УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
9 августа 2006 года
Дата введения:
1 сентября 2006 года
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ СТИРОЛА В ПРОБАХ КРОВИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.2116-06
- Область применения
Методические указания по определению концентрации стирола в крови предназначены для использования Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, работающими в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды. Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием стирола в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды. Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 «ГСОЕИ. Методики выполнения измерений», ГОСТ Р 1.5-92 «ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов». Методика выполнения измерений обеспечивает определение стирола в диапазоне концентраций 0,1-5,0 мкг/куб. см с погрешностью, не превышающей 23%, при доверительной вероятности Р = 0,95.
C6H5CHCH2 Мол. масса 103,7.
Стирол (винилбензол, фенилэтилен) — бесцветная жидкость с резким запахом. Температура кипения: 145 град. С, плотность 0,9059. Растворяется в большинстве органических растворителей, растворимость в воде 0,032% по объему (20 град. С) [1]. Стирол оказывает общетоксическое, сенсибилизирующее, эмбриотропное, раздражающее действия, отрицательно влияет на ЦНС, обладает кумулятивным эффектом [2].
2. Сущность метода
Методика основана на извлечении стирола из крови экстракцией гексаном и анализе экстракта на жидкостном хроматографе. Измерение концентрации стирола выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора. Нижний предел измерения — 0,001 мкг.
Определению не мешают фенол, бензол, толуол, этилбензол, ксилолы, карбоновые кислоты. Длительность анализа, включая пробоподготовку, — 20 мин.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.
3.1. Средства измерений
Жидкостный хроматограф с насосом высокого давления и ультрафиолетовым детектором
Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические ГОСТ 24104-01 Гири Г2-210 ГОСТ 7328-01 Микрошприцы МШ-10 ТУ 2.833.106-00 Колбы мерные вместимостью 50 куб. см ГОСТ 1770-74 Пипетки градуированные вместимостью 1, 5, 10 куб. см ГОСТ 29227-91 Редуктор кислородный ТУ 26-05-236-73 Аттестованная смесь стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,00 мг/куб. см ГСО МСО 0056.1998.
3.2. Вспомогательные устройства
Колонка стеклянная длиной 150 мм и
внутренним диаметром 3,3 мм, заполненная сорбентом Separon SGX C18 зернением 7 мкм
Центрифуга ЦЛМН-Р10-01-"Элекон" ТУ 9443-001-245.23530-97 Экстрактор ПЭ-8 ТУ 3614-001-23050963-97 Дистиллятор ТУ 61-1-721-79 Сушильный шкаф ШСС-80 ТУ 16.531.743-83 Воронки делительные вместимостью 250 куб. см ГОСТ 23932-90 Воронка Шотта (пор 16) ГОСТ 25336-82 Бюксы СВ 19/9 ТУ 92-891.029-91
Пробирки центрифужные пропиленовые
с завинчивающейся крышкой, производство «Sarstedt», Германия.
3.3. Реактивы
Гексан для хроматографии, осч ТУ 6-09-4521-77 Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, осч ТУ 6-09-14-2167-84 Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72 Гидроксид натрия, хч ГОСТ 4328-77 Спирт этиловый ГОСТ Р 51652-2000 Серная кислота ГОСТ 4204-77 Калия дихромат, хч ГОСТ 4220-75
Раствор гепарина в ампулах (5000 ед. в 1 куб. см).
3.4. Материалы
Гелий газообразный ТУ 51-940-80.
3.5. Растворы
Элюент для хроматографии
Раствор гидроксида натрия, 10%-й
Раствор дихромата калия в серной кислоте, 3%-й. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования, химреактивов и материалов, по метрологическим и техническим характеристикам не уступающих перечисленным.
4. Требования к безопасности
4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.1.005-88. 4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79, противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и меры безопасности, указанные в «Руководстве по правилам эксплуатации прибора».
5. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и владеющие техникой жидкостно-хроматографического анализа.
6. Условия измерений
6.1. При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия: — температура воздуха 15-25 град. С;
— атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.; — влажность воздуха не более 80% при температуре 25 град. С. 6.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.
7.1. Подготовка посуды
Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе двухромовокислого калия в серной кислоте, отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 град. С.
7.2. Приготовление растворов
7.2.1. Элюент для хроматографии. Смешивают 60 куб. см ацетонитрила с 40 куб. см дистиллированной воды. Подвижную фазу фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия в течение 3-5 мин. со скоростью 50-60 куб. см/мин. 7.2.2. Раствор гидроксида натрия 10%-й. Вносят в мерный стакан с меткой на 100 куб. см 10 г гидроксида натрия, прибавляют 90 куб. см дистиллированной воды и перемешивают содержимое стакана до полного растворения гидроксида натрия. Срок хранения раствора — 30 дней при 4 град. С. 7.2.3. Раствор двухромовокислого калия в серной кислоте 3%-й. Растворяют 3,0 г двухромовокислого калия в 53 куб. см концентрированной серной кислоты (плотность 1,84). Использовать свежеприготовленный раствор.
7.3. Подготовка хроматографической колонки
Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюирующую жидкость, подготовленную в соответствии с п. 7.2.1., со скоростью 0,6 куб. см/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.
7.4. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме от концентрации стирола в крови, устанавливают по шести сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из трех растворов, готовят разбавлением аттестованной смеси стирола в этиловом спирте (растворы А, Б). 7.4.1. Приготовление раствора А: 1 куб. см аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор. 7.4.2. Приготовление раствора Б: 10 куб. см аттестованной смеси стирола в этиловом спирте с концентрацией 1,0 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Используют свежеприготовленный раствор. 7.4.3. В соответствии с п. 8 проводят анализ образца крови на отсутствие стирола. Объем образца крови для приготовления градуировочных смесей должен быть не менее 12 куб. см. Образец крови с гепарином (из расчета 0,05 куб. см гепарина на 2 куб. см крови) может храниться 2 дня при температуре 4 град. С. 7.4.4. Для установления градуировочной характеристики в 2 куб. см крови добавляют 0,05 куб. см раствора гепарина, вносят раствор А или Б в соответствии с табл. 1 и помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 0,2 куб. см 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 куб. см гексана. Содержимое воронки перемешивают экстрактором со скоростью 2500 об./мин. в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с крышкой и центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 куб. мм вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме прибора.
Таблица 1
РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ СТИРОЛА В КРОВИ
Номер раствора 1 2 3 4 5 6
Объем раствора А, куб. мм 20,0 40,0 100,0 — — — (С = 0,01 мг/куб. см)
Объем раствора Б, куб. мм — — — 20,0 50,0 100,0 (С = 0,10 мг/куб. см)
Массовая концентрация стирола 0,1 0,2 0,5 1,0 2,5 5,0 в крови, мг/куб. дм
Режим работы хроматографа:
колонка стеклянная длиной 150 мм и внутренним диаметром 3,3 мм, заполненная сорбентом Separon SGX С18;
подвижная фаза — ацетонитрил/вода в соотношении 60:40; скорость подвижной фазы — 0,6 куб. см/мин.; длина волны УФ-детектора — 254 нм;
время выхода стирола в заданных условиях — 6 мин. Градуировочную характеристику устанавливают с помощью градуировочного коэффициента, который рассчитывают по формуле:
n SUM C / S i=1 i i K = -----------, n
где:
C — заданная концентрация стирола в градуировочной смеси, мг куб./дм; i
S — среднее значение трех измерений площади пика, кв. мм или единицы i
оптической плотности (е.о.п.);
n — количество градуировочных смесей (n = 6). Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.
7.5. Отбор проб
Отбор проб венозной крови в объеме 4 куб. см производят в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно вносят 0,1 куб. см раствора гепарина. Срок хранения проб в холодильнике — не более 2-х суток.
8. Выполнение измерений
Проводят два параллельных измерения образца крови: 2 куб. см крови помещают в делительную воронку, в которую добавляют 40 куб. см дистиллированной воды, 0,2 куб. см 10%-го раствора щелочи NaOH и 2 куб. см гексана. Перемешивают содержимое воронки экстрактором со скоростью 2500 об./мин. в течение 45 с. После расслоения жидкостей переносят гексановый экстракт в центрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой и центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 1500 об./мин. Аликвотную часть экстракта в количестве 10 куб. мм вводят в колонку хроматографа и анализируют в рабочем режиме хроматографа, указанном в п. 7.4.4. Идентификация хроматографического пика стирола проводится путем сопоставления времен удерживания хроматографических пиков в стандартном растворе стирола и в анализируемой пробе.
9. Вычисление результатов измерения
Концентрацию стирола в крови (мг/куб. дм) вычисляют по формуле:
Х = S х K, i
где:
Х — концентрация стирола в анализируемой пробе, мг/куб. дм; S — площадь пика стирола на хроматограмме, кв. мм или е.о.п.; i
K — градуировочный коэффициент.
За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений Х , Х , расхождение между которыми не должно
max min
превышать значения предела повторяемости r (табл. 2).
n _
Результат измерения представляют в виде (Х +/- ДЕЛЬТА) мг/куб. дм, где:
Х + Х _ _ max min Х - средний результат анализа, мг/куб. дм, Х = -----------; 2
ДЕЛЬТА — характеристика погрешности, мг/куб. дм, при Р = 0,95, равная:
_ сигма х Х ДЕЛЬТА = ---------, 100
где сигма — относительное значение характеристики погрешности, %.
10. Внутренний контроль качества результатов измерений
Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений — повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность — осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве результатов измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 «ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа». Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с нормативами, не превышающими значений, приведенных в табл. 2 и 3.
Таблица 2
ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ И ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ Р = 0,95
Наименование Предел повторяемости Предел внутрилабораторной определяемого (относительное значение воспроизводимости компонента и диапазон допускаемого расхождения (относительное значение измерений, между двумя результатами допускаемого расхождения мг/куб. дм параллельных между двумя результатами определений), r , % измерений, полученными в n одной лаборатории, но в разных условиях), R , % _ Хl Стирол, 26,5 27,6
от 0,1 до 5,0 вкл.
Таблица 3
ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТОЧНОСТИ, ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ
Наименование Показатель Показатель Показатель определяемого повторяемости воспроизводимости точности компонента и (относительное (относительное (границы диапазон среднеквадратическое среднеквадратическое относительной измерений, отклонение отклонение погрешности при мг/куб. дм повторяемости), воспроизводимости), вероятности (мкг/куб. см) сигма , % сигма , % Р = 0,95), R R +/- дельта, % Стирол, от 0,1 10,0 13,5 23,0
до 5,0 вкл.
10.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют содержание исследуемого соединения в градуировочных растворах, которые соответствует началу, середине и концу диапазона измерений. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.
10.2. Контроль повторяемости
Относительное расхождение между результатами двух измерений, выполненных в соответствии с методикой одним оператором при измерении образцов одной и той же рабочей пробы с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов в течение возможно минимального интервала времени, не должно превышать значения предела повторяемости r (табл. 2).
n Повторяемость результатов параллельных определений признают удовлетворительной, если выполняется условие:
r Х + Х n max min Х - Х <= --- х -----------, max min 100 2
где:
r - значение предела повторяемости, %; n
Х , Х - максимальный и минимальный результаты двух параллельных max min
измерений содержания i-го вещества, мг/куб. дм. Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.
10.3. Контроль воспроизводимости
Внутренний контроль качества воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:
R _ _ _ Х + Х _ _ Хl 1 2 |Х - Х | <= --- х -------, 1 2 100 2
где:
_
Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных 1
измерений, мг/куб. дм;
_
Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных 2
измерений, полученный в других условиях, мг/куб. дм;
R
_ - значение предела внутрилабораторной воспроизводимости, % Хl (табл. 2). _ _ Расхождение между результатами измерений Х и Х , полученных в разных 1 2 условиях, не должно превышать значений показателя воспроизводимости R _ Хl
при доверительной вероятности Р = 0,95, указанных в табл. 2. Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.
10.4. Контроль точности
Контроль точности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольной процедуры, равного разности между результатом контрольного измерения содержания определяемого компонента в пробе, с
_ _ известной добавкой (Х'), в рабочей пробе без добавки (Х) и величиной добавки С (добавка должна составлять не менее 40% от содержания
д
анализируемого компонента в рабочей пробе) с нормативом точности К. Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:
_ _ |Х' - Х - С | = K , д k
где:
_
Х' - средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе с известной добавкой из 2-х параллельных измерений, мг/куб. дм;
_
Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, мг/куб. дм;
С - величина добавки к пробе, мг/куб. дм. д
/дельта _ 2 дельта _ 2 K = 0,84 х /(------ х Х) + (------ х Х') . \/ 100 100
Качество контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении условия: K <= K.
k
При превышении норматива контроля точности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их. Периодичность контроля воспроизводимости и точности регламентируется в руководстве по качеству лаборатории.
Литература
- Химическая энциклопедия/Под. ред. Н.С.Зефирова. М.: "Большая российская энциклопедия", 1995. Т. 4.
- Лазарев Н.В. Вредные вещества в промышленности. Органические вещества: Справочник. М.: "Химия", 1976. Т. 1. С. 113-117.
Методические указания разработаны Пермским научно-исследовательским клиническим институтом детской экопатологии (Т.С.Уланова, Т.Д.Карнажицкая).
