«Инструкция по применению реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) для обнаружения столбнячного микроба в объектах внешней среды» (утв. Минздравом СССР 25.10.1968 N 760а-68)

УТВЕРЖДАЮ
Начальник Главного
санитарно-эпидемиологического
управления Министерства
здравоохранения СССР
А.ПАВЛОВ
25 октября 1968 г. N 760а-68

ИНСТРУКЦИЯ
ПО ПРИМЕНЕНИЮ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ СТОЛБНЯЧНОГО МИКРОБА В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ <*>

<*> Инструкция подготовлена сотрудниками ордена Трудового Красного Знамени Института эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи АМН СССР Т.И.Сергеевой, К.И.Матвеевым и Т.И.Булатовой.

Метод обнаружения столбнячного микроба с помощью реакции непрямой гемагглютинации является высоко специфичным и может быть применен в лабораториях санэпидстанций, больниц, научно-исследовательских институтах как вспомогательный метод исследования с целью установления обсемененности предметов внешней среды при проверке запыленности больничных помещений, проверке на стерильность перевязочного материала и др.

I. Объекты и цели исследования

Исследование на наличие столбнячного микроба производится в следующих случаях: а) при изучении краевой эпидемиологии столбняка с целью установления степени обсемененности Cl. tetani почвы, пыли, растений и других объектов внешней среды; б) при проведении плановых санитарно-гигиенических анализов на запыленность больничных помещений: палат, перевязочных, предоперационных, операционных, родильных и детских отделений, а также при проверке на стерильность перевязочных материалов, кетгута, шелка, лекарственных средств и т.п.; в) при анализе материалов от больных с целью подтверждения диагноза и от трупов — для постмортального заключения.

II. Взятие проб для исследования

1. Пробы почвы берутся в стерильные бактериологические пробирки с резиновыми пробками. Пробы почвы следует брать на расстоянии трех-пяти метров друг от друга в населенных пунктах (дворы, скотные дворы, огороды, сады, дороги, улицы, детские и спортивные площадки и т.д.), а также в лугах, полях, пастбищах, лесах, на берегах рек. Для взятия почвы пробирка извлекается из стерильного бумажного пакета, нижней частью пробирки сдвигается поверхностный слой почвы в 3-5 см, затем открытым концом пробирки путем винтообразного движения вглубь набирается почва, после чего плотно закрывается <>. На пробирке делают надпись: место взятия почвы, номер пробы, дата. Листья, растения и другие объекты помещаются в стерильную посуду.
   

   ---

   <> Применение шпаделей для снятия поверхностного слоя почвы затруднено, так как требуется на каждую пробу стерильный шпадель.

2. Для взятия пыли в помещениях необходимо заготовить тампоны из ваты на палочке, смочить тампоны физиологическим раствором, вложить их в пробирки, закрыть пробирки резиновыми пробками и простерилизовать в автоклаве. Взятие пыли производится следующим образом: тампоны извлекают за кончик палочки из пробирки и влажным тампоном собирают пыль с поверхности предметов, после чего опять помещают в пробирку, которая закрывается пробкой и надписывается. Для анализа перевязочные средства, образцы кетгута, шелка, лекарств направляются в заводской упаковке или же из них делается выборочное взятие стерильными инструментами тампонов, марлевых салфеток, ваты и других материалов, которые помещаются в стерильную посуду с надписью, содержащей название материала, место взятия и дату.
3. При подозрении на столбняк от больных берут на исследование содержимое раны, отторгнутые ткани, инородные тела, извлеченные из ран, перевязочные средства (тампоны, дренажные трубки, кетгут, шелк и т.д.). При криминальных абортах следует брать тампоном выделения из шейки матки. В случае подозрения на столбняк у новорожденного необходимо взять на исследование ткани из пупочной ранки, тампоны, повязки, шелк, использованные для перевязки пуповины. От трупов следует брать кусочек мышечной ткани из предполагаемого места внедрения инфекции и содержимое раны. Для взятия материала на исследование применяются стерильные инструменты и посуда. Пробы этикетируются, где указывается название материала, фамилия, имя, отчество больного или трупа, дата взятия. Все пробы до исследования должны храниться при температуре не выше 4 град.

III. Посев исследуемых материалов

Исследование всех вышеуказанных материалов производится путем посева их на жидкую среду и дальнейшего исследования культуральной жидкости посевов с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Для посевов используется бульон Глузмана или бульон Вейнберга с кусочками мяса под вазелиновым маслом при рН 7,2-7,4, разлитые по 70 мл во флаконы емкостью 100 мл. Перед посевом флаконы со средой прогревают на водяной бане при 100 град. в течение 10 минут для регенерации среды, после чего охлаждают до 45 град. В каждый флакон перед посевом добавляют по 0,5% стерильного 40% раствора глюкозы (1 мл на флакон). Посев почвы производится следующим образом: в пробирку с пробой почвы добавляют равный объем физиологического раствора, после чего почва тщательно перемешивается пастеровской пипеткой, спустя 40-60 минут выдерживания при комнатной температуре по 2-3 мл почвенной суспензии вносится во флакон со средой. Тампон с пылью извлекают за палочку из пробирки, осторожно отделяют его пипеткой от палочки и целиком помещают в питательную среду. Листья, растения и другие предметы помещают стерильным пинцетом во флакон со средой. Перевязочные и другие материалы, проверяемые на стерильность, исследуют в специальных стерильных боксах и одежде с соблюдением правил асептики. Приблизительно по 2-3 гр. материала (тампоны, бинты, вата, кетгут, шелк и т.д.) извлекают стерильными инструментами и помещают в среду. Кусочки тканей, взятые из трупов, предварительно измельчаются, а затем вносятся в питательную среду; содержимое раны, тампоны и другие материалы от больных засеваются так же, как указано выше. Все посевы помещают в термостат при 37 град. При наличии роста исследование посевов следует начинать спустя 48 часов после посева. Посевы материалов, подвергавшихся стерилизации (перевязочные средства, кетгут, шелк), необходимо при отсутствии видимого роста выдерживать в термостате до 2-х недель. Трех-четырехсуточные посевы испытуемых материалов исследуются методом реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и микроскопированием.

IV. Материалы и реактивы, необходимые для постановки РНГА

Для постановки РНГА необходимы следующие реактивы и материалы: 1) Реактивы для приготовления буферных растворов:

1/15 М NaHPO 2H O

4 2
1/15 М KH2PO4
физиологический раствор
2) Танин
3) Противостолбнячная сыворотка, очищенная и концентрированная методом «Диаферм-3» активностью 1000-1500 АЕ в 1 мл 4) Бараньи эритроциты (нативные, консервированные в растворе Олсвера или формалинизированные эритроциты) 5) Нормальная кроличья сыворотка
6) Столбнячный очищенный, концентрированный, но не адсорбированный анатоксин, активностью 150-200 ЕС в 1 мл 7) Доски для гемагглютинации из плексигласа с 72 лунками. Объем лунки 2 мл 8) Шприц непрерывного действия на 1 мл
9) Пипетки градуированные на 1, 2, 5 мл.

Приготовление буферных растворов

Для приготовления 1 литра 1/15 М Na HPO 2H O раствора берется 11,88

2 4 2 г реактива и добавляется до 1 литра физиологический раствор. Для приготовления 1 литра 1/15 М KH2PO4 раствора берется 9,08 г реактива и добавляется до 1 литра теплый (45 град.) физиологический раствор. Из этих исходных растворов готовятся буферные растворы для постановки РНГА.

Буфер с рН 6,4

1/15 М Na HPO 2H O — 61,1 мл

              2   4  2                       100 мл     1/15 М KH2PO4         - 38,9 мл   

Буфер с рН 7,0

1/15 М Na HPO 2H O — 53,4 мл

              2   4  2                       240 мл     1/15 М KH2PO4         - 186,6 мл  

Для получения большего количества буферных растворов составные части увеличивают в нужное число раз. Буферные растворы изготовляют заранее, контролируют их рН и сохраняют при 4-10 град.

Приготовление раствора танина

Для танизирования эритроцитов используется медицинский порошкообразный танин. Рабочим разведением танина является разведение его в физиологическом растворе в соотношении 1:20000. Сначала готовят исходный раствор танина, который можно сохранять в холодильнике при 4-10 град. в течение 2-3-х недель и использовать для работы. Для приготовления исходного раствора взвешивают на торсионных или аналитических весах 10-12 мг танина и помещают в пробирку, куда добавляют физиологический раствор до концентрации 1 мг/мл, в результате чего получают разведение танина 1:1000. Для получения разведения 1:20000 исходный раствор разводят в 20 раз (1 мл исходного раствора + 19 мл физиологического раствора). Противостолбнячная сыворотка «Диаферм-3» должна быть первоначально апробирована в РНГА со столбнячным анатоксином или токсином, так как не всякая серия сыворотки бывает пригодна для сенсибилизации эритроцитов. Методика проверки сыворотки изложена ниже.

Бараньи эритроциты

Для РНГА лучше использовать эритроциты, консервированные в растворе Олсвера, которые при хранении в холодильнике могут быть применены для РНГА в течение 3-4-х недель. Раствор Олсвера для консервации эритроцитов: 1) Глюкоза — 2,05 г
2) Лимоннокислый Na — 0,8 г
3) Хлористый Na — 0,42 г
4) Дистиллированная вода — до 100 мл.
Установить рН — 6,1-6,2, стерилизовать 2 раза по 30 минут текучим паром. Кровь из барана берется в стерильную посуду с раствором Олсвера в соотношении 1:1. Для РНГА можно использовать также формалинизированные эритроциты и танизированные по методу М.И.Леви (1962, 1967), которые в течение нескольких месяцев сохраняют свои свойства.

V. Методика постановки реакции

Приготовление танизированных эритроцитов

По 3-5 мл нативных или консервированных эритроцитов барана отмывают 4-5 раз физиологическим раствором в центрифуге при 2500-3000 об./мин. по 5-7 минут. Прозрачную бесцветную надосадочную жидкость сливают, по 0,15 мл осадка отмытых эритроцитов помещают в центрифужные пробирки, куда вносят 4 мл физиологического раствора и 4 мл рабочего разведения танина (1:20000), смесь выдерживают при 37 град. в течение 10 минут и отмывают: а) смесь центрифугируют 5-7 минут при 3000 об./мин., надосадочную жидкость сливают; б) осадок отмывают физиологическим раствором 2 раза.

Сенсибилизация эритроцитов противостолбнячной сывороткой

К осадку отмытых танизированных эритроцитов добавляют 3 мл противостолбнячной сыворотки, разведенной 1:10 буферным физиологическим раствором с рН — 6,4. Смесь выдерживают при 37 град. в течение 1 часа, после чего отмывают на центрифуге: а) центрифугируют 5-7 минут при 3000 об./мин., надосадочную жидкость сливают; б) осадок отмывают 4 мл буферного физиологического раствора с рН 6,4, надосадочную жидкость сливают; в) осадок отмывают буферным физиологическим раствором рН 6,4 с 1% нормальной инактивированной при 56 град. 30 минут кроличьей сывороткой, надосадочную жидкость сливают; г) осадок суспендируют в 6 мл буферного раствора рН 6,4 с 1% нормальной инактивированной кроличьей сывороткой — получается 2,5% взвесь танизированных сенсибилизированных противостолбнячной сывороткой эритроцитов. Сенсибилизация танизированных формалинизированных эритроцитов производится следующим образом: 5 мл 2,5% взвеси эритроцитов отмывают физиологическим раствором, к осадку добавляют противостолбнячную сыворотку в указанном количестве, смесь выдерживают в термостате 2 часа, после чего отмывают, как указано выше, и взвешивают в 5 мл физиологического раствора с pH 6,4 и 1% нормальной кроличьей сывороткой (инактивированной).

Разведение исследуемого материала

Из посевов исследуемого материала на жидкие питательные среды спустя 48 часов инкубации при 37 град. берут по 0,5 мл культуральной жидкости, делают мазок на предметном стекле для микроскопирования, а затем разводят в 5 раз буферным физиологическим раствором рН 7,0 и 0,4% нормальной кроличьей инактивированной сывороткой (1:250). Во все лунки доски для гемагглютинации разливают по 0,5 мл буферный раствор рН 7,0 с 0,4% кроличьей сыворотки. В 1-ю лунку вносят 0,5 мл разведенной в 5 раз культуральной жидкости, далее делают последовательные 2-кратные разведения исследуемого материала путем переноса из лунки в лунку по 0,5 мл смеси, из предпоследней лунки 0,5 мл выливают, последняя лунка остается для контроля. Таким образом получают разведения испытуемой культуральной жидкости от 1:10 до 1:10240 <> (схема 1).

<> При апробации противостолбнячных сывороток таким же образом разводят столбнячный анатоксин или столбнячный токсин.

Схема 1

       1:10    1:20   1:40   1:80  1:160  1:320  1:640 1:1280 1:2500 Контр.                                                               и т.д.                                                                                      N 1 0,5 мл  0,5 мл 0,5 мл и т.д.                                   0,5 мл       исход-                                                                      ного                                                                        разве-                                                                      дения                                                                                                                                               N 2                                                                0,5 мл                                                                               N 3                                                                0,5 мл                                                                               N 4                                                                0,5 мл                                                                               N 5                                                                0,5 мл                                                                               N 6 0,5 мл  0,5 мл 0,5 мл и т.д.                                   0,5 мл       столб.                                                                      анато-                                                                      ксина                                                                       или                                                                         токсина                                                                

В первую лунку каждого из 5 горизонтальных рядов вносят исходные разведения пяти исследуемых культур (N 1-5). В 6-й ряд вносят 0,5 мл столбнячного анатоксина или токсина и разводят так же (контроль активности сенсибилизированных эритроцитов). После приготовления разведений испытуемого материала в каждую лунку, включая и контрольные, вносят по 0,1 мл взвеси танизированных сенсибилизированных сывороткой эритроцитов. Содержимое лунок тщательно перемешивают путем осторожного встряхивания, и доски помещают в термостат на 1 час при 37 град., а затем оставляют при комнатной температуре. Предварительный учет результатов реакции производят через 2-3 часа, окончательный через 18 часов.

Учет результатов

Учет результатов производится визуально по следующей схеме: (+) — положительная реакция: равномерная агглютинация эритроцитов, лунка заполнена гомогенной розовой взвесью; (+/-) — учитываемая крайняя положительная реакция: зона агглютинированных эритроцитов несколько меньше диаметра лунки и окружена красным тонким ободком эритроцитов; (-) — отрицательная реакция: зона эритроцитов занимает половину или менее диаметра лунки и окружена плотным красным ободком или представляет собой плотный красный диск («пуговка»), лежащий на дне лунки. За положительный результат следует считать (+) или (+/-) реакцию в разведении 1:20 и выше испытуемого материала (т.е. во 2-й и последующих лунках горизонтального ряда доски), при отрицательном контроле в вертикальном 12-м ряду и положительном — в 6-м горизонтальном ряду в разведении не менее 1:1280 — 1:2560 <>.

<> При контроле противостолбнячных сывороток следует отбирать для работы те серии сывороток, которые дают положительный результат в РНГА с анатоксином или токсином в разведении не менее чем до 1:2560 — 1:5120.

Мазки, приготовленные из каждого исследуемого посева, фиксируют над пламенем, окрашивают по Граму и микроскопируют. Наличие в препарате грамположительных палочковидных микробов со спорами в виде барабанной палочки при положительной РНГА с данным посевом указывает на наличие возбудителей столбняка в исследуемом материале. При наличии в препарате микробов, похожих на Cl. tetani, и сомнительной реакции гемагглютинации необходимо повторить РНГА на 5-6-е сутки выращивания посевов, а также поставить биологическую пробу на белых мышах. Для этого нужно развести испытуемую культуральную жидкость в 5 раз и ввести по 0,5 мл двум белым мышам в мышцу задней лапки. Появление признаков столбняка (напряжение хвоста и конечности на стороне введения, изгибание позвоночника, судороги) у мыши свидетельствует о наличии столбнячного микроба. При выделении чистой культуры с целью идентификации столбнячного микроба путем посева на высокий столбик высевы отдельных колоний на жидкую среду следует проверять также по указанной методике.