«Определение массовой концентрации фенола в биосредах (моча) газохроматографическим методом. Методические указания. МУК 4.1.2107-06» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 09.08.2006)

УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
9 августа 2006 года

Дата введения:
1 сентября 2006 года

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕНОЛА В БИОСРЕДАХ (МОЧА) ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.2107-06

1. Область применения

Методические указания по определению концентраций химических веществ в биологических средах предназначены для использования Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, работающими в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды. Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием органических соединений в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды. Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 «ГСОЕИ. Методики выполнения измерений», ГОСТ Р 1.5-92. «ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов». Методика анализа обеспечивает выполнение измерений массовой концентрации фенола в моче в диапазоне концентраций: от 0,04 до 0,4 мкг/куб. см с погрешностью 10,0% при доверительной вероятности 0,95.

Фенол Молекулярная масса 128,56. C6H5OH

     Фенол  - бесцветные  кристаллы  с характерным  запахом,  Т     - 181,75                                                               кип. 

град. С. Растворим в воде и органических растворителях. Является сильным нейротоксином, поражает печень, почки, проникает через кожу [1].

2. Сущность метода

Методика основана на предварительном переводе фенола в фенилацетат с помощью уксусного ангидрида в щелочной среде, концентрировании продукта дериватизации из биологического материала (моча) экстракцией метиленхлоридом и последующем газохроматографическом анализе экстракта. Необходимость превращения фенола в производные вызвана тем, что прямой газохроматографический анализ фенолов, особенно следовых количеств, осложнен высокой полярностью фенольных соединений и низким давлением их паров. Улучшить газохроматографические свойства фенола можно путем превращения их в менее полярные соединения. Выполнение измерений массовой концентрации фенола проводят методом газовой хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора. Определению не мешают о-, м-, п-крезолы, ксиленолы, хлорфенолы в количествах, не превышающих верхнюю границу измеряемых концентраций фенола. Длительность анализа, включая экстракцию пробы, — 20 мин.

3. Средства измерений, вспомогательные
устройства, материалы и реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и растворы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными или лучшими метрологическими и техническими характеристиками.

3.1. Средства измерений

Хроматограф газовый с пламенно-ионизационным детектором

 Секундомер "Агат"                                         ТУ 25-1894.003-90 Микрошприцы МШ-10                                         ТУ 2.833.106-00 Весы аналитические ВЛР-200                                ГОСТ 24104-01 Разновесы Г2-210                                          ГОСТ 7328-01 Линейка измерительная                                     ГОСТ 427-75 Лупа измерительная                                        ГОСТ 25706-83 Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 куб. см      ГОСТ 1770-74 Пипетки вместимостью 5, 10 куб. см                        ГОСТ 29227-91.

3.2. Вспомогательные устройства

Хроматографическая колонка стеклянная длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм

 Бидистиллятор стеклянный БС                                ТУ 25-11.1592-81 Редуктор кислородный                                       ТУ 26-05-236-73 Центрифуга СМ-4, 3000 об./мин. Бюксы стеклянные                                           ГОСТ 25336-82 Воронка делительная                                        ГОСТ 23932-90.

3.3. Материалы

 Гелий в баллоне                                             ТУ 51-940-80 Водород технический                                         ГОСТ 3022-80 Воздух в баллоне                                            ГОСТ 17433-80.

3.4. Реактивы

3% OV-1 на хроматоне N-супер фракции
0,16-0,20 мм — неподвижная фаза для
заполнениях роматографической колонки

 Фенол, чда                                          ТУ 6-09-5303-86 Нафталин, хч                                        ТУ 6-09-2200-77 Натрия карбонат, чда                                ГОСТ 83-79 Уксусный ангидрид, ч                                МРТУ 6-09-5708-68 Ацетон, осч                                         ТУ 2633-004-11291058-94 Метиленхлорид, хч                                   ТУ 6-09-2662-77 Серная кислота, осч                                 ГОСТ 14262-78 Калия дихромат, чда                                 ГОСТ 4220-75.

3.5. Растворы

Раствор калия дихромата, 3%-й.

4. Требования к безопасности

4.1. При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76. 4.2. При работе необходимо соблюдать «Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях» (утверждены МЗ СССР 20.12.82) и «Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением» (утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87). 4.3. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88. 4.4. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.

6. Условия измерений

6.1. При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия: — температура воздуха (20 +/- 5) град. С; — атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.; — влажность воздуха не более 80% при температуре 25 град. С. 6.2. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, подготовка хроматографической колонки, приготовление аттестованных смесей, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка посуды

Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе дихромата калия в серной кислоте (3 г дихромата калия на 100 куб. см концентрированной серной кислоты), отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть бидистиллированной водой и просушить при температуре 120 град. С.

7.2. Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой, устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелий) с расходом 30 куб. см/мин. при температуре 250 град. С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

7.3. Приготовление аттестованных смесей

Для построения градуировочного графика собирают мочу, не содержащую исследуемого компонента, и готовят серию рабочих аттестованных растворов. Исходный аттестованный раствор фенола. В мерную колбу объемом 25 куб. см, содержащую ацетон в объеме 15 куб. см, вводят 10 мг фенола и объем доводят до метки ацетоном. Весовое содержание определяемого вещества в исходном аттестованном растворе составляет 400 мкг/куб. см. Срок хранения — 5 ч. Исходный аттестованный раствор нафталина. В мерную колбу объемом 25 куб. см, содержащую ацетон в объеме 15 куб. см, вводят 10 мг нафталина и объем доводят до метки ацетоном. Весовое содержание определяемого вещества в исходном аттестованном растворе составляет 400 мкг/куб. см. Срок хранения — 3 дня.

7.4. Определение градуировочных коэффициентов фенола по отношению к внутреннему стандарту

Рабочий аттестованный раствор. В мерную колбу объемом 50 куб. см, содержащую 30 куб. см мочи, вносят объемы исходных аттестованных растворов фенола и нафталина согласно табл. 1. Содержимое колбы доводят до метки мочой.

Таблица 1

РАБОЧИЕ АТТЕСТОВАННЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНЫХ КОЭФФИЦИЕНТОВ ФЕНОЛА ПО ОТНОШЕНИЮ К ВНУТРЕННЕМУ СТАНДАРТУ

Номер смеси 1 2 3 4 5 6

Фенол, 0,005 0,01 0,02 0,025 0,04 0,05 объем исходного аттестованного раствора (400 мкг/куб. см), куб. см

Концентрация фенола, мкг/куб. см 0,04 0,08 0,16 0,20 0,32 0,40

Нафталин, 0,10 0,09 0,07 0,05 0,03 0,02 объем исходного аттестованного раствора (400 мкг/куб. см), куб. см

Концентрация нафталина, мкг/куб. см 0,80 0,72 0,56 0,40 0,24 0,16

Для определения градуировочных коэффициентов в делительную воронку объемом 250 куб. см вносят 50 куб. см рабочего аттестованного раствора и добавляют 2 г кристаллического карбоната натрия. Плавным покачиванием перемешивают содержимое воронки, затем вводят в воронку 0,3 куб. см уксусного ангидрида и встряхивают в течение 0,5 мин. для перевода фенола в уксуснокислый эфир. Продукт ацилирования дважды экстрагируют метиленхлоридом порциями по 2,5 куб. см в течение 2 мин. Экстракты центрифугируют в течение 10 мин. После удаления белка объединенные органические вытяжки помещают в бюксу и упаривают под ИК-лампой до 1 куб. см. В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 10 мм каждого экстракта рабочего аттестованного раствора и анализируют в условиях: температура термостата колонок — 110 град. С; температура испарителя — 170 град. С;
температура детектора — 170 град. С;
расход газа-носителя (гелий) — 30 куб. см/мин.; скорость диаграммной ленты — 240 мм/ч;

время удерживания ацетата фенола — 3 мин. 20 с;

нафталина — 6 мин. На полученной хроматограмме определяют высоты или площади пиков определяемого компонента и внутреннего стандарта и по средним результатам из 6 серий рассчитывают градуировочные коэффициенты.

     Значение градуировочного коэффициента К     вычисляют по формуле:                                            i/ст                                      S   х Q                                       ст    i                              К     = --------,                               i/ст   S  х Q                                       i    ст

где:
S , S — площади пиков исследуемого компонента (фенилацетата) и i ст
внутреннего стандарта (нафталина), кв. мм;

     Q ,   Q     -   количество  исследуемого  компонента  (фенилацетата)  и      i     ст 

внутреннего стандарта (нафталина), мкг.

По результатам 7 измерений определяется среднее значение

 градуировочного  коэффициента  К     и  строится  градуировочный  график  в                                 i/ст координатах градуировочный коэффициент - отношение площадей пиков S  / S  .                                                                    i    ст 

Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.

7.5. Отбор проб

Отбор проб мочи в объеме не менее 200 куб. см производят в тщательно вымытый стеклянный сосуд с притертой пробкой. Анализ мочи проводить сразу или хранить в холодильнике не более 12 ч после отбора пробы.

8. Выполнение измерений

Пробу мочи в объеме 50 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, добавляют внутренний стандарт — нафталин 0,1 куб. см (исходный аттестованный раствор 400 мкг/куб. см) и 2 г кристаллического карбоната натрия. Плавным покачиванием перемешивают содержимое воронки, затем вводят в воронку 0,3 куб. см уксусного ангидрида и встряхивают в течение 0,5 мин. для перевода фенола в уксуснокислый эфир. Продукт ацилирования дважды экстрагируют метиленхлоридом порциями по 2,5 куб. см в течение 2 мин. Экстракты объединяют и центрифугируют в течение 10 мин. После удаления белка объединенные органические вытяжки помещают в бюксу и упаривают под ИК-лампой до 1 куб. см. Полученный экстракт хроматографируют и проводят количественное определение анализируемого соединения в подготовленной пробе методом внутреннего стандарта. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб мочи. Условия выполнения измерений аналогичны условиям при установлении градуировочной характеристики (п. 7.4.).

9. Вычисление результатов измерений

На хроматограмме рассчитывают площади пиков фенилацетата и внутреннего стандарта (нафталина).

За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных измерений Х , Х , расхождение между которыми не должно

max min
превышать значения предела повторяемости r (табл. 3).

n Расчет концентрации фенола (мкг/куб. см) в биопробе вычисляют по формуле:

                                S  х m   х К                                 i    ст    i/ст                            Х = ----------------,                                    S   х V                                     ст

где:
X — концентрация фенола в биопробе, мкг/куб. см; S , S — площади пиков фенилацетата и нафталина, кв. мм;

      i   ст     К      - градуировочный коэффициент (устанавливается по градуировочному      i/ст графику - К     - S  / S  );            i/ст    i    ст     m   - навеска нафталина, мкг;      ст 

V — объем пробы, куб. см.
Результат измерения представляют в виде:

                          _                         (Х +/- ДЕЛЬТА), мкг/куб. см,

где:

                                                     Х    + Х     _                                           _    max    min     Х - средний результат анализа, мкг/куб. см, Х = -----------,                                                          2 

при условии:

                                     r     Х    + Х                                      n     max    min                      Х    - Х    <= --- х -----------,                       max    min    100        2

где:
Х - максимальный результат из 2-х параллельных измерений; max
Х - минимальный результат из 2-х параллельных измерений; min
r - значение предела повторяемости, %; n
ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мкг/куб. см, при Р = 0,95, равная:

                                               _                                      дельта х Х                             ДЕЛЬТА = ----------,                                         100

где:
дельта - относительное значение характеристики погрешности, % (табл. 2).

10. Внутренний контроль качества результатов измерений

Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа". Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2 и 3.

Таблица 2

ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТОЧНОСТИ, ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ

  Наименование  Показатель             Показатель       Показатель точности   определяемого повторяемости      воспроизводимости         (границы         компонента и  (относительное       (относительное        относительной        диапазон    среднеквадратиче- среднеквадратическое    погрешности при      измерений,   ское отклонение        отклонение          вероятности         мкг/куб. см  повторяемости),   воспроизводимости),       Р = 0,95),                      дельта , %            дельта   , %        +/- дельта, %                           r                     R_                                                                           Хl                                                                                                           Фенол,               6,9                2,9                  10,0          

от 0,04 до 0,40 вкл.

Таблица 3

ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ И ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ Р = 0,95

      Наименование      Предел повторяемости    Предел внутрилабораторной         определяемого        (относительное           воспроизводимости             компонента и      значение допускаемого    (относительное значение       диапазон измерений,    расхождения между     допускаемого расхождения           мкг/куб. см       двумя результатами     между двумя результатами                                параллельных        измерений, полученными в                                определений),        одной лаборатории, но в                                    r , %               разных условиях),                                        n                         R_ , %                                                                       Хl                                                                                            Фенол,                        10,3                       8,0               

от 0,04 до 0,40 вкл.

10.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют содержания исследуемых соединений в градуировочных растворах, которые соответствуют началу, середине и концу градуировочного интервала. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.

10.2. Контроль повторяемости

Относительное расхождение между результатами двух измерений, выполненных в соответствии с методикой одним оператором при измерении образцов одной и той же рабочей пробы с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов в течение возможно минимального интервала времени, не должно превышать значения предела повторяемости r , (табл. 3).

                                                              n     Повторяемость     результатов     параллельных    измерений    признают 

удовлетворительной, если:

                                     r     Х    + Х                                      n     max    min                      Х    - Х    <= --- х -----------,                       max    min    100        2

где:
r - значение предела повторяемости, %; n
Х - максимальный результат из 2-х параллельных измерений; max
Х - минимальный результат из 2-х параллельных измерений. min
Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

10.3. Контроль воспроизводимости

Внутренний контроль воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

                                           _                                         R    Х  + Х                         _    _       Хl    1    2                        |Х  - Х | <= --- х -------,                          1    2     100      2

где:
_
Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных 1
измерений, мкг/куб. см;

Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных 2
измерений, полученный в других условиях, мкг/куб. см;

R - значение предела внутрилабораторной воспроизводимости, % Хl
(табл. 3).

_ Расхождение между результатами измерений Х , и Х , полученными в разных

1 2 условиях, не должно превышать значений показателя воспроизводимости R ,

Хl при доверительной вероятности Р = 0,95, указанных в табл. 3. Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

10.4. Контроль точности

Контроль точности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольной процедуры, равного разности между результатом

_1 контрольного измерения содержания фенола в пробе с известной добавкой (Х )

_
в рабочей пробе без добавки (Х) и величиной добавки С (добавка должна

д составлять не менее 40% от содержания фенола в рабочей пробе) с нормативом точности К.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

                             _1   _                            |Х  - Х - С | = К ,                                       д     k

где:
_1
Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе с известной добавкой из 2-х параллельных измерений, мкг/куб. см;

_
Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, мкг/куб. см;

С - величина добавки к пробе, мкг/куб. см. д

                                /дельта   _ 2   дельта   _1 2                  К = 0,84 х   /(------ х Х) + (------ х Х ) .                             \/   100            100

Качество контрольной процедуры признают удовлетворительной при выполнении условия: К <= К.

k
При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, устраняют их и процедуру контроля повторяют. Периодичность контроля исполнения процедуры ВКК регламентируют в руководстве по качеству лаборатории.

Литература

1. Бандман А.Л., Войтенко Г.А., Волкова Н.В. и др. Вредные химические вещества. Углеводороды. Галогенпроизводные углеводородов: Справ. изд./Под ред. В.А.Филова и др. Л.: "Химия", 1990.

Методические указания разработаны Пермским научно-исследовательским клиническим институтом детской экопатологии (Т.С.Уланова, Т.В.Нурисламова, Н.А.Попова).