Диагноз на скорость: созданы экспресс-тесты бактериальных инфекций

Ежегодно миллионы людей во всем мире, несмотря на относительную доступность существующих методов лечения, умирают от бактериальных инфекций, во многом из-за слишком поздно или неправильно поставленного диагноза. Все идет к тому, что в ближайшем будущем традиционные методы диагностики заменят новые, современные технологии, позволяющие не только очень быстро и точно выявить возбудителя инфекционного заболевания, но и узнать о нем много другой информации, критически важной для эффективной терапии.

По бактериальной ДНК

В первую очередь речь идет о методах секвенирования (расшифровки ДНК) нового поколения (next-generation sequencing, NGS), сравнительно высокая скорость получения результата и дешевизна которых делает их более современной альтернативой традиционным микробиологическим техникам. А также заменой или увеличивающим эффективность дополнением к быстродействующему, но дорогостоящему методу полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принципы работы NGS основаны на одновременной расшифровке сразу нескольких участков бактериального генома.

Так, междисциплинарная группа исследователей из Университета Джорджа Вашингтона (США) сообщила в журнале Journal of Clinical Microbiology об успешном опыте применения NGS для выявления патогенов, которые вызывают пневмонию у пациентов, находящихся на аппарате искусственной вентиляции легких. Заболевание развивается довольно часто и может убить и без того ослабленного пациента, так что срочная диагностика инфекции в прямом смысле жизненно необходима. NGS позволило выявить ДНК патогенов в 72 процентах образцов бронхиальных выделений. При этом метод позволил определить состав и количество микроорганизмов в образцах значительно более точно, чем стандартные микробиологические методы. Авторы надеются, что технологии NGS очень скоро войдут в обычную клиническую практику.

Параллельно с американскими специалистами над разработкой и внедрением современных методов диагностики работает группа под руководством профессора Марк Пэллен (Mark Pallen) из Школы медицины Уорвикского университета (Великобритания). Ранее Пэллен и его коллеги при помощи NGS реконструировали геном возбудителя бруцеллеза — бактерии Brucella melitensis. Ее ДНК была выделена из 700-летних человеческих костных останков, найденных во время раскопок в средневековой сардинской деревушке.

Теперь ученые предложили новый подход к диагностике туберкулеза. Сегодня чтобы диагностировать заболевание, нужно вырастить бактерии из образца мокроты (иногда это занимает недели и месяцы) и исследовать их под микроскопом. Этот метод не менялся с 1880-х годов. Очень часто в микроскоп невозможно определить конкретный штамм бактерий, тем более, если инфекция смешанная.

Пэллен и его коллеги впервые применили для диагностики «метод дробовика», который ученые используют при секвенировании длинных участков ДНК. Суть метода в следующем. Геном дробится на случайные фрагменты, которые затем секвенируют обычными методами. Полученные таким образом перекрывающиеся нуклеотидные последовательности собирают с помощью специальных программ в единое целое. Используя настольный секвенатор Illumina MiSeq, ученые выявили ДНК туберкулезной бактерии во всех восьми исследуемых образцах мокроты и смогли определить штамм возбудителя в семи из них. Для разных образцов процесс занял от одного до двух дней.

Проведенное исследование было призвано принципиально подтвердить возможность использования метода для диагностики туберкулеза. Теперь группа Пэллена планирует продолжить изучение его возможностей на более широком спектре образцов.

По запаху

А вот пример совершенно иного подхода к идентификации патогенных микроорганизмов. Команда химиков и микробиологов из Лестерского Университета (Великобритания) разработала метод, позволяющий выявлять десять различных штаммов патогенной бактерии Clostridium difficile по выделяемым ими комбинациям летучих органических соединений (ЛОС).

C. difficile вызывает тяжелую диарею у пациентов, прошедших курс лечения антибиотиками в стационаре. Различные штаммы бактерии сильно различаются по своей патогенности, поэтому быстрая и точная диагностика очень важна. Стандартные тесты не позволяют быстро выявить штамм микроорганизма. При этом комбинации ЛОС уникальны для каждого штамма. «Запах» каждого из них формируют такие вещества, как метанол, диметиламин, p-кресол, а также соединения серы. При помощи масс-спектрометра авторы работы выявили в общей сложности 69 видов ЛОС. Ученые планируют продолжить работу в этом направлении и создать доступный диагностический инструмент, способный практически мгновенно по уникальному «запаху» выявить присутствие в фекалиях больного определенного бактериального штамма, даже если бактерии представлены в образце в очень небольшом количестве.

Бактерия или вирус?

Тем временем исследователи из Школы медицины Университета Дьюка (США) разработали и успешно испытали методику, позволяющую с 90-процентной точностью выяснить вирусную природу инфекции верхних дыхательных путей, исключив бактериальное заражение, и избежать таким образом необоснованного применения антибиотиков.

В отличие от действующих методик, которые выявляют следы конкретных патогенов в крови, Джеффри Гинзбург (Geoffrey S. Ginsburg) и его коллеги смотрели, насколько активно в клетках крови работают три десятка генов, специфично вовлеченных в иммунный ответ на острую респираторную вирусную инфекцию (ОРВИ).

Испытание метода на 102 добровольцах, поступивших в приемное отделение больницы с повышенной температурой, позволило установить, что 28 из них заражены вирусной, а 39 — бактериальной инфекцией. Чувствительность метода к присутствию вируса составила 89 процентов, а точность — 94 процента. Результаты анализа были готовы через 12 часов, но Гинзбург уверяет, что в дальнейшем это время удастся сократить.

«В свете грозящих человечеству пандемий различных вирусов становится чрезвычайно важной более быстрая и значительно более точная диагностика наличия вирусной инфекции, чем используемая в клинической практике в настоящее время, — отмечает Гинзбург. — Эти анализы для подтверждения присутствия инфекции требуют знания, о каком патогене идет речь, так как являются штаммо-специфичными. Предложенный нами метод может быть использован при появлении новых, ранее неизвестных патогенов, в том числе в случае биотерроризма».

Соавтор Гинзбурга Кристофер Вудс (Christopher W. Woods) отмечает еще одну причину, по которой технологию стоит как можно быстрее внедрять в практику. «Метод, позволяющий точно идентифицировать вирусную инфекцию, при которой применение антибиотиков бесполезно, даст возможность снизить неоправданное использование антибактериальных препаратов и тем самым ограничить процесс появления все более резистентных патогенов», — считает Вудс. Распространение устойчивости к антибиотикам у микроорганизмов — одна из самых серьезных проблем, которые угрожают человечеству. И ученые из разных областей пытаются предотвратить катастрофу, о которой большинство людей даже не догадываются.

Ежегодно миллионы людей во всем мире, несмотря на относительную доступность существующих методов лечения, умирают от бактериальных инфекций, во многом из-за слишком поздно или неправильно поставленного диагноза. Все идет к тому, что в ближайшем будущем традиционные методы диагностики заменят новые, современные технологии, позволяющие не только очень быстро и точно выявить возбудителя инфекционного заболевания, но и узнать о нем много другой информации, критически важной для эффективной терапии.

По бактериальной ДНК

В первую очередь речь идет о методах секвенирования (расшифровки ДНК) нового поколения (next-generation sequencing, NGS), сравнительно высокая скорость получения результата и дешевизна которых делает их более современной альтернативой традиционным микробиологическим техникам. А также заменой или увеличивающим эффективность дополнением к быстродействующему, но дорогостоящему методу полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принципы работы NGS основаны на одновременной расшифровке сразу нескольких участков бактериального генома.

Так, междисциплинарная группа исследователей из Университета Джорджа Вашингтона (США) сообщила в журнале Journal of Clinical Microbiology об успешном опыте применения NGS для выявления патогенов, которые вызывают пневмонию у пациентов, находящихся на аппарате искусственной вентиляции легких. Заболевание развивается довольно часто и может убить и без того ослабленного пациента, так что срочная диагностика инфекции в прямом смысле жизненно необходима. NGS позволило выявить ДНК патогенов в 72 процентах образцов бронхиальных выделений. При этом метод позволил определить состав и количество микроорганизмов в образцах значительно более точно, чем стандартные микробиологические методы. Авторы надеются, что технологии NGS очень скоро войдут в обычную клиническую практику.

Параллельно с американскими специалистами над разработкой и внедрением современных методов диагностики работает группа под руководством профессора Марк Пэллен (Mark Pallen) из Школы медицины Уорвикского университета (Великобритания). Ранее Пэллен и его коллеги при помощи NGS реконструировали геном возбудителя бруцеллеза — бактерии Brucella melitensis. Ее ДНК была выделена из 700-летних человеческих костных останков, найденных во время раскопок в средневековой сардинской деревушке.

Теперь ученые предложили новый подход к диагностике туберкулеза. Сегодня чтобы диагностировать заболевание, нужно вырастить бактерии из образца мокроты (иногда это занимает недели и месяцы) и исследовать их под микроскопом. Этот метод не менялся с 1880-х годов. Очень часто в микроскоп невозможно определить конкретный штамм бактерий, тем более, если инфекция смешанная.

Пэллен и его коллеги впервые применили для диагностики «метод дробовика», который ученые используют при секвенировании длинных участков ДНК. Суть метода в следующем. Геном дробится на случайные фрагменты, которые затем секвенируют обычными методами. Полученные таким образом перекрывающиеся нуклеотидные последовательности собирают с помощью специальных программ в единое целое. Используя настольный секвенатор Illumina MiSeq, ученые выявили ДНК туберкулезной бактерии во всех восьми исследуемых образцах мокроты и смогли определить штамм возбудителя в семи из них. Для разных образцов процесс занял от одного до двух дней.

Проведенное исследование было призвано принципиально подтвердить возможность использования метода для диагностики туберкулеза. Теперь группа Пэллена планирует продолжить изучение его возможностей на более широком спектре образцов.

По запаху

А вот пример совершенно иного подхода к идентификации патогенных микроорганизмов. Команда химиков и микробиологов из Лестерского Университета (Великобритания) разработала метод, позволяющий выявлять десять различных штаммов патогенной бактерии Clostridium difficile по выделяемым ими комбинациям летучих органических соединений (ЛОС).

C. difficile вызывает тяжелую диарею у пациентов, прошедших курс лечения антибиотиками в стационаре. Различные штаммы бактерии сильно различаются по своей патогенности, поэтому быстрая и точная диагностика очень важна. Стандартные тесты не позволяют быстро выявить штамм микроорганизма. При этом комбинации ЛОС уникальны для каждого штамма. «Запах» каждого из них формируют такие вещества, как метанол, диметиламин, p-кресол, а также соединения серы. При помощи масс-спектрометра авторы работы выявили в общей сложности 69 видов ЛОС. Ученые планируют продолжить работу в этом направлении и создать доступный диагностический инструмент, способный практически мгновенно по уникальному «запаху» выявить присутствие в фекалиях больного определенного бактериального штамма, даже если бактерии представлены в образце в очень небольшом количестве.

Бактерия или вирус?

Тем временем исследователи из Школы медицины Университета Дьюка (США) разработали и успешно испытали методику, позволяющую с 90-процентной точностью выяснить вирусную природу инфекции верхних дыхательных путей, исключив бактериальное заражение, и избежать таким образом необоснованного применения антибиотиков.

В отличие от действующих методик, которые выявляют следы конкретных патогенов в крови, Джеффри Гинзбург (Geoffrey S. Ginsburg) и его коллеги смотрели, насколько активно в клетках крови работают три десятка генов, специфично вовлеченных в иммунный ответ на острую респираторную вирусную инфекцию (ОРВИ).

Испытание метода на 102 добровольцах, поступивших в приемное отделение больницы с повышенной температурой, позволило установить, что 28 из них заражены вирусной, а 39 — бактериальной инфекцией. Чувствительность метода к присутствию вируса составила 89 процентов, а точность — 94 процента. Результаты анализа были готовы через 12 часов, но Гинзбург уверяет, что в дальнейшем это время удастся сократить.

«В свете грозящих человечеству пандемий различных вирусов становится чрезвычайно важной более быстрая и значительно более точная диагностика наличия вирусной инфекции, чем используемая в клинической практике в настоящее время, — отмечает Гинзбург. — Эти анализы для подтверждения присутствия инфекции требуют знания, о каком патогене идет речь, так как являются штаммо-специфичными. Предложенный нами метод может быть использован при появлении новых, ранее неизвестных патогенов, в том числе в случае биотерроризма».

Соавтор Гинзбурга Кристофер Вудс (Christopher W. Woods) отмечает еще одну причину, по которой технологию стоит как можно быстрее внедрять в практику. «Метод, позволяющий точно идентифицировать вирусную инфекцию, при которой применение антибиотиков бесполезно, даст возможность снизить неоправданное использование антибактериальных препаратов и тем самым ограничить процесс появления все более резистентных патогенов», — считает Вудс. Распространение устойчивости к антибиотикам у микроорганизмов — одна из самых серьезных проблем, которые угрожают человечеству. И ученые из разных областей пытаются предотвратить катастрофу, о которой большинство людей даже не догадываются.