<Письмо> Роспотребнадзора от 13.12.2013 N 01/14260-13-32 “О направлении рекомендаций ВОЗ по лабораторным исследованиям ближневосточного респираторного синдрома коронавируса”

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

ПИСЬМО
от 13 декабря 2013 г. N 01/14260-13-32

О НАПРАВЛЕНИИ РЕКОМЕНДАЦИЙ ВОЗ ПО ЛАБОРАТОРНЫМ ИССЛЕДОВАНИЯМ БЛИЖНЕВОСТОЧНОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА КОРОНАВИРУСА

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека направляет рекомендации Всемирной организации здравоохранения “Лабораторные исследования ближневосточного респираторного синдрома коронавируса” для использования в работе.

Вр.и.о. руководителя
А.Ю.ПОПОВА

ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БЛИЖНЕВОСТОЧНОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА КОРОНАВИРУСА

Межсессионные рекомендации
Сентябрь 2013

1. Введение

Целью данного документа является предоставление лабораториям и вовлеченным в процесс лабораторных исследований посредникам межсессионных рекомендаций по ближневосточному респираторному синдрому Коронавируса (БРС-КВ). Всемирная организация здравоохранения регулярно публикует обновляемые сведения о текущем положении заболеваемости БРС-КВ на: http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/en/. Рекомендации, подготовленные ВОЗ, основаны на текущих знаниях. Они были пересмотрены лабораторными экспертами, включая специалистов, которые имеют опыт обращения с данным вирусом и другими коронавирусами, и квалифицированных специалистов в области диагностических проб на коронавирусы. ВОЗ тщательно отслеживает исследования, относящиеся к этому вирусу, и пересмотрит данные ею рекомендации, если это будет необходимо. В случае если нововведения не появятся, срок действия данного документа истечет 28 февраля 2014 г.

2. Показания для обследования

ВОЗ рекомендует, чтобы практикующие врачи, врачи-эпидемиологи и лабораторные научные работники для выявления заболевания следовали схеме опроса, разработанной ВОЗ и опубликованной здесь: . int/csr/disease/coronavirus_infections/case_definition/en/index.html, которая будет при необходимости обновляться. Тестирование на другие патогенные заболевания, используя лабораторные процедуры, как это установлено руководствами местного уровня по приобретенной пневмонии, должно проводиться в рабочем порядке, но, не задерживая при этом тестирование на БРС-КВ. Примеры другой этиологии болезни, включают: пневмококк, ХИБ-инфекция, легионелла пневмобилия, вирусы гриппа и синцитиальный респираторный вирус человека.

3. Хранение и транспортировка проб

Когда бы ни были взяты пробы для исследования, необходимо следовать руководству по инфекционному контролю. ВОЗ разработано специальное руководство, которое доступно по следующей ссылке: http://www.who.int/ csr/disease/coronavirus_infections/IPCnCoVguidance_06May13.pdf. Забор проб лучше производить из нижних дыхательных путей, где находятся содержащие наивысшие концентрации вируса материалы, такие как бронхоальвеолярные выделения, мокротные и трохейные материалы. Недавние сообщения о случаях заболеваемости инфекцией БРС-КВ в Саудовской Аравии (3) подтвердили также важность при выявлении вируса забора проб из верхних дыхательных путей, таких как мазки из носо- и ротоглотки. При возможности, необходимо забирать пробы как из верхних, так и из нижних дыхательных путей. Для того чтобы увеличить вероятность обнаружения вируса, в течение курса лечения необходимо забирать множество проб с различных участков тела пациента. Даже после первичного обнаружения вируса настоятельно рекомендуется продолжать забор проб и их исследование, так как это позволит улучшить знания в области продолжительности бессимптомного вирусовыделения. Вирус обнаружен в моче и кале, но на предыдущем уровне он был найден в нижних дыхательных путях (1). На сегодняшний день, существует мало информации о значении цельной крови при заборе проб для выявления БРС-КВ. Необходимо забирать сыворотку крови. Парные пробы более предпочтительны, однако одинарная проба тоже ценна. Забор сыворотки для парных проб должен производиться спустя 14-21 день, при условии, что первая проба была взята в течение первой недели заболевания. Если возможна только одинарная проба, она должна быть произведена минимум через 14 дней после появления симптомов. В Таблице 1 перечислены виды проб, которые могут быть взяты, а также нормы по их хранению, транспортировке.

       Тип материала       Определенная    Транспортировка    Категория при                                среда при     до лаборатории   перевозке опасных                           транспортировке                      материалов                                                                                     Сыворотка               нет             4 °С <>          Биологические                                               Если период       препараты,                                                  после взятия      Категория Б                                                 пробы > 48 часов,                                                             необходима                                                                    заморозка и                                                                   транспортировка                                                               на сухом льду                                                                                                       Бронхоальвеолярные      нет             аналогично        аналогично         

                          стерильный                                                                    физиологический                                                               раствор, если                                                                 проба на                                                                      бактериальные                                                                 культуры                                                                                                                            Сыворотка для           нет             4 °С <> или      аналогично          серологического                         заморозить и                          исследования:                           перевозить на                         Парные пробы с первым                   сухом льду                           

забором предпочтительно в первую неделю болезни и вторым забором двумя- тремя неделями позже. Одинарная проба должна быть взята минимум через 14 дней после проявления симптомов.

<*> С использованием водного льда или путем холодного обертывания, по обстоятельствам.

Пробы должны быть доставлены в лабораторию как можно быстрее. Важность надлежащего обращения при транспортировке не может быть переоценена. Если существует вероятность задержек при доставке проб в лабораторию, настоятельно рекомендуется пробы заморозить, предпочтительно при -80 °С, и транспортировать на сухом льду. Однако важно избегать повторного замораживания и размораживания проб. Сыворотка должна быть выделена из цельной крови и может храниться при 4 °С, а также может быть заморожена до -20 °С и ниже и транспортироваться на сухом льду. Необходимо избегать хранения респираторных и сывороточных проб в домашних морозильных камерах без образования наледи, в связи с сильными температурными колебаниями в них. Перевозка проб в пределах государственных границ должна отвечать действующим федеральным нормативам. Международная транспортировка проб БРС-КВ должна отвечать международным нормативам, как описано в “Руководстве ВОЗ по транспортировке патогенных материалов 2013-2014”, доступном по ссылке: http://www.who.int/ihr/ publications/who_hse_ihr_20100801/en/index.html.

4. Алгоритм выявления БРС-КВ с помощью
рвОТ-ПЦР и секвенирования

Порядок подтверждения случаев инфекции БРС-КВ основан на выявлении уникальных цепочек вирусной РНК путем осуществления в режиме реального времени полимеразной цепной реакции с обратной транскриптацией (рвОТ ПЦР) с подтверждением с помощью секвенирования нуклеиновой кислоты, если это необходимо. Ниже приведены результаты серологического исследования БРС-КВ. При определенных условиях, но не в случае рутинной диагностики, лаборатории с соответствующим опытом и системами сдерживания распространения инфекции могут предпринять попытку выделить вирус из клетки. Процедуры по выделению вируса не подпадают под текущую редакцию предлагаемых рекомендаций. При наличии данного вируса все исследования должны проводиться в соответствующим образом оборудованных лабораториях персоналом, обученным правилам техники безопасности. Межсессионные рекомендации ВОЗ по системе управления лабораторными биорисками при работе с БРС-КВ опубликованы по ссылке: http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/NovelCorona virus_InterimRecommendationsLaboratoryBiorisk_190213/en/index.html. Отдельные страны – члены ВОЗ будут решать, какая из лабораторий, если таковые имеются, будет проводить данные исследования. Было разработано три метода рвОТ-ПЦР для рутинного выявления БРС-КВ, а их детали были опубликованы. Это следующие методы: исследование, нацеленное на изменение гена Е протеина (upE) (4), и исследование, направленное на открытую рамку считывания 1б (ОРС 1б) (4) и открытую рамку считывания 1а (ОРС 1а) (5). Исследование upE считается высокочувствительным и, поэтому, является рекомендуемым при скрининге, также как и ОРС 1а исследование, которое обладает той же чувствительностью. ОРС 1б исследование считается менее чувствительным по отношению к ОРС 1а. Источники (4) и (5) содержат подробные описания по осуществлению данных исследований. Кроме того, в Центрах по Контролю и Профилактике Заболеваний США (ЦКПЗ) было разработано тестирование рвОТ-ПЦР, направленное на БРС-КВ нуклеокапсид (Н) белкового гена, которое может служить дополнением к upE и ОРС 1а исследованиям для скрининга и подтверждения. Было установлено 2 участка генома нового коронавируса, подходящих для секвенирования, для более точного подтверждения диагноза. Они находятся в РНК-зависимой РНК полимеразе (РзРп) и в (Н) генах (5). Дальнейшее описание данных исследований доступно на сайте Института Вирусологии, Бонн, Германия: http://www.virology-bonn.de/index.php?id=40. Дальнейшую информацию о данных исследованиях, сформулированную американскими ЦКПЗ, можно получить у Декана Д.Ердмана ([email protected]). Рисунок 1 показывает алгоритм проведения исследования при подозрении на случай заболеваемости БРС-КВ с помощью рвОТ ПЦР.

Рисунок 1. Алгоритм проведения исследования на БРС-КВ методом рвОТ-ПЦР

Результаты исследования на БРС-КВ лабораторий с ограниченным опытом в данных исследованиях должны подтверждаться лабораториями с большим опытом обработки образцов, содержащих этот вирус. ВОЗ может оказывать помощь государствам-членам в поиске лабораторий, способных предоставить такую услугу. Кроме того, лаборатории, возможно, будут заинтересованы в перепроверке своих положительных результатов методом повторного извлечения нуклеиновой кислоты и повторного тестирования образцов. При противоречии двух анализов рвОТ-ПЦР, направленных на уникальное местоположение в геноме БРС-КВ, необходимо проведение секвенирования ампликона, полученного из соответствующего ОТ-ПЦР анализа. Эти данные секвенирования, в дополнение к подтверждению присутствия вируса, могут также дать ценную информацию, которая может помочь в понимании происхождения вируса и способов его распространения. Поэтому рекомендуется секвенировать максимально возможное количество нуклеиновых кислот БРС-КВ из положительных образцов. Известны случаи четырех коронавирусов человека с поражением дыхательных путей легкой и средней тяжести. Это бэта-коронавирусы hCoV-OC43 и hCoV-HKU1, и альфа-коронавирусы hCoV-229Е и hCoV-NL63. Коммерческий многоканальный тест ПЦР для респираторных возбудителей в состоянии определить эти вирусы. Важно положительные результаты данных тестов ошибочно не связать с БРС-КВ. Серия отрицательных результатов не должна полностью исключать вероятность инфицирования. Ниже описан ряд факторов, которые могут привести к ложно-отрицательным результатам: – низкое качество образца;
– образец был взят либо слишком поздно, либо слишком рано; – образец был взят и транспортирован не должным образом; – технические причины, возникающие при тестировании, например, мутация ПЦР ингибирования. Если получен отрицательный результат у пациентов с высоким индексом подозрения на заражение коронавирусом, то необходимо взять и проверить дополнительные образцы. Лаборатории также могут рассмотреть вопрос о направлении одного или более отрицательных образцов в зарубежные лаборатории для подтверждения результатов. Чтобы считать случай лабораторно подтвержденным, должно быть выполнено одно из следующих условий: – положительный результат ПЦР как минимум для двух разных клеток в геноме БРС-КВ или
– один положительный результат ПЦР для конкретной клетки в геноме БРС-КВ и дополнительный секвенированный другой ПЦР продукт, подтверждающий принадлежность к известной последовательности БРС-КВ. Случай положительного результата ПЦР для одной конкретной клетки без дальнейшего тестирования, но с динамикой потенциального воздействия и последовательных клинических признаков, считается вероятным случаем.

5. Серологическое исследование на БРС-КВ

Детали двух исследований по иммунофлюоресценции для выявления антител к БРС-КВ были опубликованы в источнике (5). Данные исследования, наравне с реакцией сывороточной нейтрализации, были использованы в случаях с больными, лечащимися в Немецком госпитале, с высокой чувствительностью и специфичностью (7). Также были проведены исследования по выявлению антител к БРС-КВ с использованием технологии белковой микроматрицы, и результаты данных исследований опубликованы в источнике (8). Они оказались очень индивидуальными. Американские ЦКПЗ разработали двухступенчатый подход к выявлению антител к БРС-КВ, основанный на скрининговом исследовании при помощи рекомбинантного нуклеокапсида (Н) белкового фермент-связанного иммуносорбентного исследования (ELISA), следующего за контрольным тестом с использованием непрямой реакции флюоресцирующих цельно-вирионных антител (IFA) или реакции нейтрализации. Все серологические тесты, разработанные на сегодняшний день, срабатывали для небольшого количества проб в фазе выздоровления при БРС-КВ, и еще не представлялась возможность сравнить действенность разных методов. В данное время инструменты для проведения серологического теста недоступны. Рекомендуется при любом положительном результате одинарного серологического исследования, подтвердить данные с помощью реакции нейтрализации. Хотя такое оборудование, как ELISA, используемое для исследования проб, может в конечном итоге стать повсеместно используемым в лабораториях множества стран, нейтрализационные исследования все равно необходимо будет проводить в специализированных лабораториях высококвалифицированным персоналом. На сегодняшний день, нет единого мнения об интерпретации результатов серологических тестов у конкретных пациентов. Данные методы были подтверждены с использованием ограниченного количества проб сыворотки крови в фазе выздоровления, поэтому при подтверждении заболевания на основании только этого теста, разумно оценивать результаты с осторожностью. Таким образом, на настоящий момент, в случаях, когда исследовательские лаборатории сообщают о положительном серологическом тесте без проведения ПЦР теста или секвенирования, подтверждение вероятного заболевания БРС-КВ наступает только тогда, когда инфекция проявляет себя в других условиях и тестах. Итоговая классификация случаев заболевания будет зависеть от клинической и эпидемиологической информации, объединенной с результатами лабораторных исследований. Процедура определения заболеваемости, разработанная ВОЗ, находится по ссылке: http://www.who.int/csr/disease/ coronavirus_infections/case_definition/en/index.html. Однако серологические тесты могут предоставить ценную информацию об уровне заболеваемости населения, поэтому поддерживается проведение массовых серологических исследований, особенно внутри известных групп риска. Государства – члены ВОЗ и лаборатории, желающие проводить серологическое тестирование для БРС-КВ, должны связаться с институтом, разработавшим вышеизложенные методы, для обсуждения наиболее подходящего решения для соответствия требуемым условиям. При необходимости, ВОЗ может содействовать общению между государствами-членами и специализированными лабораториями. Содействуется дальнейший сбор и тестирование сыворотки крови у людей с подтвержденным диагнозом и у людей, подверженных заболеванию, поскольку это помогает общему пониманию БРС-КВ инфекции, а также развитию методов исследования, существующих на сегодняшний день.

6. Реагенты

Поскольку основной порядок проб для исследования рвОТ-ПЦР на БРС-КВ опубликован, лаборатории могут заказать реагенты у своих обычных поставщиков. Или лаборатории могут проконсультироваться по ссылке: http://www.virology-bonn.de/index.php?id=40. Положительные контрольные материалы для upE и 1а специфического рвОТ-ПЦР исследования могут быть заказаны на портале Европейского Вирусного Архива: http://www.european-virus-archive.com/Portal/produit.php?ref=1386&id_rubrique=9. Государства-члены, нуждающиеся в помощи при приобретении контрольных материалов для рвОТ-ПЦР исследования, могут обратиться за помощью к ВОЗ. Американские ЦКПЗ произвели диагностический комплект для определения БРС-КВ с помощью рвОТ-ПЦР и сделают его доступным с ограниченными условиями. Более подробную информацию спрашивайте у Декана Д.Эрдмана: ([email protected]).

7. Глобальная сеть лабораторий

Доступ к своевременным и точным лабораторным тестам для случаев, требующих исследования, необходимая часть наблюдения при возникновении инфекции. Все страны, желающие провести первичные или подтверждающие исследования, должны иметь доступ к надежному тестированию в национальных или международных лабораториях. ВОЗ может содействовать доступу государств-членов в международные лаборатории, если такая необходимость возникает. Государства-члены могут подписать с международными лабораториями Соглашение на передачу имущества, распространяющее свое действие на такие области отношений, как владение клиническими материалами и правами на интеллектуальную собственность, до отправления образцов на обследование.

8. Сообщения о случаях заболевания и результаты тестов

Лаборатории должны уведомить относящиеся к общественному здоровью власти в своей стране незамедлительно после получения ими образца на БРС-КВ и до проведения любых исследований. Все результаты тестирования, и положительные, и отрицательные, должны быть немедленно сообщены властям. Государствам-членам необходимо незамедлительно уведомить ВОЗ о первично-положительном результате лабораторного исследования, даже до завершения всех исследований и итогового подтверждения. Детали проведения конкретного исследования должны быть включены в уведомительное сообщение.

9. Список литературы

1. К.Дростен и др. Клинические особенности и вирусологический анализ случаев заболевания Ближневосточным респираторным синдромом коронавируса. Журнал “Lancet”, 2013. Опубликовано в сети Интернет 17 июня. http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(13)70154-3
2. Б.Гиери и др. Клинические особенности и диагностирование двух случаев заболевания Ближневосточным респираторным синдромом коронавируса: отчет о внутрибольничном заражении. Журнал “Lancet”, 2013. Опубликовано в сети Интернет 29 мая. http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(13)60982-4
3. А.Ассири. Эпидемиологические, демографические и клинические характеристики 47 случаев заболевания Ближневосточным респираторным синдромом коронавируса в Саудовской Аравии: наглядное исследование. Журнал “Lancet”, 2013. Опубликовано в сети Интернет 26 июля. http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(13)70204-4
4. В.Корман и др. Выявление нового коронавируса человека в реальном времени методом полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой. Журнал “Eurosurveillance”, 2012. 17:20285. http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=20285
5. В.Корман и др. Исследования для лабораторного подтверждения заболеваний новым коронавирусом (hCoV-EMC) человека. Журнал “Eurosurveillance”, 2012. 17:20334. http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=20334
6. С.Ван Богемен и др. Геномная характеристика вновь открытого коронавируса обусловленного синдромом острой дыхательной недостаточности у людей. Журнал “mBio”, 2012. Опубликовано в сети Интернет 20 ноября. 10.1128/mBio.00473-12
7. Ю.Буххолц и др. Контактное изучение случаев заболевания коронавирусом человека у лечащихся в Немецком госпитале. Октябрь-ноябрь 2012. Журнал “Eurosurveillance”, 2013. 18:20406. http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=20406
8. К.Реускен и др. Специфическая серология развивающегося коронавируса человека с использованием протеинового микрочипа. Журнал “Eurosurveillance”, 2013. 18:20441. http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=20441