«МУ 1.2.2740-10. 1.2. Гигиена, токсикология, санитария. Порядок отбора проб для выявления, идентификации и характеристики действия наноматериалов в водных беспозвоночных. Методические указания» (утв. Роспотребнадзором 23.09.2010) «МУ 1.2.2741-10. 1.2. Гигиена, токсикология, санитария. Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных. Методические указания» (утв. Роспотребнадзором 23.09.2010) «МР 2.2.4.0009-10. Профилактика заболеваний суставов нижних конечностей профессиональной этиологии на основе использования низкоинтенсивного лазерного излучения. Методические рекомендации» (утв. Роспотребнадзором 23.09.2010) <Письмо> ФМБА России от 22.09.2010 N 32-024/650 «Об отмене еженедельных донесений о выданных свидетельствах об аккредитации»

Введен в действие с 10 октября 2010 года (пункт 4 данного документа). Текст документа

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
23 сентября 2010 года

Дата введения —
10 октября 2010 года

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

ПОРЯДОК
ОТБОРА ПРОБ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ХАРАКТЕРИСТИКИ ДЕЙСТВИЯ НАНОМАТЕРИАЛОВ В ВОДНЫХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУ 1.2.2740-10

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт питания РАМН; Учреждением Российской академии наук Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова РАН; Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы» (ФГУП ВНИИМС); Учреждением Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН; Учреждением Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н.Баха (ИНБИ РАН); ООО «Интерлаб».
2. Разработаны в рамках реализации Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2010 годы».
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 23 сентября 2010 г.
4. Введены в действие с 10 октября 2010 г.
5. Введены впервые.
6. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают требования к методам отбора проб органов и тканей, предназначенных для выявления и идентификации наноматериалов в водных беспозвоночных и характеристики действия на них наноматериалов. 1.2. Требования, изложенные в настоящих методических указаниях, применяются в ходе проведения исследований по оценке безопасности наноматериалов в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с воздействием наночастиц и наноматериалов на организм человека и объекты окружающей среды. 1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единства методов и средств отбора проб в ходе оценки безопасности наноматериалов и нанотехнологий для состояния здоровья человека. 1.4. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями и иными организациями и учреждениями, проводящими исследования по оценке безопасности наноматериалов.

II. Нормативные ссылки

2.1. Федеральный закон Российской Федерации от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения». 2.2. Федеральный закон Российской Федерации от 2 января 2000 г. N 29-ФЗ «О качестве и безопасности пищевых продуктов». 2.3. Федеральный закон Российской Федерации от 26 июня 2008 г. N 102-ФЗ «Об обеспечении единства измерений». 2.4. Федеральный закон Российской Федерации от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ «О техническом регулировании». 2.5. Федеральный закон Российской Федерации от 10 января 2002 г. N 7-ФЗ «Об охране окружающей среды». 2.6. Постановление Правительства Российской Федерации от 2 февраля 2006 г. N 60 «Об утверждении Положения о проведении социально-гигиенического мониторинга». 2.7. Постановление Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N 322 «Об утверждении Положения о Федеральной службе в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека». 2.8. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19 июня 2003 г. N 267 «Об утверждении Правил лабораторной практики». 2.9. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации и Главного государственного инспектора Российской Федерации по охране природы от 10.11.1997 N 25 и от 10.11.1997 N 03-19/24-3483 «Об использовании методологии оценки риска для управления качеством окружающей среды и здоровья населения в Российской Федерации». 2.10. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 23 июля 2007 г. N 54 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы». 2.11. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 г. N 79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов». 2.12. МУ 1.2.2520-09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов». 2.13. МР 1.2.2566-09 «Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo». 2.14. МР 1.2.2522-09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека». Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 01.07.2009. 2.15. ГОСТ 8.207-76 «Государственная система обеспечения единства измерений. Прямые измерения с многократными наблюдениями. Методы обработки результатов наблюдений. Основные положения». 2.16. ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности». 2.17. ГОСТ 26678-85 «Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия». 2.18. ГОСТ 3-88 «Перчатки хирургические резиновые. Технические условия». 2.19. ГОСТ Р 51652-2000 «Спирт этиловый ректифицированный из пищевого сырья. Технические условия». 2.20. ГОСТ 21241-89 «Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний». 2.21. ГОСТ 21239-93 «Инструменты хирургические. Ножницы. Общие требования и методы испытаний». 2.22. ГОСТ 30393-95 «Инструменты хирургические. Скальпели со съемными лезвиями. Присоединительные размеры». 2.23. ГОСТ 24104-2001 «Весы лабораторные. Общие технические требования». 2.24. ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры». 2.25. ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия». 2.26. ГОСТ 12.2.003-91 «Система стандартов безопасности труда. Оборудование производственное. Общие требования безопасности». 2.27. ГОСТ 12.2.052-81 «Система стандартов безопасности труда. Оборудование, работающее с газообразным кислородом. Общие требования безопасности». 2.28. ГОСТ 12.1.004-91 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования». 2.29. ГОСТ Р 50444-92 «Приборы, аппараты и оборудование медицинские. Общие технические условия». 2.30. ГОСТ Р 51350-99 «Безопасность электрических контрольно-измерительных приборов и лабораторного оборудования. Часть 1. Общие требования».

III. Общие положения

3.1. Цель и назначение пробоотбора

3.1.1. Целью отбора проб является получение представительной и усредненной пробы, которая наиболее полно позволит выявить и идентифицировать исследуемые наноматериалы в организмах водных беспозвоночных и охарактеризовать воздействие на них наночастиц и наноматериалов в ходе проведения исследований по токсиколого-гигиенической характеристике наночастиц и наноматериалов и оценке их воздействия на состояние объектов окружающей среды. 3.1.2. Назначение процедуры отбора проб заключается в отборе для заданной цели тех образцов органов, тканей или целых организмов беспозвоночных, в которых с наибольшей вероятностью можно выявить и идентифицировать исследуемые наноматериалы и которые с наибольшей вероятностью являются мишенями воздействия наноматериалов. 3.1.3. Биологические образцы, полученные от беспозвоночных, подвергшихся в условиях эксперимента (биологического тестирования) или в естественной среде обитания воздействию наночастиц и наноматериалов, могут содержать их остаточные количества и поэтому должны рассматриваться как объекты, обладающие потенциальной биологической опасностью. Особенности процедур отбора проб должны обеспечивать снижение риска воздействия наночастиц и наноматериалов на персонал организаций (лабораторий), проводящих отбор проб и последующие исследования биологических показателей, а также на население и окружающую среду до приемлемого уровня.

3.2. Требования к организации, производящей отбор проб

3.2.1. Организации, проводящие отбор проб, должны быть уполномочены в установленном порядке на право проведения санитарно-эпидемиологических экспертиз и исследований. 3.2.2. Организации, проводящие отбор проб, должны быть оснащены необходимым оборудованием, в т.ч. средствами измерений, прошедшими метрологический контроль и поверку (калибровку) в установленном порядке. 3.2.3. Эксплуатация оборудования проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения поверки (калибровки) средств измерений и текущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание. 3.2.4. Персонал, проводящий отбор проб, должен иметь профессиональную подготовку в области работы с водными организмами и пройти инструктаж по технике безопасности и методам преодоления последствий нештатных ситуаций, возникающих в процессе работы.

3.3. Перечень объектов и материалов, подлежащих пробоотбору

3.3.1. Перечень биологических материалов (тканей, органов, целых организмов беспозвоночных), являющихся предметом пробоотбора, определяется целями и задачами проводимых исследований, способом введения наноматериалов животным в эксперименте, физико-химическими характеристиками наноматериалов (размер частиц, химический и фазовый состав), а также имеющимися в распоряжении лаборатории, проводящей исследование, данными о местах накопления в организмах беспозвоночных наноматериалов и органах-мишенях их воздействия. 3.3.2. Общими требованиями к биологическому материалу являются максимальная концентрация исследуемого наноматериала в образце, а также отсутствие нежелательных примесей, которые могли бы исказить результаты, получаемые с помощью применяемых для анализа методик. 3.3.3. В качестве биологических объектов рекомендуется использовать следующие виды беспозвоночных: пресноводных усоногих рачков (Cladocera) — дафния (Daphnia magna), цериодафния (Ceriodaphnia affinis) и др.; пресноводных двустворчатых моллюсков (Bivalvia) — беззубка обыкновенная (Anodonta cygnea), перловица обыкновенная (Unio pictorum) и др.

3.4. Соблюдение правил надлежащей лабораторной практики

3.4.1. В процессе отбора проб беспозвоночных необходимо руководствоваться правилами надлежащей лабораторной практики в соответствии с положениями Приказа Минздрава России от 19 июня 2003 г. N 267. 3.4.2. Соблюдение правил надлежащей лабораторной практики обеспечивает: — систему качества процедуры пробоотбора; — документальное сопровождение всех этапов пробоотбора; — отсутствие неконтролируемых влияний процедур пробоотбора на результаты анализа наноматериалов и их биологического тестирования; — репрезентативность отбираемых проб.
3.4.3. Соблюдение правил надлежащей лабораторной практики применительно к процедурам отбора образцов водных беспозвоночных включает: — назначение руководителем организации лиц, ответственных за мониторинг качества и репрезентативности отбираемого биологического материала (из числа сотрудников, не участвующих в исследовании); — систему регистрации отбираемых образцов, их хранение и транспортирование в условиях, исключающих возможность порчи, изменения физико-химических и биологических свойств; — наличие и соблюдение стандартных операционных процедур (СОП) на все производственные операции, включая: составление списка (перечня) отбираемых проб, отбор, идентификацию, маркировку, предварительную обработку проб, использование и хранение исследуемых наноматериалов и вспомогательных реактивов; обслуживание и градуировку средств измерения (весов, пипеток, дозаторов), применяемых при пробоотборе; приготовление реактивов, кормов; протоколирование отбора проб; обслуживание помещений; обезвреживание или утилизацию биологических образцов (если это необходимо); ликвидацию последствий нештатных ситуаций; — наличие средств измерений, прошедших поверку (калибровку) в установленном порядке; — эксплуатацию оборудования в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению, регулярную фиксацию результатов поверки средств измерений и текущего ремонта оборудования в специальном журнале; — наличие помещения для содержания гидробионтов (аквариальной), обеспечивающего раздельное содержание различных видов животных и животных одного вида, используемых в исследованиях биологического действия различных наноматериалов, соответствующего санитарно-эпидемиологическим и ветеринарным требованиям; — наличие отдельных помещений, инвентаря и оборудования для работы с опасными для здоровья и жизни человека объектами исследования, соответствующих установленным санитарно-эпидемиологическим требованиям.

3.5. Соблюдение мер конфиденциальности

3.5.1. Сотрудники, принимающие участие в процессе отбора проб, обязаны соблюдать конфиденциальность в отношении любых данных (результатов наблюдений), полученных в ходе процедуры отбора проб, в соответствии с законодательством Российской Федерации. 3.5.2. Организация, проводящая пробоотбор, должна обеспечить конфиденциальность полученных в ходе пробоотбора данных (результатов наблюдений) о воздействии наноматериалов на водных беспозвоночных в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации.

3.6. Организация защиты проб от несанкционированных внешних воздействий

3.6.1. Организация, проводящая пробоотбор для выявления и идентификации наноматериалов в водных беспозвоночных, должна обеспечить защиту отбираемых проб от несанкционированных внешних воздействий. 3.6.2. Контейнер с пробой, направляемой на исследование, необходимо запечатать либо упаковать в сейф-пакет, опломбировать или опечатать его таким способом, чтобы несанкционированное вскрытие легко определялось.

3.7. Ответственность организации, производящей отбор проб

3.7.1. Ответственность за качественный отбор проб, репрезентативность отобранной пробы, оформление документов на пробы и их сохранность, а также за соблюдение правил техники безопасности в процессе отбора проб несут организации, проводящие пробоотбор. 3.7.2. Ответственность за сохранность проб и документации на пробы при перевозке, соблюдение правил техники безопасности при перевозке несут организации, осуществляющие перевозку проб.

IV. Процедура отбора проб

4.1. Составление плана (схемы) отбора проб

План (схема) отбора проб составляется перед началом исследований и должен включать следующие данные: 4.1.1) наименование выявляемого наноматериала, оценку его потенциальной опасности согласно МР 1.2.2522-09, свойства наноматериала (согласно данным производителя (поставщика) продукции и (или) литературным данным); 4.1.2) вид (виды) водных организмов, подлежащих пробоотбору; 4.1.3) вид отбираемых проб (исследуемого материала); 4.1.4) методику отбора проб;
4.1.5) перечень используемого для отбора проб оборудования и реактивов; 4.1.6) число отбираемых проб и их размер (масса, число особей); 4.1.7) инструкции по разделению отобранной пробы на части (выделению контрольной пробы при необходимости); 4.1.8) тип и характеристики тары для отбора, транспортирования и хранения проб; 4.1.9) способ маркировки проб;
4.1.10) специальные меры предосторожности при работе с наноматериалами; 4.1.11) условия хранения и транспортировки проб; 4.1.12) инструкции по очистке и хранению оборудования для отбора проб, инактивации био- и наноматериалов.

4.2. Протоколирование отбора проб

4.2.1. Процедура отбора проб должна быть запротоколирована по окончании процесса. В протоколе (акте) отбора проб указывают: — название организации, производившей отбор проб; — фамилии сотрудников, проводивших отбор проб; — место отбора проб (при отборе из естественных водоемов); — наименование исследуемого биологического материала (несокращенное родовое и видовое название животного, согласно действующей биологической номенклатуре в русской и латинской транскрипции), для крупных животных — наименование отбираемой ткани (органа); — цель исследования (медико-биологическое тестирование в целях экспертизы безопасности продукции наноиндустрии; плановый контроль и надзор и др.); — размер пробы (число особей или масса), единицы измерения; — метод отбора пробы;
— способ консервирования пробы;
— число повторов (реплик) отобранных образцов биологического материала, в т.ч. контрольных проб; — дата (год, месяц, число) и время суток, когда произведен отбор пробы; — порядок маркировки (нумерации) проб;
— сведения об опечатывании (опломбировании) проб; — наименование организации, в которую направлены пробы; — наименование показателей для определения в пробах; — опись дополнительных документов, прилагаемых к пробам (при необходимости); — дата и время суток отправки проб;
— способ отправки (транспортирования) проб; — отметка о месте хранения контрольной пробы; — подписи сотрудников, осуществивших отбор и транспортирование проб (с расшифровкой подписей). 4.2.2. Протокол (акт) отбора проб составляется в двух экземплярах, один из которых остается в организации, производившей пробоотбор, а другой передается организации, осуществляющей проведение лабораторных исследований. 4.2.3. При отборе однородных серийных проб биоматериала возможно составление единого протокола (акта) на серию проб (образцов) с обязательным указанием порядка нумерации и общей численности индивидуальных проб.

4.3. Меры по обеспечению репрезентативности пробоотбора

4.3.1. Количество особей крупных беспозвоночных или отбираемых образцов мелких ракообразных, используемых для исследований, должно быть достаточным для получения статистически достоверных результатов. При тестировании на биологических объектах удовлетворительная погрешность определения (доверительный интервал) исследуемого показателя принимается равным 10% при уровне значимости p < 0,05. В этом случае число особей (образцов) должно быть установлено на основе соотношения:

                                    __                                   /2                                 \/S                        дельта = ----- x t         ,                                   __     0,025,N-1                                 \/N

где:
дельта — абсолютная погрешность определения; N — численность группы (подбираемая экспериментально); t — значение критерия Стьюдента для уровня значимости p = 0,025 и числа степеней свободы N — 1;

2
S — квадрат выборочной дисперсии, определяемой по формуле:

                           2     1    n        _ 2                          S  = ----- SUM (X  - X) ,                               N - 1 i=1   i

где:
X — определенные в опыте значения биологического показателя или i
концентрации наночастиц;

_
X — их арифметическое среднее.
В большинстве случаев для обеспечения репрезентативности исследования каждая из исследуемых групп должна содержать не менее 10 экземпляров крупных беспозвоночных или 10 образцов мелких ракообразных. 4.3.2. Число проб тканей, получаемых от индивидуальных моллюсков, должно определяться целями и методами исследования, а также имеющимися данными об органотропности выявляемых наноматериалов. 4.3.3. При необходимости, для проведения исследований отбираются образцы здоровых особей той же видовой принадлежности, не подвергшихся воздействию наноматериалов. Не допускается отбор особей экстремально большого или малого размера, с видимыми уродствами, аномалиями развития, с видимыми признаками заболеваний, если иное не диктуется целями пробоотбора.

4.4. Порядок отбора точечной, объединенной, средней, лабораторной, контрольной проб биологического материала

4.4.1. Для выявления, идентификации и характеристики действия наноматериалов у водных беспозвоночных отбирают либо точечные пробы тканей и органов (моллюски), либо используют группы целых организмов (рачки). При исследовании органов, тканей объединенную пробу не формируют. При обследовании моллюсков каждый параметр характеризуется в пробах от индивидуальных животных, после чего полученный результат усредняется (статистически обрабатывается). 4.4.2. Точечная проба, отобранная для выявления и идентификации определенного наноматериала в биологическом материале, является одновременно и средней пробой, из которой (при необходимости) простым делением на две части формируют лабораторную и контрольную пробы. 4.4.3. В случае проведения исследований в целях арбитража, на месте в процессе отбора проб выделяют контрольные (референтные, арбитражные) пробы. Масса (размер) контрольной пробы должна быть не более массы лабораторной пробы, но не менее пробы, необходимой для проведения анализов, определяемых целью исследования. 4.4.4. Контрольная проба хранится при регламентированных для данного вида проб режимах в сейф-пакетах или в опломбированной (опечатанной) таре. Длительность хранения контрольных проб определяют так же, как и для опытных проб.

4.5. Методы препарирования беспозвоночных для определения наноматериалов

4.5.1. При отборе проб следует использовать следующее основное и вспомогательное лабораторное оборудование: Холодильник бытовой электрический ГОСТ 26678-85 Морозильная камера, обеспечивающая
температуру -20 °C или ниже (производства фирмы «Vestfrost», Дания или аналогичная) Весы лабораторные общего назначения 2-го класса

 точности с погрешностью взвешивания не более 0,001 г        ГОСТ 24104-88Е Пинцет медицинский                                          ГОСТ 21241-89 Ножницы медицинские                                         ГОСТ 21239-93 Скальпель (допускается использование скальпелей с одноразовыми сменными лезвиями)                           ГОСТ 30393-95 Мельничный газ N 25 - 43, число отверстий, приходящихся на 1 кв. см, соответствует номеру              ГОСТ 4403-91 Сачки диаметром 1 - 2 см из мельничного газа Фильтры бумажные обеззоленные "белая лента",                ГОСТ 12026-76 или термоконтейнеры различной вместимости,                  ТУ 6-09-1678-77 

или медицинская сумка-холодильник
4.5.2. При отборе проб следует применять следующие расходуемые материалы: Пробирки для микропроб однократного применения типа «Эппендорф» вместимостью 0,5, 1,5 и 2,0 куб. см ТУ 64-2-300-80 Криопробирки вместимостью 2,0 куб. см
Штативы для пробирок
Перчатки хирургические резиновые ГОСТ 3-88 Флаконы и банки цилиндрические полиэтиленовые или политетрафторэтиленовые с навинчивающимися крышками для отбора и хранения проб и реактивов

 вместимостью 100, 250, 500, 1000, 2000 куб. см              ТУ 6-19-45 Спирт этиловый                                              ГОСТ 18300-87 

4.5.3. Пробы рачков отбирают из обследуемого водоема сачком соответствующего диаметра, после чего дают стечь воде и подсушивают отобранные особи на бумажном фильтре. 4.5.4. При вскрытии моллюсков отбирают кусочки тканей или органов стерильными инструментами. Необходимость отбора проб каждого из органов определяют по предположительной локализации исследуемого наноматериала согласно документации, предоставляемой производителем (поставщиком) продукции. При отсутствии сведений о локализации наноматериала органы животного отбирают в последовательности: жабры — пищеварительный тракт — печень — сердце — гонады — мышечная ткань. 4.5.5. Пробу делят на две части. Одну часть фиксируют в подходящем фиксирующем растворе (п. 4.6) для последующего светооптического или электронно-микроскопического анализа, вторую замораживают при температуре -70 °C.

4.6. Фиксация (консервация) биологических проб для определения наноматериалов

4.6.1. Для светооптического анализа наноматериалов в рачках их целиком фиксируют в 70% этиловом спирте или 10%-м растворе формалина. 4.6.2. Для других способов анализа наноматериалов рачков целиком замораживают при температуре -70 °C. 4.6.3. Часть пробы тканей или органов моллюсков помещают в пластиковые сосуды соответствующего объема и хранят при температуре -70 °C. 4.6.4. Для электронно-микроскопического анализа наноматериалов пробы тканей и органов моллюсков фиксируют в смеси 2,5% глутарового альдегида на 0,1 М фосфатно-солевом буфере pH 7,2 — 7,4 с добавлением 2% нейтрального формалина. Возможно длительное (до 2 месяцев) хранение образцов в фиксаторе при температуре 4 °C. Нельзя допускать замораживание образцов, т.к. образующиеся кристаллы льда разрушают ткани.

4.7. Меры предосторожности при работе с наноматериалами, содержащимися в беспозвоночных, препарировании биоматериала, отборе и консервации проб

4.7.1. Перед проведением отбора биологических проб от беспозвоночных, подвергшихся воздействию наноматериала, на основании документации производителя (поставщика) продукции наноиндустрии и собственных данных организации, проводящей отбор проб, должна быть выполнена предварительная оценка уровня потенциальной опасности наноматериала для здоровья человека в соответствии с МР 1.2.2522-09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека». 4.7.2. Биологические образцы, предположительно содержащие наночастицы и наноматериалы, следует рассматривать как потенциально опасные и соблюдать в обращении с ними соответствующие меры предосторожности для потенциально опасного биологического материала согласно стандартным операционным процедурам (СОП), установленным в лаборатории, проводящей исследование. 4.7.3. В процессе выполнения работ с наноматериалами обязательным является ношение персоналом рабочей/защитной одежды (халат, шапочка, спецобувь, перчатки). При выполнении работ, при которых возможно образование аэрозолей наноматериалов, дополнительно используются средства индивидуальной защиты (защитные очки, респиратор). На рабочих местах запрещается принимать еду, пить, курить, употреблять жевательную резинку, наносить косметику, а также хранить продукты питания, напитки, табачные изделия, выращивать комнатные растения. После завершения работ с наноматериалами проводят влажную уборку на рабочем месте и в помещении. 4.7.4. Работы с биологическими материалами, предположительно содержащими наночастицы и наноматериалы, способные к образованию аэрозоля, следует проводить в ламинаре или в отдельных боксовых помещениях, снабженных системой вентиляции. 4.7.5. Возникающие в ходе пробоотбора отходы биологических материалов инактивируются автоклавированием в течение 1 ч при давлении в 1,5 атмосферы или кипячением при 100 °C в течение 30 мин. После этого биологические материалы, предположительно содержащие наночастицы, сдают в специализированные организации, осуществляющие утилизацию потенциально опасных биологических отходов. Запрещается: утилизация биологических материалов с бытовым мусором, слив жидких биологических образцов в канализацию. 4.7.6. После препарирования отобранных проб инструменты, столики для манипуляций, банки, бачки, садки должны обеззараживаться путем замачивания в дезинфицирующем растворе и последующего автоклавирования. 4.7.7. Все рабочие подразделения должны быть обеспечены аварийными аптечками. В состав аварийной аптечки входят: спирт этиловый 70° (два флакона по 100 куб. см), 2 — 3 навески перманганата калия для приготовления 0,05%-го раствора (12,5 мг перманганата калия + 25 куб. см воды), вода для инъекций, одноразовые шприцы, глазные пипетки, 5% настойка йода, 3%-й раствор перекиси водорода, ножницы с закругленными браншами, перевязочные средства (вата, бинты и пр.), жгут и нашатырный спирт. 4.7.8. По окончании работы отобранные пробы должны переноситься в хранилища (сейфы, холодильники, термостаты и т.д.). Не допускается оставлять биологические материалы и препараты, содержащие наноматериалы и наночастицы, после окончания работы на открытых местах или в не опечатанных хранилищах. 4.7.9. Поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми, устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы не должны быть скользкими. Лабораторная мебель должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств, поверхность столов не должна иметь трещин и швов.

4.8. Меры по устранению возможных нештатных ситуаций

4.8.1. При аварии, сопровождающейся загрязнением воздуха, производственного помещения, спецодежды наноматериалами или предположительно содержащими их биологическими образцами, все находящиеся в помещении лица должны немедленно прекратить работу и принять меры по устранению загрязнения, установленные в СОП. 4.8.2. При аварии, связанной с попаданием наночастиц и содержащих их биологических образцов на кожу или слизистые покровы, следует промыть их немедленно большим количеством воды, обработать 70% этиловым спиртом. 4.8.3. Сотрудники должны пройти инструктаж о поведении в случае аварии. В подразделениях должен быть разработан план ликвидации аварии, иметься запас дезинфицирующих средств.

V. Транспортирование и хранение биологических образцов

5.1. Тара для транспортирования биологических образцов, упаковка и маркировка

5.1.1. Подлежащие транспортированию биологические образцы от водных беспозвоночных, подвергнутых воздействию наноматериалов, следует собирать в одноразовые стерильные контейнеры (флаконы, пробирки) с завинчивающейся крышкой (материал — стекло, полиэтилен, полипропилен, политетрафторэтилен), позволяющие осуществлять консервацию или глубокую заморозку проб. Контейнеры, применяемые для транспортирования образцов, должны обеспечивать герметичность, стерильность и целостность образцов, а также исключать при открытии возможность образования аэрозоля. 5.1.2. Для отбора пробы необходимо использовать контейнер такого объема, чтобы не допустить его заполнения доверху. 5.1.3. Контейнер с пробой необходимо запечатать либо упаковать в сейф-пакет, который опломбировать или опечатать. Контейнеры для транспортирования материала должны обеспечить герметичность, стерильность и целостность образцов, а также исключать возможность образования аэрозоля при открытии. 5.1.4. Каждый отобранный образец должен быть идентифицирован таким способом, чтобы исключить возможность изменения данных о пробе, промаркирован таким образом, чтобы надпись не стиралась. На пробирке или флаконе в обязательном порядке указывают номер пробы, соответствующий акту отбора проб или прилагаемой к нему описи. Акт отбора проб составляется на все отправляемые в лабораторию пробы в соответствии с п. 4.2.1. При необходимости указывается дополнительная информация. Запрещается: указывать порядковые номера и иные сведения о пробах на крышках (пробках) пробирок или флаконов с пробами и других элементах тары, удаляемых при вскрытии проб. 5.1.5. При отборе серии однородных биологических образцов допускается их совместная упаковка и опечатывание в сейф-пакете. При этом к акту отбора проб прилагается опись проб, содержащая сведения об общем количестве проб и порядке их нумерации.

5.2. Температурный режим, допустимая длительность транспортирования

5.2.1. Перевозка и хранение материала осуществляется в условиях «холодовой цепи» с обеспечением необходимого контроля температурного и влажностного режима, установленного в соответствии с СОП для данного вида проб. 5.2.2. Для соблюдения требуемого температурного режима контейнеры с пробами или содержащие их сейф-пакеты помещают в сумку-холодильник или термоконтейнер с хладагентами. При соблюдении противоэпидемического режима возможна перевозка материала для исследования в металлическом термосе с термопакетами, льдом или сухим льдом.

5.3. Требования к транспортным средствам

5.3.1. Для перевозки биологического материала должны использоваться специально оборудованные транспортные средства, оборудование которых обеспечивает поддержание постоянства состояния, состава и качества проб, а также безопасность окружающей среды, требования асептики и антисептики, отсутствие резкого перепада температур и влажности, предохранение образцов от вредного воздействия окружающей среды и погодных условий, защиту контейнеров с образцами от разрушения в случае аварии транспортного средства. 5.3.2. При транспортировании проб на значительные расстояния допускается использование авиационного или железнодорожного транспорта при условиях выделения для сумок (укладок), содержащих контейнеры с образцами биологического материала, отдельного багажного места. 5.3.3. Не допускается транспортирование образцов общественным городским и пригородным транспортом, а также необорудованным личным автотранспортом. 5.3.4. Сумки (укладки), содержащие контейнеры с образцами, должны быть в обязательном порядке маркированы с нанесением предупредительных надписей «биоопасность», «наноопасность», «содержит наноматериалы/наночастицы» и т.д.

5.4. Требования к хранилищу (банку) биологических образцов

5.4.1. Хранение биологических образцов, полученных от водных беспозвоночных, должно осуществляться в отдельных, хорошо вентилируемых помещениях, оборудованных раковиной с подводкой воды и бактерицидными лампами для обеззараживания воздуха и поверхностей, в холодильниках и морозильных камерах с контролем температурного режима. Не допускается хранение образцов в помещениях общего пользования, в холодильниках или морозильных камерах, используемых для хранения пищевых продуктов, кормов, химических реактивов и т.д. 5.4.2. Стены, пол и мебель помещений для хранения биологических образцов должны быть покрыты материалами, выдерживающими влажную уборку и дезинфекцию. 5.4.3. Помещение для хранения образцов дополнительно оборудуется рабочим столом, контейнером для раздельного сбора мусора (упаковочной тары, тампонов с дезрастворами, бумаги, транспортных наполнителей и т.д.), емкостью для приготовления дезраствора, источниками УФ-света (кварцевыми лампами) для проведения стерилизации помещения. 5.4.4. Контейнеры с образцами, полученными от водных беспозвоночных одной (опытной или контрольной) группы, должны храниться в пластмассовых, металлических или стеклянных коробках или укладках с крышками, отдельно от образцов, полученных от организмов других групп и организмов, обработанных другими видами наноматериалов. Коробки (укладки) для хранения контейнеров с образцами должны быть маркированы (подписаны) для облегчения поиска необходимого образца. Содержание надписи должно включать: — дату отбора проб;
— наименование эксперимента (исследуемого наноматериала); — наименование или номер группы;
— предельный срок хранения;
— фамилию ответственного лица.
Запрещается наносить маркирующие надписи на крышки коробок (укладок) во избежание их случайной замены при извлечении образцов. Категорически запрещается хранение неподписанных контейнеров, коробок, укладок с пробами биологического материала. При выявлении неподписанных контейнеров с пробами или таких контейнеров, подписи на которых невозможно прочитать, контейнеры (без их вскрытия) подлежат утилизации вместе с потенциально опасным биологическим материалом (п. 4.7.5). 5.4.5. Помещение для хранения биологических образцов должно быть оборудовано кодовым замком либо аналогичным устройством и охранной сигнализацией для ограничения несанкционированного доступа.

---

Примечание.
Нумерация пунктов дана в соответствии с официальным текстом документа.

---

5.6. Признаки, свидетельствующие о порче (непригодности) биологических образцов

5.6.1. Для лабораторных исследований не принимаются образцы с нарушенной герметичностью и целостностью упаковки, сорванными пломбами и печатями. 5.6.2. Непригодными для исследований считают образцы, которые доставлены в загрязненной посуде, со следами физического воздействия (трещинами, отколотыми краями и другими дефектами). 5.6.3. Забраковываются образцы биологических тканей с явно выраженными признаками порчи (резкий, неприятный гнилостный запах, изменения консистенции, цвета, наличие визуально различимого поражения плесенью, брожение, гниение, ослизнение, прокисание и др.). 5.6.4. Пробы для морфологического (светооптического или электронно-микроскопического) исследования забраковываются в том случае, если они подверглись замораживанию-оттаиванию. 5.6.5. На непригодные для исследования образцы составляется акт о списании, в котором указывают причину забраковки пробы. Забракованные пробы уничтожаются в установленном порядке.

Приложение 1
к МУ 1.2.2740-10

ТИПОВОЙ АКТ
ОТБОРА ПРОБ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ НАНОМАТЕРИАЛОВ В ВОДНЫХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

---

(штамп организации, осуществляющей отбор проб) адрес: ____________________________________________________________________ тел.: ___________ факс:___________ электронная почта: _____________________

                                     АКТ                                 отбора проб N ______                                        от "___" __________ 20__ г. 

Город (район, населенный пункт) ___________________________________________ Место отбора проб: ________________________________________________________

---

(при отборе проб в естественном водоеме указать его месторасположение) Мною (нами), _____________________________________________________________,

(указать должность, Ф.И.О.) в присутствии _____________________________________________________________

(указать должность, Ф.И.О.) проведен отбор проб _______________________________________________________

(указать наименование отбираемых проб, вид организмов)

---

Цель проведения исследований:

---

(экспертиза безопасности продукции наноиндустрии, плановый контроль

             и надзор; выявление последствий техногенной аварии                        или иной нештатной ситуации)

Количество образца, единицы измерения: ____________________________________ Проба отобрана методом ____________________________________________________ Способ консервации пробы: _________________________________________________ Общее число отобранных повторов образцов: _________________________________

из них контрольных ____________________________________________________ из них лабораторных ___________________________________________________

Пробы отобраны в ____ ч ____ мин.
пронумерованы и опломбированы (опечатаны) _________________________________

---

(указать порядок нумерации проб, номер пломбы, номер сейф-пакета) направляются в ____________________________________________________________

---

(указать наименование лаборатории) для _______________________________________________________________________

---

(указать перечень биологических показателей и наночастиц (наноматериалов),

по которым необходимо провести исследования)

---

Отметки о сопроводительных документах, направляемых с пробами:

---

---

(наименование, номер и дата сопроводительного документа)

Дата отправки проб ______, время: _____ ч ____ мин. Способ отправки (доставки) проб:

---

Отметка о месте хранения контрольной пробы: _______________________________

---

Подпись представителя(ей), осуществлявших отбор проб:

---

      (подпись)                                           (Ф.И.О.) ___________________                            ____________________________      (подпись)                                           (Ф.И.О.)

Представитель организации, осуществлявшей отправку, доставку проб в лабораторию:

---

(подпись) (Ф.И.О.) Настоящий акт составлен в двух экземплярах под одним номером и вручен (направлен):
— 1-й экземпляр предназначен для отправки в лабораторию; — 2-й экземпляр хранится у специалиста (в организации), осуществлявшего отбор проб.

Приложение 2
(справочное)

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Контрольная проба — часть средней пробы, хранящаяся в организации (лаборатории), проводящей отбор проб и предназначенная для повторного или арбитражного исследования в случае конфликта интересов сторон, принимающих участие в исследовании безопасности наноматериалов. Лабораторная проба — часть средней пробы, предназначенная для формирования тестового образца (образцов), направляемого на исследования в организацию (лабораторию), изучающую характер действия наноматериалов на лабораторных животных. Надлежащая лабораторная практика (Стандарт GLP, «Good Laboratory Practice») — система норм, правил и указаний, направленных на обеспечение согласованности и достоверности результатов лабораторных исследований, в т.ч. репрезентативность отбора проб. Наноматериалы — вид продукции наноиндустрии, вещества и композиции веществ, представляющие собой искусственно или естественно упорядоченную систему базовых элементов с нанометрическими характеристическими размерами и особым проявлением физического и (или) химического взаимодействий при кооперации наноразмерных элементов, обеспечивающих существенное улучшение или возникновение совокупности качественно новых (в т.ч. ранее неизвестных) механических, химических, электрофизических, оптических, теплофизических и других свойств данных материалов, определяемых проявлением наномасштабных факторов. Проба — одна или несколько единиц (объемов) материала, отобранная установленным способом из совокупности (лота, партии), позволяющая получить информацию о заданной характеристике совокупности и являющаяся основой для принятия решения о совокупности, веществе или их характеристике. Репрезентативная проба сохраняет характеристики лота, партии, из которого была выбрана. Ее частным случаем является случай простой случайной пробы (точечная проба), когда у каждого элемента или части вещества есть равная вероятность попасть в пробу. Стандартные операционные процедуры — документы, в которых детально изложено выполнение определенных лабораторных процедур, которые, как правило, не детализированы в протоколах исследований и методических руководствах.

---

Введен в действие с 10 октября 2010 года (пункт 3 данного документа) Текст документа

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
23 сентября 2010 года

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

ПОРЯДОК
ОТБОРА ПРОБ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ НАНОМАТЕРИАЛОВ В ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУ 1.2.2741-10

1. Авторский коллектив: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт питания РАМН; Государственное учебно-научное учреждение Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова; Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН; Федеральное государственное унитарное предприятие «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы» (ФГУП ВНИИМС); Учреждение Российской Академии наук Институт биохимии им. А.Н.Баха (ИНБИ РАН); Учреждение Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН; ООО «Интерлаб». Разработаны в рамках Федеральной целевой программы «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2010 гг.».
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 23 сентября 2010 г.
3. Введены в действие с 10 октября 2010 г.
4. Введены впервые.
5. Область применения

1.1. Настоящие Методические указания устанавливают требования к методам отбора от лабораторных животных проб биологических материалов, предназначенных для определения абиогенных (техногенных) и биогенных наночастиц и наноматериалов искусственного происхождения с учетом данных о путях поступления наноматериалов в организм и предполагаемых органах, в которых может происходить их накопление. 1.2. Требования, изложенные в настоящих Методических указаниях, применяются в ходе проведения исследований по оценке безопасности наночастиц и наноматериалов искусственного происхождения в целях принятия решений по оценке рисков, связанных с воздействием наночастиц и наноматериалов на организм человека. 1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единства методов и средств отбора проб в ходе оценки безопасности наноматериалов и нанотехнологий для состояния здоровья человека и компонентов естественных биоценозов. 1.4. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями и иными организациями и учреждениями, проводящими исследования по оценке безопасности наноматериалов.

II. Нормативные ссылки

2.1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения». 2.2. Федеральный закон от 2 января 2000 г. N 29-ФЗ «О качестве и безопасности пищевых продуктов». 2.3. Федеральный закон от 26 июня 2008 г. N 102-ФЗ «Об обеспечении единства измерений». 2.4. Федеральный закон от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ «О техническом регулировании». 2.5. Федеральный закон от 10 января 2002 г. N 7-ФЗ «Об охране окружающей среды». 2.6. Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. N 987 «О государственном надзоре и контроле в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов». 2.7. Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. N 988 «О государственной регистрации новых пищевых продуктов, материалов и изделий». 2.8. Постановление Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N 322 «Об утверждении Положения о Федеральной службе в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека». 2.9. Приказ Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. N 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». 2.10. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19 июня 2003 г. N 267 «Об утверждении Правил лабораторной практики». 2.11. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации и Главного государственного инспектора Российской Федерации по охране природы от 10.11.1997 N 25 и от 10.11.1997 N 03-19/24-3483 «Об использовании методологии оценки риска для управления качеством окружающей среды и здоровья населения в Российской Федерации». 2.12. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 23 июля 2007 г. N 54 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы». 2.13. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 г. N 79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов». 2.14. СП 2.2.2.1327-03 «Гигиенические требования к организации технологических процессов, производственному оборудованию и рабочему инструменту». 2.15. СанПиН 2.1.7.1322-03 «Гигиенические требования к размещению и обезвреживанию отходов производства и потребления». 2.16. СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности». 2.17. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». 2.18. Методические указания МУ 1.2.2520-09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов». 2.19. Методические рекомендации МР 1.2.2566-09 «Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo». 2.20. Методические рекомендации МР 1.2.2522-09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека». 2.21. Методические рекомендации МР 1.2.2641-10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах». 2.22. Методические указания МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». 2.23. Методические указания МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории». 2.24. Руководство Р 3.5.1904-04 «Использование ультрафиолетового излучения для обеззараживания воздуха помещений». 2.25. ГОСТ 8.207-76 «Государственная система обеспечения единства измерений. Прямые измерения с многократными наблюдениями. Методы обработки результатов наблюдений. Основные положения». 2.26. ГОСТ 26678-85 «Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия». 2.27. ГОСТ 3-88 «Перчатки хирургические резиновые. Технические условия». 2.28. ГОСТ 20015-88 «Хлороформ. Технические условия». 2.29. ГОСТ Р 51652-2000 «Спирт этиловый ректифицированный из пищевого сырья. Технические условия». 2.30. ГОСТ 21241-89 «Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний». 2.31. ГОСТ 21239-93 «Инструменты хирургические. Ножницы. Общие требования и методы испытаний». 2.32. ГОСТ 30393-95 «Инструменты хирургические. Скальпели со съемными лезвиями. Присоединительные размеры». 2.33. ГОСТ 24104-2001 «Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия». 2.34. ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры». 2.35. ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия». 2.36. ГОСТ 9293-74 «Азот газообразный и жидкий. Технические условия». 2.37. ГОСТ 12.2.003-91 «Система стандартов безопасности труда. Оборудование производственное. Общие требования безопасности». 2.38. ГОСТ 12.2.052-81 «Система стандартов безопасности труда. Оборудование, работающее с газообразным кислородом. Общие требования безопасности». 2.39. ГОСТ 12.1.004-91 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования». 2.40. ГОСТ 4233-77 «Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия». 2.41. ОСТ 11-029.003-80 «Изделия электронной техники. Вода, применяемая в производстве. Марки, технические требования, методы очистки и контроля». 2.42. ГОСТ 5833-75 «Реактивы. Сахароза. Технические условия». 2.43. ГОСТ 4198-75 «Реактивы. Калий фосфорно-кислый однозамещенный. Технические условия». 2.44. ГОСТ 2493-75 «Реактивы. Калий фосфорно-кислый двузамещенный 3-водный. Технические условия». 2.45. ГОСТ 6259-75 «Реактивы. Глицерин. Технические условия». 2.46. ГОСТ 4172-76 «Реактивы. Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 12-водный. Технические условия». 2.47. ГОСТ 1625-89 «Формалин технический. Технические условия». 2.48. ГОСТ 4517-87 «Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе». 2.49. ГОСТ Р 50444-92 «Приборы, аппараты и оборудование медицинские. Общие технические условия». 2.50. ГОСТ Р 51350-99 «Безопасность электрических контрольно-измерительных приборов и лабораторного оборудования. Часть 1. Общие требования». 2.51. ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий».

III. Общие положения

3.1. Цель и назначение пробоотбора

3.1.1. Целью отбора проб является получение представительной и усредненной пробы, которая наиболее полно позволит выявить и идентифицировать исследуемые наноматериалы, введенные лабораторным животным, в составе их органов и тканей, а также в выделениях (экскретах) в ходе проведения исследований по токсиколого-гигиенической характеристике наночастиц или наноматериалов. 3.1.2. Назначение процедуры отбора проб заключается в отборе для заданной цели тех органов, тканей и иных биологических материалов, которые наиболее пригодны для анализа и в которых с наибольшей вероятностью можно выявить и идентифицировать исследуемые наноматериалы. 3.1.3. Биологические образцы, полученные от животных, которым по условиям эксперимента были введены наночастицы (наноматериалы), могут содержать эти наночастицы (наноматериалы) и поэтому должны рассматриваться как объекты, обладающие повышенной биологической опасностью. Особенности процедур отбора проб должны обеспечивать снижение риска воздействия наночастиц и наноматериалов, а также инфицированных микроорганизмами образцов на персонал организаций (лабораторий), проводящих отбор проб и последующие исследования биологических показателей, а также на население и окружающую среду до приемлемого уровня.

3.2. Требования к организации, осуществляющей отбор проб

3.2.1. Организации, осуществляющие отбор проб, должны быть уполномочены в установленном порядке на право проведения медико-биологических исследований на лабораторных животных и обладать системой контроля качества, обеспечить независимость и прозрачность процедуры пробоотбора. 3.2.2. Организации, осуществляющие отбор проб, должны быть оснащены необходимым оборудованием, в т.ч. средствами измерений, прошедшими поверку (калибровку) в установленном порядке. 3.2.3. Эксплуатация оборудования проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения поверки (калибровки) средств измерений и текущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание. Персонал, проводящий отбор проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных, должен иметь профессиональную подготовку в области работы с лабораторными животными и пройти инструктаж по вопросам техники безопасности и методам преодоления последствий возможных нештатных ситуаций.

3.3. Перечень объектов и материалов, подлежащих пробоотбору

3.3.1. Для выявления и идентификации биогенных наноматериалов в лабораторных животных проводят отбор следующих биологических материалов: — соскобы со слизистых оболочек, отделяемое эрозивно-язвенных элементов, соскобы с конъюнктивы и т.д.; — мазки, смывы (из носоглотки, зева и т.д.); — мокрота, бронхоальвеолярный лаваж;
— кровь, плазма, сыворотка крови;
— моча, различные биологические жидкости (лимфа, слюна, желчь, слезная жидкость, молоко); — фекалии;
— биоптаты (кусочки тканей и органов).
Перечень биологических материалов, отбираемых с целью определения наночастиц и наноматериалов, может изменяться по указанию организации, проводящей анализ наноматериалов в образцах, в зависимости от предполагаемой локализации исследуемого наноматериала в организме и используемых методов анализа. 3.3.2. Общими требованиями к биологическому материалу являются максимальная концентрация исследуемого наноматериала в образце, а также отсутствие нежелательных примесей, которые могут вызвать искажение результатов проводимых анализов. 3.3.3. Методы, применяемые при отборе проб биологических материалов, их консервации, транспортировании и хранении, должны исключать или сводить к минимуму возможные изменения физико-химического состояния наночастиц и наноматериалов, присутствующих в образцах. 3.3.4. Для исследований методом ПЦР кровь должна быть нативной (не свернувшейся), в связи с чем ее собирают в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА. Важно: гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя, т.к. он является ингибитором ПЦР!

3.4. Соблюдение правил надлежащей лабораторной практики

3.4.1. В процессе отбора проб для характеристики действия наноматериалов в лабораторных животных необходимо руководствоваться правилами надлежащей лабораторной практики в соответствии с положениями Приказа Минздрава России от 19 июня 2003 г. N 267. 3.4.2. Соблюдение правил надлежащей лабораторной практики обеспечивает: — надлежащее качество процедуры пробоотбора; — документальное сопровождение всех этапов пробоотбора; — совместимость различных методов пробоотбора между собой и отсутствие неконтролируемых влияний процедур пробоотбора на количество и физико-химическое состояние определяемых наноматериалов; — репрезентативность отбираемых проб;
— гуманное обращение с лабораторными животными. 3.4.3. Соблюдение правил надлежащей лабораторной практики применительно к процедурам отбора биологических образцов включает: — назначение руководителем организации лиц, ответственных за мониторинг качества и репрезентативности отбираемого биологического материала (из числа сотрудников, не участвующих в исследовании); — систему регистрации отбираемых образцов, их хранение и транспортирование в условиях, исключающих возможность порчи, изменения физико-химических свойств анализируемых наноматериалов; — наличие и соблюдение стандартных операционных процедур (СОП) на все производственные операции, включая: составление списка (перечня) отбираемых проб, отбор, идентификацию, маркировку, предварительную обработку проб, использование и хранение исследуемых веществ; обслуживание и градуировку средств измерения (весов, пипеток, дозаторов), применяемых при пробоотборе; приготовление реактивов, кормов; протоколирование отбора проб; обслуживание помещений; обезвреживание или утилизацию биологических образцов (если это необходимо); ликвидацию последствий нештатных ситуаций; — наличие средств измерений, прошедших поверку (калибровку) в установленном порядке; — эксплуатацию оборудования в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению, регулярную фиксацию результатов поверки средств измерений и текущего ремонта оборудования в специальном журнале; — наличие помещения для лабораторных животных (вивария), обеспечивающего изоляцию (карантин) поступающих животных, больных животных и животных, подозреваемых в носительстве инфекций; позволяющего осуществлять раздельное содержание различных видов животных и животных одного вида, которым были введены различные наноматериалы; соответствующего санитарно-эпидемиологическим и ветеринарным требованиям; — наличие отдельных помещений, инвентаря и оборудования для приготовления кормов для лабораторных животных, а также для работы с опасными для здоровья и жизни человека объектами исследования, соответствующих установленным санитарно-эпидемиологическим требованиям.

3.5. Соблюдение мер конфиденциальности

3.5.1. Сотрудники, принимающие участие в процессе отбора проб для выявления наноматериалов в лабораторных животных, обязаны соблюдать конфиденциальность в отношении любых данных, полученных в ходе процедуры отбора проб, в соответствии с законодательством Российской Федерации. 3.5.2. Организация, уполномоченная на проведение пробоотбора для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных, должна обеспечить конфиденциальность полученных в ходе пробоотбора данных и результатов в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации.

3.6. Организация защиты проб
от несанкционированных внешних воздействий

3.6.1. Организация, уполномоченная на проведение пробоотбора для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных, должна обеспечить их защиту от несанкционированных внешних воздействий. 3.6.2. Контейнер с пробой необходимо запечатать либо упаковать в сейф-пакет, опломбировать или опечатать его таким способом, чтобы не допустить несанкционированного вскрытия пробы или чтобы несанкционированное вскрытие легко определялось.

3.7. Ответственность организации, производящей отбор проб

3.7.1. Ответственность за качественный отбор проб, репрезентативность отобранной пробы, оформление документов на пробы и их сохранность, а также за соблюдение правил техники безопасности в процессе отбора проб несут организации, осуществляющие пробоотбор. 3.7.2. Ответственность за сохранность проб и документации на пробы при перевозке, соблюдение правил техники безопасности при перевозке несут организации, осуществляющие перевозку проб.

IV. Технология (процедура) пробоотбора

4.1. Составление плана (схемы) отбора проб

4.1.1. План (схема) отбора проб составляется перед началом исследований и должен включать следующие данные: — наименование выявляемого наноматериала, оценка его потенциальной опасности согласно МР 1.2.2522-09, свойства наноматериала (согласно данным производителя (поставщика) продукции и (или) литературным данным); — вид отбираемых проб (исследуемого материала); — методику отбора проб;
— количество отбираемых проб;
— инструкции по разделению отобранной пробы на части (выделению контрольной пробы при необходимости); — тип и характеристики тары для отбора проб; — расшифровку маркировки тары для отбора проб; — специальные меры предосторожности при работе с наноматериалами, соблюдение стерильности; — условия хранения и транспортирования проб; — инструкции по очистке и хранению оборудования для отбора проб, инактивации биоматериалов.

4.2. Протоколирование отбора проб

4.2.1. Процедура отбора проб должна быть запротоколирована по окончании процесса. В протоколе (акте) отбора проб указывают: — название организации, производившей отбор проб; — фамилии сотрудников, проводящих отбор проб; — цель отбора пробы;
— номер пробы;
— наименование отбираемого биологического материала; — размер образца, единица измерения (объем или масса); — наименование введенного наноматериала; — дату введения наноматериала;
— метод отбора пробы;
— метод консервации пробы;
— количество отобранных образцов (реплик пробы), в т.ч. лабораторных, контрольных; — дату и время отбора проб;
— сведения о нумерации, опломбировании, опечатывании проб; — наименование лаборатории — получателя пробы; — перечень анализируемых компонентов в составе проб; — отметки о дополнительных сопроводительных документах (при необходимости); — способ отправки проб;
— отметку о месте хранения контрольной пробы (при необходимости); — подписи сотрудников, осуществляющих отбор проб и их доставку в лабораторию, проводящую анализ наноматериалов. 4.2.2. Протокол (акт) отбора проб составляется в двух экземплярах, один из которых остается в организации, производившей пробоотбор, а другой передается организации, осуществляющей проведение лабораторных исследований. 4.2.3. При отборе однородных серийных проб возможно составление единого протокола (акта) на серию проб (образцов) с обязательным указанием порядка нумерации и общей численности индивидуальных проб.

4.3. Меры по обеспечению репрезентативности пробоотбора

4.3.1. Для медико-биологических исследований достоверными (достаточными) считаются доверительные границы, установленные с вероятностью безошибочного прогноза не менее 95%. При этом вероятность выхода средней величины в генеральной совокупности за пределы доверительных границ будет равна или менее 5%, т.е. уровень значимости — p <= 0,05.

В случае если тест проведен на N животных, для каждого из которых определено значение исследуемого фактора X (содержания наноматериала в

n образце), принимают гипотезу о нормальном распределении фактора X. Далее

_ n рассчитывают среднее по выборке X = SUM X и несмещенную выборочную

                                           i=1  i            2     1    n        _ 2 дисперсию S  = ----- SUM (X - X) .                N - 1 i=1   i     В  этом  случае  вероятность нахождения истинного значения исследуемого                           _                 S                     S параметра  X   интервале (X - t          х ---; X + t          х ---) равна             0                  0,025,N-1     _       0,025,N-1     _                                            \/N                   \/N 0,95,  где  t          - коэффициент Стьюдента с N - 1 степенью свободы для              0,025,N-1 

квантиля распределения, равного 0,025 (2,5%).

Таким образом, число экспериментов N для определения доверительного интервала для истинного значения зависит не только от требуемой ширины интервала, но и от выборочной дисперсии для выборки X , которая может быть

i установлена опытным путем. Задаваясь величиной доверительного интервала (d) 10% от выборочного среднего (X), определяют их фактические значения для выборки из 10 животных (N = 9; t = 2,68), сравнивают с заданным соотношением, после чего в случае если d > 0,1X, численность обследуемой группы животных увеличивают.

---

Примечание.
В официальном тексте документа, видимо, допущена опечатка: имеется в виду п. 4.3.1, а не п. 4.5.1.

---

4.3.2. Количество животных, используемых в эксперименте, должно быть минимальным, однако достаточным для получения статистически достоверных результатов. Численность экспериментальной группы животных определяется в соответствии с п. 4.5.1. Для снижения числа животных в группе следует добиваться минимальной дисперсии определяемого показателя, для чего использовать животных высокого качества, свободных от специфических патогенов (SPF) и (применительно к мелким лабораторным животным) принадлежащих к определенной генетической линии.

4.4. Методы гуманной эвтаназии животных

4.4.1. Эвтаназию лабораторных животных проводят в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. N 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Исполнителем должен быть обеспечен контроль за соблюдением правовых и этических норм использования лабораторных животных при проведении забоя животных и отбора проб. 4.4.2. Оптимальным и универсальным методом эвтаназии животных является 3-кратная передозировка наркоза. Допускается эвтаназия мелких животных с помощью ингаляционного наркоза (хлороформ или эфир) без предварительного введения других видов анестетиков. 4.4.3. Умерщвление и вскрытие животных проводят в отдельном специально оборудованном помещении (секционной) в пределах клиники лабораторных животных (вивария). Манипуляции с животными должны исключать возможность продолжительных стрессорных воздействий. Следует производить манипуляции с животными таким образом, чтобы этого не могли наблюдать остальные животные.

4.5. Методы препарирования биологического материала для определения биогенных наноматериалов (рекомбинантные вирусы, рекомбинантные вирусные белки, псевдовирусные частицы)

4.5.1. При отборе проб следует использовать следующее основное и вспомогательное лабораторное оборудование: — ламинарный шкаф биологической безопасности, класс II, с вертикальным восходящим потоком воздуха БОВ-001-АМС («Миасский завод медицинского оборудования», Россия) или аналогичный; — облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 по ТУ 16-535-84; — холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678-85; — морозильная камера, обеспечивающая температуру -20 °С или ниже (фирмы «Vestfrost», Дания, или аналогичная); — льдогенератор (SD18 фирмы «Simag», Италия, или аналогичный); — центрифуга со скоростью вращения ротора до 12000 об./мин. и охлаждением для пробирок вместимостью 1,5 и 0,5 куб. см (5 415 R фирмы «Eppendorf», ФРГ, или аналогичная); — встряхиватель вибрационный типа «Вортекс» со скоростью вращения до 3000 об./мин. (V3 фирмы «Elmi Ltd», Латвия, или аналогичный); — весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с погрешностью взвешивания не более 0,001 г по ГОСТ 24104-2001; — твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 куб. см с диапазоном рабочих температур 25-100 °С (Термит, «ДНК-Технология», Россия, или аналогичный); — пластина для манипуляций с мелкими грызунами (мышами) (из пробки или пенопласта); — хирургический столик для мелких животных (крысы, морские свинки); — булавки или иглы для фиксации животных на препаровальном столике; — пинцет медицинский, ГОСТ 21241-89;
— ножницы медицинские по ГОСТ 21239-93; — скальпель по ГОСТ 30393-95 (возможно использование скальпеля со съемными лезвиями); — резиновые груши для пипетирования биологического материала; — дозаторы с переменным объемом дозирования фирмы «Gilson», США: 0,2-2,0 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм, с точностью +/- 1,2%; 2-20 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм, с точностью +/- 0,8%; 1-10 куб. см с шагом 0,1 куб. см, с точностью +/- 0,5%; — дозаторы «Ленпипет» по ТУ 9452-002-33189998-2007: 0,5-10,0 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм, с точностью +/- 0,8%; 20-200 куб. мм с шагом 0,1 куб. мм, с точностью +/- 0,6%; 100-1000 куб. мм с шагом 1 куб. мм, с точностью +/- 3%; — цилиндры стеклянные мерные лабораторные разной вместимости, колбы конические разной вместимости по ГОСТ 1770-74Е; — сосуды Дьюара по ГОСТ 12.2.003-91, ГОСТ 12.2.052-81, ГОСТ 12.1.004-91, ТУ 26-04-622-88. Примечание: Для вскрытия желательно использовать два набора инструментов — для разрезания кожи и для взятия кусочков органов.

4.5.2. При отборе проб следует применять следующие реактивы и расходуемые материалы: — хлороформ по ГОСТ 20015-88;
— диэтиловый эфир (эфир для наркоза стабилизированный) по ТУ 2600-001-43852015-05; — спирт этиловый ректификованный медицинский по ГОСТ Р 51652-2000; — азот жидкий по ГОСТ 9293-74;
— изотонический раствор натрия хлорида (0,9 г/л хлористого натрия по ГОСТ 4233-77); — дистиллированная вода по ОСТ 11-029.003-80; — транспортная среда для биологических тканей (0,218 М сахароза по ГОСТ 5833-75, 0,0038 М калий фосфорно-кислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75, 0,0072 М калий фосфорно-кислый двузамещенный по ГОСТ 2493-75, 1% БСА по ТУ 6-09-10-342-90); — глицериновая смесь (2 л изотонического раствора, 1 л глицерина по ГОСТ 6259-75 и 20%-ный раствор фосфорно-кислого натрия двузамещенного по ГОСТ 4172-76, pH довести до 7,8-8,0. Стерилизуют при давлении 0,5 атмосфер в течение 15-30 мин. После стерилизации pH должен быть 7,8); — фосфатная буферная смесь: на 1 л дистиллированной воды берут 0,45 г калия фосфорно-кислого однозамещенного по ГОСТ 4198-75 и 5,34 г калия фосфорно-кислого двузамещенного по ГОСТ 2493-75. Стерилизуют при давлении 1 атмосфера в течение 30 мин.; — транспортная среда ESP, содержащая: саркозил 1% (фирма «Amresco», США, или аналогичный); ЭДТА 0,05 М (фирма «Sigma», США, или аналогичная); свободная от нуклеаз проназа Е 1 мг/куб. см (фирма «Sigma», США, или аналогичная); — пробирки для микропроб однократного применения типа «Эппендорф» вместимостью 0,5; 1,5 и 2,0 куб. см по ТУ 64-2-300-80; — криопробирки вместимостью 2,0 куб. см; — штативы для пробирок;
— наконечники пластиковые объемом 1-200 куб. мм и 200-1000 куб. мм с фильтром; — бакпечатки однократного применения по ТУ 64-2-279-79; — пастеровские пипетки, воронки стеклянные по ГОСТ 25336-82; — перчатки хирургические резиновые по ГОСТ 3-88; — термоконтейнеры различной вместимости или медицинская сумка-холодильник; — сейф-пакеты одноразовые для хранения и транспортирования проб. 4.5.3. Кровь собирают асептически с использованием одноразовых инструментов, у крупных животных (кроликов, собак, птиц и т.д.) путем венопункции, у мелких животных (мышей, крыс) — из кончика хвоста или из сердца, в случае вскрытия животных, в стерильную пробирку (1,5-2 куб. см) с антикоагулянтом ЭДТА (гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя!). Плазму получают центрифугированием цельной крови в течение 20 мин. при 3000 об./мин. Для выявления и идентификации наноматериалов в крови лабораторных животных методом ИФА приготавливают пробы сывороток: кровь отстаивают 0,5-1 ч в термостате при температуре 37 °С для формирования фибринового сгустка (не превратившийся в фибрин фибриноген может стать источником ложнопозитивных результатов), затем центрифугируют 10 мин. при 1200 g. Образовавшуюся прозрачную без признаков гемолиза сыворотку отбирают с помощью пипетки в отдельные чистые пробирки (1,5-2 куб. см). Клетки крови (лейкоцитарную фракцию цельной крови, лейкоцитарную пленку) для выявления лейкотропных псевдовирусных наночастиц следует отбирать после центрифугирования цельной крови и удаления плазмы. Лейкоцитарную массу собирают с поверхности осадка клеток и переносят в стерильную пробирку объемом 1,5-2,0 куб. см. 4.5.4. Другие жидкости организма (лимфа, спинномозговая жидкость, желчь) отбирают при помощи пункции стерильными иглами либо пастеровскими пипетками в стерильные одноразовые пробирки объемом 1,5-2,0 куб. см. 4.5.5. Соскобы осуществляют с помощью специальных стерильных одноразовых инструментов — зондов, цитощеток или тампонов, после чего рабочую часть зонда помещают в транспортную среду производителя набора для выделения нуклеиновых кислот. Согласно рекомендациям производителя рабочую часть зонда удаляют из пробирки либо обламывают и оставляют в транспортной среде, плотно закрыв крышку пробирки. 4.5.6. Смывы из носоглотки приготавливают путем введения с помощью одноразового шприца или зонда теплого стерильного изотонического раствора натрия хлорида в носовые ходы. Промывную жидкость собирают в стерильную пробирку. 4.5.7. Мазки берут сухими стерильными ватными тампонами на пластиковой основе вращательными движениями. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда) помещают в стерильную одноразовую пробирку со специальной транспортной средой и аккуратно обламывают, пробирку плотно закрывают крышкой. 4.5.8. Пробу фекалий отбирают отдельным наконечником с фильтром или одноразовыми лопатками, переносят в специальный стерильный флакон или бакпечатку. У мелких животных пробы фекалий отбирают при вскрытии в асептических условиях из толстого отдела кишечника. Из твердых фекалий готовят фекальную суспензию, смешивая 0,8 куб. см фосфатного буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида) с 0,1 г (0,1 куб. см) фекалий и тщательно ресуспендируя на вортексе до образования гомогенной суспензии. Для длительного хранения к суспензии добавляют глицерин до конечной концентрации 10-15%. Для выделения ДНК или РНК используют осветленный экстракт фекалий, который приготавливают из фекалий водянистой консистенции, свежей суспензии фекалий или суспензии, подвергавшейся замораживанию с глицерином. Взвесь фекалий интенсивно гомогенизируют на вортексе, осветляют путем центрифугирования при 10000 g в течение 5 мин. В стерильную пробирку отбирают супернатант. 4.5.9. Аутопсию лабораторных животных производят в специально оборудованном помещении, которое полностью соответствует санитарно-гигиеническим требованиям к помещениям данного назначения. Все инструменты должны пройти антисептическую обработку в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. Стеклянную посуду, соприкасающуюся с пробами, предварительно тщательно моют и стерилизуют одним из следующих способов: насыщенным паром в автоклаве в течение 30 мин. при 120 °С; горячим воздухом в стерилизаторе (сухожаровом шкафу) 30 мин. при 100 °С. Допускается стерилизация инструментов погружением в этиловый спирт. Для обеззараживания рук и рабочих поверхностей необходимо использовать латексные перчатки и 70%-ный этиловый спирт-ректификат. Одноразовая пластиковая стерильная посуда в неповрежденной упаковке дополнительной стерилизации не требует. Кусочки тканей или органов отбирают методом биопсии либо при вскрытии животных стерильными инструментами. Предпочтительно использование одноразовых инструментов; многоразовые хирургические инструменты освобождают от загрязнения следами нуклеиновых кислот путем обеззараживания автоклавированием (132 +/- 2 °С, 0,2 МПа, 60 мин.) или кипячением (100 °С, 30 мин.). Необходимость отбора проб каждого из органов определяют по предположительной локализации исследуемого наноматериала. Отобранные образцы тканей и органов помещают в стерильные пробирки или флаконы с транспортной средой согласно рекомендациям фирм-изготовителей наборов для определения нуклеиновых кислот. Возможно также использование охлажденного изотонического раствора хлорида натрия либо замораживание проб в жидком азоте. Отбор проб необходимо производить начиная с контрольной группы животных во избежание контаминации проб исследуемой ДНК (РНК) от опытной группы животных.

4.6. Методы препарирования биологического материала для определения наночастиц неорганического происхождения

4.6.1. При отборе проб следует использовать следующее основное и вспомогательное лабораторное оборудование: — холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678-85; — морозильная камера, обеспечивающая температуру -200 °С или ниже (фирма «Vestfrost», Дания, или аналогичная); — льдогенератор (SD18, фирма «Simag», Италия, или аналогичный); — центрифуга со скоростью вращения ротора до 12000 об./мин. и охлаждением для пробирок вместимостью 1,5 и 0,5 куб. см (5 415 R, фирма «Eppendorf», ФРГ, или аналогичная); — встряхиватель вибрационный типа «Вортекс» со скоростью вращения до 3000 об./мин. (V3, фирма «Elmi Ltd», Латвия, или аналогичный); — весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с погрешностью взвешивания не более 0,001 г по ГОСТ 24104-2001; — твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 куб. см с диапазоном рабочих температур 25-100 °С (Термит, «ДНК-Технология», Россия, или аналогичный); — pH-метр по ГОСТ 27987-88 или аналогичный; — пластина для манипуляций с мелкими грызунами (мышами) (из пробки или пенопласта); — хирургический столик для мелких животных (крысы, морские свинки); — пинцет медицинский, ГОСТ 21241-89;
— ножницы медицинские по ГОСТ 21239-93; — ножницы глазные по ГОСТ 21239-89;
— скальпель по ГОСТ 30393-95 (возможно использование скальпеля со съемными лезвиями); — резиновые груши для пипетирования биологического материала; — сосуды Дьюара по ГОСТ 12.2.003-91, ГОСТ 12.2.052-81, ГОСТ 12.1.004-91, ТУ 26-04-622-88; — термоконтейнеры различной вместимости или медицинская сумка-холодильник по ГОСТ Р 50444-92, ГОСТ Р 51350-99; — ультразвуковая ванна с выходной мощностью не менее 60 Вт и рабочей частотой не ниже 40 кГц. 4.6.2. При отборе проб следует применять следующие расходуемые материалы: — булавки или иглы для фиксации животных на препаровальном столике; — дозаторы с переменным объемом дозирования фирмы «Gilson», США: 0,2-2,0 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм, с точностью +/- 1,2%; 2-20 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм, с точностью +/- 0,8%; 1-10 куб. см с шагом 0,1 куб. см, с точностью +/- 0,5%; — или дозаторы «Ленпипет» по ТУ 9452-002-33189998-2007: 0,5-10,0 куб. мм с шагом 0,01 куб. мм, с точностью +/- 0,8%; 20-200 куб. мм с шагом 0,1 куб. мм, с точностью +/- 0,6%; 100-1000 куб. мм с шагом 1 куб. мм, с точностью +/- 3%; — пробирки для микропроб однократного применения типа «Эппендорф» вместимостью 0,5; 1,5 и 2,0 куб. см по ТУ 64-2-30-80; — криопробирки вместимостью 2,0 куб. см; — штативы для пробирок;
— наконечники пластиковые объемом 1-200 куб. мм и 200-1000 куб. мм; — цилиндры стеклянные мерные лабораторные разной вместимости, колбы конические разной вместимости по ГОСТ 1770-74Е; колбы плоскодонные конические на 250 куб. см с НШ 29, тип КнКШ 250-29/32 по ГОСТ 10394-74; колбы мерные вместимостью 100, 500, 1000 куб. см, тип 2-100-2, 2-500-2 по ГОСТ 1770-74; воронки лабораторные по ГОСТ 25336, иная посуда мерная лабораторная по ГОСТ 1770-74 и посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336-82; — перчатки хирургические резиновые по ГОСТ 3-88; — бритва фирмы «Ted Pella, Inc.» (США), кат. N 121-1, или аналогичная; — чашки Петри по ГОСТ 25336-82;
— флаконы стеклянные завинчивающиеся из темного стекла (вайл) объемом 10 куб. см; — термоконтейнеры различной вместимости или медицинские сумки-холодильники; — сейф-пакеты одноразовые для хранения и транспортирования проб. 4.6.3. При отборе проб следует применять следующие реактивы: — хлороформ по ГОСТ 20015-88;
— диэтиловый эфир (эфир для наркоза стабилизированный) по ТУ 2600-001-43852015-05; — спирт этиловый ректифицированный 96%-ный по ГОСТ 51652-2000; — азот жидкий по ГОСТ 9293-74;
— деионизованная вода по ГОСТ 6709-79;
— изотонический раствор натрия хлорида (0,9 г/л хлористого натрия по ГОСТ 4233-77); — глутаровый альдегид по ТУ 6-02-1273-89; — нейтральный формалин по ГОСТ 1625-75 или приготовленный в соответствии с ГОСТ 4517-87, п. 2.15;

• раствор фосфорно-солевого буфера 0,04 М KH PO , 0,16 М K HPO , pH 7,2

  2 4 2 4 — 7,4, 1,76% KCl. Для приготовления раствора на лабораторных весах готовят навески 6,2 г KH PO х H O (х.ч. по ГОСТ 4198-75), 33,65 г K HPO х 3H O

  2 4 2 2 4 2 (х.ч. по ГОСТ 2493-75) и 17,4 г KCl (х.ч., ГОСТ 4568-95) и вносят их в мерную колбу объемом 1000 куб. см, содержащую 500 куб. см дистиллированной воды. Соли растворяют при перемешивании, объем раствора доводят до 1000 куб. см; — раствор для фиксации: 2,5%-ный раствор глутарового альдегида, 2%-ный раствор формалина на фосфатно-солевом буфере. Для приготовления 100 куб. см раствора в мерную колбу вносят 50 куб. см двухкратного раствора фосфатно-солевого буфера, 10 куб. см коммерческого препарата глутарового альдегида (25%-ный водный раствор) и 5 куб. см коммерческого препарата формалина (40%-ный водный раствор). На pH-метре доводят pH буфера до 6,9 добавлением 1 М HCl, далее объем раствора доводят до 100 куб. см. 4.6.4. Кровь собирают асептически с использованием одноразовых инструментов, у крупных животных (крупного рогатого скота, овец, свиней, кроликов, собак, птиц и т.д.) путем венопункции, у мелких животных (мышей, крыс) — из кончика хвоста или из сердца, в случае вскрытия животных, в стерильную пробирку (1,5-2 куб. см), куда предварительно внесен раствор гепарина (10 ед./куб. см) (для электронной микроскопии оптимально иметь не менее 30 куб. мм сыворотки крови). После забора крови пробирки закрывают крышками и центрифугируют на небольшой скорости (до 2000 g) в течение 10 с — 1 мин., чтобы сбросить капельки крови, осевшие на стенки пробирок, не дав им высохнуть. 4.6.5. Процедуру отбора сыворотки следует начинать не позднее чем через 1,5 ч после отбора крови, чтобы избежать гемолиза. Для получения сыворотки кровь помещают в термостат (37 °С) на 30 мин., после чего центрифугируют в течение 10 мин. на скорости 2000 g. Отбирают сыворотку, не задевая тромба, в отдельную новую пробирку, которую маркируют соответствующим образом (с добавлением буквы «С» — сыворотка). Маркированные пробирки замораживают и хранят при температуре -20 °С. 4.6.6. Процедуру отбора плазмы следует начинать непосредственно после отбора крови, чтобы избежать ее свертывания. Для получения плазмы в отобранную кровь добавляют гепарин (10 ед./куб. см). Пробирки с гепаринизированной кровью центрифугируют в течение 10 мин. при скорости 2000 g. Отбирают плазму, не задевая клеточный осадок, в отдельную пробирку, которую маркируют соответствующим образом (с добавлением буквы «П» — плазма). На пробирки с осадком клеток крови наносят маркировку «КК» — клетки крови. Маркированные пробирки замораживают и хранят при температуре -20 °С. 4.6.7. Другие жидкости организма (лимфа, спинномозговая жидкость, желчь и др.) отбирают при помощи пункции одноразовыми шприцами в одноразовые пробирки объемом 1,5-2,0 куб. см. Пробирки маркируют, замораживают и хранят при температуре -20 °С. 4.6.8. Соскобы осуществляют с помощью специальных одноразовых инструментов — зондов, цитощеток или тампонов, после чего рабочую часть зонда аккуратно обламывают и помещают в криопробирки с фосфатно-солевым буфером pH 7,2-7,4, плотно закрыв крышку. Каждая проба маркируется отдельно путем погружения в среду этикетки (надпись выполняется карандашом). 4.6.9. Смывы из носоглотки приготавливают путем введения с помощью одноразового шприца или зонда теплого стерильного изотонического раствора натрия хлорида в носовые ходы. Промывную жидкость собирают в отдельную пробирку. Пробирки маркируют, замораживают и хранят при температуре -20 °С. 4.6.10. Мазки берут сухими стерильными ватными тампонами на пластиковой основе вращательными движениями. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда) и помещают в криопробирки с фосфатно-солевым буфером pH 7,2-7,4, плотно закрыв крышку. Каждая проба маркируется отдельно путем погружения в среду этикетки (надпись выполняется карандашом). 4.6.11. Пробу фекалий отбирают отдельным наконечником или одноразовыми лопатками, переносят в специальный флакон. У мелких животных пробы фекалий отбирают при вскрытии в асептических условиях из толстого отдела кишечника. Из твердых фекалий готовят фекальную суспензию, смешивая при помощи вибрационного встряхивателя 0,8 куб. см фосфатно-солевого буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида) с 0,1 г (0,1 куб. см) фекалий до образования гомогенной взвеси. Для длительного хранения к суспензии добавляют глицерин до конечной концентрации 10-15%. 4.6.12. Аутопсию лабораторных животных производят в специально оборудованном помещении, которое полностью соответствует санитарно-гигиеническим требованиям к помещениям данного назначения. Все инструменты должны пройти антисептическую обработку в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. Стеклянную посуду, соприкасающуюся с пробами, предварительно тщательно моют и стерилизуют одним из следующих способов: насыщенным паром в автоклаве в течение 30 мин. при 120 °С; горячим воздухом в стерилизаторе (сухожаровом шкафу) 30 мин. при 100 °С. Допускается стерилизация инструментов погружением в этиловый спирт. Для обеззараживания рук и рабочих поверхностей необходимо использовать латексные перчатки и 70%-ный этиловый спирт-ректификат. Одноразовая пластиковая стерильная посуда в неповрежденной упаковке дополнительной стерилизации не требует. Инструменты (скальпель, ножницы и пинцет), применяемые при вскрытии, и посуду многоразового использования, предназначенную для фиксации и хранения проб, дополнительно обрабатывают в ультразвуковой ванне с целью исключить вероятность перекрестного загрязнения образцов наночастицами. Кусочки тканей или органов отбирают методом биопсии либо при вскрытии животных с использованием хирургических инструментов. При вскрытии животных в первую очередь отбирают кровь, поступающую к сердцу через нижнюю полую вену, чтобы избежать излияния крови в полости тела и исключить загрязнение тканей наночастицами в случае высокой их концентрации в крови. Затем последовательно выделяют тонкий и толстый кишечник, желудок, почки, печень, селезенку, легкие, сердце, аорту, брыжеечные, подмышечные и другие лимфатические узлы, после вскрытия черепной коробки животного — головной мозг. Необходимость отбора проб каждого из органов определяют по предположительной локализации исследуемого наноматериала. Выделенный орган с помощью пинцета немедленно помещают в чашку Петри с фосфатно-солевым буфером pH 7,2-7,4 и промывают от крови. Желудок и кишечник освобождают от содержимого и тщательно промывают водой, а затем фосфатно-солевым буфером pH 7,2-7,4. В зависимости от цели исследования органы переносят в соответствующие фиксирующие жидкости или замораживают в жидком азоте или с помощью сухого льда. 4.6.13. Для приготовления срезов тканей для электронной микроскопии орган разрезают острой бритвой на куски размером 1 х 1 х 1 мм (6 кусков от одного органа одного животного). Куски пинцетом переносят в пенициллиновые флаконы с фиксатором (2,5%-ный глутаровый альдегид на 0,1 М фосфатно-солевом буфере pH 7,2-7,4 с добавлением 2%-ного нейтрального формалина) из расчета 4 куб. см на один флакон. Из разных отделов желудка и кишечника вырезают кусочки площадью 1 кв. мм (объемом не более 1 куб. мм), переносят в пенициллиновые флаконы с фиксатором. Органы желудочно-кишечного тракта и кожи требуют ориентации при фиксации. Для этого поперечные срезы кожи и определенных отделов желудочно-кишечного тракта прикладывают на небольшие кусочки бумаги и в таком виде помещают в фиксатор. Отношение объема фиксатора к фиксируемой ткани должно быть не менее 10:1. Пробы из одного органа от одного животного помещают в один флакон. Каждый флакон маркируют специальным химически стойким маркером или восковым карандашом либо приклеивают бумажную этикетку, запись на которой делают карандашом. На этикетке необходимо указывать номер животного и название органа, а также вид анализа, для которого подготовлена проба. Возможно длительное (до 2 месяцев) хранение образцов в фиксаторе при температуре 4 °С. Нельзя допускать замораживание образцов, т.к. образующиеся кристаллы льда разрушают ткани. 4.6.14. Для приготовления тканевых гомогенатов для электронной микроскопии из органов вырезаются фрагменты размером от 5 х 5 х 5 мм до 10 х 10 х 10 мм, фрагменты большего размера предпочтительнее, небольшие органы или органы мелких животных можно фиксировать целиком. Органы или их фрагменты помещают в криопробирки с фосфатно-солевым буфером pH 7,2-7,4, плотно закрыв крышку. Каждая проба маркируется отдельно путем погружения в среду этикетки (надпись выполняется карандашом). 4.6.15. Отобранные пробы соскобов, мазков, фекалий, кусочков органов и тканей замораживают погружением в жидкий азот, заключенный в морозоустойчивом теплоизолированном сосуде с широким горлом. Каждую пробу после замораживания быстро заворачивают в фольгу. Пробы от разных органов помещают раздельно и снабжают этикетками с названиями этих органов, пробы от одного животного помещают в общую упаковку и погружают в сосуд Дьюара или термос с жидким азотом для кратковременного хранения или транспортирования. Также можно использовать колотый сухой лед в морозоустойчивой термоизолирующей (например пенопластовой) емкости. Для длительного хранения препараты извлекают из жидкого азота и помещают в низкотемпературный холодильник с температурой не выше -80 °С. В таких условиях пробы могут храниться в течение неограниченного времени.

4.7. Фиксация (консервация) биологических проб для определения наноматериалов

4.7.1. Пробы фекальных масс собирают в стерильную одноразовую посуду (бакпечатки) с консервантом или используют специальные транспортные системы, содержащие консерванты (транспортные среды). В качестве консервантов (транспортных сред) используют глицериновую смесь, фосфатно-солевой буфер.

4.7.2. Пробы тканей или органов помещаются в охлажденный изотонический раствор хлорида натрия или в специальную транспортную среду (0,218 М сахароза, 0,0038 М KH PO , 0,0072 М K HPO , 1% БСА) либо подвергают

2 4 2 4 глубокому замораживанию в жидком азоте (-180 °С). 4.7.3. Для фиксации (консервации) проб биологических тканей, органов и жидкостей, предназначенных для определения биогенных наноматериалов на основе нуклеиновых кислот, используют специальные транспортные среды, разработанные и рекомендованные производителями наборов реагентов для выделения ДНК (РНК). В случае необходимости длительного хранения и перевозки проб в отсутствие низкотемпературных холодильников следует использовать транспортную среду ESP. 4.7.4. В целях фиксации (консервации) пробы, предназначенные для определения неорганических наноматериалов методом электронной микроскопии в срезах органов и тканей животных, помещают в маркированные пенициллиновые флаконы с фиксатором (раствор 2,5%-го глутарового альдегида в 0,1 М фосфатно-солевом буфере pH 7,2-7,4 с добавлением 2%-ного нейтрального формалина) из расчета 4 куб. см на один флакон. Отношение объема фиксатора к фиксируемой ткани должно составлять не менее 10:1. Возможно длительное (до 2 месяцев) хранение образцов в фиксаторе при температуре 4 °С. Нельзя допускать замораживание образцов, т.к. образующиеся кристаллы льда разрушают ткани! 4.7.5. В целях фиксации (консервации) пробы, предназначенные для определения неорганических наноматериалов методом электронной микроскопии в соскобах, мазках, фекалиях, гомогенатах органов и тканей, помещают в маркированные криопробирки с фосфатно-солевым буфером pH 7,2-7,4. Пробы замораживают жидким азотом в морозоустойчивом теплоизолированном сосуде с широким горлом. Замороженные пробы каждую в отдельности быстро заворачивают в фольгу и погружают в сосуд Дьюара или термос с жидким азотом для долговременного хранения. Во избежание взрыва емкость с азотом не должна быть герметически закрыта. Можно также использовать колотый сухой лед в морозоустойчивой термоизолирующей (например, пенопластовой) емкости. В целях уменьшения теплообмена емкость с сухим льдом должна быть закрыта. Для длительного хранения препараты извлекают из жидкого азота и помещают в низкотемпературный холодильник с температурой не выше -80 °С. В таких условиях пробы могут храниться в течение длительного времени.

4.8. Количества отбираемых проб биологического материала

4.8.1. Объем (масса, количество) отбираемой пробы (проб) различных видов определяется в зависимости от выявляемых наночастиц (абиогенных и биогенных) и применяемых методов выявления (ПЭМ, АСМ, элементный анализ, хроматография, ПНР, ИФА). 4.8.2. Количество отбираемых образцов должно быть достаточным для выделения контрольной и лабораторной проб, размерами, допускающими проведение всех предусмотренных планом исследования анализов. 4.8.3. Количество отобранного биологического материала не должно быть избыточным. Избыток отделяемого, слизь и гной отрицательно влияют на качество проводимых анализов. Для выделения ДНК (РНК) для одного анализа методом ПЦР (ОТ-ПЦР) достаточно 200 куб. мм плазмы крови, 100 мкг образцов тканей или органов, фекалий. Для одного анализа сывороток крови методом ИФА объем образца может составлять 5-1000 куб. мм в зависимости от рекомендаций фирмы-изготовителя тест-систем. Для одного анализа методами ПЭМ и АСМ достаточно 30 куб. мм плазмы крови, 200 мкг образцов тканей или органов, фекалий.

4.9. Порядок отбора точечной, объединенной, средней, лабораторной, контрольной проб биологического материала

4.9.1. Для выявления и идентификации наноматериалов у лабораторных животных отбирают точечные пробы биологических жидкостей, тканей и органов, как было описано в пп. 4.5 и 4.6. При исследовании органов, тканей и биологических жидкостей организма на содержание наноматериалов объединенную пробу не формируют. Каждый параметр характеризуется в пробах от индивидуальных животных, после чего полученный результат усредняется (статистически обрабатывается). 4.9.2. Точечная проба, отобранная для выявления и идентификации определенного наноматериала в биологическом материале, является одновременно и средней пробой, из которой простым делением на две части формируют лабораторную и контрольную пробы. При необходимости контрольная проба выделяется в процессе отбора проб. 4.9.3. Контрольная проба выделяется при необходимости на месте в процессе отбора проб, ее масса должна быть не более массы лабораторной пробы. Как правило, контрольная проба выделяется от точечной пробы и составляет половину ее массы (объема). 4.9.4. Контрольная проба хранится в сейф-пакете или в опломбированном (опечатанном) виде в течение срока ее годности при регламентированных температурных и влажностных режимах.

4.10. Меры предосторожности при введении наноматериалов в животных, эвтаназии, препарировании биоматериала, отборе и консервации проб

4.10.1. Перед проведением исследований содержания каждого отдельного наноматериала в лабораторных животных должна быть выполнена предварительная оценка уровня их потенциальной опасности для здоровья человека согласно МР 1.2.2522-09. 4.10.2. Биологические образцы, предположительно содержащие наночастицы и наноматериалы, следует рассматривать как потенциально опасные и соблюдать в обращении с ними соответствующие меры предосторожности для потенциально опасного биологического материала согласно стандартным операционным процедурам (СОП), установленным в лаборатории, проводящей исследование. 4.10.3. Работы с биологическими материалами и жидкостями, содержащими наночастицы, следует проводить в резиновых перчатках. Работы с отобранными биологическими пробами, предположительно содержащими наноматериалы, выполняются в ламинаре или в отдельных боксовых помещениях, снабженных системой вентиляции. Отбор проб следует производить в одноразовую посуду. Не допускается проведение работ в помещениях с неисправной системой вентиляции и воздуховодов! 4.10.4. Проанализированные биологические материалы инактивируются автоклавированием в течение 1 ч при давлении в 1,5 атмосферы или кипячением при 100 °С в течение 30 мин. После этого биологические материалы, предположительно содержащие наночастицы, сдают в специализированные организации, осуществляющие утилизацию потенциально опасных биологических отходов. Запрещается: утилизация биологических материалов с бытовым мусором, слив жидких биологических образцов в канализацию. 4.10.5. В процессе выполнения работ с наноматериалами обязательным является ношение персоналом рабочей/защитной одежды (халат, шапочка, спецобувь, перчатки). При выполнении работ, при которых возможно образование аэрозолей наноматериалов, дополнительно используются средства индивидуальной защиты (защитные очки, респиратор). На рабочих местах запрещается принимать еду, пить, курить, употреблять жевательную резинку, наносить косметику, а также хранить продукты питания, напитки, табачные изделия, выращивать комнатные растения. После завершения работ с наноматериалами проводят влажную уборку на рабочем месте и в помещении. 4.10.6. Для предохранения от инфицирования персонала при отборе проб биоматериалов и их транспортировании необходимо: — не загрязнять наружную поверхность посуды при отборе проб; — не загрязнять сопроводительные документы; — избегать контакта пробы биоматериала с не защищенными перчатками руками сотрудников, проводящих сбор и транспортирование проб; — транспортировать пробы в переносках или укладках с раздельными гнездами. 4.10.7. После вскрытия животных инструменты, пластины для манипуляций, хирургические столики, банки, бачки, садки из-под животных, подстилочный материал и т.п. должны обеззараживаться путем замачивания в дезинфицирующем растворе с последующим автоклавированием. Для дезинфекции допускается использование только дезинфицирующих средств, разрешенных в установленном порядке к применению в Российской Федерации. Методы и средства обеззараживания определяются в каждом отдельном случае в зависимости от характера исследуемого наноматериала (биогенного или абиогенного происхождения), характера обеззараживаемого материала и целевого назначения средства. 4.10.8. Для дезинфекции применяют средства, содержащие в качестве действующих веществ активный кислород (перекисные соединения и др.), катионные поверхностно-активные вещества, хлорактивные соединения, альдегиды, спирты (этанол, пропанол и др.), чаще всего в виде многокомпонентных рецептур, содержащих одно или несколько действующих веществ и функциональные добавки (антикоррозионные, дезодорирующие, моющие и др.). Режимы дезинфекции различных объектов дезинфицирующими средствами приведены в инструкциях по их применению. Согласно СП 1.3.2322-08 для обработки поверхностей в помещениях, приборов и оборудования используют дезинфицирующие средства с моющим эффектом. Для дезинфекции выделений (фекалий и др.) и посуды из-под выделений используют хлорактивные средства. Для дезинфекции спецодежды используют средства, не содержащие альдегидов и спиртов. Для дезинфекции хирургических инструментов и лабораторной посуды применяются средства на основе альдегидов, катионных поверхностно-активных веществ, перекиси водорода, хлорсодержащие средства. Для дезинфекции банок, бачков, садков из-под животных используют дезинфицирующие средства на основе альдегидов, катионных поверхностно-активных веществ, перекиси водорода, спиртов, хлорсодержащие средства. 4.10.9. Твердые обеззараженные отходы и тушки животных сдают в специализированные организации, осуществляющие утилизацию потенциально опасных биологических отходов. Допускается промежуточное хранение до утилизации трупного материала в упакованном виде в специально выделенной для этих целей и размещенной в отдельном помещении морозильной камере при температуре не выше -18 °С. Запрещается: хранение трупного материала в бытовых и предназначенных для хранения химических реактивов холодильниках. Хранение и утилизация трупного материала и биологических отходов, получаемых в экспериментах с применением наночастиц, должны осуществляться отдельно от аналогичных материалов, получаемых в исследованиях, где наночастицы и наноматериалы не используются. На упаковочную тару для биологических отходов, предположительно содержащих наночастицы и наноматериалы, наносят предупредительные надписи («наноопасность», «содержит наночастицы/наноматериалы» и т.д.). 4.10.10. Все рабочие подразделения должны быть обеспечены аварийными аптечками. В состав аварийной аптечки входят: спирт этиловый 70° (два флакона по 100 куб. см), 2-3 навески перманганата калия для приготовления 0,05%-го раствора (12,5 мг перманганата калия + 25 куб. см воды), вода для инъекций, одноразовые шприцы, глазные пипетки, 5%-ная настойка йода, 3%-ный раствор перекиси водорода, ножницы с закругленными браншами, перевязочные средства (вата, бинты и пр.), жгут и нашатырный спирт. При работе с микроорганизмами, вирусами и наноматериалами, содержащими ДНК, РНК (псевдовирусными наночастицами), в аптечке также должен быть 1%-ный раствор борной кислоты или навески для приготовления раствора (0,25 г борной кислоты + 25 куб. см воды), специфические сыворотки, иммуноглобулины на 2-4 человек, интерферон или индуктор интерферона, антибиотики широкого спектра действия из тетрациклиновой группы (хлортетрациклин, окситетрациклин, тетрациклин или др.) и из группы аминогликозидов (стрептомицин, канамицин, мономицин или др.) по 1 флакону для приготовления растворов. 4.10.11. При пипетировании необходимо пользоваться только резиновыми грушами или автоматическими устройствами. Жидкость из пипетки должна стекать по внутренней стенке сосуда. Не допускается переливание жидких образцов через край, продувание через них воздуха из пипеток. 4.10.12. По окончании работы биологические образцы должны переноситься в хранилища (сейфы, холодильники, термостаты и т.д.). Не допускается оставлять после окончания работы на открытых местах или в неопечатанных хранилищах биологические образцы, посуду с посевами микроорганизмов и вводимые животным наноматериалы. Не допускается оставлять биологические материалы и препараты, содержащие наноматериалы и наночастицы, после окончания работы на открытых местах или в неопечатанных хранилищах! 4.10.13. Поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми, устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы не должны быть скользкими. Лабораторная мебель должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств, поверхность столов не должна иметь трещин и швов. 4.10.14. Комнаты, рабочие поверхности, штативы, оборудование, применяемые при работе с лабораторными животными, следует обеззараживать ежедневно ультрафиолетовым излучением в течение 1 ч. Полы ежедневно подвергают влажной уборке с применением дезинфицирующих средств, регламентированных санитарными правилами. Перед началом работы рабочую поверхность столов дополнительно обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом. Ежемесячно проводят профилактическую обработку рабочей поверхности столов и штативов 1 N соляной кислотой.

4.11. Возможные нештатные ситуации в ходе отбора проб биологических материалов и меры по их устранению

4.11.1. Различают следующие виды аварий и внештатных ситуаций: — с разбрызгиванием образца, т.е. с образованием аэрозоля (бой пробирок, флаконов или колб с жидкими образцами; разбрызгивание тканевой или клеточной суспензии из пипетки или шприца; разбрызгивание тканевой жидкости при вскрытии трупов животных, а также другие аварии, ведущие к загрязнению воздуха или окружающих предметов аэрозолем, предположительно содержащим наноматериалы); — без разбрызгивания образца (разлив, утечка биологического материала через трещины в лабораторной посуде, пробирках для центрифугирования, падение капель жидкости и фрагментов тканей на лабораторные столы, пол лаборатории и т.д.); — нарушение целости кожных покровов сотрудников, проводящих отбор проб, вследствие травмы, нанесенной хирургическими инструментами, осколками лабораторной посуды и т.д. 4.11.2. При аварии с разбрызгиванием все находящиеся в помещении лица должны немедленно прекратить работу и принять меры по обезвреживанию зараженных участков, используя средства обезвреживания, установленные в СОП. 4.11.3. Забрызганная защитная одежда должна быть обильно смочена дезинфицирующим раствором (п. 4.10.8) и помещена в бикс (бак) для последующего автоклавирования. Сотрудники должны надеть чистую рабочую одежду. 4.11.4. При попадании жидких образцов в ротовую полость или на слизистые оболочки следует обильно промыть их водой, рот и горло прополоскать этиловым спиртом. Руки обрабатывают дезинфицирующим раствором или спиртом.

---

Примечание.
В официальном тексте документа, видимо, допущена опечатка: имеется в виду п. 4.10.8, а не п. 4.9.6.

---

4.11.5. Осколки разбитой посуды собирают тампонами с дезинфицирующим раствором (п. 4.9.6), лабораторную посуду, находившуюся в момент аварии на рабочих поверхностях, обтирают салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором. По окончании дезинфекции для обеззараживания воздуха и поверхностей помещения используют бактерицидные лампы. Вытяжная вентиляция во время дезинфекции и последующей экспозиции должна оставаться включенной. 4.11.6. При аварии без разбрызгивания накладывают тампон с дезинфицирующим раствором на место контаминации, затем протирают дезинфицирующим раствором рабочую поверхность. Руки обрабатывают дезинфицирующим раствором или 70°-ным спиртом. 4.11.7. При аварии, связанной с нарушением целости кожных покровов: прекращают работу, руки обрабатывают дезинфицирующим раствором. Снимают перчатку и выдавливают из ранки кровь в дезинфицирующий раствор, на место ранения ставят компресс с дезинфицирующим раствором или 70°-ным этиловым спиртом, затем обрабатывают 5%-ным раствором йода.

V. Транспортирование и хранение биологических образцов

5.1.1. Подлежащие транспортированию биологические образцы от животных, которым были введены наноматериалы, следует собирать в одноразовые стерильные контейнеры (флаконы, пробирки) с завинчивающейся крышкой (материал — стекло, полиэтилен, полипропилен, полистирол), позволяющие осуществлять глубокую заморозку проб. Контейнеры, применяемые для транспортирования образцов и материала, должны обеспечивать герметичность, стерильность и целостность образцов, а также исключать при открытии возможность образования аэрозоля. 5.1.2. Для транспортирования образцов, предназначенных для определения биогенных наноматериалов, содержащих ДНК и РНК, используют стеклянную и пластиковую посуду с маркировкой «RNase-, DNase-free» либо обработанную ингибиторами РНКаз. Образцы цельной крови, клеточных фракций (включая эритроцитарную массу) при транспортировании не замораживают; транспортирование осуществляют в сумках-холодильниках, охлаждаемых пакетами или грелками, заполненными колотым льдом, при температуре 2-8 °С. Время транспортирования образцов — не более 3 суток. Образцы тканей для электронной микроскопии в соответствующих задачам исследования фиксирующих растворах (формальдегид, параформ и другое) транспортируют в сумках-холодильниках при температуре не ниже 0 и не выше 20 °С. Замораживание проб не допускается. Время транспортирования проб не ограничивается. Для транспортирования образцов фекальных масс возможно использование специальных транспортных систем (свабов) с транспортными средами (Кэри-Блер, Амиеса, Стюарта) и без них, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. Транспортирование проб в этих условиях проводится при температуре +2-8 °С в течение не более 2-3 ч. 5.1.3. Контейнеры с пробой необходимо поместить в тару (предпочтительно — сейф-пакет промышленного изготовления), которая опломбируется или опечатывается. Аналогично при необходимости производится опечатывание контрольных проб, закладываемых на хранение. Данные, позволяющие идентифицировать опечатанные (опломбированные) пробы, вносятся в протокол отбора проб. 5.1.4. Отобранный биологический материал должен быть промаркирован таким образом, чтобы надпись не стиралась. На контейнере (пробирке или флаконе) указывают только номер пробы. Остальная информация указывается в протоколе отбора проб, заполняемом в соответствии с п. 4.2.1 и Прилож. 1 к настоящим Методическим указаниям. При необходимости в протоколе может указываться дополнительная информация, не предусмотренная Прилож. 1 к настоящим Методическим указаниям. Запрещается наносить номера и иные идентифицирующие надписи на пробки (крышки) контейнеров для проб и иные элементы тары, удаляемые до начала исследования образцов. 5.1.5. При транспортировании серии однородных проб (от группы животных) допускается составление на них единого протокола отбора проб, в котором в дополнение к п. 5.1.4 должны быть указаны общее число проб и порядок их нумерации. 5.2. Требования к транспортным средствам. 5.2.1. Для перевозки биологического материала должны использоваться специально оборудованные автотранспортные средства, оборудование которых обеспечивает поддержание постоянства состояния, состава и качества проб, а также безопасность окружающей среды, требования асептики и антисептики, отсутствие резкого перепада температур и влажности, предохранение образцов от вредного воздействия окружающей среды и погодных условий, защиту контейнеров с образцами от разрушения в случае аварии транспортного средства. 5.2.2. При транспортировании проб на значительные расстояния допускается использование авиационного или железнодорожного транспорта при условиях выделения для сумок (укладок), содержащих контейнеры с образцами биологического материала, отдельного багажного места. 5.2.3. Не допускается транспортирование образцов общественным городским и пригородным транспортом, а также необорудованным личным автотранспортом. 5.2.4. Сумки (укладки), содержащие контейнеры с образцами, должны быть в обязательном порядке маркированы с нанесением предупредительных надписей «биоопасность», «наноопасность», «содержит наноматериалы/наночастицы» и т.д. 5.3. Требования к хранилищу (банку) биологических образцов. 5.3.1. Хранение биологических образцов, полученных от животных, которым были введены наноматериалы, должно осуществляться в отдельных хорошо вентилируемых помещениях, оборудованных раковиной с подводкой воды, в морозильных камерах. Не допускается хранение образцов в помещениях общего пользования, в холодильниках или морозильных камерах, используемых для хранения пищевых продуктов, кормов, химических реактивов и т.д. 5.3.2. Стены, пол и мебель помещений для хранения биологических образцов должны быть покрыты материалами, выдерживающими влажную уборку и дезинфекцию. 5.3.3. Помещение для хранения образцов дополнительно оборудуется рабочим столом, контейнером для раздельного сбора мусора (упаковочной тары, тампонов с дезрастворами, бумаги, транспортных наполнителей и т.д.), предположительно содержащего наноматериалы, емкостью для приготовления дезраствора, источниками УФ-света (кварцевыми лампами) для проведения стерилизации помещения. 5.3.4. Контейнеры с образцами, полученными от животных одной (опытной или контрольной) группы, должны храниться в пластмассовых, металлических или стеклянных коробках или укладках с крышками отдельно от образцов, полученных от животных других групп и животных, обработанных другими видами наноматериалов. Коробки (укладки) для хранения контейнеров с образцами должны быть маркированы (подписаны) для облегчения поиска необходимого образца. Содержание надписи должно включать: — дату исследования;
— наименование эксперимента (исследуемого наноматериала); — наименование или номер группы;
— предельный срок хранения;
— фамилию ответственного лица.
Запрещается наносить маркирующие надписи на крышки коробок (укладок) во избежание их случайной замены при извлечении образцов. Категорически запрещается хранение неподписанных контейнеров, коробок, укладок с пробами биологического материала. При выявлении неподписанных контейнеров с пробами или таких контейнеров, подписи на которых невозможно прочитать, контейнеры (без их вскрытия) подлежат утилизации вместе с потенциально опасным биологическим материалом (п. 4.10.4). 5.3.5. Помещение для хранения биологических образцов должно быть оборудовано кодовым замком либо аналогичным устройством и охранной сигнализацией для ограничения несанкционированного доступа. 5.4. Температурный режим, допустимая длительность транспортирования. 5.4.1. Перевозку и хранение биологических образцов, предположительно содержащих наноматериалы, необходимо осуществлять в условиях «холодовой цепи» с обеспечением необходимого контроля установленного температурного режима. Контейнер помещают в сумку-холодильник, термос или термоконтейнер с обеспечивающими нужную температуру хладагентами. 5.4.2. При использовании специальных транспортных систем необходимо руководствоваться требованиями производителя транспортных систем, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. В зависимости от используемой транспортной среды, вида исследуемого материала и температурного режима сроки перевозки и хранения материала могут варьировать в широком диапазоне. Общим требованием является доставка проб в лабораторию максимально быстро с соблюдением мер против протекания, высушивания и повреждения проб. 5.4.3. Транспортирование проб для исследований методом ПЦР (ОТ-ПЦР) осуществляется при следующих параметрах: Образцы нативной крови: — при температуре от 2 до 8 °С — в течение 12 ч. Образцы плазмы и сыворотки — при температуре от 2 до 8 °С — в течение

 крови:                        5 сут.;                             - при температуре минус 20 °С - в течение                               2 недель. Образцы мочи, биологических - при температуре от 2 до 8 °С - в течение жидкостей:                    1 суток;                             - при температуре -20 °С - в течение 1 недели. Образцы смывов, мазков:     - при температуре от 2 до 8 °С - в течение 6 ч;                             - при температуре -20 °С - в течение 1 недели. Образцы нативных фекалий:   - при комнатной температуре - в течение 6 ч;                             - при температуре от 2 до 8 °С - в течение                               3 суток. 

Образцы фекальной суспензии — при температуре -20 °С — в течение 1 недели. с глицерином, фекального
экстракта:
Образцы органов и тканей: — при комнатной температуре — в течение 6 ч;

• при температуре от 2 до 8 °С — в течение 3 суток;
• при температуре -20 °С — в течение 1 недели. 5.4.4. При нарушении температурного режима и сроков транспортирования биоматериала ДНК (РНК) может разрушаться, что приведет к ложноотрицательным результатам. Допускается только однократное замораживание материала! 5.4.5. При необходимости длительной перевозки в отсутствие низкотемпературных холодильников рекомендуется использовать транспортную среду ESP. Исследуемый материал может храниться в среде ESP при температуре (25 +/- 5) °С в темном месте в течение 10 дней. 5.4.6. Транспортирование проб для исследований методом ИФА осуществляется при следующих параметрах: Образцы цельной крови: — при температуре от 2 до 8 °С — в течение

  1 суток. Образцы сыворотки крови: — при температуре от 2 до 8 °С — в течение

  4 суток;

• при температуре -20 °С — в течение 2 недель. Допускается только однократное замораживание материала! 5.4.7. Транспортирование проб для исследований методом ПЭМ и АСМ осуществляется при следующих параметрах: Образцы плазмы и сыворотки — при температуре -20 °С — в течение 2 недель. крови: Образцы мочи, биологических — при температуре от 2 до 8 °С — в течение жидкостей: 1 суток;
• при температуре -20 °С — в течение 1 недели. Образцы смывов, мазков: — при температуре от 2 до 8 °С — в течение 6 ч;
• при температуре -20 °С — в течение 1 недели. Образцы нативных фекалий: — при комнатной температуре — в течение 6 ч;
• при температуре от 2 до 8 °С — в течение 3 суток;
• в жидком азоте (-180 °С) — в течение 2 недель и более. Образцы фекальной суспензии — при температуре -20 °С — в течение 1 недели; с глицерином, фекального — в жидком азоте (-180 °С) — в течение 2 недель. экстракта: Образцы органов и тканей: — при комнатной температуре — в течение 6 ч;
• при температуре от 2 до 8 °С — в течение 3 суток;
• при температуре -20 °С — в течение 1 недели;
• в жидком азоте (-180 °С) — в течение 2 недель. 5.5. Допустимые сроки хранения биологических образцов. 5.5.1. Хранение биологических образцов для исследований методом ПЦР (ОТ-ПЦР) осуществлять при следующих условиях: Образцы нативной крови: — при температуре от 2 до 8 °С — в течение 12 ч.

  Замораживать цельную кровь нельзя! Образцы плазмы и сыворотки — при температуре от 2 до 8 °С — в течение крови: 5 суток;

• при температуре -20 °С — в течение года;
• при температуре -70 °С и ниже — неограниченно. Образцы мочи, биологических — при температуре от 2 до 8 °С — в течение жидкостей: 1 суток;
• при температуре -20 °С — в течение 1 недели;
• при температуре -70 °С и ниже — неограниченно. Образцы смывов, мазков: — при температуре от 2 до 8 °С — в течение 6 ч;
• при температуре -20 °С — в течение 1 недели;
• при температуре -70 °С и ниже — неограниченно. Образцы нативных фекалий: — при комнатной температуре — в течение 6 ч;
• при температуре от 2 до 8 °С — в течение 3 суток. Образцы фекальной суспензии — при температуре -20 °С — в течение 1 недели; с глицерином, фекального — при температуре -70 °С и ниже — длительно. экстракта: Образцы органов и тканей: — при комнатной температуре — в течение 6 ч;
• при температуре от 2 до 8 °С — в течение 3 суток;
• при температуре -20 °С — в течение 1 недели;
• при температуре -70 °С и ниже — неограниченно. 5.5.2. Хранение биологических образцов для исследований методом ИФА осуществлять при следующих условиях: Образцы цельной крови: — при температуре от 2 до 8 °С — в течение

  1 суток. Образцы сыворотки крови: — при температуре от 2 до 8 °С — в течение

  4 суток;

• при температуре -20 °С — в течение 2 недель. 5.5.3. Хранение биологических образцов для исследований методами ПЭМ и АСМ осуществлять при следующих условиях: Образцы плазмы и сыворотки — при температуре -20 °С — в течение года; крови: — при температуре -70 °С и в жидком азоте

  (-180 °С) — длительно. Образцы мочи, биологических — при температуре от 2 до 8 °С — в течение жидкостей: 1 суток;

• при температуре -20 °С — в течение 1 недели;
• при температуре -70 °С и в жидком азоте (-180 °С) — длительно. Образцы смывов, мазков: — при температуре от 2 до 8 °С — в течение 6 ч;
• при температуре -20 °С — в течение 1 недели;
• при температуре -70 °С и в жидком азоте (-180 °С) — длительно. Образцы нативных фекалий: — при комнатной температуре — в течение 6 ч;
• при температуре от 2 до 8 °С — в течение 3 суток. Образцы фекальной суспензии — при температуре -20 °С — в течение 1 недели; с глицерином, фекального — при температуре -70 °С и в жидком азоте экстракта: (-180 °С) — длительно. Нативные образцы органов и — при температуре от 2 до 8 °С — в течение 3 ч; тканей: Образцы органов и тканей в — при комнатной температуре — в течение 6 ч; фиксаторах: — при температуре от 2 до 8 °С — неограниченно. 5.5.4. При хранении жидких биологических образцов допускается только однократное замораживание материала, поэтому предназначенные для нескольких неодновременных исследований образцы рекомендуется разделять на аликвоты по 50-100 куб. мм. 5.6. Признаки, свидетельствующие о порче (непригодности) биологических образцов. 5.6.1. Для лабораторных исследований не принимаются образцы с нарушенной герметичностью и целостностью контейнеров, сорванными с упаковочной тары пломбами и печатями. 5.6.2. Непригодными для исследований считают образцы, которые доставлены в загрязненной посуде, со следами физического воздействия: трещинами, отколотыми краями и другими дефектами. 5.6.3. Забраковываются образцы биологических жидкостей и тканей с явно выраженными признаками порчи: резкий, неприятный гнилостный запах, изменения консистенции, цвета, наличие глубокого или значительного поражения плесенью, брожение, гниение, ослизнение, прокисание и др. 5.6.4. Для исследований методом ИФА непригодной считается сыворотка крови, содержащая примесь эритроцитов, имеющая признаки бактериального пророста, хилеза (мутная), гемолиза. 5.6.5. Для исследования методами ПЭМ и АСМ непригодными считаются биологические образцы, подвергнутые повторному замораживанию-оттаиванию. 5.6.6. На непригодные для исследования образцы составляется акт о списании, в котором указывают причину забраковки пробы. Забракованные пробы уничтожаются в установленном порядке.

Приложение 1

ТИПОВОЙ АКТ
ОТБОРА ПРОБ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ НАНОМАТЕРИАЛОВ В ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

---

(штамп организации, осуществляющей отбор проб) адрес: ____________________________________________________________________ телефон: _____________ факс: ____________ электронная почта: ______________

                                     АКТ          отбора биологических проб для определения наноматериалов N ________                                       от "__" __________ 20__ г. 

Мною (нами), ______________________________________________________________ в присутствии _____________________________________________________________ проведен отбор проб _______________________________________________________

---

---

Цель проведения отбора проб _______________________________________________

---

Наименование отбираемого биологического материала _________________________

---

Размер образца, единица измерения (объем, масса) __________________________ Наименованное введенного наноматериала ____________________________________ Дата введения наноматериала _______________________________________________ Проба отобрана методом ____________________________________________________ Способ консервации пробы __________________________________________________ Количество отобранных образцов ____________________________________________ из них контрольных _______________________________________________________ из них лабораторных ______________________________________________________

---

Пробы отобраны в _______________ ч _______________ мин. ___________________ в количестве ___________________, пронумерованы и опломбированы (опечатаны)

---

(указать порядок нумерации проб, номер пломбы, номер сейф-пакета) направляются в ____________________________________________________________

---

(указать наименование лаборатории) для _______________________________________________________________________

---

               (указать перечень наночастиц (наноматериалов),                по которым необходимо провести исследования) ___________________________________________________________________________            (отметка о порядке хранения или обращения продукции)

Отметки о сопроводительных документах, направляемых с пробами:

---

---

(учреждение — получатель проб, номер и дата сопроводительного документа) Дата отправки проб ____________, время: ____________ ч _______ мин. Способ отправки (доставки) проб:

---

Отметка о месте хранения контрольной пробы ________________________________

---

Подпись сотрудников, осуществлявших отбор проб:

---

(подпись) (Ф.И.О.)

---

(подпись) (Ф.И.О.)

Представитель организации, осуществлявшей доставку проб в лабораторию:

---

(подпись) (Ф.И.О.)

Настоящий акт составлен в двух экземплярах под одним номером и вручен (направлен):

• 1-й экземпляр предназначен для отправки в лабораторию;
• 2-й экземпляр хранится у специалиста (в организации), осуществлявшего отбор проб.

Приложение 2

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Инкремент — некоторое количество материала, отобранное одновременно из большого общего объема для формирования пробы. Контрольная проба — часть средней пробы, хранящаяся в лаборатории, проводящей исследования, или у владельца продукции и предназначенная для повторного или арбитражного исследования при классифицировании лота, партии как несоответствующих или возникновении споров по результатам проведенных исследований. Лабораторная проба (конечная проба или репрезентативная часть конечной пробы) — часть средней пробы, предназначенная для формирования тестового образца (образцов), направляемого на исследования (доставленного в лабораторию), определенная нормативными документами, с целью подтверждения соответствия контролируемого объекта установленным требованиям. Лабораторные животные — экспериментальные или подопытные животные, специально выращиваемые и используемые в лабораториях для научных и практических целей. Лабораторные животные должны быть здоровы и обладать рядом специфических особенностей. Надлежащая лабораторная практика (Стандарт GLP, «Good Laboratory Practice») — система норм, правил и указаний, направленных на обеспечение согласованности и достоверности результатов лабораторных исследований. Наноматериалы — вид продукции наноиндустрии, вещества и композиции веществ, представляющие собой искусственно или естественно упорядоченную систему базовых элементов с нанометрическими характеристическими размерами и особым проявлением физического и (или) химического взаимодействий при кооперации наноразмерных элементов, обеспечивающих существенное улучшение или возникновение совокупности качественно новых (в т.ч. ранее неизвестных) механических, химических, электрофизических, оптических, теплофизических и других свойств данных материалов, определяемых проявлением наномасштабных факторов. Нормативные документы — государственные (национальные) стандарты (ГОСТ), методические указания (МУ), ветеринарные правила и нормы (ВетПиН) и санитарные правила и нормы (СанПиН), устанавливающие нормы, правила, методы, в т.ч. по отбору, упаковке, доставке и хранению проб. Объединенная проба — совокупность идентичных отобранных от однородной продукции точечных проб, предназначенная для составления средней пробы. Объединенную (составную) пробу получают равномерным перемешиванием первичных проб (элементов) из лота расфасованных продуктов или смешивая первичные пробы (инкременты) из лота нерасфасованных сыпучих, жидких продуктов. Органотропность — свойство физического, химического или биологического фактора избирательно воздействовать на определенный орган. Отбор проб — процедура по выделению или составлению пробы, включающая не основанный на статистике случайный — эмпирический или точечный — отбор проб, используемая для принятия решения о соответствии лота продукции установленным требованиям. Проба (репрезентативная проба) — одна или несколько единиц (объемов) вещества, отобранных установленными способами из совокупности (лота, партии), позволяющая получить информацию о заданной характеристике совокупности и являющаяся основой для принятия решения о совокупности, веществе или процессе их производства. Репрезентативная проба — сохраняет характеристики лота, партии, из которого была выбрана. Ее частным случаем является случай простой случайной пробы (точечная проба), когда у каждого элемента или части вещества есть равная вероятность попасть в пробу. Средняя проба — часть объединенной пробы, предназначенная для проведения исследований: формирования лабораторной (проба А) и контрольной (проба Б) проб. Стандартные операционные процедуры — документы, в которых детально изложено выполнение определенных лабораторных процедур, которые, как правило, не детализированы в протоколах исследований и методических руководствах. Схема отбора проб — процедура отбора проб, включающая в себя «переключение» (переход) от одного плана выборочного контроля (например, стандартного) к другому (например, более жесткому). Точечная проба — некоторое минимальное количество вещества (продукции), отобранного из одного места за один прием от данной партии для составления объединенной пробы. В некоторых случаях отбора проб от однородной фасованной продукции, штучной продукции точечная проба может выступать в качестве репрезентативной контрольной, лабораторной пробы. Характеристика — свойство, помогающее, позволяющее идентифицировать или различить элементы в лоте. Характеристика может быть количественной (измеряемое значение, описывается переменными) и качественной (описывается свойствами). Холодовая цепь — это постоянно функционирующая система организационных и практических мероприятий, обеспечивающая оптимальный температурный режим хранения и транспортирования проб на всех этапах пути их следования. Эвтаназия — гуманное быстрое и безболезненное умерщвление животного, не сопровождающееся у него чувством тревоги и страха.

Приложение 3

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

 АСМ                   Атомно-силовая микроскопия БСА                   Бычий сывороточный альбумин ДНК                   Дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА                   Иммуноферментный анализ ОТ-ПЦР                Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция ПЦР                   Полимеразная цепная реакция ПЭМ                   Просвечивающая электронная микроскопия РНК                   Рибонуклеиновая кислота РНКаза (ДНКаза)       Рибонуклеаза (дезоксирибонуклеаза) СП                    Санитарные правила ЭДТА                  Этилендиаминтетрауксусная кислота 

RNase-, DNase-free Свободный от РНКаз, ДНКаз

---

Вводится в действие с 23 ноября 2010 года (пункт 4 данного документа) Текст документа

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
23 сентября 2010 года

Дата введения:
23 ноября 2010 года

2.2.4. ФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ СРЕДЫ

ПРОФИЛАКТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ СУСТАВОВ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ЭТИОЛОГИИ НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
МР 2.2.4.0009-10

1. Методические рекомендации разработаны Федеральным государственным учреждением науки «Северо-Западный научный центр гигиены и общественного здоровья».
2. Одобрены Ученым Советом ФГУН ФНЦГ им. Ф.Ф.Эрисмана Роспотребнадзора (протокол N 4 от 28.05.10).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 23 сентября 2010 г.
4. Введены в действие с 23 ноября 2010 г.
5. Введены впервые.

ВВЕДЕНИЕ

Методические рекомендации посвящены новому методу профилактики костно-мышечной системы, а именно заболеваний суставов нижних конечностей. Документ предназначен для специалистов лечебно-профилактического и гигиенического профиля, работающих в области улучшения условий труда и охраны здоровья работников. Удельный вес заболеваний, связанных с физическими нагрузками, составляет 49,4% по Санкт-Петербургу за 1982 — 2001 гг. При обследовании 553 профессий физического труда число работающих с физическими перегрузками составляет 56,1% (профессиональная заболеваемость в Ленинграде — Санкт-Петербурге за 20 лет (1982 — 2001 гг.; клинико-эпидемиологический анализ), СПб, 2003 г.). Проблема сохранения здоровья работающих, подверженных в процессе трудовой деятельности воздействию неблагоприятных факторов, приобретает острую актуальность. В основе предлагаемого метода профилактики заболеваний опорно-двигательного аппарата лежит действие низкоинтенсивного лазерного излучения. Диффузно рассеянное лазерное излучение, воздействуя на суставы нижних конечностей, улучшает кровообращение. Расширяется артериальное русло как кожи, так и артериальное русло, питающее костную ткань суставов. Исследования на изолированном сосуде показали, что в основе механизма действия лазерного излучения лежит изменение тонуса сосудов, увеличение амплитуды и частоты сокращения сосудов, улучшение кровенаполнения, обменных процессов в исследуемых органах (Ерофеев Н.П., Захарова Л.Б., Малькова Н.Ю. /Сб. науч. тр./ под ред. проф. А.В. Борисова — СПб, 1997). Усиливается выведение недоокисленных продуктов, так как повышается активность антиоксидантной системы. Происходит активация окислительно-восстановительной тиолдисульфидной системы. Активизируются обменные процессы в клетках кожи, костной ткани. Появление ответной реакции антиперекисных ферментных систем крови свидетельствует об усилении процессов свободного радикального окисления. Это препятствует появлению свободных радикалов, перекисных соединений, способствующих прогрессированию заболевания. Основными неблагоприятными факторами условий труда, способствующими развитию заболеваний суставов нижних конечностей, являются статико-динамическая нагрузка на суставы при работе в режиме «стоя», работа в неудобной рабочей позе, в режиме «сидя». К профессиям, где могут развиваться заболевания суставов нижних конечностей, относятся профессии: штукатур, маляр, ткачиха, прядильщица, оператор компьютера, станочники, судосборщики, полировщики, продавцы, рабочие других профессий. Наиболее значимыми для профилактики заболеваний суставов нижних конечностей являются профессиональный отбор в профессию, предварительные при приеме на работу и периодические медицинские осмотры с целью выявления и лечения лиц с начальными проявлениями заболеваний. Известны способы профилактики заболеваний суставов нижних конечностей, в соответствии с которыми к профилактическим мероприятиям относятся механизация и автоматизация производственных процессов, оптимизация режима труда, улучшение микроклиматических условий в цехах, а также проведение разгрузочных физических упражнений, соответствующих особенностям профессии (Руководство по профессиональным заболеваниям под ред. Н.Ф. Измерова. Москва, Медицина, 1996). Однако все эти мероприятия, связанные со значительными экономическими затратами, не обладают высокой эффективностью, не восстанавливают функции суставов. Новизной метода является применение рассеянного лазерного излучения инфракрасной области спектра в зависимости от зоны действия и величины энергетической экспозиции. Известен способ лечения заболеваний костно-мышечной системы, в соответствии с которым суставы облучают лазером инфракрасной области спектра с длиной волны 830 — 890 нм дозой, не превышающей 0,3 Дж/кв. см на одну процедуру (В.А. Буйлин, С.В. Москвин. Низкоинтенсивные лазеры в терапии различных заболеваний. — М.: Фирма «Техника», 2001. 70 — 83 с.). Облучение проводят точечно: при заболеваниях мелких суставов кистей их облучают с тыльной стороны в точке наибольшей болезненности; локтевые, лучезапястные и плечевые суставы облучают по проекции суставной щели последовательно в 3 — 4 точках. Авторы предлагают проведение повторного курса через три недели. При проведении профилактических мероприятий изменения в суставах носят функциональный характер, они не так выражены, как при заболеваниях. Цель профилактических мероприятий — ограничение развития изменений и восстановление нарушенных функций. Этого можно достигнуть при дозах воздействия меньших, чем при лечении. Кроме этого, воздействие на суставы в предлагаемом способе выполняют диффузно рассеянным излучением широким пучком, а не точечно. Проведение воздействия на сустав точечно, на несколько определенных зон, сложнее, чем воздействие на сустав диффузно рассеянным излучением широким пучком. Способ профилактики должен быть простым, легко воспроизводимым, поэтому известный способ лечения не может быть использован для целей профилактики.

Описание метода

Формула метода. Способ профилактики заболеваний суставов нижних конечностей профессиональной этиологии, включающий проведение курса физического воздействия на суставы, отличающийся тем, что воздействуют диффузно рассеянным лазерным излучением инфракрасной области спектра с энергетической экспозицией 1500 — 2100 Дж/кв. м. На разработанный способ получен патент N 2306963 «Способ профилактики заболеваний суставов нижних конечностей профессиональной этиологии».

Показания и противопоказания к применению метода. Показанием к применению метода профилактики является статико-динамическая нагрузка на суставы нижних конечностей, работа в режиме «стоя», в неудобной рабочей позе, режиме «сидя». Противопоказания: онкологические, кожные заболевания. Метод следует применять с осторожностью при активной форме туберкулеза, беременности, болезнях эндокринной системы, болезнях системы кровообращения декомпенсированной формы.

Материально-техническое обеспечение метода. Прибор «АЛП-01-Латон», регистрационное удостоверение МЗ РФ N 9/06101298/0786-00 от 08.08.2000.

Описание метода.
Диффузно рассеянное лазерное излучение инфракрасной области спектра (800 — 1000 нм) с энергетической экспозицией 1500 — 2100 Дж/кв. м, воздействуя на кожу суставов нижних конечностей, проникает на глубину до 6 — 7 см, улучшает кровообращение. Расширяется артериальное русло как кожи, так и артериальное русло, питающее костную ткань суставов. Усиливается выведение недоокисленных продуктов. Активизируются обменные процессы в клетках кожи, костной ткани, включая повышение активности антиоксидантной системы, повышается неспецифическая резистентность организма. Это препятствует появлению свободных радикалов, перекисных соединений, способствующих прогрессированию заболевания, и приводит к полному восстановлению функции суставов. Воздействие не вызывает неприятных ощущений у пациентов и хорошо переносится. Метод профилактики апробирован на 92 судосборщиках корпусов металлических судов, 89 пользователях персонального компьютера (ПК), 56 полировщицах ювелирных изделий. Основными неблагоприятными условиями труда при работе судосборщиков являются физическая нагрузка — статическая и динамическая, работа с виброинструментом, работа при низкой температуре, в режиме «стоя», неудобная рабочая поза и другие; у пользователей ПК — неудобная рабочая поза, из-за плохо оборудованного рабочего места, работа в режиме «сидя», отсутствие подставки для ног; полировщиц ювелирных изделий — физическая нагрузка — статическая и динамическая на кисти рук, работа с виброинструментом неудобная рабочая поза из-за плохо оборудованного рабочего места, работа в режиме «сидя», отсутствие подставки для ног. Для профилактики суставов нижних конечностей диффузно рассеянное излучение инфракрасной области спектра направляют на один из суставов нижних конечностей. Длина волны излучения 0,89 мкм, энергетическая экспозиция 1500 — 2100 Дж/кв. м, длительность сеанса 5 минут курс 7 — 10 дней. Процедуру проводят в положении пациента сидя. Ноги располагают на полу на теплом коврике в оптимальном физиологическом положении: мышцы стопы, голени, бедра максимально расслаблены. На измененный сустав нижних конечностей (коленный, голеностопный, суставы пальцев стопы) воздействуют диффузно рассеянным лазерным излучением инфракрасной области спектра с энергетической экспозицией 1500 — 2100 Дж/кв. м на одну процедуру.

Эффективность использования метода.
По предложенному способу были проведены профилактические мероприятия у 92 судосборщиков корпусов металлических судов, 89 пользователей персонального компьютера (ПК), 56 полировщиц ювелирных изделий. Возраст работающих судосборщиков — 21 — 49 лет, стаж работы — 3 — 21 лет, возраст пользователей ПК — 24 — 54 года, стаж — 2 — 14 лет, возраст полировщиц ювелирных изделий — 24 — 53 года, стаж — 4 — 27 лет. Все работающие осматривались невропатологом, хирургом. Определителем угла поворота УО-1 (угломер) определялся угол сгибания, разгибания в коленном и голеностопном суставах до и после проведения профилактических мероприятий (измерение длины, окружности и амплитуды движений в суставах конечностей. Обзорная информация. Серия: врачебно-трудовая экспертиза и восстановление трудоспособности инвалидов. Составители: Ю.Т. Кочетков, М.В. Горностаева. — Москва, 1982. 85 с.). Исследовалось тиолдисульфидное равновесие в белковой и небелковой фракциях крови. Работающие жаловались на боли в суставах стопы, коленном, голеностопном, особенно при ходьбе, ограничение подвижности суставов, плохой сон. В некоторых случаях выявлялись жалобы на боли в суставах в покое. Объективно выявлялась болезненность суставов при пальпации. Жалобы на подвижность в суставах нижних конечностей до и после проведения профилактических мероприятий представлены в таблицах 1, 2, 3.

Таблица 1

ЖАЛОБЫ И ПОДВИЖНОСТЬ В СУСТАВАХ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ ДО И ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ У СУДОСБОРЩИКОВ (N = 92)

Наименование Болезненность, Подвижность в суставах (в градусах)

       сустава        неприятные                                                                   ощущения                                                                                                                                             до про- после     до профилактики   после профилактики                      филак-  профи-                                                              тики    лактики сгибание разгибание сгибание разгибание                                                                               Коленный          62      8       60 - 70  160 - 170  45 - 50  170 - 175                                                                                Голеностопный     37      0       85 - 90  110 - 120  80 - 90  130 - 135                                                                                Мелкие суставы    52      0       малоподвижны        подвижны             

стопы

Таблица 2

ЖАЛОБЫ И ПОДВИЖНОСТЬ В СУСТАВАХ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ ДО И ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ У ПОЛЬЗОВАТЕЛЕЙ ПК (N = 89)

Наименование Болезненность, Подвижность в суставах (в градусах)

       сустава        неприятные                                                                   ощущения                                                                                                                                             до про- после     до профилактики   после профилактики                      филак-  профи-                                                              тики    лактики сгибание разгибание сгибание разгибание                                                                               Коленный          41      3       60 - 65  170 - 175  40 - 45  175 - 180                                                                                Голеностопный     64      0       85 - 90  120 - 125  75 - 80  130 - 140                                                                                Мелкие суставы    31      0       малоподвижны        подвижны             

стопы

Таблица 3

ЖАЛОБЫ И ПОДВИЖНОСТЬ В СУСТАВАХ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ ДО И ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ У ЮВЕЛИРОВ (N = 56)

Наименование Болезненность, Подвижность в суставах (в градусах)

       сустава        неприятные                                                                   ощущения                                                                                                                                             до про- после     до профилактики   после профилактики                      филак-  профи-                                                              тики    лактики сгибание разгибание сгибание разгибание                                                                               Коленный          32      3       60 - 65  170 - 175  40 - 45  175 - 180                                                                                Голеностопный     26      0       85 - 90  120 - 125  80 - 85  130 - 140                                                                                Мелкие суставы    31      0       малоподвижны        подвижны             

стопы

Изменение тиолдисульфидного равновесия (SH/SS) после проведения профилактических мероприятий у представителей обследуемых групп представлено в таблице 4.

Таблица 4

ТИОЛДИСУЛЬФИДНОЕ РАВНОВЕСИЕ (SH/SS) ДО И ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ОБСЛЕДУЕМЫХ ГРУПП

   Наименование       Исходное состояние          После профилактики              группы                                                                                    белковая     небелковая     белковая      небелковая                      фракция крови фракция крови фракция крови  фракция крови                                                                                Судосборщик     3,0 +/- 0,21  2,9 +/- 0,2   4,08 +/- 0,01 3,7 +/- 0,02                                                                                  Оператор ПК     2,89 +/- 0,34 3,35 +/- 0,28 3,90 +/- 0,02 4,2 +/- 0,21     

Полировщик ЮИ 2,90 +/- 0,30 3,5 +/- 0,2 4,0 +/- 0,2 4,3 +/- 0,2

Всем работающим были проведены профилактические мероприятия. Из таблиц виден положительный эффект действия лазерного излучения на суставы. Улучшена подвижность в суставах, изменены обменные процессы. Возросло тиолдисульфидное равновесие в белковой и небелковой фракциях крови, что свидетельствует о повышении неспецифической резистентности организма работающих. Эти изменения отмечаются во всех исследуемых группах. Однако у 8 судосборщиков, 3 пользователей ПК и 3 полировщиц ювелирных изделий отмечались неприятные ощущения в коленном суставе после проведения профилактических мероприятий. В то же время функциональная подвижность этих суставов была восстановлена. В основе механизма действия лазерного излучения лежит изменение тонуса сосудов, обменных процессов. Диффузно рассеянное лазерное излучение инфракрасной области спектра, воздействуя на кожу суставов нижних конечностей, проникает на глубину до 6 — 7 см, улучшает кровообращение. Расширяется артериальное русло как кожи, так и артериальное русло, питающее костную ткань суставов. Исследования на изолированном сосуде показали, что в основе механизма действия лазерного излучения лежит изменение тонуса сосудов, увеличение амплитуды и частоты сокращения сосудов, улучшение кровенаполнения, обменных процессов в исследуемых органах. Усиливается выведение недоокисленных продуктов, так как повышается активность антиоксидантной системы. Происходит активация окислительно-восстановительной тиолдисульфидной системы. Активизируются обменные процессы в клетках кожи, костной ткани. Появление ответной реакции антиперекисных ферментных систем крови свидетельствует об усилении процессов свободного радикального окисления. Это препятствует появлению свободных радикалов, перекисных соединений, способствующих прогрессированию заболевания, и приводит к полному восстановлению функции суставов. Предполагается, что применение профилактических мероприятий с использованием низкоинтенсивного лазерного излучения снизит рост количества случаев профессиональных заболеваний. На разработанный способ получен патент N 2306963.

---

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ АГЕНТСТВО

ПИСЬМО
от 22 сентября 2010 г. N 32-024/650

ОБ ОТМЕНЕ ЕЖЕНЕДЕЛЬНЫХ ДОНЕСЕНИЙ О ВЫДАННЫХ СВИДЕТЕЛЬСТВАХ ОБ АККРЕДИТАЦИИ

В связи с вводом в эксплуатацию автоматизированной системы по ведению реестра свидетельств об аккредитации граждан и организаций, привлекаемых центральным аппаратом ФМБА России и его территориальными органами в качестве экспертов, экспертных организаций к проведению мероприятий по контролю при осуществлении проверок юридических лиц и индивидуальных предпринимателей считать утратившим силу подпункт «в» пункта 1.2 письма заместителя руководителя ФМБА России В.В. Романова от 27.02.2010 N 32-024/147.

Заместитель руководителя
В.В.РОМАНОВ

---