Убить рак: иридий, человеческий сывороточный альбумин и немного синего света

Иридий (Ir) это чрезвычайно твердый переходной металл из платиновой группы. Как и вымышленный адамантий, иридий очень стойко переносит коррозию даже при температуре в 2000 °C. Еще одно сходство этих двух металлов в их внеземном происхождении. Точнее сказать, иридия на нашей планете очень мало, посему в большой концентрации он встречается в местах падения метеоритов.

Иридий (Ir)

Иридий достаточно молодой металл в научном мире, так как был открыт в 1803 году химиком Смитсоном Теннантом. Он воздействовал на платину смесью из азотной и соляной кислот, которая имеет очень необычное название — царская водка. И как понятно из состава этого раствора, после его употребление вы не станете «пьяным мастером», как Джеки Чан в одноименном фильме, а скорее мертвым мастером. Ибо слово «водка» изначально обозначало простую воду и лишь после XIV века начало использоваться для обозначения алкогольного напитка.

С помощью царской водки мистер Теннант смог получить в чистом виде те примеси, которые были в платине, а именно осмий и иридий.

Как уже было сказано ранее, иридия очень мало — в год добывается примерно 3 тонны этого металла. Для сравнения, добыча серебра по некоторым данным превышает отметку в 27000 тонн в год.

Основа исследования

В основе исследования лежит уже применяемый на практике метод лечения онкологических заболеваний (и некоторых других также) — фотодинамическая терапия (ФДТ). Основными героями этого метода являются фотосенсибилизаторы и свет.

Фотосенсибилизаторы* — вещества, которые увеличивают чувствительность к световому воздействию у биологических тканей.

Сенсибилизаторы достаточно переборчивы, то есть накапливаются только в тех тканях, которые необходимо изменить для дальнейшей процедуры облучения светом.

Когда свет проникает в целевые ткани, происходит фотохимическая реакция — молекулярный триплетный кислород (³O₂) преобразуется в синглетный. Помимо этого образуются высокоактивные радикалы. В совокупности это приводит к отмиранию раковых клеток.

Ученые приводят в пример фотофрин и аминолевулиновую кислоту, как самые распространенные фотосенсибилизаторы в ФДТ терапии. Однако в последние годы все больше внимания уделяется металлам с высоким коэффициентом люминесценции, поскольку они обладают необычными и полезными фотохимическими и фотофизическими свойствами. К примеру, TLD1433 (рутений) для ФДТ лечения мочевого пузыря и WST11 (палладий) для лечения сосудов.

Результаты исследования

Так почему не использовать иридий, подумали ученые. Но для начала нужен механизм, который позволит применить этот металл. Не будет же пациент употреблять иридий перорально, как обычные таблетки. И тут к работе подключается человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), который за счет своих свойств и количества (порядка 55% от всех белков крови) является отличным переносчиком различных веществ (в нашем случае лекарственных). Проще говоря, ЧСА можно применить для доставки противораковых препаратов в необходимую область тела пациента, что уже было продемонстрировано в предыдущих исследованиях с применением осмия, рутения и палладия.

Изображение №1

В рассматриваемом нами исследовании ученые создали малеимид-функционализированный октаэдрический органо-иридиевый (III) комплекс Ir1 (1а) в совокупности с ЧСА. Данный комплекс (Ir1-ЧСА) оказался значительно эффективнее в увеличении фосфоресценции в сравнении с «чистым» Ir1, то есть без ЧСА.

В темноте Ir1-ЧСА по большей степени не токсичен для обычных клеток, но проявляет сильную фото-цитотоксичность по отношению к раковым клеткам и их сфероидам (клеточным образованиям).

Синтезированный Ir1 проявлял стабильность в течение 12 часов в темноте и спустя 1 час облучения синим светом. При этом необходимо было проверить углерод-углеродную связь (С=С). Для этого была проведена реакция комплекса Ir1 и цистеина (Cys) в молярном соотношении Cys: Ir1 — 2:1 в [D₆]DMSO/D₂O при температуре 298 K в течение 30 минут. В результате протонного магнитного резонанса ученые выяснили пиковый показатель виниловых протонов малеимидных групп на отметке в 6.62 ppm (миллионная доля). При добавлении цистеина пики исчезли, но потом вновь возникли уже в диапазоне 2.9…3.9 ppm. Ученые связывают это с конъюгацией цистеина.

Далее ученые проверили способен ли свободный тиол Cys34 из ЧСА вступать в реакцию с С=С. Для этого 30 μM (микромолль) Ir1 инкубировали с ЧСА (0-120 μM) в течение 1 часа. Далее полученные продукты реакций были разделены с помощью обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ).

При достижении ЧСА в 120 μM пик Ir1 исчезал полностью (соотношение ЧСА: Ir1 = 4:1). Таким образом содержание тиола (SH) составило 0.27±0.1 моль SH на 1 моль ЧСА (1с). Следовательно, концентрация свободных SH-групп из 120 μM ЧСА составляет 32.4±1.2 μM. При таком показателе возникает реакция с 30 μM Ir1, приводя к возникновению аддукта (прямого соединения молекул) Ir1 и ЧСА в соотношении 1:1.

Чистый Ir1 не демонстрировал сильного излучения в водном растворе, в отличие от комплекса Ir1-ЧСА (1d). Чем выше была концентрация ЧСА, тем сильнее становилась фосфоресценция самого Ir1 (1е).

Изображение №2

Дабы удалить группы свободных тиолов из ЧСА в раствор было добавлено 100 μM цистина на сутки при температуре 277 K. Полученный продукт соединили с Ir1 на 30 минут. Наблюдения показали значительное снижение фосфоресценции. В случае конъюгата ЧСА-Cys34 и Ir1 (2а) ситуация была противоположной, а это говорит о том, что именно свободный тиол Cys34 является связующим звеном (правильнее говоря, доменом связывания) для Ir1.

Теперь необходимо было более подробно изучить ЧСА, разобрав его на составляющие. Человеческий сывороточный альбумин имеет одну цепь из 585 аминокислотных остатков, среди которых ученым нужно было найти именно те, что усиливают люминесценцию Ir1. Для этого был проведен люминесцентный анализ взаимодействия Ir1 с различными аминокислотами (2b и 2с). И как мы можем видеть на графике 2b, лидером среди аминокислот с колоссальным отрывом стал гистидин (His), усиливающий люминесценцию Ir1 в 37 раз.

Немного разобравшись в том, что и как работает внутри составных компонентов комплекса Ir1-ЧСА, ученые перешли к практическому применению, то есть к опытам.

Сначала 0.4 миллимоль Ir1 разбавили в 20 мл MeOH:H2O, добавили 0.4 миллимоль HSA и перемешивали в течение 1 часа. Далее с помощью конфокальной микроскопии было исследовано распространение Ir1-ЧСА в живых клетках рака легких (A549).

Уже спустя 30 минут Ir1-ЧСА по большей степени концентрировался в цитоплазме раковых клеток. На 60-120 минуте от начала инкубации, комплекс проникал в ядра клеток рака.

Изображение №3: конфокальная микроскопия клеток рака легких A549.

Однако стоит отметить, что не весь комплекс проникал в ядра раковых клеток, а только Ir1. Проверка иммунофлуоресцентным методом показала, что ЧСА просто отсутствует в ядрах клеток, попавших под воздействие Ir1.

Изображение №4: иммунофлуоресцентный анализ наличия ЧСА в клетках рака легких.

Но ЧСА не исчезает бесследно, он просто остается в цитоплазме и в мембране ядра клетки рака. Получается, что ЧСА полностью выполняет свою функцию: он доставил Ir до ядра клетки, а сам остался снаружи.

Изображение №5: квантовый выход и время жизни фосфоресценции Ir1 и комплекса Ir1-ЧСА.

Ученые также проверили квантовый выход (утрировано, силу) и время жизни фосфоресценции Ir1 (самого по себе) и комплекса Ir1-ЧСА.

Квантовый выход Ir1 был очень мал (всего лишь 0.001), а время жизни при температуре 298 K составило 182.7 наносекунд (5а). А вот у Ir1-ЧСА квантовый выход был уже 0.036, а время жизни — 871.8 нс. Такая продолжительность фосфоресценции отлично способствует генерации синглетного кислорода (¹ O₂).

Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса с использованием 2,2,6,6-тетраметилпиперидина в качестве спиновой ловушки помогла обнаружить генерацию 1O2 в чистом Ir1 и в комплексе Ir1-ЧСА при иррадиации в 465 нм в течение 20 минут (5b). Как и ожидалось, квантовый выход 1O2 у Ir1-ЧСА был значительно выше (0.83), чем у Ir1 (0.06).

Также необходимо было проверить степень воздействия Ir1-ЧСА и Ir1 на раковые клетки и на здоровые. В качестве раковых клеток выступило три варианта: рак легких A549, гепатома Hep-G2 и устойчивый к цисплатину рак легких A549R. В качестве здоровых клеток использовались MRC-5 (легкие) и LO2 (печень). Эксперимент проводился в двух вариациях освещения: полная темнота на протяжении всего опыта и синий свет.

Клетки инкубировали Ir1 или Ir1-ЧСА в течение 2 часов, промывали с помощью пербората натрия и облучались синим светом в течение 20 минут либо оставляли в темноте (второй вариант опыта). После этого клетки восстанавливались в течение 46 часов.

Воздействие Ir1 на клетки A549 и в темноте (89.6 μM), и при освещении (53.3 μM) практически отсутствовало.

Таблица воздействия Ir1 и Ir1-ЧСА на раковые клетки: чем больше число, тем меньше воздействия (т.е. больше клеток рака остались невредимы).

А вот Ir1-ЧСА показал совсем иные результаты. В темноте испытуемый комплекс никак не влиял на раковые клетки, но при освещении степень его цитотоксичности значительно возросла. Подобные результаты, как мы с вами видим из таблицы выше, Ir1 и Ir1-ЧСА показали и по отношению к другим раковым клеткам. При этом здоровые клетки и в темноте, и при освещении не были затронуты Ir1 и Ir1-ЧСА.

Напоследок ученые провели анализ активных форм кислорода (АФК) внутри клеток после светового облучения. В темноте, как и ожидалось, никаких АФК обнаружено не было. А вот в клетках, которые подвергались световому облучению после применения Ir1-ЧСА, АФК были обнаружены (5с).

Для более детального ознакомления с исследованием настоятельно рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

Данным исследованием ученые не пытались изобрести велосипед в виде применения редких металлов в фотодинамической терапии, ибо это уже было сделано ранее с осмием и палладием. Однако никто еще не пробовал использовать иридий, что исследователи и решили исправить. Их труд не оказался бесполезен, так как иридий показал отличные результаты в борьбе с раковыми клетками разных типов, при этом не затрагивая здоровые.

Онкологические заболевания — одни из самых распространенных, каждый год забирающих миллионы жизней. Изобретение новых методов борьбы с этим недугом и совершенствование имеющихся должно и будет продолжаться. Конечно, нам пока еще далеко до тотальной победы над раком, но ученые по всему миру продолжают свою борьбу в лабораториях, как и миллионы больных в палатах.

Не стоит также забывать и факторах, которые приводят к возникновению онкологических заболеваний. Часть из них (экология, вредные привычки и т.д.) человеку вполне по силам ликвидировать.

Иридий (Ir) это чрезвычайно твердый переходной металл из платиновой группы. Как и вымышленный адамантий, иридий очень стойко переносит коррозию даже при температуре в 2000 °C. Еще одно сходство этих двух металлов в их внеземном происхождении. Точнее сказать, иридия на нашей планете очень мало, посему в большой концентрации он встречается в местах падения метеоритов.

Иридий (Ir)

Иридий достаточно молодой металл в научном мире, так как был открыт в 1803 году химиком Смитсоном Теннантом. Он воздействовал на платину смесью из азотной и соляной кислот, которая имеет очень необычное название — царская водка. И как понятно из состава этого раствора, после его употребление вы не станете «пьяным мастером», как Джеки Чан в одноименном фильме, а скорее мертвым мастером. Ибо слово «водка» изначально обозначало простую воду и лишь после XIV века начало использоваться для обозначения алкогольного напитка.

С помощью царской водки мистер Теннант смог получить в чистом виде те примеси, которые были в платине, а именно осмий и иридий.

Как уже было сказано ранее, иридия очень мало — в год добывается примерно 3 тонны этого металла. Для сравнения, добыча серебра по некоторым данным превышает отметку в 27000 тонн в год.

Основа исследования

В основе исследования лежит уже применяемый на практике метод лечения онкологических заболеваний (и некоторых других также) — фотодинамическая терапия (ФДТ). Основными героями этого метода являются фотосенсибилизаторы и свет.

Фотосенсибилизаторы* — вещества, которые увеличивают чувствительность к световому воздействию у биологических тканей.

Сенсибилизаторы достаточно переборчивы, то есть накапливаются только в тех тканях, которые необходимо изменить для дальнейшей процедуры облучения светом.

Когда свет проникает в целевые ткани, происходит фотохимическая реакция — молекулярный триплетный кислород (³O₂) преобразуется в синглетный. Помимо этого образуются высокоактивные радикалы. В совокупности это приводит к отмиранию раковых клеток.

Ученые приводят в пример фотофрин и аминолевулиновую кислоту, как самые распространенные фотосенсибилизаторы в ФДТ терапии. Однако в последние годы все больше внимания уделяется металлам с высоким коэффициентом люминесценции, поскольку они обладают необычными и полезными фотохимическими и фотофизическими свойствами. К примеру, TLD1433 (рутений) для ФДТ лечения мочевого пузыря и WST11 (палладий) для лечения сосудов.

Результаты исследования

Так почему не использовать иридий, подумали ученые. Но для начала нужен механизм, который позволит применить этот металл. Не будет же пациент употреблять иридий перорально, как обычные таблетки. И тут к работе подключается человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), который за счет своих свойств и количества (порядка 55% от всех белков крови) является отличным переносчиком различных веществ (в нашем случае лекарственных). Проще говоря, ЧСА можно применить для доставки противораковых препаратов в необходимую область тела пациента, что уже было продемонстрировано в предыдущих исследованиях с применением осмия, рутения и палладия.

Изображение №1

В рассматриваемом нами исследовании ученые создали малеимид-функционализированный октаэдрический органо-иридиевый (III) комплекс Ir1 (1а) в совокупности с ЧСА. Данный комплекс (Ir1-ЧСА) оказался значительно эффективнее в увеличении фосфоресценции в сравнении с «чистым» Ir1, то есть без ЧСА.

В темноте Ir1-ЧСА по большей степени не токсичен для обычных клеток, но проявляет сильную фото-цитотоксичность по отношению к раковым клеткам и их сфероидам (клеточным образованиям).

Синтезированный Ir1 проявлял стабильность в течение 12 часов в темноте и спустя 1 час облучения синим светом. При этом необходимо было проверить углерод-углеродную связь (С=С). Для этого была проведена реакция комплекса Ir1 и цистеина (Cys) в молярном соотношении Cys: Ir1 — 2:1 в [D₆]DMSO/D₂O при температуре 298 K в течение 30 минут. В результате протонного магнитного резонанса ученые выяснили пиковый показатель виниловых протонов малеимидных групп на отметке в 6.62 ppm (миллионная доля). При добавлении цистеина пики исчезли, но потом вновь возникли уже в диапазоне 2.9…3.9 ppm. Ученые связывают это с конъюгацией цистеина.

Далее ученые проверили способен ли свободный тиол Cys34 из ЧСА вступать в реакцию с С=С. Для этого 30 μM (микромолль) Ir1 инкубировали с ЧСА (0-120 μM) в течение 1 часа. Далее полученные продукты реакций были разделены с помощью обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ).

При достижении ЧСА в 120 μM пик Ir1 исчезал полностью (соотношение ЧСА: Ir1 = 4:1). Таким образом содержание тиола (SH) составило 0.27±0.1 моль SH на 1 моль ЧСА (1с). Следовательно, концентрация свободных SH-групп из 120 μM ЧСА составляет 32.4±1.2 μM. При таком показателе возникает реакция с 30 μM Ir1, приводя к возникновению аддукта (прямого соединения молекул) Ir1 и ЧСА в соотношении 1:1.

Чистый Ir1 не демонстрировал сильного излучения в водном растворе, в отличие от комплекса Ir1-ЧСА (1d). Чем выше была концентрация ЧСА, тем сильнее становилась фосфоресценция самого Ir1 (1е).

Изображение №2

Дабы удалить группы свободных тиолов из ЧСА в раствор было добавлено 100 μM цистина на сутки при температуре 277 K. Полученный продукт соединили с Ir1 на 30 минут. Наблюдения показали значительное снижение фосфоресценции. В случае конъюгата ЧСА-Cys34 и Ir1 (2а) ситуация была противоположной, а это говорит о том, что именно свободный тиол Cys34 является связующим звеном (правильнее говоря, доменом связывания) для Ir1.

Теперь необходимо было более подробно изучить ЧСА, разобрав его на составляющие. Человеческий сывороточный альбумин имеет одну цепь из 585 аминокислотных остатков, среди которых ученым нужно было найти именно те, что усиливают люминесценцию Ir1. Для этого был проведен люминесцентный анализ взаимодействия Ir1 с различными аминокислотами (2b и 2с). И как мы можем видеть на графике 2b, лидером среди аминокислот с колоссальным отрывом стал гистидин (His), усиливающий люминесценцию Ir1 в 37 раз.

Немного разобравшись в том, что и как работает внутри составных компонентов комплекса Ir1-ЧСА, ученые перешли к практическому применению, то есть к опытам.

Сначала 0.4 миллимоль Ir1 разбавили в 20 мл MeOH:H2O, добавили 0.4 миллимоль HSA и перемешивали в течение 1 часа. Далее с помощью конфокальной микроскопии было исследовано распространение Ir1-ЧСА в живых клетках рака легких (A549).

Уже спустя 30 минут Ir1-ЧСА по большей степени концентрировался в цитоплазме раковых клеток. На 60-120 минуте от начала инкубации, комплекс проникал в ядра клеток рака.

Изображение №3: конфокальная микроскопия клеток рака легких A549.

Однако стоит отметить, что не весь комплекс проникал в ядра раковых клеток, а только Ir1. Проверка иммунофлуоресцентным методом показала, что ЧСА просто отсутствует в ядрах клеток, попавших под воздействие Ir1.

Изображение №4: иммунофлуоресцентный анализ наличия ЧСА в клетках рака легких.

Но ЧСА не исчезает бесследно, он просто остается в цитоплазме и в мембране ядра клетки рака. Получается, что ЧСА полностью выполняет свою функцию: он доставил Ir до ядра клетки, а сам остался снаружи.

Изображение №5: квантовый выход и время жизни фосфоресценции Ir1 и комплекса Ir1-ЧСА.

Ученые также проверили квантовый выход (утрировано, силу) и время жизни фосфоресценции Ir1 (самого по себе) и комплекса Ir1-ЧСА.

Квантовый выход Ir1 был очень мал (всего лишь 0.001), а время жизни при температуре 298 K составило 182.7 наносекунд (5а). А вот у Ir1-ЧСА квантовый выход был уже 0.036, а время жизни — 871.8 нс. Такая продолжительность фосфоресценции отлично способствует генерации синглетного кислорода (¹ O₂).

Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса с использованием 2,2,6,6-тетраметилпиперидина в качестве спиновой ловушки помогла обнаружить генерацию 1O2 в чистом Ir1 и в комплексе Ir1-ЧСА при иррадиации в 465 нм в течение 20 минут (5b). Как и ожидалось, квантовый выход 1O2 у Ir1-ЧСА был значительно выше (0.83), чем у Ir1 (0.06).

Также необходимо было проверить степень воздействия Ir1-ЧСА и Ir1 на раковые клетки и на здоровые. В качестве раковых клеток выступило три варианта: рак легких A549, гепатома Hep-G2 и устойчивый к цисплатину рак легких A549R. В качестве здоровых клеток использовались MRC-5 (легкие) и LO2 (печень). Эксперимент проводился в двух вариациях освещения: полная темнота на протяжении всего опыта и синий свет.

Клетки инкубировали Ir1 или Ir1-ЧСА в течение 2 часов, промывали с помощью пербората натрия и облучались синим светом в течение 20 минут либо оставляли в темноте (второй вариант опыта). После этого клетки восстанавливались в течение 46 часов.

Воздействие Ir1 на клетки A549 и в темноте (89.6 μM), и при освещении (53.3 μM) практически отсутствовало.

Таблица воздействия Ir1 и Ir1-ЧСА на раковые клетки: чем больше число, тем меньше воздействия (т.е. больше клеток рака остались невредимы).

А вот Ir1-ЧСА показал совсем иные результаты. В темноте испытуемый комплекс никак не влиял на раковые клетки, но при освещении степень его цитотоксичности значительно возросла. Подобные результаты, как мы с вами видим из таблицы выше, Ir1 и Ir1-ЧСА показали и по отношению к другим раковым клеткам. При этом здоровые клетки и в темноте, и при освещении не были затронуты Ir1 и Ir1-ЧСА.

Напоследок ученые провели анализ активных форм кислорода (АФК) внутри клеток после светового облучения. В темноте, как и ожидалось, никаких АФК обнаружено не было. А вот в клетках, которые подвергались световому облучению после применения Ir1-ЧСА, АФК были обнаружены (5с).

Для более детального ознакомления с исследованием настоятельно рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

Данным исследованием ученые не пытались изобрести велосипед в виде применения редких металлов в фотодинамической терапии, ибо это уже было сделано ранее с осмием и палладием. Однако никто еще не пробовал использовать иридий, что исследователи и решили исправить. Их труд не оказался бесполезен, так как иридий показал отличные результаты в борьбе с раковыми клетками разных типов, при этом не затрагивая здоровые.

Онкологические заболевания — одни из самых распространенных, каждый год забирающих миллионы жизней. Изобретение новых методов борьбы с этим недугом и совершенствование имеющихся должно и будет продолжаться. Конечно, нам пока еще далеко до тотальной победы над раком, но ученые по всему миру продолжают свою борьбу в лабораториях, как и миллионы больных в палатах.

Не стоит также забывать и факторах, которые приводят к возникновению онкологических заболеваний. Часть из них (экология, вредные привычки и т.д.) человеку вполне по силам ликвидировать.