SENS-Диагностика. Биомаркеры белковых агрегатов

Такие белковые структуры имеют диаметр около 5–10 нм и длину до 800 нм, и состоят из двух и более параллельных разнонаправленных филаментов, образующих специфическую структуру – кросс-бета-складчатую конформацию. Именно такая структура определяет специфическое оптическое свойство амилоида – способность к двойному лучепреломлению. И обнаружение этого свойства положено в основу диагностики амилоидоза. При микроскопии окрашенных красителем конго красным препаратов в поляризованном свете амилоид изменяет красный цвет окраски на зеленое свечение [1].

Скопления неправильных белков авторы концепции SENS называют «внеклеточным мусором» (Extracellular junk) и определяют одной из причин старения, что видится вполне справедливым. Амилоидные фибриллы в силу своей структуры не подвержены действию специальных ферментов, расщепляющих белки (протеаз), и потому имеют свойство накапливаться в тканях организма, нарушая их работу. Структурные и химико-физические свойства амилоида зависят от основного белка-предшественника, содержание которого в фибрилле – около 80%, и это определяет специфичный признак для каждого типа амилоидоза. Термином амилоидоз обозначают группу наследственных или приобретенных заболеваний, связанных с внеклеточным отложением фибрилл нерастворимых белков, вызывающих тканевые структурные нарушения и дисфункции органов. В настоящее время известно более 20 амилоидогенных белков-предшественников и столько же клинических вариантов амилоидоза. Кроме широко известного β-амилоида существует АА-амилоид, связанный с ревматоидным артритом, болезнями сердца, почек и воспалением кишечника, AIAPP-амилоид, участвующий в патогенезе сахарного диабета 2 типа, и другие [2].

β-амилоид.

Способом решения проблемы накопления белковых агрегатов авторы SENS видят в использовании специализированных каталитически активных антител, так называемых абзимов (англ. abzyme, antibody enzyme), которые подбираются конкретно под амилоиды и удаляют их из ткани. Недавно в рамках этого подхода был разработан один перспективный способ. Было обнаружено подмножество человеческих антител, которое обладает каталитической активностью против определенного антигена, разбивая его на более мелкие и менее вредные фрагменты, а не захватывает его для удаления или разрушения другими иммунными клетками. Использование этих новых каталитических антител в качестве терапии для нацеливания на амилоиды дает потенциальные преимущества перед секвестрирующими антителами, применяемыми в других вакцинах, нацеленных на амилоиды. Первый заключается в том, что ожидается сокращение дозы, необходимой для эффективного удаления внеклеточных агрегатов из тканей. Это связано с тем, что секвестрирующие антитела могут захватить, а затем транспортировать только одну молекулу амилоида за один раз. Тогда как абзимы связываются с молекулой амилоида, измельчают ее и затем переходят на следующую, одну за другой, позволяя каждой молекуле антитела быстро разрушать несколько амилоидных молекул. Другим является то, что каталитические антитела относятся к классу, который более эффективно переносится через гематоэнцефалический барьер, защищающий наш мозг, тогда как секвестрирующим антителам труднее преодолеть этот барьер [3].

Самым известным и наиболее изученным амилоидом сегодня является β-амилоид, который многие исследователи связывают с болезнью Альцгеймера. Эта патология была описана больше века назад А. Альцгеймером, который первым указал на основной патоморфологический признак данного заболевания – нерастворимые сенильные бляшки, обнаруживаемые в мозге умерших, страдавших этой болезнью. Сегодня в мире насчитывается более 40 миллионов человек с диагнозом болезни Альцгеймера – вероятность развития данной патологии удваивается каждые пять лет после 65 летнего рубежа. И долгосрочные оценки ВОЗ, касающиеся массового увеличения таких больных в ближайшие десятилетия, крайне пессимистичны.

Известно, что нерастворимые бляшки в мозге больных образованы главным образом β-амилоидным пептидом (Aβ), который имеет молекулярную массу 4 кДа и длину около 40 аминокислотных остатков. Aβ представляет собой фрагмент трансмембранного белка предшественника бета-амилоида (amyloid precursor protein, АРР), который обнаруживается во многих тканях организма, в том числе в синапсах нейронов. АРР вовлечен в некоторые физиологические процессы, связанные с нейропластичностью, образованием синапсов и нейропротекцией (выживанием нервных клеток) [4].

В отличие от своего предшественника, Aβ является токсичным для нервных клеток, способствуя их дегенерации и гибели. Он образуется путём отделения внеклеточного N-концевого домена (sAPP) белка-предщественника. Этот процесс может быть осуществлён двумя разными секретазами — α-секретазой и β-секретазой, которые имеют принципиальное различие в своём действии. В первом случае фрагментация происходит между аминокислотными остатками внутри последовательности Аβ, что предотвращает последующее образование амилоидного пептида. Во-втором, патологическом, под воздействием β-секретазы процесс фрагментации в силу своих особенностей заканчивается образованием Аβ. Этот второй путь, связанный с развитием нейропатологий, более редкий, и почему фрагментация белка-предшественника идёт по нему, остаётся не до конца ясным [5].

β-секретаза.

Нейротоксичность Аβ связана с нарушением кальциевого гомеостаза, эксайтотоксичностью, воспалительными процессами, стимулированием окислительного стресса и апоптоза. Ранее господствовало мнение, что накопление в мозге Аβ – процесс сугубо патологический в силу невозможности выведения Аβ из тканей мозга. Сегодня известно, что Аβ всё-таки может выводиться из мозга как минимум 2 путями: периваскулярным (через лимфу) и протеолитическим (расщеплением различными ферментами) [6, 7]. Поэтому формирование в пожилом возрасте болезни Альцгеймера с сопутствующим ей накоплением нерастворимых фибрилл амилоида может быть связано с разными стимулирующими факторами. Которые могут иметь генетическую природу и быть связаны со стрессами, гипоксией, ишемией и перенесёнными инсультами [8].

β-амилоид окисляет холестерин и полиненасыщенные жирные кислоты, образуя наиболее токсичные формы активные формы кислорода – гидроксильный радикал и перекись водорода. Рацемизация L-аспарагиновой кислоты в долгоживущих белках способствует формированию β-амилоида и α-синуклеина. Патологические скопления последнего наблюдаются при болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, болезни Леви и других нейродегенеративных заболеваниях.

Ещё одним патоморфологическим признаком нейродегенерации при болезни Альцгеймера выступают агрегаты гиперфосфорилированного тау-белка (τ-белка): парные спиральные филаменты (PHF) и нейрофибриллярные клубки (NFT). Физиологически τ-белок участвует в стабилизации микротрубочек нейронов, которые обеспечивают перенос через цитоплазму нейронов клеточных органелл, гликопротеидов и других веществ. При болезни Альцгеймера τ-белок гиперфосфорилируется, теряет нормальную способность стабилизировать микротрубочки и скапливается в клетке нерастворимыми нейротоксичными структурами. Что во время формирования патологии происходит ранее – формирование агрегатов амилоида или τ-белка – вопрос не до конца ясный. Но, очевидно, что эти два процесса взаимосвязаны и стимулируют друг друга. Так, оба патологичных белка демонстрируют прионные свойства, схожие с прионным белком PrPsc: неправильно свёрнутые формы белков по типу цепной реакции стимулируют превращение нормальных белков в неправильные в окружающих их здоровых нейронах. Между собой Аβ и τ-белок также взаимодействуют по типу прионов: описано, как Аβ активирует протеинкиназу GSK3, фосфорилируя τ-белок и вызывая его неправильный фординг [5].

τ-белок.

Ещё совсем недавно считалось, что, хотя прионные болезни и болезнь Альцгеймера имеют определённые биохимические сходства, вторая патология, в отличие от первой не является инфекционной и не передаётся от одного организма к другому. Но в 2015 году появились первые тревожные новости. В журнале Nature была опубликована статья британских неврологов, в которой они рассказали о возможном пути передачи Аβ от одного человека другому. Авторы провели аутопсийное исследование мозга восьми человек, умерших от болезни Крейтцфельдта-Якоба. У шести умерших, в дополнение к повреждениями, связанными с основной болезнью, в мозге обнаружили обширные скопления амилоидов. Что нехарактерно ни для молодого возраста умерших, ни для данной патологии. В их геномах также не было найдено никаких дефектов, связанных с амилоидогенезом и нейропатологиями. Исследователи предположили, что Аβ были занесены в организм умерших во время инъекций заражённого амилоидом гормона роста. Точно также, как ранее были заражены и погибли несколько сотен людей от инъекций гормона роста, содержавших прионы [9].

Функции τ-белка в норме и патологии.

Подтверждением инфекционности болезни Альцгеймера может служить ещё одно исследование, в котором лабораторным мышам с повышенным амилоидогенезом и обычным мышам хирургически объединили кровоток. В результате здоровые мыши начали накапливать Аβ в мозге, что вообще не характерно для этих грызунов. Это исследование впервые показало потенциальную возможность проникновения Аβ с кровью в мозг и последующее участие в развитии нейродегенерации [10].

Взаимосвязь накопления в тканях β-амилоида и τ-белка с возрастными нейропатологиями определяет необходимость поиска эффективных методов по выявлению этих белковых агрегатов как биомаркеров будущей нейропатологии и ускоренного старения. Сегодня уже известно несколько таких методов.

Отложения амилоидов в тканях головного мозга можно детектировать с помощью позитронно-эмиссионной томографии, когда β-амилоид определяют по радиоактивному изотопу, введённому в организм и соединившемуся с амилоидом.

Одними из самых чувствительных биомаркеров в ранней диагностике болезни Альцгеймера и умеренных конгитивных нарушений (УКН) в переходной к патологии фазе сегодня считаются уровни амилоида Аβ-42, общего τ-белка и фосфорилированного τ-белка в спинномозговой жидкости (ликворе). Причём амилоиды при патологии показывают уменьшения уровня, а уровни в ликворе τ-белка, общего и фосфорилированного – увеличиваются. Связано это с тем, что у здоровых людей нет скоплений амилоида в виде бляшек и, потому большое количество свободного амилоида обнаруживается в ликворе. Низкие же значения τ-белка показывают отсутствие разрушения нейронального цитоскелета.

Обнаружена значительная корреляция между возрастом и замедлением выведения β-амилоида из нервной системы, что может быть связано со склерозированием лимфатических сосудов и снижением их дренажных способностей. Восстановление дренажа – один из перспективных методов лечения болезни Альцгеймера, предложен компанией Leucadia, интервью с основателем которой было переведено и опубликовано на habr.com/post/371513

Так, нормальными показателями для здорового человека может считаться концентрация в ликворе Аβ-42 на уровне 716,9±94,2 нг/мл. А уровень Аβ-42, показывающий повышенный риск развития нейропатологии, составляет 209 нг/мл. Для τ-белка нормальными показателями в цереброспинальной жидкости считаются уровни 73,9±51,7 нг/мл. Повышение уровней τ-белка до 231,6±158,5 нг/мл уже может свидетельствовать о наличии активного нейродегенеративного процесса. По сегодняшним представлениям, комбинированное изучение уровней в ликворе Аβ-42 и τ-белка показывают высокую чувствительность в ранней диагностике нейропатологий – 94% вероятности диагностики болезни Альцгеймера [11].

В скором времени ожидается появление ультрачувствительных иммунологических и масс-спектрометрических методов диагностики амилоидоза (соотношения Aβ42/40 или APP669-711/Aβ42 протеинов) и нейродегенерации (τ-белки и нейрофиламенты) в плазме крови [12]. Также существуют «безметочные» методы обнаружения неправильно свернутых протеинов в плазме [13].

Авторы обзора: Денис Одиноков, Алексей Ржешевский.

Такие белковые структуры имеют диаметр около 5–10 нм и длину до 800 нм, и состоят из двух и более параллельных разнонаправленных филаментов, образующих специфическую структуру – кросс-бета-складчатую конформацию. Именно такая структура определяет специфическое оптическое свойство амилоида – способность к двойному лучепреломлению. И обнаружение этого свойства положено в основу диагностики амилоидоза. При микроскопии окрашенных красителем конго красным препаратов в поляризованном свете амилоид изменяет красный цвет окраски на зеленое свечение [1].

Скопления неправильных белков авторы концепции SENS называют «внеклеточным мусором» (Extracellular junk) и определяют одной из причин старения, что видится вполне справедливым. Амилоидные фибриллы в силу своей структуры не подвержены действию специальных ферментов, расщепляющих белки (протеаз), и потому имеют свойство накапливаться в тканях организма, нарушая их работу. Структурные и химико-физические свойства амилоида зависят от основного белка-предшественника, содержание которого в фибрилле – около 80%, и это определяет специфичный признак для каждого типа амилоидоза. Термином амилоидоз обозначают группу наследственных или приобретенных заболеваний, связанных с внеклеточным отложением фибрилл нерастворимых белков, вызывающих тканевые структурные нарушения и дисфункции органов. В настоящее время известно более 20 амилоидогенных белков-предшественников и столько же клинических вариантов амилоидоза. Кроме широко известного β-амилоида существует АА-амилоид, связанный с ревматоидным артритом, болезнями сердца, почек и воспалением кишечника, AIAPP-амилоид, участвующий в патогенезе сахарного диабета 2 типа, и другие [2].

β-амилоид.

Способом решения проблемы накопления белковых агрегатов авторы SENS видят в использовании специализированных каталитически активных антител, так называемых абзимов (англ. abzyme, antibody enzyme), которые подбираются конкретно под амилоиды и удаляют их из ткани. Недавно в рамках этого подхода был разработан один перспективный способ. Было обнаружено подмножество человеческих антител, которое обладает каталитической активностью против определенного антигена, разбивая его на более мелкие и менее вредные фрагменты, а не захватывает его для удаления или разрушения другими иммунными клетками. Использование этих новых каталитических антител в качестве терапии для нацеливания на амилоиды дает потенциальные преимущества перед секвестрирующими антителами, применяемыми в других вакцинах, нацеленных на амилоиды. Первый заключается в том, что ожидается сокращение дозы, необходимой для эффективного удаления внеклеточных агрегатов из тканей. Это связано с тем, что секвестрирующие антитела могут захватить, а затем транспортировать только одну молекулу амилоида за один раз. Тогда как абзимы связываются с молекулой амилоида, измельчают ее и затем переходят на следующую, одну за другой, позволяя каждой молекуле антитела быстро разрушать несколько амилоидных молекул. Другим является то, что каталитические антитела относятся к классу, который более эффективно переносится через гематоэнцефалический барьер, защищающий наш мозг, тогда как секвестрирующим антителам труднее преодолеть этот барьер [3].

Самым известным и наиболее изученным амилоидом сегодня является β-амилоид, который многие исследователи связывают с болезнью Альцгеймера. Эта патология была описана больше века назад А. Альцгеймером, который первым указал на основной патоморфологический признак данного заболевания – нерастворимые сенильные бляшки, обнаруживаемые в мозге умерших, страдавших этой болезнью. Сегодня в мире насчитывается более 40 миллионов человек с диагнозом болезни Альцгеймера – вероятность развития данной патологии удваивается каждые пять лет после 65 летнего рубежа. И долгосрочные оценки ВОЗ, касающиеся массового увеличения таких больных в ближайшие десятилетия, крайне пессимистичны.

Известно, что нерастворимые бляшки в мозге больных образованы главным образом β-амилоидным пептидом (Aβ), который имеет молекулярную массу 4 кДа и длину около 40 аминокислотных остатков. Aβ представляет собой фрагмент трансмембранного белка предшественника бета-амилоида (amyloid precursor protein, АРР), который обнаруживается во многих тканях организма, в том числе в синапсах нейронов. АРР вовлечен в некоторые физиологические процессы, связанные с нейропластичностью, образованием синапсов и нейропротекцией (выживанием нервных клеток) [4].

В отличие от своего предшественника, Aβ является токсичным для нервных клеток, способствуя их дегенерации и гибели. Он образуется путём отделения внеклеточного N-концевого домена (sAPP) белка-предщественника. Этот процесс может быть осуществлён двумя разными секретазами — α-секретазой и β-секретазой, которые имеют принципиальное различие в своём действии. В первом случае фрагментация происходит между аминокислотными остатками внутри последовательности Аβ, что предотвращает последующее образование амилоидного пептида. Во-втором, патологическом, под воздействием β-секретазы процесс фрагментации в силу своих особенностей заканчивается образованием Аβ. Этот второй путь, связанный с развитием нейропатологий, более редкий, и почему фрагментация белка-предшественника идёт по нему, остаётся не до конца ясным [5].

β-секретаза.

Нейротоксичность Аβ связана с нарушением кальциевого гомеостаза, эксайтотоксичностью, воспалительными процессами, стимулированием окислительного стресса и апоптоза. Ранее господствовало мнение, что накопление в мозге Аβ – процесс сугубо патологический в силу невозможности выведения Аβ из тканей мозга. Сегодня известно, что Аβ всё-таки может выводиться из мозга как минимум 2 путями: периваскулярным (через лимфу) и протеолитическим (расщеплением различными ферментами) [6, 7]. Поэтому формирование в пожилом возрасте болезни Альцгеймера с сопутствующим ей накоплением нерастворимых фибрилл амилоида может быть связано с разными стимулирующими факторами. Которые могут иметь генетическую природу и быть связаны со стрессами, гипоксией, ишемией и перенесёнными инсультами [8].

β-амилоид окисляет холестерин и полиненасыщенные жирные кислоты, образуя наиболее токсичные формы активные формы кислорода – гидроксильный радикал и перекись водорода. Рацемизация L-аспарагиновой кислоты в долгоживущих белках способствует формированию β-амилоида и α-синуклеина. Патологические скопления последнего наблюдаются при болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, болезни Леви и других нейродегенеративных заболеваниях.

Ещё одним патоморфологическим признаком нейродегенерации при болезни Альцгеймера выступают агрегаты гиперфосфорилированного тау-белка (τ-белка): парные спиральные филаменты (PHF) и нейрофибриллярные клубки (NFT). Физиологически τ-белок участвует в стабилизации микротрубочек нейронов, которые обеспечивают перенос через цитоплазму нейронов клеточных органелл, гликопротеидов и других веществ. При болезни Альцгеймера τ-белок гиперфосфорилируется, теряет нормальную способность стабилизировать микротрубочки и скапливается в клетке нерастворимыми нейротоксичными структурами. Что во время формирования патологии происходит ранее – формирование агрегатов амилоида или τ-белка – вопрос не до конца ясный. Но, очевидно, что эти два процесса взаимосвязаны и стимулируют друг друга. Так, оба патологичных белка демонстрируют прионные свойства, схожие с прионным белком PrPsc: неправильно свёрнутые формы белков по типу цепной реакции стимулируют превращение нормальных белков в неправильные в окружающих их здоровых нейронах. Между собой Аβ и τ-белок также взаимодействуют по типу прионов: описано, как Аβ активирует протеинкиназу GSK3, фосфорилируя τ-белок и вызывая его неправильный фординг [5].

τ-белок.

Ещё совсем недавно считалось, что, хотя прионные болезни и болезнь Альцгеймера имеют определённые биохимические сходства, вторая патология, в отличие от первой не является инфекционной и не передаётся от одного организма к другому. Но в 2015 году появились первые тревожные новости. В журнале Nature была опубликована статья британских неврологов, в которой они рассказали о возможном пути передачи Аβ от одного человека другому. Авторы провели аутопсийное исследование мозга восьми человек, умерших от болезни Крейтцфельдта-Якоба. У шести умерших, в дополнение к повреждениями, связанными с основной болезнью, в мозге обнаружили обширные скопления амилоидов. Что нехарактерно ни для молодого возраста умерших, ни для данной патологии. В их геномах также не было найдено никаких дефектов, связанных с амилоидогенезом и нейропатологиями. Исследователи предположили, что Аβ были занесены в организм умерших во время инъекций заражённого амилоидом гормона роста. Точно также, как ранее были заражены и погибли несколько сотен людей от инъекций гормона роста, содержавших прионы [9].

Функции τ-белка в норме и патологии.

Подтверждением инфекционности болезни Альцгеймера может служить ещё одно исследование, в котором лабораторным мышам с повышенным амилоидогенезом и обычным мышам хирургически объединили кровоток. В результате здоровые мыши начали накапливать Аβ в мозге, что вообще не характерно для этих грызунов. Это исследование впервые показало потенциальную возможность проникновения Аβ с кровью в мозг и последующее участие в развитии нейродегенерации [10].

Взаимосвязь накопления в тканях β-амилоида и τ-белка с возрастными нейропатологиями определяет необходимость поиска эффективных методов по выявлению этих белковых агрегатов как биомаркеров будущей нейропатологии и ускоренного старения. Сегодня уже известно несколько таких методов.

Отложения амилоидов в тканях головного мозга можно детектировать с помощью позитронно-эмиссионной томографии, когда β-амилоид определяют по радиоактивному изотопу, введённому в организм и соединившемуся с амилоидом.

Одними из самых чувствительных биомаркеров в ранней диагностике болезни Альцгеймера и умеренных конгитивных нарушений (УКН) в переходной к патологии фазе сегодня считаются уровни амилоида Аβ-42, общего τ-белка и фосфорилированного τ-белка в спинномозговой жидкости (ликворе). Причём амилоиды при патологии показывают уменьшения уровня, а уровни в ликворе τ-белка, общего и фосфорилированного – увеличиваются. Связано это с тем, что у здоровых людей нет скоплений амилоида в виде бляшек и, потому большое количество свободного амилоида обнаруживается в ликворе. Низкие же значения τ-белка показывают отсутствие разрушения нейронального цитоскелета.

Обнаружена значительная корреляция между возрастом и замедлением выведения β-амилоида из нервной системы, что может быть связано со склерозированием лимфатических сосудов и снижением их дренажных способностей. Восстановление дренажа – один из перспективных методов лечения болезни Альцгеймера, предложен компанией Leucadia, интервью с основателем которой было переведено и опубликовано на habr.com/post/371513

Так, нормальными показателями для здорового человека может считаться концентрация в ликворе Аβ-42 на уровне 716,9±94,2 нг/мл. А уровень Аβ-42, показывающий повышенный риск развития нейропатологии, составляет 209 нг/мл. Для τ-белка нормальными показателями в цереброспинальной жидкости считаются уровни 73,9±51,7 нг/мл. Повышение уровней τ-белка до 231,6±158,5 нг/мл уже может свидетельствовать о наличии активного нейродегенеративного процесса. По сегодняшним представлениям, комбинированное изучение уровней в ликворе Аβ-42 и τ-белка показывают высокую чувствительность в ранней диагностике нейропатологий – 94% вероятности диагностики болезни Альцгеймера [11].

В скором времени ожидается появление ультрачувствительных иммунологических и масс-спектрометрических методов диагностики амилоидоза (соотношения Aβ42/40 или APP669-711/Aβ42 протеинов) и нейродегенерации (τ-белки и нейрофиламенты) в плазме крови [12]. Также существуют «безметочные» методы обнаружения неправильно свернутых протеинов в плазме [13].

Авторы обзора: Денис Одиноков, Алексей Ржешевский.