«Количественное определение формальдегида в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания. МУК 4.1.770-99» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.07.1999)
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 июля 1999 года
Дата введения —
6 сентября 1999 года
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОРМАЛЬДЕГИДА В КРОВИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.770-99
- Разработаны под редакцией академика РАЕН, д.м.н., проф. Зайцевой Н.В., к.б.н. Улановой Т.С., к.б.н. Нурисламовой Т.В., Карнажицкой Т.Д., Суетиной Г.Н., Поповой Н.В., Митрофановой В.М., Плаховой Л.В., Рудаковой Е.А. (ПНИКИ детской экопатологии).
- Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 6 июля 1999 г.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 «Методики выполнения измерений», ГОСТа Р 1.5-92 «Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов». Методика анализа аттестована и обеспечивает определение формальдегида в диапазоне концентраций 0,05 — 3,0 мкг/куб. см.
НСНО Мол. масса — 30,03
Формальдегид (муравьиный альдегид, метаналь) — газ с резким запахом. 35 — 40%-ный водный раствор формальдегида называется формалином или формолем. Растворы выделяют газообразный формальдегид при комнатной температуре. — минус 19,3 °С, — минус 118,3 °С. Формальдегид растворим в воде и органических растворителях (бензол, толуол, ацетон, этанол, этилацетат и др.). Формальдегид — раздражающий газ, вызывает дегенеративные процессы в паренхиматозных органах, сенсибилизирует кожу, действует на ЦНС. Относится ко 2 классу опасности. Содержание формальдегида в крови контрольной группы — мкг/куб. см. Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью результата измерений 20,0% при доверительной вероятности 0,95.
СУЩНОСТЬ МЕТОДА
Методика основана на предварительном переводе формальдегида в 2,4-динитрофенилгидразон формальдегида, экстракции продукта дериватизации из биологического материала гексаном, упаривании гексанового экстракта, растворении упаренного остатка в ацетонитриле и анализе на жидкостном хроматографе. Измерение концентрации формальдегида выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора. Определению не мешают метанол, этанол, уксусный альдегид, ацетон, муравьиная кислота и другие карбонильные соединения. Длительность анализа, включая подготовку пробы, — 50 мин.
СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ
При выполнении анализа применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными метрологическими характеристиками.
Средства измерений
Жидкостный хроматограф с насосом высокого давления (ЧССР) и ультрафиолетовым детектором LCD 2563 (ЧССР)
Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические ТУ 25-06113-79
Разновесы
ГОСТ 73208-82
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2, пределы 0 — 100 °С, цена деления 1 °С ТУ 25-2021-003-88
Секундомер «Агат»
ГОСТ 5072-792.2
Микрошприцы МШ-10
ТУ 5Е2.833.106
Лупа измерительная
ГОСТ 25706-83
Линейка металлическая измерительная, цена деления 1 мм ГОСТ 17435-72
Цилиндр мерный вместимостью 50 куб. см
ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные вместимостью 1, 5 и 10 куб. см ГОСТ 20292-74
Пробирки центрифужные мерные вместимостью 10 куб. см
Колбы мерные вместимостью 50, 100 куб. см ГОСТ 1770-74
Стандартные образцы:
формальдегид в воде с концентрацией 1,0 мг/куб. см ГСО 6263-91.2.1.
Вспомогательные устройства
Колонка из кварцевого стекла длиной 15 см и внутренним диаметром 3,3 мм, заполненная сорбентом Separon С 18 с размером частиц 5 мкм Центрифуга СМ-4 (2750 об./мин.)
Дистиллятор
ТУ 61-1-721-79
Сушильный шкаф ШСС-80 П УХЛ 4.2
ТУ 16.531.743-83
ИК-лампа
Дефлегматор длиной 300 мм
ГОСТ 9425-60
Холодильник шариковый ХШ-300 (6 шар.)
ГОСТ 1770-74
Холодильник прямой ХПТ-3-300
ГОСТ 1770-74
Воронка Шотта (пор 16)
ГОСТ 25336
Воронки делительные вместимостью 250 куб. см ГОСТ 23932-79
Бюксы вместимостью 10 куб. см с притертой крышкой ГОСТ 25336-82
Стакан термостойкий вместимостью 2 куб. дм ГОСТ 25336-82
Колба для перегонки круглодонная вместимостью 2 куб. дм ГОСТ 25336-82.
Реактивы
Гексан, х. ч., очищенный для хроматографии ГОСТ 6-09-4521-77
Ацетонитрил, ч., очищенный для хроматографии ТУ 6-09-3534-87
Вода дистиллированная
ГОСТ 6709-72
2,4-динитрофенилгидразин, ч., очищенный перекристаллизацией из ацетонитрила, чистота не менее 99,0% ТУ 6-09-2394-77
2,4-динитрофенилгидразон формальдегида, перекристаллизованный из метанола или этанола, чистота не менее 99,0%
Кислота соляная (плотность 1,19), х. ч. ГОСТ 3118-77
Перманганат калия, ч.
ГОСТ 20490-75
Калий двухромовокислый, ч. д. а.
ГОСТ 4220-75.
ТРЕБОВАНИЯ К БЕЗОПАСНОСТИ
Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям «Пожарных норм проектирования зданий и сооружений» (СНиП ПА-5-700) и «Санитарных норм проектирования промышленных предприятий» (СН 245-71) и СНиП-74. При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76. При работе необходимо соблюдать «Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях», утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М.,1981), и «Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением», утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989). При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.
ТРЕБОВАНИЯ К КВАЛИФИКАЦИИ ОПЕРАТОРА
К выполнению хроматографических измерений биологических проб допускаются лица, прошедшие обучение работе на жидкостном хроматографе.
УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ
При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия: — температура воздуха (20 +/- 10) °С;
— атмосферное давление 630 — 800 мм рт. ст.; — влажность воздуха — не более 80% при температуре 25 °С. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.
ПОДГОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЙ
Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды и растворителей, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.
Подготовка посуды
Используемую посуду необходимо тщательно вымыть хромовой смесью, тщательно ополоснуть водопроводной и дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С.
Подготовка растворителей
Очистка ацетонитрила от примесей. В колбу вместимостью 2 куб. дм помещают 1 куб. дм ацетонитрила и 20 г , кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч, затем перегоняют с дефлегматором, отбирая фракции по 200 куб. см. Когда в колбе останется около 200 куб. см продукта, перегонку прекращают. Остаток можно смешивать с новой порцией растворителя. Первую фракцию отбрасывают, а остальные проверяют на поглощение в УФ-области.
Приготовление растворов
Хромовая смесь. В термостойкий стакан вместимостью 2 куб. дм насыпают 50 г хромовокислого калия, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 куб. дм концентрированной серной кислоты. Элюент для хроматографии. 50 куб. см очищенного ацетонитрила смешивают с 50 куб. см дистиллированной воды. Подвижную фазу фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия или азота в течение 5 — 10 мин. со скоростью 50 — 60 куб. об./мин. Соляная кислота, 2 моль/куб. дм. 163,0 куб. см концентрированной HCl (плотность 1,19 г/куб. см) вносят в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. 2,4-динитрофенилгидразин, 0,2%-ный раствор в 2М соляной кислоте. 0,2 г 2,4-динитрофенилгидразина вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 2М раствором соляной кислоты. Исходный раствор формальдегида для калибровки (раствор А). 1 куб. см ГСО формальдегида с концентрацией 1,0 мг/куб. см переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора — 36 ч. Рабочий раствор для градуировки УФ-детектора. В мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 10 куб. см раствора А и доводят дистиллированной водой до метки (раствор Б). Срок хранения раствора — 36 ч. Идентификация хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида. Готовят раствор 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида в ацетонитриле с концентрацией 0,01 — 0,02 мг/куб. см, вводят в колонку хроматографа 1 — 2 куб. мм раствора. Снимают хроматограмму в условиях хроматографического анализа и определяют время удерживания 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида.
Подготовка хроматографической колонки
Колонку устанавливают на хроматограф и подают элюирующую жидкость (ацетонитрил:вода = 1:1) со скоростью 1 куб. см/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.
Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме от концентрации формальдегида в крови, устанавливают по пяти сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из шести растворов, готовят из растворов А и Б. Растворы для установления градуировочной характеристики готовят в мерных колбах вместимостью 50 куб. см. Для этого в каждую колбу вносят раствор А (или раствор Б) в соответствии с таблицей, доводят объем до метки цельной кровью, не содержащей формальдегид, и тщательно перемешивают. Растворы готовят непосредственно перед определением.
Таблица
РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ ФОРМАЛЬДЕГИДА В КРОВИ
Номер раствора
1
2
3
4
5
6
Объем раствора А
(конц. 10 мкг/куб. см), куб. см
—
—
0,25
0,50
1,00
1,50
Объем раствора Б
(конц. 1 мкг/куб. см), куб. см
0,25
0,50
—
—
—
—
Массовая концентрация формальдегида, мкг/куб. см 0,05
0,10
0,50
1,00
2,00
3,00
2 куб. см каждого рабочего раствора помещают в делительную воронку, добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 2 куб. см 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2М соляной кислоте, 2 капли концентрированной соляной кислоты, 5 куб. см гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения гексана и крови верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 1 — 2 мин. со скоростью 2750 об./мин., затем 1,5 куб. см гексана переносят в бюкс и выпаривают досуха под ИК-лампой. Высушенный остаток растворяют в 0,4 куб. см ацетонитрила и вводят в хроматограф аликвотную часть (10 мкл). Проводят по пять параллельных вводов обработанных экстрактов каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях:
подвижная фаза
ацетонитрил:вода = 1:1,
скорость движения элюента
0,6 куб. см/мин.,
скорость диаграммной ленты
0,3 см/мин.,
длина волны УФ-детектора
365 нм,
шкала детектора
2,
время удерживания:
2,4-динитрофенилгидразина
4 мин. 20 с,
2,4-динитрофенилгидразона формальдегида 5 мин. 50 с.
По средним для каждой точки значениям аналитического сигнала (площади пика) строят градуировочную характеристику S = f (С), где: S — площадь пика, кв. мм (или усл. ед.); С — концентрация градуировочного раствора, мкг/куб. см. По установленной градуировочной характеристике и по значению аналитического сигнала пробы определяют концентрацию формальдегида в исследуемом образце.
Отбор проб
Для отбора проб крови используют чистую посуду объемом 10 куб. см. Кровь отбирают из вены в количестве 2 кв. см. Срок хранения пробы крови в холодильнике — не более 48 ч.
ВЫПОЛНЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЙ
2 куб. см анализируемой пробы помещают в делительную воронку, добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 2,0 куб. см 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2М соляной кислоте, 2 капли концентрированной соляной кислоты, 5 куб. см гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения жидкостей верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 1 — 2 мин. со скоростью 2750 об./мин., затем 1,5 куб. см гексана переносят в бюкс и выпаривают досуха под ИК-лампой. Высушенный остаток растворяют в 0,4 куб. см ацетонитрила и вводят в хроматограф аликвотную часть (10 куб. мм). Анализ проводят при вышеуказанных условиях работы хроматографа. По установленной градуировочной характеристике и по значению аналитического сигнала пробы определяют концентрацию формальдегида в исследуемом образце.
ВЫЧИСЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЯ
Вычисляют значение площади хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида по формуле:
S = h x L, кв. мм,
где:
h — высота пика, мм;
L — ширина пика на половине высоты, мм. Из градуировочных характеристик по значению площади хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида находят массовую концентрацию формальдегида в крови, мкг/куб. см.
ВНУТРЕННИЙ ОПЕРАТИВНЫЙ КОНТРОЛЬ
Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).
Оперативный контроль сходимости
Периодичность контроля сходимости измерений зависит от количества рабочих измерений (2 параллельные пробы). Отбирают 2 пробы мочи и каждую из них анализируют в точном соответствии с прописью методики. Результаты признаются удовлетворительными, если выполняется условие:
,
где:
и — результаты анализа 1 и 2 проб;
d — допустимое расхождение между двумя результатами одной и той же пробы (d = 55%);
- среднее значение между двумя определениями.
Оперативный контроль точности
Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля. Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50 — 150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X’. Результаты анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X’ получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д. Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:
где:
С — добавка к пробе в виде раствора с концентрацией мкг/куб. см;
- норматив оперативного контроля погрешности, мкг/куб. см. При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают:
,
где: и — характеристики погрешностей для исходной пробы и пробы с добавкой, мкг/куб. см;
и .
При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают, что:
.
При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.
