«Определение массовой концентрации стирола в пробах крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания. МУК 4.1.2116-06» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 09.08.2006)

УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
9 августа 2006 года

Дата введения:
1 сентября 2006 года

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ СТИРОЛА В ПРОБАХ КРОВИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.2116-06

1. Область применения

Методические указания по определению концентрации стирола в крови предназначены для использования Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, работающими в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды. Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием стирола в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды. Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 «ГСОЕИ. Методики выполнения измерений», ГОСТ Р 1.5-92 «ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов». Методика выполнения измерений обеспечивает определение стирола в диапазоне концентраций 0,1-5,0 мкг/куб. см с погрешностью, не превышающей 23%, при доверительной вероятности Р = 0,95.

C6H5CHCH2 Мол. масса 103,7.

Стирол (винилбензол, фенилэтилен) — бесцветная жидкость с резким запахом. Температура кипения: 145 град. С, плотность 0,9059. Растворяется в большинстве органических растворителей, растворимость в воде 0,032% по объему (20 град. С) [1]. Стирол оказывает общетоксическое, сенсибилизирующее, эмбриотропное, раздражающее действия, отрицательно влияет на ЦНС, обладает кумулятивным эффектом [2].

2. Сущность метода

Методика основана на извлечении стирола из крови экстракцией гексаном и анализе экстракта на жидкостном хроматографе. Измерение концентрации стирола выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора. Нижний предел измерения — 0,001 мкг.
Определению не мешают фенол, бензол, толуол, этилбензол, ксилолы, карбоновые кислоты. Длительность анализа, включая пробоподготовку, — 20 мин.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с насосом высокого давления и ультрафиолетовым детектором

 Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические                  ГОСТ 24104-01 Гири Г2-210                                              ГОСТ 7328-01 Микрошприцы МШ-10                                        ТУ 2.833.106-00 Колбы мерные вместимостью 50 куб. см                     ГОСТ 1770-74 Пипетки градуированные вместимостью 1, 5, 10 куб. см     ГОСТ 29227-91 Редуктор кислородный                                     ТУ 26-05-236-73 Аттестованная смесь стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,00 мг/куб. см                          ГСО МСО 0056.1998.

3.2. Вспомогательные устройства

Колонка стеклянная длиной 150 мм и
внутренним диаметром 3,3 мм, заполненная сорбентом Separon SGX C18 зернением 7 мкм

 Центрифуга ЦЛМН-Р10-01-"Элекон"                    ТУ 9443-001-245.23530-97 Экстрактор ПЭ-8                                    ТУ 3614-001-23050963-97 Дистиллятор                                        ТУ 61-1-721-79 Сушильный шкаф ШСС-80                              ТУ 16.531.743-83 Воронки делительные вместимостью 250 куб. см       ГОСТ 23932-90 Воронка Шотта (пор 16)                             ГОСТ 25336-82 Бюксы СВ 19/9                                      ТУ 92-891.029-91 

Пробирки центрифужные пропиленовые
с завинчивающейся крышкой, производство «Sarstedt», Германия.

3.3. Реактивы

 Гексан для хроматографии, осч                            ТУ 6-09-4521-77 Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, осч            ТУ 6-09-14-2167-84 Вода дистиллированная                                    ГОСТ 6709-72 Гидроксид натрия, хч                                     ГОСТ 4328-77 Спирт этиловый                                           ГОСТ Р 51652-2000 Серная кислота                                           ГОСТ 4204-77 Калия дихромат, хч                                       ГОСТ 4220-75 

Раствор гепарина в ампулах (5000 ед. в 1 куб. см).

3.4. Материалы

Гелий газообразный ТУ 51-940-80.

3.5. Растворы

Элюент для хроматографии
Раствор гидроксида натрия, 10%-й
Раствор дихромата калия в серной кислоте, 3%-й. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования, химреактивов и материалов, по метрологическим и техническим характеристикам не уступающих перечисленным.

4. Требования к безопасности

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.1.005-88. 4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79, противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и меры безопасности, указанные в «Руководстве по правилам эксплуатации прибора».

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и владеющие техникой жидкостно-хроматографического анализа.

6. Условия измерений

6.1. При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия: — температура воздуха 15-25 град. С;
— атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.; — влажность воздуха не более 80% при температуре 25 град. С. 6.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка посуды

Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе двухромовокислого калия в серной кислоте, отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 град. С.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. Элюент для хроматографии. Смешивают 60 куб. см ацетонитрила с 40 куб. см дистиллированной воды. Подвижную фазу фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия в течение 3-5 мин. со скоростью 50-60 куб. см/мин. 7.2.2. Раствор гидроксида натрия 10%-й. Вносят в мерный стакан с меткой на 100 куб. см 10 г гидроксида натрия, прибавляют 90 куб. см дистиллированной воды и перемешивают содержимое стакана до полного растворения гидроксида натрия. Срок хранения раствора — 30 дней при 4 град. С. 7.2.3. Раствор двухромовокислого калия в серной кислоте 3%-й. Растворяют 3,0 г двухромовокислого калия в 53 куб. см концентрированной серной кислоты (плотность 1,84). Использовать свежеприготовленный раствор.

7.3. Подготовка хроматографической колонки

Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюирующую жидкость, подготовленную в соответствии с п. 7.2.1., со скоростью 0,6 куб. см/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

7.4. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме от концентрации стирола в крови, устанавливают по шести сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из трех растворов, готовят разбавлением аттестованной смеси стирола в этиловом спирте (растворы А, Б). 7.4.1. Приготовление раствора А: 1 куб. см аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор. 7.4.2. Приготовление раствора Б: 10 куб. см аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор. 7.4.3. В соответствии с п. 8 проводят анализ образца крови на отсутствие стирола. Объем образца крови для приготовления градуировочных смесей должен быть не менее 12 куб. см. Образец крови с гепарином (из расчета 0,05 куб. см гепарина на 2 куб. см крови) может храниться 2 дня при температуре 4 град. С. 7.4.4. Для установления градуировочной характеристики в 2 куб. см крови добавляют 0,05 куб. см раствора гепарина, вносят раствор А или Б в соответствии с табл. 1 и помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 0,2 куб. см 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 куб. см гексана. Содержимое воронки перемешивают экстрактором со скоростью 2500 об./мин. в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с крышкой и центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 куб. мм вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме прибора.

Таблица 1

РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ СТИРОЛА В КРОВИ

Номер раствора 1 2 3 4 5 6

Объем раствора А, куб. мм 20,0 40,0 100,0 — — — (С = 0,01 мг/куб. см)

Объем раствора Б, куб. мм — — — 20,0 50,0 100,0 (С = 0,10 мг/куб. см)

Массовая концентрация стирола 0,1 0,2 0,5 1,0 2,5 5,0 в крови, мг/куб. дм

Режим работы хроматографа:
колонка стеклянная длиной 150 мм и внутренним диаметром 3,3 мм, заполненная сорбентом Separon SGX С18;

подвижная фаза — ацетонитрил/вода в соотношении 60:40; скорость подвижной фазы — 0,6 куб. см/мин.; длина волны УФ-детектора — 254 нм;
время выхода стирола в заданных условиях — 6 мин. Градуировочную характеристику устанавливают с помощью градуировочного коэффициента, который рассчитывают по формуле:

                                  n                                 SUM C  / S                                 i=1  i    i                             K = -----------,                                      n

где:
C — заданная концентрация стирола в градуировочной смеси, мг куб./дм; i
S — среднее значение трех измерений площади пика, кв. мм или единицы i
оптической плотности (е.о.п.);

n — количество градуировочных смесей (n = 6). Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.

7.5. Отбор проб

Отбор проб венозной крови в объеме 4 куб. см производят в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно вносят 0,1 куб. см раствора гепарина. Срок хранения проб в холодильнике — не более 2-х суток.

8. Выполнение измерений

Проводят два параллельных измерения образца крови: 2 куб. см крови помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 0,2 куб. см 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 куб. см гексана. Перемешивают содержимое воронки экстрактором со скоростью 2500 об./мин. в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 куб. мм вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме хроматографа, указанном в п. 7.4.4. Идентификация хроматографического пика стирола проводится путем сопоставления времен удерживания хроматографических пиков в стандартном растворе стирола и в анализируемой пробе.

9. Вычисление результатов измерения

Концентрацию стирола в крови (мг/куб. дм) вычисляют по формуле:

                         Х = S  х K,                              i

где:
Х — концентрация стирола в анализируемой пробе, мг/куб. дм; S — площадь пика стирола на хроматограмме, кв. мм или е.о.п.; i
K — градуировочный коэффициент.
За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений Х , Х , расхождение между которыми не должно

max min
превышать значения предела повторяемости r (табл. 2).

                                           n                                              _ 

Результат измерения представляют в виде (Х +/- ДЕЛЬТА) мг/куб. дм, где:

                                                    Х   + Х     _                                          _    max   min     Х - средний результат анализа, мг/куб. дм, Х = -----------;                                                         2 

ДЕЛЬТА — характеристика погрешности, мг/куб. дм, при Р = 0,95, равная:

                                             _                                     сигма х Х                            ДЕЛЬТА = ---------,                                        100

где сигма — относительное значение характеристики погрешности, %.

10. Внутренний контроль качества результатов измерений

Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений — повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность — осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве результатов измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 «ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа». Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с нормативами, не превышающими значений, приведенных в табл. 2 и 3.

Таблица 2

ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ И ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ Р = 0,95

       Наименование       Предел повторяемости    Предел внутрилабораторной       определяемого     (относительное значение       воспроизводимости       компонента и диапазон допускаемого расхождения   (относительное значение          измерений,      между двумя результатами  допускаемого расхождения          мг/куб. дм             параллельных       между двумя результатами                             определений), r , %    измерений, полученными в                                            n        одной лаборатории, но в                                                        разных условиях),                                                                R  , %                                                                       _                                                                           Хl                                                                                            Стирол,                         26,5                      27,6             

от 0,1 до 5,0 вкл.

Таблица 3

ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТОЧНОСТИ, ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

   Наименование        Показатель           Показатель        Показатель       определяемого     повторяемости      воспроизводимости      точности        компонента и      (относительное       (относительное       (границы          диапазон     среднеквадратическое среднеквадратическое  относительной      измерений,         отклонение           отклонение      погрешности при     мг/куб. дм      повторяемости),    воспроизводимости),    вероятности      (мкг/куб. см)       сигма , %            сигма , %         Р = 0,95),                                R                    R           +/- дельта, %                                                                                Стирол, от 0,1          10,0                 13,5              23,0        

до 5,0 вкл.

10.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют содержание исследуемого соединения в градуировочных растворах, которые соответствует началу, середине и концу диапазона измерений. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.

10.2. Контроль повторяемости

Относительное расхождение между результатами двух измерений, выполненных в соответствии с методикой одним оператором при измерении образцов одной и той же рабочей пробы с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов в течение возможно минимального интервала времени, не должно превышать значения предела повторяемости r (табл. 2).

n Повторяемость результатов параллельных определений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

                                    r     Х    + Х                                     n     max    min                     Х    - Х    <= --- х -----------,                      max    min    100        2

где:
r - значение предела повторяемости, %; n
Х , Х - максимальный и минимальный результаты двух параллельных max min
измерений содержания i-го вещества, мг/куб. дм. Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

10.3. Контроль воспроизводимости

Внутренний контроль качества воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

                                     R     _    _                                      _    Х  + Х                         _    _       Хl    1    2                        |Х  - Х | <= --- х -------,                          1    2     100      2

где:
_
Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных 1
измерений, мг/куб. дм;

_
Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных 2
измерений, полученный в других условиях, мг/куб. дм;

R

      _  -  значение   предела   внутрилабораторной   воспроизводимости,   %      Хl (табл. 2).                                                _    _     Расхождение  между  результатами измерений Х  и Х , полученных в разных                                                 1    2 условиях, не должно превышать значений показателя   воспроизводимости   R                                                                          _                                                                          Хl 

при доверительной вероятности Р = 0,95, указанных в табл. 2. Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

10.4. Контроль точности

Контроль точности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольной процедуры, равного разности между результатом контрольного измерения содержания определяемого компонента в пробе, с

_ _ известной добавкой (Х'), в рабочей пробе без добавки (Х) и величиной добавки С (добавка должна составлять не менее 40% от содержания

д
анализируемого компонента в рабочей пробе) с нормативом точности К. Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

                           _    _                          |Х' - Х - С | = K ,                                     д     k

где:
_
Х' - средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе с известной добавкой из 2-х параллельных измерений, мг/куб. дм;

_
Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, мг/куб. дм;

С - величина добавки к пробе, мг/куб. дм. д

                            /дельта   _ 2    дельта   _  2              K = 0,84 х   /(------ х Х)  + (------ х Х') .                         \/   100             100

Качество контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении условия: K <= K.

k
При превышении норматива контроля точности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их. Периодичность контроля воспроизводимости и точности регламентируется в руководстве по качеству лаборатории.

Литература

1. Химическая энциклопедия/Под. ред. Н.С.Зефирова. М.: "Большая российская энциклопедия", 1995. Т. 4.
2. Лазарев Н.В. Вредные вещества в промышленности. Органические вещества: Справочник. М.: "Химия", 1976. Т. 1. С. 113-117.

Методические указания разработаны Пермским научно-исследовательским клиническим институтом детской экопатологии (Т.С.Уланова, Т.Д.Карнажицкая).