Биологи МГУ имени М.В. Ломоносова совместно с коллегами из Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта (ИМБ РАН) и Института белка РАН, применив метод трансфекции РНК, выяснили, как одна и та же мРНК может направлять синтез белка в клетке четырьмя различными способами. Результаты работы опубликованы в авторитетном журнале Scientific Reports.

Клеточный стресс и переформатирование белкового синтеза

«Наша работа посвящена изучению механизмов биосинтеза белка, в том числе в условиях клеточного стресса. В ней освещается три аспекта. Первый аспект — методический. Мы презентуем метод, позволяющий анализировать синтез белка в клетке с помощью метода краткосрочной РНК-трансфекции», — комментирует ведущий автор статьи, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник НИИ ФХБ МГУ и ИМБ РАН Сергей Дмитриев.

Трансфекция — способ, позволяющий доставлять ДНК и РНК в живую клетку. Обычно в клетку доставляют ДНК: она проникает в ядро, запускает там процессы синтеза новых РНК, и только потом эти РНК попадают в цитоплазму и могут принять участие в получении белков. Биологи МГУ предлагают доставлять в клетку уже готовую РНК, которая сразу может служить матрицей для синтеза белка. РНК доставляется в клетку с помощью специального химического реагента. При попадании в цитоплазму она освобождается и сразу начинает участвовать в производстве белков: ей остается только встретиться с рибосомой.

Таким образом, путь до конечного продукта получается сильно короче. Уже через час-два можно наблюдать активность белка и оценивать его количество.

Этот метод позволяет изучать стрессовые воздействия на клетку на коротких временных интервалах. К клеточным стрессам относятся, например, тепловой шок, вызванный повышением температуры, окислительный стресс, спровоцированный активными формами кислорода, реакция на химические агенты, нарушающие гомеостаз, в том числе на антибиотики и терапевтические препараты. Факторы клеточного стресса вынуждают клетку приостановить биосинтез белка (либо «переформатировать» его), пока система не придёт в равновесие.

«Эти процессы обычно занимают от 1 до 4 часов, и их действие удобнее всего изучать с помощью нашего метода «быстрой» РНК-трансфекции. Мы проводили работу на культивируемых клетках почки человека — стандартном модельном объекте для подобных исследований. В результате нами была разработана методика, которая позволяет получать искусственную РНК, трансфицировать её в клетку и видеть результат через очень короткое время. Вся эта процедура была обозначена нами аббревиатурой FLERT (от англ. fleeting mRNA transfection) – немного созвучной со словом «флирт»», — улыбается Сергей.

Почему у рибосомы сумма 40S и 60S равна 80S

Матричная РНК (мРНК) — полимер из нуклеотидов, кодирующий белок. Одну аминокислоту кодируют 3 нуклеотида. Для производства белка в клетке существует специальная молекулярная машина под названием рибосома, которая, двигаясь вдоль мРНК, считывает с неё информацию тройками. Именно так, используя мРНК как матрицу, рибосома и синтезирует белок.

Машина для синтеза белка устроена очень сложно. Она состоит из двух субчастиц — малой (40S) и большой (60S). Когда они соединяются, получается целая рибосома, но она, как ни странно, обозначается не 100S, а 80S. Дело в том, что эти числа отражают не массу частицы, а коэффициент седиментации, определяемый при центрифугировании. Этот коэффициент зависит от нескольких параметров, в том числе от формы частицы.

Для того чтобы приступить к раскодированию информации, нужно сначала найти правильную точку старта — триплет, с которого предстоит начать считывание.

Обнаружить точку старта — это нетривиальная задача, поскольку триплеты в мРНК никак не обозначены. Но если начать читать не с того нуклеотида, то рамка считывания окажется сбита, и всё пойдёт вкривь и вкось.

Найти в матрице то место, с которого следует начать читать триплеты, рибосоме помогают специальные белки (факторы инициации трансляции).

Обычно в цепочке мРНК точка старта отстоит от её начала на какое-то расстояние. Часть мРНК, предшествующая стартовому кодону, именуется лидером. Этот лидер рибосома должна «проехать», не читая. Российские ученые заинтересовались вопросом, что будет, если мРНК сразу начнется со стартового кодона, с «первого слова». Интересно, что у архей (одноклеточные организмы-прокариоты, живущие на Земле миллиарды лет и способные выживать в экстремальных условиях) и у некоторых других примитивных организмов большинство мРНК начинаются прямо со стартового кодона. Такие РНК называются безлидерными. Принято считать, что безлидерные мРНК — эволюционный прообраз матричных РНК, ведь древние рибосомы ещё не умели находить стартовые точки и начинали декодирование с самого начала.

Для того чтобы рибосома связалась с мРНК и начала синтез белка, ей нужно пройти несколько стадий. Как правило, сначала с мРНК связывается 40S-субчастица рибосомы, а уже потом на стартовом кодоне к ней присоединяется большая 60S-субчастица. А вот безлидерная мРНК может связываться сразу с целой рибосомой. Это открытие сделал ещё в 90-е годы профессор МГУ имени М.В. Ломоносова Иван Шатский.

В новой работе ученые показали, что благодаря своим уникальным свойствам безлидерные РНК устойчивы ко многим видам стресса и продолжают направлять синтез белков даже в условиях, при которых обычные РНК с лидером прекращают работать в первые же минуты после воздействия.

С помощью метода FLERT это удалось показать в системе in vivo.

Все дороги хороши — выбирай на свой вкус

Продолжение работы принесло ещё более интересные результаты. Оказалось, что уникальные свойства безлидерной мРНК придают ей большую пластичность в выборе механизмов синтеза белка.

Ранее у эукариот было найдено несколько способов, с помощью которых рибосома может оказаться на стартовом кодоне. Эти способы опосредуются разным набором белков — факторов инициации трансляции — и были открыты на разных мРНК.

Самый распространенный способ, которым может воспользоваться любая клеточная мРНК, обеспечивается белком eIF2. Однако этот фактор быстро становится неактивным при любом стрессовом воздействии. В результате рибосомы перестают распознавать стартовые кодоны на всех мРНК, кроме тех, которые пользуются другими факторами инициации.

Позднее ученые обнаружили, что eIF2 — не единственный фактор, который подходит для этих целей. Например, мРНК вируса гепатита С способна обойтись без eIF2, а вместо него использовать другие факторы — eIF5B или eIF2D (это открытие также было сделано учеными МГУ имени М.В. Ломоносова ранее). Считалось, что вирус в этом плане уникален: если обычные матрицы пассивно ждут, пока с ними свяжется рибосома, то мРНК вируса гепатита С сама «хватает» 40S-субчастицу и «сажает» ее на нужное место в цепочке.Это необычное свойство и делает возможным использование альтернативных путей.

Теперь же ученые показали, что безлидерная мРНК способна делать то же самое.

Интересно, что фактор eIF5B есть у всех организмов — это эволюционно консервативный белок. А классический eIF2 присутствует только у эукариот, у высших организмов, т.е. он универсальным не является. Совокупность упомянутых работ позволяет сказать, что хорошо изученный классический фактор eIF2 нужен только тогда, когда рибосомы узнают мРНК посредством поиска стартового кодона. Такой способ инициации трансляции называется сканированием, именно для него и нужен eIF2. Когда стартовый кодон найден, на место eIF2 приходит eIF5B и начинается биосинтез белка. Эволюционно более древняя безлидерная мРНК может использовать примитивный механизм, сразу привлекая фактор eIF5B.

«У нас получился красивый результат, который сразу всё объяснил. Мы обнаружили, что примитивная РНК может использовать эволюционно древний механизм. А кроме того, она умеет пользоваться и тремя остальными путями: через eIF2, eIF2D или прямое связывание целой 80S рибосомы», — заключает Сергей Дмитриев.

Исследования поддержаны грантом Российского научного фонда (РНФ).