конечной точке». При использовании ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) учет и анализ результатов проводится в процессе амплификации, согласно инструкции к приборам. Работу проводят в соответствии с инструкциями к диагностическим тест-системам, зарегистрированными в установленном порядке. Генотипирование штаммов возбудителя сапа проводят с помощью пульс-электрофореза, амплификации с произвольными праймерами и метода, основанного на мультилокусном анализе вариабельности тандемных повторов (MLVA).
5.5. Идентификация культур
Выделенные бактериологическим и биологическим методами микроорганизмы исследуют на принадлежность к возбудителю сапа, используя стандартные бактериологические тесты (табл. 1).
Таблица 1
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ B. MALLEI И ДРУГИХ ВИДОВ БУРКХОЛЬДЕРИЙ И ПСЕВДОМОНАД
ТЕСТЫ B. mallei B. pseudo- B. cepacia P. aerugi- P. putida P. fluo- P. stut- S. malto- Acineto- mallei nosa rescens zeri philia bacter spp. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Окисление: Глюкозы + + + + + + + + + Фруктозы + + + + + + + + - Ксилозы - + + + + + + +/- + Лактозы + + + - +/- +/- - + + Мальтозы + + + - +/- +/- + + + Аргининдигидролаза + + - + + + - - - Лизиндекарбоксилаза - - + - - - - + - Желатиназа + + +/- +/- - + - + + Денитрификация + + - +/- - - + - - ДНК-аза - - - +/- - - - + - Гидролиз эскулина - +/- + - - - - + - Число жгутиков 0 > 1 > 1 1 > 1 > 1 1 > 1 - Рост при 4 °C - - - - +/- + - - - Рост при 42 °C - + +/- + - - + +/- +/- Устойчивость + + + - - - - - -
к полимиксину
Устойчивость — + + — — — — — — к гентамицину
Рост при 2,5% NaCl — — + + + + + + +
Диффундирующий — — +/- + + + — — — пигмент
Г + Ц моль% 69 69 67 67 62 60 64 66 48
R-колонии на МПГА — +/- — — — — — + —
Вирулентность для + + — +/- — — — — — з/х
Ауксотрофность — — — — — — — — +
Примечание: (+) и (-) — наличие или отсутствие признака у >= 90% штаммов данного вида.
Возбудитель сапа неподвижен, не растет при температуре 42 °C и на среде с гентамицином, окисляет, но не ферментирует глюкозу, обладает цитохромоксидазной и каталазной активностями, обладает аргининдигидролазой, тесты на лизин- и орнитиндекарбоксилазы отрицательны. Резистентность к полимиксину B является таксономическим признаком, использующимся при дифференциации его от бактерий родов Pseudomonas и Acinetobacter. Коммерческие идентификационные системы типа API 20E или 20NE не позволяют достоверно определять видовую принадлежность сапных культур, вероятно вследствие замедленного роста на используемых в системах средах и вариабельности проявления на них биохимических свойств возбудителя. При проверке на этих наборах типичных штаммов B. mallei под выявляемыми кодами значатся различные виды бактерий родов Acinetobacter или Pseudomonas. Выделение и идентификация L-форм B. mallei. Наличие скрытых форм сапа подтверждается при обследовании лошадей с помощью аллергической пробы с маллеином, при этом выявляются группы животных с положительной пробой, но без клинических проявлений. Выделить возбудитель без введения провоцирующих агентов обычно не удается. Развитие острых форм инфекции у таких животных во многом зависит от условия их содержания, эксплуатации и питания. Можно вызвать провокацию инфекции путем введения внутривенно маллеина или других препаратов, снижающих резистентность макроорганизма. Таким образом, сап характеризуется способностью протекать в скрытых латентных формах с сохранением потенциальной возможности развития активного процесса. Исследование способности возбудителя сапа к L-трансформации показало, что формирование латентных форм инфекции сопровождается морфологической трансформацией клеток возбудителя. Персистенция в виде L-форм, не вызывая видимых патологических проявлений, обеспечивает при развитии иммунодефицитного состояния полное восстановление биологических свойств возбудителя и, следовательно, манифестацию инфекции. Возможность формирования латентной инфекции во многом определяется состоянием макроорганизма, в частности его иммунной системы и дозы инфекта. Формированию латентных форм инфекции у экспериментальных животных также способствует химиотерапия лекарственными препаратами (рифампицин, сульфаметоксазол и др.). Введение экспериментальным животным с латентной формой сапной инфекции иммунодепрессанта (циклофосфана) приводит к манифестации инфекции в острой форме с последующим выделением бактериальной формы возбудителя. Для выделения L-форм необходимо производить посев исследуемого материала на специальные высокопитательные стабилизированные полужидкие среды. Состав одной из таких сред (ССС):
сердечно-мозговой экстракт 37,0 г дрожжевой экстракт 10,0 г нормальная лошадиная сыворотка (НЛС) 100,0 мл сахароза 100,0 г агар-агар 3,0 г дистиллированная вода 1 л
Стерилизуется при 1,5 атм. 15 мин. В охлажденную до 50 °C среду добавляют НЛС, предварительно простерилизованную фильтрацией, и разливают по 5 мл в пробирки. Для выделения L-форм пригодна также среда типа PPLO, применяющаяся для культивирования микоплазм. Посевы инкубируют при 37 °C до 20 сут. в условиях, исключающих высыхание сред. Если в посевном материале будет присутствовать бактериальная форма возбудителя, то на вторые сутки обнаруживается обильный рост в толще и на поверхности полужидкой среды. Нестабильные L-формы (легко восстанавливающие клеточную стенку) могут обеспечить обильный рост также в ближайшие 3 — 4 сут. Стабильные L-формы на 6 — 10 сут. образуют рост в виде слабого помутнения полужидкой среды в месте внесения исследуемого материала. Идентификация бактериальной формы возбудителя и нестабильных L-форм не представляет трудностей после пересева на обычные питательные среды. Стабильные L-формы при пассажах на полужидкой среде ССС сохраняют жизнеспособность в течение 3 — 4 пассажей, поэтому необходимо проводить их идентификацию из первичного посева. С этой целью можно использовать классический метод иммунофлуоресценции, подготовив мазки непосредственно из питательной среды с явлениями роста L-форм. Морфологическую характеристику L-форм проводят на основании фазовоконтрастной микроскопии.
Достаточно надежная идентификация обеспечивается также методом генетической трансформации. В качестве реципиента при этом используется ауксотрофный штамм возбудителя мелиоидоза — близкородственный вид, обладающий равноценной взаимной трансформабельностью с возбудителем сапа. С этой целью 0,1 мл суспензии штамма B. pseudomallei VPA (авирулентный пуринзависимый мутант с уровнем вероятной реверсии к прототрофности < 1 x -10 9
10 ) в концентрации 10 м.к./мл высевают газоном на минимальную среду. На засеянную и предварительно высушенную поверхность агаровой пластинки наносят бляшками идентифицируемые культуры L-форм в объеме 0,05 — 0,1 мл. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 2 — 3 сут. Результат считается положительным, если в месте нанесения проб выявляется рост прототрофных колоний возбудителя мелиоидоза.
6. Дезинфекция при работе с возбудителем сапа
Для обеззараживания объектов (различные поверхности, жесткая мебель, санитарно-техническое оборудование, белье, посуда, изделия медицинского назначения), контаминированных возбудителем сапа, рекомендованы преимущественно композиции на основе четвертично-аммониевых соединений, дополнительно содержащие полигексаметилен-гуанидин, метасиликат натрия, спирт, глиоксаль и другие компоненты (Биодез-Экстра, Велтогран, Лизоформин-3000, Новодез-Форте, РИК-Д, Септодор-Форте, Эффект-Форте), а также хлорсодержащее средство — двуосновная соль гипохлорита кальция (ДСГК). Данные препараты по токсикологической характеристике относятся к III — IV классам опасности и имеют сроки хранения в пределах 3 — 5 лет. При времени экспозиции от 60 до 120 мин. рабочие концентрации препаратов в зависимости от вида обрабатываемого объекта и состава средства варьируют от 0,2% до 5,0%. Содержащие глутаровый альдегид средства (Лизоформин-3000, Новодез-Форте) более токсичны, но вызывают гибель возбудителя сапа при низких концентрациях и коротких экспозициях. Хлорсодержащие растворы средства ДСГК, содержащие 0,15 — 0,44% активного хлора, эффективны против возбудителя сапа на обеззараживаемых объектах при 60 — 120 мин. экспозиции.
7. Экстренная профилактика сапа при аварии в лаборатории
В случае регистрации аварии проводят мероприятия в соответствии с действующими нормативными и методическими документами по работе с возбудителями I — II групп патогенности.
Примечание.
Письмом Роспотребнадзора от 06.02.2012 N 01/980-12-32 направлен Перечень административных территорий субъектов Российской Федерации, эндемичных по клещевому вирусному энцефалиту в 2011 году. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА
ПИСЬМО
от 14 января 2011 г. N 01/245-1-32
О ПЕРЕЧНЕ ЭНДЕМИЧНЫХ ТЕРРИТОРИЙ ПО КЛЕЩЕВОМУ ВИРУСНОМУ ЭНЦЕФАЛИТУ В 2010 Г.
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека направляет для использования в работе и планирования противоэпидемических мероприятий Перечень административных территорий субъектов Российской Федерации, эндемичных по клещевому вирусному энцефалиту в 2010 году. Руководитель
Г.Г.ОНИЩЕНКО
Приложение
ЦЕНТРАЛЬНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ОКРУГ
Белгородская область нет
Брянская область нет
Владимирская область нет
Воронежская область нет
Ивановская область Из 27 административных территорий 20 являются эндемичными: Гаврило-Посадский, Фурмановский, Верхне- Ландеховский, Вичугский, Заволжский, Ивановский, Кинешемский, Комсомольский, Лежневский, Палехский, Пестяковский, Пучежский, Родниковский, Савинский, Тейковский, Шуйский, Юрьевецкий районы, г. Вичуга, г. Иваново, г.Тейково Калужская область нет Костромская область Вся территория области Курская область нет Липецкая область нет Московская область Из 53 административных территорий 2 являются эндемичными: Дмитровский, Талдомский районы Орловская область нет Рязанская область нет Смоленская область нет Тамбовская область нет Тверская область Из 37 административных территорий 34 являются эндемичными: Андреапольский, Бежецкий, Бельский, Бологовский, Весьегонский, Вышневолоцкий, Жарковский, Западно-Двинский, Калининский, Калязинский, Кашинский, Кесовогорский, Кимрский, Конаковский, Краснохолмский, Кувшиновский, Лесной, Лихославльский, Максатихинский, Молоковский, Нелидовский, Оленинский, Осташковский, Рамешковский, Сандовский, Селижаровский, Сонковский, Спировский, Старицкий, Торжокский, Торопецкий, Удомельский, Фировский районы, г. Тверь Тульская обл нет Ярославская область Из 23 административных территорий 18 являются эндемичными: Большесельский, Брейтовский, Гаврилов-Ямский, Даниловский, Любимский, Мышкинский, Некоузский, Некрасовский, Первомайский, Пошехонский, Ростовский, Рыбинский, Тутаевский, Угличский, Ярославский районы, г. Ярославль, г.Рыбинск, г. Ростов г. Москва нет
СЕВЕРО-ЗАПАДНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ОКРУГ
Архангельская область Из 25 административных территорий 18 являются эндемичными: Вельский, Верхнетоемский, Вилегодский, Виноградовский, Каргопольский, Коношский, Котласский, Красноборский, Ленский, Няндомский, Онежский, Плесецкий, Устьянский, Холмогорский, Шенкурский районы, г. Коряжма, г. Котлас, г. Мирный Вологодская область Все 26 административных территорий области Калининградская область Все 22 административные территории области Республика Карелия Из 18 административных территорий 11 являются эндемичными: Кондопожский, Лахденпохский, Медвежьегорский, Олонецкий, Питкярантский, Прионежский, Пряжинский, Пудожский, Суоярвский районы, г. Петрозаводск и окрестности, г. Сортавала и окрестности Республика Коми Из 20 административных территорий 6 являются эндемичными: Сыктывдинский, Сысольский, Усть- Куломский, Койгородский, Прилузский районы, г. Сыктывкар Ленинградская область Все 17 административных территорий области Мурманская область нет Ненецкий автономный округ нет Новгородская область Все 24 административные территории области Псковская область Все 26 административные территории области г. Санкт-Петербург Из 18 административных территорий 7 являются эндемичными: Колпинский, Красносельский, Курортный, Приморский, Петродворцовый, Пушкинский, Московский районы
ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ОКРУГ
Республика Адыгея нет
Астраханская область нет
Волгоградская область нет
Республика Дагестан нет
Республика Ингушетия нет
Республика Кабардино-Балкария нет
Республика Калмыкия нет
Карачаево-Черкесская Республика нет
Краснодарский край нет
Ростовская обл нет
Республика нет Северная Осетия — Алания
Ставропольский край нет
Чеченская Республика нет
ПРИВОЛЖСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ОКРУГ
Кировская область Все 40 административных территорий области Нижегородская область Из 50 административных территорий 32 являются эндемичными: Арзамасский, Балахнинский, Богородский, Борский, Большеболдинский, Вадский, Вачский, Ветлужский, Володарский, Городецкий, Д.Константиновск, Ковернинский, Кстовский, Лысковский, Перевозский, Починковский, Павловский, Пильненский, Семеновский, Сеченовский, Сергачский, Спасский, Тонкинский, Тоншаевский, Уренский, Чкаловский, Шарангский, Шатковский, Шахунский районы, г. Дзержинск, г. Н. Новгород Оренбургская область Из 47 административных территорий 12 являются эндемичными: Абдулинский, Асекеевский, Бугурусланский, Бузулукский, Грачевский, Гайский, Матвеевский, Оренбургский, Пономаревский, Сакмарский, Северный, Шарлыкский районы Пензенская область нет Пермский край Все 45 административных территорий Республика Башкортостан Из 68 административных территорий 39 являются эндемичными: Альшеевский, Аскинский, Бакалинский, Белебеевский, Белокатайский, Белорецкий, Бирский, Благовещенский, Буздякский, Бураевский, Бурзянский, Гафурийский, Давлекановский, Дуванский, Ермикеевский, Иглинский, Ишимбайский, Калтасинский, Караидельский, Кигинский, Краснокамский, Кугарчинский, Куюргазинский, Мелеузовский, Мечетлинский, Мишкинский, Миякинский, Нуримановский, Салаватский, Стерлибашевский, Стерлитамакский, Татышлинский, Туймазинский, Уфимский, Федоровский, Чекмагушевский, Чишминский, Шаранский, Янаульский Республика Марий Эл Из 17 административных территорий 9 являются эндемичными: Звениговский, Советский, Медведевский, Моркинский, Волжский, Килемарский, Оршанский, Сернурский районы, г. Йошкар-Ола Республика Мордовия нет Республика Татарстан Из 45 административных территорий 26 являются эндемичными: Агрызский, Азнакаевский, Аксубаевский, Актанышский, Алькеевский, Алексеевский, Альметьевский, Бавлинский, Бугульминский, Елабужский, Заинский, Лениногорский, Менделеевский, Мензелинский, Муслюмовский, Нижнекамский, Новошешминский, Нурлатский, Сабинский, Спасский, Тукаевский, Тюлячинский, Чистопольский, Черемшанский, Ютазинский районы, г. Набережные Челны Самарская область Из 35 административных территорий 26 являются эндемичными: Безенчукский, Богатовский, Больше-Глущицкий, Борский, Волжский, Елховский, Камышлинский, Кинельский, Кинель-Черкасский, Клявлинский, Кошкинский, Красноармейский, Красноярский, Похвистневский, Приволжский, Сергиевский, Ставропольский, Сызранский, Челно-Вершинский, Шенталинский, Шигонский, районы, г. Самара, г. Жигулевскuй, г.Тольятти, г.Новокуйбышевск, г.Сызрань Саратовская область нет Удмуртская Республика Все 30 административных территорий республики Ульяновская область Из 24 административных территорий 5 являются эндемичными: Мелекесский, Майнский, Старо- Майнский, Сенгилевский, Ульяновский районы Чувашская Республика нет
УРАЛЬСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ОКРУГ
Курганская область Из 26 административных территорий 19 являются эндемичными: Белозерский, Варгашинский, Далматовский, Каргапольский, Катайский, Кетовский, Куртамышский, Лебяжьевский, Макушинский, Мишкинский, Мокроусовский, Целинный, Шадринский, Шатровский, Шумихинский, Щучанский, Юргамышский районы, г. Курган, г. Шадринск Свердловская область Все 93 административные территории области Тюменская область Все 23 административные территории области Ханты-Мансийский автономный Из 22 административных округ - Югра территорий 19 являются эндемичными: Нефтеюганский, Октябрьский, Ханты-Мансийский, Сургутский, Кондинский, Нижневартовский, Советский р-ны, г.Ханты- Мансийск, г.Урай, г.Сургут, г.Нефтеюганск, г.Нижневартовск, г.Мегион, г.Нагань, г.Когалым, г.Лангепас, г.Покачи, г.Пыть-Ях, г.Югорск
Челябинская область Все 38 административных территорий области Ямало-Ненецкий автономный округ нет
СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ОКРУГ
Республика Алтай Все 11 административных территорий
Алтайский край Из 65 административных территорий 58 являются являются эндемичными: Алейский, Алтайский, Бийский, Баевский, Быстроистокский, Благовещенский, Волчихинский, Егорьевский, Ельцовский, Завьяловский, Змеиногорский, Заринский, Зональный, Залесовский, Калманский, Каменский, Курьинский, Кытмановский, Косихинский, Краснощековский, Красногорский, Крутихинский, Кулундинский, Локтевский, Мамонтовский, Панкрушинихинский, Поспелихинский, Павловский, Первомайский, Петропавловский, Ребрихинский, Рубцовский, Романовский, Смоленский, Солонешенский,Советский,Солтонский, п. Сибирский, Тальменский, Тогульский, Топчихинский, Троицкий, Третьяковский, Тюменцевский, Усть-Пристанский, Усть-Калманский, Хабарский, Целинный, Чарышский, Шипуновский, Шелаболихинский районы, г. Барнаул, г. Белокуриха, г. Бийск, г. Заринск, г. Новоалтайск, г. Рубцовск, г. Славгород Республика Бурятия Из 22 административных территорий 18 являются эндемичными: Баргузинский, Бичурский, Джидинский, Заиграевский, Закаменский, Иволгинский, Кабанский, Курумканский, Кяхтинский, Мухоршибирский, Муйский, Окинский, Прибайкальский, Северо-Байкальский, Селенгинский, Тарбагатский, Тункинский районы, окрестности г. Улан-Удэ Иркутская область Из 36 административных территорий 30 являются эндемичными: Братский, Балаганский, Жигаловский, Заларинский, Зиминский, Иркутский, Казачинско-Ленский, Качугский, Куйтунский, Нижнеудинский, Ольхонский, Слюдянский, Тайшетский, Тулунский, Усть-Илимский, Усть-Удинский, Усольский, Черемховский, Чунский, Шелеховский районы, г. Ангарск, г. Братск, г. Иркутск, г. Саянск, Аларский, Баяндаевский, Боханский, Нукутский, Осинский, Эхирит-Булагатский районы Кемеровская область Все 38 административных территорий области Красноярский край Из 61 административных территорий 56 являются эндемичными: Абанский, Ачинский, Балахтинский, Березовский, Бирилюсский, Боготольский, Богучанский, Большемуртинский, Большеулуйский, Дзержинский, Енисейский, Емельяновский, Ермаковский, Идринский, Иланский, Ирбейский, Казачинский, Канский, Каратузский, Кежемский, Козульский, Краснотуранский, Курагинский, Манский, Минусинский, Мотыгинский, Назаровский, Нижнеигашский, Новоселовский, Рыбинский, Партизанский, Пировский, Саянский, Сухобузимский, Тасеевский, Тюхтетский, Ужурский, Уярский, Шарыповский, Шушенский районы, г. Ачинск,г. Боготол, г. Бородино, г. Дивногорск, г. Енисейск, г. Канск,г.Красноярск, г.Лесосибирск, г. Минусинск, г. Назарово, г. Сосновоборск, г. Шарыпово, п. Кедровый, Зеленогорск, Железногорск, Солнечный, Новосибирская область Из 33 административных территорий 22 являются эндемичными: Барабинский, Болотнинский, Венгеровский, Искитимский, Каргатский, Колыванский, Коченевский, Краснозерский, Кыштовский, Маслянинский, Мошковский, Новосибирский, Ордынский, Северный, Сузунский, Тогучинский, Усть-Тарский, Черепановский, Чулымский районы, г. Бердск, г. Новосибирск, г. Обь Омская область Из 32 административных территорий 15 являются эндемичными: Большереченский, Большеуковский, Горьковский, Знаменский, Колосовский, Крутинский, Муромцевский, Нижнеомский, Омский, Саргатский, Седельниковский, Тарский, Тевризский, Тюкалинский, Усть-Ишимский районы Томская область Все 20 административных территорий области Республика Тыва Из 18 административных территорий 12 являются эндемичными: Каа-Хемский, Кызылский, Пий-Хемский, Сут-Хольский, Тандинский, Тес-Хемский, Тоджинский, Улуг-Хемский, Чаа-Хольский, Чеди-Хольский, Тери-Хольский районы, г. Кызыл Республика Хакасия Из 13 административных территорий 10 являются эндемичными: Аскизский, Бейский, Боградский, Таштыпский, Усть-Абаканский, Ширинский, Орджоникидзевский районы, г. Абаза, г. Саяногорск и окрестности, г. Сорск Забайкальский край Из 32 административных территорий 23 являются эндемичными: Акшинский, Александрово-Заводский, Балейский, Борзинский, Газимуро- Заводский, Карымский, Красночикойский, Могочинский, Нерчинский, Оловяннинский, Петровск- Забайкальский, Сретенский, Тунгокоченский, Улетовский, Хилокский, Чернышевский, Читинский, Шелопугинский, Шилкинский, Агинский, Дульгургинский, Моготуйский районы, г. Чита
ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ОКРУГ
Амурская область Из 27 административных территорий 15 являются эндемичными: Архаринский, Бурейский, Зейский, Магдагачинский, Мазановский, Октябрьский, Свободненский, Селемджинский, Сковородинский, Тындинский, Шимановский районы, г. Зея, г. Свободный, г. Тында, г. Шимановск Еврейская автономная область Все 6 административных территорий области Камчатский край нет Магаданская область нет Приморский край Из 32 административных территорий 30 являются эндемичными: г. Владивосток, г. Артем, г. Уссурийск, г. Спасск-Дальний, г. Арсеньев, г. Находка, г. Партизанск, г. Лесозаводск, г. Дальнегорск, г. Дальнереченск, Анучинский, Чугуевский, Спасский, Яковлевский, Кировский, Пожарский, Тернейский, Кавалеровский, Лазовский, Ольгинский, Хасанский, Шкотовский,Партизанский, Черниговский, Пограничный, Октябрьский, Надеждинский, Красноармейский, Михайловский, Дальнереченский районы Республика Саха (Якутия) нет Сахалинская область Из 19 административных территорий 15 являются эндемичными: Анивский, Долинский, Корсаковский, Курильский, Макаровский, Невельский, Ногликский, Поронайский, Смирныховский, Томаринский, Тымовский, Углегорский, Холмский, г. Александровск-Сахалинский, г. Южно-Сахалинск Хабаровский край Из 19 административных территорий 17 являются эндемичными: Амурский, Бикинский, Ванинский, Верхнебуреинский, Вяземский, им. Лазо, им. П. Осипенко, Комсомольский, Нанайский, Николаевский, Совгаванский, Солнечный, Ульчский, Хабаровский, Тугуро-Чумиканский районы, г. Комсомольск-на-Амуре, г. Хабаровск Чукотский автономный округ нет
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА
ПРИКАЗ
от 12 января 2011 г. N 2
О СБОРЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ И ДАННЫХ
СОЦИАЛЬНО-ГИГИЕНИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ЗА 2010 ГОД
В целях дальнейшего совершенствования работы по ведению социально-гигиенического мониторинга и формирования федерального информационного фонда данных за 2010 год приказываю: 1. Руководителям управлений Федеральной службы по надзору а сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по субъектам Российской Федерации: 1.1. Провести сбор показателей и данных социально-гигиенического мониторинга за 2010 год в два этапа: 1.1.1. До 15 марта 2011 года: «Атмосферный воздух населенных мест», «Питьевая вода систем централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения», «Санитарно-эпидемиологическая безопасность почвы населенных мест», «Контаминация продовольственного сырья и продуктов питания химическими веществами»; 1.1.2. До 30 июня 2011 года: «Медико-демографические показатели», «Здоровье населения», «Сведения о социально-экономическом состоянии территории», «Условия труда и профессиональная заболеваемость», «Показатели радиационной безопасности объектов окружающей среды и среды обитания людей». 1.2. Направлять данные за 2010 год в ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека с сопроводительным письмом на CD-дисках почтой. 2. ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека: 2.1. Разместить на сайте ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (www.fcgsen.ru), в разделе «Федеральный информационный фонд данных социально-гигиенического мониторинга», шаблоны таблиц MS Excel и инструкцию по заполнению шаблонов для формирования Федерального информационного фонда данных социально-гигиенического мониторинга за 2010 год, а также направить их в адрес управлений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в субъектах Российской Федерации по электронной почте. 2.2. Дополнить базу данных федерального информационного фонда показателями и данными социально-гигиенического мониторинга за 2010 год. 2.3. Провести анализ представленных данных за 2010 год и включить аналитический материал по данным социально-гигиенического мониторинга в Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации за 2010 год». 3. Руководителям управлений Роспотребнадзора по субъектам Российской Федерации взять под личный контроль соблюдение Инструкции при заполнении шаблонов и отправку данных в установленные сроки. 4. Контроль за выполнением настоящего Приказа возложить на заместителя руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Н.В. Шестопалова.
Руководитель
Г.Г.ОНИЩЕНКО
