Общая фармакопейная статья "Определение анти-A и анти-B гемагглютининов в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека. ОФС.1.8.2.0005.15" ("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II") Общая фармакопейная статья "Испытание на анти-D антитела в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека. ОФС.1.8.2.0004.15" ("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II") Общая фармакопейная статья "Определение активности факторов свертывания крови. ОФС.1.8.2.0003.15" ("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II") Общая фармакопейная статья "Иммуноэлектрофорез в агаровом геле. ОФС.1.8.2.0002.15" ("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II") Общая фармакопейная статья "Иммунодиффузия в геле. ОФС.1.8.2.0001.15" ("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II") Общая фармакопейная статья "Иммуноглобулины и сыворотки (антитела) гетерологичные. ОФС.1.8.1.0004.15" ("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II") Приказ Минздрава МО от 23.01.2015 N 80 "Об утверждении Регламента взаимодействия участников системы льготного лекарственного обеспечения"

В соответствии с Приказом Минздрава России от 21.11.2014 N 768 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Определение анти-A и анти-B гемагглютининов в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека ОФС.1.8.2.0005.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод, используемый для определения анти-A и анти-B гемагглютининов в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека. Метод непрямой гемагглютинации «на плоскости» (Метод A) или гелевый метод (Метод B) основаны на том, что содержащиеся в испытуемом препарате анти-A и анти-B гемагглютинины, являясь неполными антителами класса Ig G, вызывают сенсибилизацию эритроцитов. Добавление антиглобулиновой сыворотки в солевой среде при температуре () °С вызывает агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов и позволяет визуализировать результат реакции.

Проведение испытания.
Содержание гемагглютининов определяют с использованием эритроцитов человека групп крови A1 (II), резус-отрицательный и B (III), резус-отрицательный. Допустимо применение как свежеприготовленной суспензии (при использовании метода непрямой гемагглютинации «на плоскости» (Метод A), так и стандартных эритроцитов, входящих в наборы для определения групп крови (при использовании Методов A и B). При определении содержания гемагглютининов «на плоскости» (Метод A) используют 5% суспензию эритроцитов, при определении содержания гемагглютининов гелевым методом (Метод B) использую 0,8% суспензию эритроцитов.

Метод непрямой гемагглютинации «на плоскости» (Метод A)

В стеклянные пробирки или лунки планшета вносят равное количество соответствующего разведения испытуемого образца (ИО) и 5% суспензии эритроцитов человека группы крови A1 (II) (первый ряд) и 5% суспензии эритроцитов человека группы крови B (III) (второй ряд). Пробы осторожно перемешивают и инкубируют в течение 30 мин. при температуре () °С. По окончании инкубации пробы центрифугируют при 1500-2000 об/мин. в течение 10 мин. Затем удаляют надосадочную жидкость, полученный осадок ресуспендируют в десятикратном объеме 0,9% раствора натрия хлорида и вновь центрифугируют при 1500-2000 об/мин. в течение 10 мин. Процедуру повторяют не менее 3 раз. Надосадочную жидкость удаляют, добавляют равный осадку эритроцитов объем поливалентной антиглобулиновой сыворотки (сыворотка Кумбса) и осторожно перемешивают. Пробы инкубируют при температуре () °С в течение 30 мин. По окончании инкубации под микроскопом или визуально исследуют пробы, отмечая наличие агглютинации эритроцитов. Титр гемагглютининов определяют как максимальное разведение испытуемого образца, при котором происходит агглютинация эритроцитов любой степени интенсивности. Разведение до содержания белка 30 г/л при определении титра не учитывают. В каждую пробу, в которой не определяется агглютинация, вносят равное количество (по объему) контрольных клеток Кумбса, осторожно перемешивают и через 2-4 мин. оценивают агглютинацию. Критерии приемлемости результатов:
— в пробах с отрицательным результатом (отсутствие агглютинации) после добавления контрольных клеток Кумбса должна наблюдаться агглютинация.

Гелевый метод (Метод В)

Примечания.
1. Подготовка испытуемого образца. Испытуемый препарат разводят солевым раствором (0,9% раствор натрия хлорида или буферный раствор низкой ионной силы (LISS) до содержания белка 30 г/л. Готовят два ряда двукратных разведений испытуемого образца с использованием 1% раствора бычьего сывороточного альбумина (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128). При использовании гелевого метода (Метод B) разведения препарата готовят с использованием 0,9% раствора натрия хлорида или буферного раствора низкой ионной силы (LISS). 2. Подготовка суспензии стандартных эритроцитов. Эритроциты человека группы крови A (II), резус-отрицательные (свежеприготовленные, не более 3 сут. хранения) центрифугируют 10 мин. при 1500-2000 об/мин. при комнатной температуре, надосадочную жидкость сливают. Полученный осадок ресуспендируют в десятикратном объеме 0,9% раствора натрия хлорида и снова центрифугируют в течение 10 мин. при 1500-2000 об/мин. при комнатной температуре. Процедуру повторяют не менее 3 раз до получения прозрачной надосадочной жидкости. Для получения 5% суспензии 1 объем осадка эритроцитов ресуспендируют в 19 объемах 0,9% раствора натрия хлорида. Аналогичным образом приготавливают 5% суспензию эритроцитов человека группы крови B (III), резус-отрицательные.

В соответствии с Приказом Минздрава России от 21.11.2014 N 768 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Испытание на анти-D антитела в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека ОФС.1.8.2.0004.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод определения анти-D антител в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека. Анти-D антитела определяют методом гемагглютинации «на плоскости» (Метод A) или в геле (Метод B). Принцип метода состоит в том, что содержащиеся в испытуемом препарате анти-D антитела, являясь иммуноглобулинами класса G, способны вызывать агглютинацию D-положительных эритроцитов.

Проведение испытания.
Содержание анти-D антител определяют с использованием папаинизированных D-положительных эритроцитов человека группы крови I (0). Предпочтительно использование эритроцитов фенотипа 0R2R2, возможно также применение эритроцитов фенотипов 0R1R1 или 0R1R2. Смешивание эритроцитов разных фенотипов недопустимо. Для контроля специфичности анализа применяют D-отрицательные эритроциты фенотипа 0rr. Допустимо применение как свежеприготовленной суспензии эритроцитов (при испытаниях методом гемагглютинации «на плоскости», Метод A), так и стандартных эритроцитов, входящих в тест-наборы (Методы A и B). При определении содержания анти-D-антител Методом A используют 3% суспензию эритроцитов, при определении содержания гемагглютининов гелевым методом (Метод B) используют 0,8% суспензию эритроцитов.

Метод гемагглютинации «на плоскости» (Метод A)

В стеклянные пробирки или лунки планшета вносят равное количество соответствующего разведения препарата и 3% суспензии D-положительных эритроцитов человека группы крови I (0) — первый ряд и 3% суспензии D-отрицательных эритроцитов человека группы крови I (0) — второй ряд. К подготовленному разведению стандартного образца также добавляют равное количество 3% суспензии D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) и 3% суспензии D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд). Пробы осторожно встряхивают (на шейкере) в течение 10 сек., затем центрифугируют в течение 1 мин. при 80 об/мин. Пробирки (планшеты) располагают под углом 70° к горизонтальной поверхности и оценивают визуально агглютинацию эритроцитов через 4-5 мин. (но не более чем через 10 мин.). Содержание анти-D антител, определяемое максимальным разведением препарата, при котором наблюдают агглютинацию любой интенсивности, сравнивают с содержанием анти-D антител в положительном стандартном образце.

Метод гемагглютинации в геле (Метод В)

Гелевый метод основан на использовании гелевой карты, представляющей собой пластиковый планшет с микропробирками, наполненными гелевыми колонками. Каждая микропробирка состоит из дозирующей/инкубационной камеры и колонки, содержащей полимеризованные микросферы декстрана в буферном растворе низкой ионной силы (LISS). В дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) или по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующего разведения испытуемого образца. Одновременно готовят пробы положительного и отрицательного стандартных образцов содержания анти-D антител: в дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) или по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующего разведения стандартного образца. Пробы инкубируют при температуре () °С в течение 30 мин. По окончании инкубации пробы центрифугируют (на специальной центрифуге для гелевых карт) в стандартных условиях (запрограммированный режим) и оценивают агглютинацию. Агглютинированные эритроциты распределяются в толще гелевой колонки или в ее верхней части. Неагглютинированные эритроциты оседают на дно микропробирки. Содержание анти-D антител, определяемое максимальным разведением препарата, при котором наблюдают агглютинацию любой интенсивности, сравнивают с содержанием анти-D антител в положительном стандартном образце. Критерии приемлемости результатов:
— в пробирках (планшетах, микропробирках), содержащих суспензию D-отрицательных эритроцитов человека, агглютинация должна отсутствовать. Наличие агглютинации в этих пробирках (планшетах, микропробирках) свидетельствует о неспецифической реакции; испытания в этом случае необходимо повторить; — содержание анти-D антител в положительном стандартном образце должно соответствовать аттестованным величинам.

Примечания.
1. Подготовка испытуемого образца. Испытуемый образец разводят фосфатным буферным раствором (pH ), содержащим 2 г/л бычьего сывороточного альбумина, до содержания белка в образце 25 г/л. Это разведение испытуемого образца принимают за двукратное разведение (1:2), даже если оно и не соответствует истинной кратности разведения. Готовят два ряда двукратных разведений испытуемого образца с использованием фосфатного буферного раствора (pH ), содержащего 2 г/л бычьего сывороточного альбумина (1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256). При использовании гелевого метода (Метод B) разведения испытуемого образца готовят с использованием 0,9% раствора натрия хлорида или буферного раствора низкой ионной силы (LISS). 2. Подготовка стандартных образцов содержания анти-D антител. В качестве стандартных образцов используют 5% раствор иммуноглобулина человека, содержащий 0,0475 МЕ/мл анти-D антител и имеющий номинальный титр в реакции гемагглютинации 1:8 (положительный стандартный образец) и 5% раствор иммуноглобулина человека, содержащий анти-D антитела в разведении не более 1:2 (отрицательный стандартный образец). Содержание анти-D антител в положительном стандартном образце является максимально допустимым для препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения. Подготовку стандартных образцов проводят в соответствии с инструкцией по применению. Анализ проводят с образцами, разведенными фосфатным буферным раствором (pH ), содержащим 2 г/л бычьего сывороточного альбумина, до содержания белка 25 г/л. 3. Подготовка раствора папаина. Лиофилизат папаина растворяют в соответствии с инструкцией производителя. Инкубируют при температуре () °С в течение 10-15 мин. Раствор используют свежеприготовленным. Возможно хранение раствора при температуре () °С в течение 5 сут. или при температуре минус () °С в течение 6 мес. Раствор после оттаивания повторному замораживанию не подлежит. 4. Подготовка суспензии стандартных эритроцитов. Свежеприготовленные D-положительные эритроциты (хранившиеся не более 3 сут.), полученные не менее чем от 3 доноров, центрифугируют в течение 10 мин. при 1500-2000 об/мин. при комнатной температуре. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в десятикратном объеме фосфатного буферного раствора и центрифугируют 10 мин. при тех же условиях. Процедуру повторяют не менее 3 раз, до получения прозрачной надосадочной жидкости. В стеклянную пробирку вносят равные объемы промытых эритроцитов и раствора папаина, инкубируют в течение 15 мин. при температуре () °С, а затем центрифугируют при 1500-2000 об/мин. в течение 10 мин. После удаления надосадочной жидкости осадок ресуспендируют в десятикратном объеме фосфатного буферного раствора и центрифугируют при тех же условиях. Для приготовления 3% суспензии 1 объем осадка папаинизированных эритроцитов ресуспендируют в 32 объемах фосфатного буферного раствора, содержащего 2 г/л бычьего сывороточного альбумина. Аналогичным образом приготавливают 3% суспензию D-отрицательных эритроцитов, полученных от 1-3 доноров. 5. Приготовление фосфатного буферного раствора. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 8,0 г натрия хлорида, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата, 0,2 г калия хлорида, 0,2 калия дигидрофосфата. Добавляют 900 мл воды очищенной. Доводят pH до 1 М раствором натрия гироксида или 1 М раствором хлористоводородной кислоты, перемешивают, доводят объем раствора до метки водой очищенной и вновь перемешивают.

В соответствии с Приказом Минздрава России от 21.11.2014 N 768 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Определение активности факторов свертывания крови ОФС.1.8.2.0003.15
Вводится впервые

Настоящая фармакопейная статья распространяется на методы определения активности факторов системы свертывания крови человека I, II, VII, VIII, IX, X, XI, фактора Виллебранда, антитромбина III в плазме и препаратах крови.

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Определение активности факторов свертывания базируется на 2 подходах: 1. Одностадийный метод. Восстановление процесса свертывания крови в дефицитной по фактору плазме после добавления препарата этого фактора (клоттинговый метод). 2. Двухстадийный метод. На первой стадии с использованием специфического кофактора активируется протеолитическая активность фактора II или фактора X с образованием соответственно активированного фактора IIa или Xa. На второй стадии количество образовавшегося активированного фактора определяют по реакции расщепления им специфического хромогенного пептида (хромогенный метод). Возможно проведение хромогенного метода 2 способами: по кинетике образования хромогена под действием активированного фактора или по конечной точке накопления хромогена за определенное время инкубации. Для проведения обоих методов возможно использование пластиковых пробирок, планшетов, оптико-механических, механических полуавтоматических и полностью автоматизированных коагулометров. Во всех методах расчет активности производят при сравнении активности тестируемого образца с активностью Международного стандарта NIBSC или вторичного стандартного образца фактора свертывания, откалиброванного относительно международного стандарта в международных единицах активности (ME). Эквивалентность международного стандарта в ME устанавливается ВОЗ. За 1 ME (100%) принимают активность фактора свертывания в 1,0 мл свежей нормальной пулированной плазме крови от 300 доноров. Активность может быть выражена в МЕ/мл, МЕ/флакон, МЕ/мг белка и в % от заявленного производителем количества.

ФАКТОРЫ

Фактор I (фибриноген)

Клоттинговый метод
Определение активности фибриногена проводят методом Клаусса. Принцип метода
При добавлении тромбина к образцу, содержащему фибриноген, наблюдается образование сгустка фибрина. При использовании тромбина с высокой активностью (~ 10 МЕ/мл) и образцов с низкой концентрацией фибриногена (ниже 100 мг/дцл) можно получить линейную зависимость. Для определения фибриногена используют коммерческие тестовые системы, в состав которых входит реагент тромбина, содержащий ингибитор гепарина, и буфер для разведения образцов или коммерческий тромбин-реагент. Концентрация фибриногена выражается в мг/дцл. Для построения калибровочного графика используют стандартный образец фибриногена или аттестованную по международному стандарту плазму-калибратор. Стандартный образец или образец плазмы-калибратора растворяют в дистиллированной воде согласно инструкции. Готовят 5 последовательных разведений стандартного образца, начиная с концентрации ~ 100 мг/дцл, с помощью буфера для разведения образцов pH = . Анализ проводят при температуре 37 °С согласно инструкции к набору. Для каждого разведения трижды определяют время образования сгустка. По полученным результатам в логарифмических координатах строят калибровочный график зависимости времени образования сгустка от концентрации фибриногена. Готовят 2 разведения испытуемого образца с концентрацией ниже 100 мг/дцл. Для каждого разведения время образования сгустка определяют трижды. Количество фибриногена в каждом разведении определяют по калибровочному графику.

Фактор II (тромбин)

Клоттинговый метод Определение активности фактора II проводят с использованием в качестве субстрата человеческой плазмы, дефицитной по фактору II. Процесс свертывания активируется добавлением к смеси кальция тромбопластина. Для разведения стандарта и препаратов используют NaCl-имидазоловый буфер pH с добавлением 0,1% бычьего или человеческого альбумина. Для построения калибровочного графика готовят серию последовательных разведений стандарта фактора II в интервале активности от 0,3 до 1 МЕ/мл. Препарат разводят до концентрации менее 1 МЕ/мл. Анализируют 3 разведения препарата. Для каждого образца измерение времени свертывания проводят минимум 2 раза. Измерение проводят в течение 1 ч после разведения препарата. Анализ проводят при температуре () °С. В пластиковую пробирку вносят 50 мкл плазмы, дефицитной по фактору II, и 50 мкл разведения стандарта или препарата. Смесь инкубируют при () °С в течение 120-240 с. Время свертывания определяют с момента добавления к смеси 200 мкл предварительно нагретого до температуры () °С кальция тромбопластина. В зависимости от техники постановки анализа объемы реагентов могут варьироваться в соответствующей пропорции. Калибровочный график строят в полулогарифмических координатах. По логарифмической оси абсцисс откладывают значения активности фактора II, по оси ординат — время свертывания соответствующих разведений стандарта. Активность фактора II для каждого разведения испытуемого образца находят по калибровочному графику. Активность FII (A) в исследуемом образце рассчитывают по формуле:

A = Ax · k,

где: Ax — активность соответствующего разведения исследуемого образца, найденная по калибровочному графику; k — разведение исследуемого образца.

2. Хромогенный метод
Метод основан на сравнении ферментативной активности фактора IIa, образованного после специфической активации фактора II, в отношении специфического хромогенного пептидного субстрата с такой же активностью стандартного образца (международного или аналогичного). Фактор II активируется с помощью активатора экарина, выделенного из яда гадюки. Активированный фактор II (тромбин) селективно расщепляет хромогенный субстрат (H-D-фенилаланин-L-пипеколил-L-аргинин-4-нитроанилида дигидрохлорид, 4-толуолсульфонилглицил-пролил-L-аргинин-4-нитроанилид, H-D-циклогексилглицил—аминобутирил-L-аргинин-4-нитроанилид, D-циклогексилглицил-L-аланил-L-аргинин-4-нитроанилида диацетат) с образованием n-нитроанилина. Кинетику реакции исследуют фотометрическим методом при 405 нм. При этом значение оптической плотности пропорционально активности фактора II. Определение фактора II хромогенным методом осуществляют с помощью специальных тестовых наборов. Анализ выполняется в соответствии с инструкцией к набору. Стандартный образец и препарат предварительно разводят плазмой, дефицитной по фактору II, до концентрации ~ 1 МЕ/мл (основное разведение). Из основного разведения готовят 3 разведения стандартного образца и 3 разведения препарата трис-солевым буферным раствором pH 8,4. Каждое разведение стандартного образца определяют двухкратно, полученные значения используют для построения калибровочного графика. Испытуемые образцы определяют трехкратно. Испытания проводят в ручном режиме с использованием микропланшет и спектрофотометра, поддерживающего температуру в диапазоне () °С или в автоматическом режиме с использованием коагулометра. Для проведения испытаний в ручном режиме в лунки микропланшета вносят по 25 мкл каждого разведения испытуемого препарата или стандартного образца. В каждую лунку прибавляют по 125 мкл буфера для разведения, по 25 мкл экарина и инкубируют при температуре () °С в течение 2 мин. По истечении времени инкубации в каждую лунку вносят по 25 мкл хромогенного субстрата фактора IIа. Определяют скорость изменения оптической плотности при длине волны 405 нм непрерывно в течение 3 мин. и рассчитывают среднюю скорость изменения оптической плотности (A/мин.). Если непрерывное измерение оптической плотности невозможно, определяют оптическую плотность при длине волны 405 нм через последовательные интервалы времени (например, через 40 с) и строят график зависимости оптической плотности от времени и рассчитывают A/мин. как угол наклона прямой. Из значений A/мин. каждого индивидуального разведения стандартного образца и испытуемого препарата рассчитывают активность испытуемого препарата.

3. Тест на отсутствие тромбина
Определение проводят коагулометрическим методом. Для испытаний готовят восстановленный в соответствии с инструкцией раствор препарата. При наличии в препарате гепарина его нейтрализуют добавлением протамина сульфата из расчета 10 мкг протамина сульфата на 1 ME гепарина. Приготовление раствора фибриногена
0,3 г фибриногена растворяют в 100 мл, перемешивают и выдерживают 15-20 мин. при комнатной температуре. Срок хранения раствора 1 мес. при температуре от 2 до 8 °С. Приготовление раствора тромбина
Лиофилизат растворяют в соответствии с инструкцией производителя, выдерживают 15-20 мин. при комнатной температуре и разводят 0,9% раствором натрия хлорида до содержания тромбина 1 МЕ/мл. Срок хранения раствора 6 мес. при температуре минус 20 °С. Раствор после оттаивания повторному замораживанию не подлежит. Ход определения
В 2 пробирки вносят равные объемы восстановленного препарата и раствора фибриногена. В третью пробирку (контрольная проба) вносят равные объемы раствора тромбина и раствора фибриногена, перемешивают содержимое пробирок вращательными движениями. Одну пробирку с восстановленным препаратом инкубируют на водяной бане с температурой 37 °С в течение 6 ч, другую пробирку с восстановленным препаратом — при комнатной температуре в течение 24 ч. Отмечают наличие или отсутствие коагуляции (сгустка). Контрольную пробу инкубируют на водяной бане при температуре 37 °С и отмечают время образования сгустка. Критерием приемлемости результатов является коагуляция в контрольной пробе через 30 с.

Фактор VII

Клоттинговый метод Определение активности фактора VII проводят с использованием человеческой плазмы, дефицитной по фактору VII. Процесс свертывания активируется добавлением к смеси кальция тромбопластина. Для разведения стандарта и препаратов используют NaCl-имидазоловый буфер pH 7,3 с добавлением 0,1% раствора альбумина человеческого или бычьего. Для построения калибровочного графика готовят серию последовательных разведений стандарта образца фактора VII в интервале от 0,3 до 1 МЕ/мл. Препарат разводят до концентрации менее 1 МЕ/мл. Анализируют 3 разведения препарата. Для каждого образца измерение времени свертывания проводят минимум 2 раза. Измерение проводят непосредственно после разведения препарата. Анализ проводят при температуре () °С. В пластиковую пробирку вносят 50 мкл плазмы, дефицитной по фактору VII и 50 мкл разведения стандарта или препарата. Смесь инкубируют при () °С в течение 120-240 с. Время свертывания определяют с момента добавления к смеси 200 мкл предварительно прогретого до температуры () °С кальция тромбопластина. В зависимости от техники постановки анализа объемы реагентов могут варьироваться в соответствующей пропорции. Калибровочный график строят в полулогарифмических координатах. По логарифмической оси абсцисс откладывают значения активности фактора VII, по оси ординат — время свертывания соответствующих разведений стандарта. Активность фактора VII для каждого разведения испытуемого образца находят по калибровочному графику. Активность FVII (A) в исследуемом образце рассчитывают по формуле:

A = Ax · k,

2. Хромогенный метод
В присутствии тканевого фактора (TF) и ионов Ca2+ происходит активация фактора VII (образование FVIIa). Комплекс FVIIa, TF, Ca2+ и фосфолипида активирует фактор X. Активированный фактор X (FXa) селективно расщепляет хромогенный субстрат FXa-1 метоксикарбонил-D-циклогексилаланил-глицил-L-аргинин-n-нитроанилид-ацетат с образованием n-нитроанилина. Исследование образца проводят фотометрическим методом при 405 нм. Значение оптической плотности (или увеличение поглощения) пропорционально количеству фактора VII. Определение фактора VII хромогенным методом осуществляют с помощью специальных тестовых наборов. Анализ выполняется в соответствии с инструкцией к набору. Стандартный образец и препарат предварительно разводят плазмой, дефицитной по фактору VII, до концентрации ~ 1 МЕ/мл (основное разведение). Из основного разведения готовят с помощью буферного раствора 3 разведения стандартного образца и 3 разведения препарата трис-солевым буфером pH 7,3-8,0 с добавлением 0,1% человеческого или бычьего альбумина. Каждое разведение стандартного образца определяют двухкратно, полученные значения используют для построения калибровочного графика. Испытуемые образцы определяют трехкратно. Испытания проводят в ручном режиме с использованием пластиковых пробирок или микропланшет при температуре () °С или в автоматическом режиме с использованием коагулометра. В лунки микропланшет вносят разведения испытуемого препарата или стандартного образца, добавляют кальций-тромбопластиновую смесь, раствор фактора X и инкубируют при температуре () °С от 2 до 5 мин., после чего вносят раствор хромогенного субстрата фактора Xa. Измеряют изменение оптической плотности при длине волны 405 нм либо в кинетическом режиме, либо прерывают реакцию гидролиза через 3-15 мин. добавлением 20% (об/об) раствора уксусной кислоты ледяной и измеряют оптическую плотность.

Фактор VIII

Клоттинговый метод Определение активности фактора VIII проводят с использованием человеческой плазмы, дефицитной по фактору VIII. Источником фосфолипидов, необходимых для осуществления свертывания, является АЧТВ-реагент. Для разведения стандарта и препаратов используют NaCl-имидазоловый буферный раствор pH (), с добавлением 0,1% раствора человеческого или бычьего альбумина. Для построения калибровочного графика готовят серию последовательных разведений стандарта, начиная от концентрации 2 МЕ/мл. Препарат разводят до концентрации ~ 0,5-2 МЕ/мл. Анализируют 3 разведения препарата. Для каждого образца измерение времени свертывания проводят минимум 2 раза. Измерение проводят в течение 1 ч после разведения препарата. Анализ проводят при температуре () °С. В пластиковую пробирку вносят 100 мкл плазмы, дефицитной по фактору VIII, 100 мкл разведения стандарта или препарата и 100 мкл АЧТВ-реагента и инкубируют при температуре () °С в течение 2 мин. Время свертывания фиксируют с момента прибавления к смеси 100 мкл предварительно прогретого до температуры () °С 0,025 М раствора кальция хлорида. В зависимости от техники постановки анализа объемы реагентов могут варьироваться в соответствующей пропорции. Калибровочный график строят в полулогарифмических координатах. По логарифмической оси абсцисс откладывают значения активности фактора VIII, по оси ординат — время свертывания соответствующих разведений стандарта. Активность фактора VIII для каждого разведения испытуемого образца находят по калибровочному графику. Активность FVIII (A) в исследуемом образце рассчитывают по формуле:

A = Ax · k,

где: Ax — активность соответствующего разведения исследуемого препарата, найденная по калибровочному графику; k — разведение исследуемого образца.

2. Хромогенный метод
Количественное определение фактора VIII проводят с помощью набора реактивов, в котором фактор VIII является кофактором для фактора IXa при активации фактора X в форму Xa, расщепляющего хромогенный субстрат. Принцип метода
В присутствии ионов Ca2+ и фосфолипидов фактор X под действием фактора IXa активируется в Xa. При избытке фактора X и оптимальных количеств Ca2+, фосфолипидов и фактора IXa скорость активации фактора X линейно зависит от количества фактора VIII. Фактор Xa гидролизует хромогенный субстрат S-2765 (N-a-Z-DArg-Gly-Arg-pNA) с высвобождением хромогенной группы pNA, окраску которой регистрируют спектрофотометрически при 405 нм. Количество образовавшегося фактора Xa и, следовательно, интенсивность окрашивания, пропорциональны активности фактора VIII в образце. Набор реактивов для определения активности фактора VIII стабилен в течение срока, указанного производителем при температуре хранения от 2 до 8 °С. Набор реактивов содержит:
1. 7,7 мг хромогена S-2765 с добавкой синтетического ингибитора тромбина I-2581. Реактив восстанавливают в 6,0 мл стерильной воды для инъекций. Восстановленный раствор стабилен в течение 1 мес. при температуре от 2 до 8 °С. Перед использованием нагревают до температуры 37 °С. 2. Реактив бычьих факторов: 0,3 Ед фактора IX, 2,7 ME фактора X и 1 NIH Ед тромбина, лиофилизированных в присутствии 40 ммоль CaCl2 и 0,2 ммоль фосфолипидов. Реактив восстанавливают в 2,0 мл стерильной воды для инъекций. Восстановленный раствор стабилен в течение 12 ч при температуре от 2 до 8 °С, 2 нед. при температуре минус 30 °С и 1 мес. при температуре минус 80 °С. Не следует хранить при температуре минус 20 °С. Перед использованием нагревают до температуры 37 °С. 3. Концентрат x10 трис-буфера. Стабилен в течение 1 мес. при температуре от 2 до 8 °С. Перед употреблением разводят стерильной водой для инъекций в соотношении 1:10. Дополнительные реактивы:
1. Международный стандартный образец — раствор концентрата фактора свертывания VIII человека (NIBSC, Eur. Pharm. Ref. Std. BRP Н 0920000) или плазма, откалиброванная по международному стандарту фактора VIII. 2. Контрольная нормальная или патологическая плазма, откалиброванная по международному стандарту фактора VIII. 3. 0,9% раствор натрия хлорида.
4. 20% уксусная кислота или 2% лимонная кислота (используются в методике конечной точки накопления хромогена). 5. Вода лабораторная деионизованная MillyQ. Оборудование:
1. Пластиковые пробирки;
2. Микропланшеты;
3. Термостат 37 °С;
4. Спектрофотометр 405 нм или ридер микропланшет 405 нм; 5. Калиброванные пипетки;
6. Вортекс;
7. Секундомер.
Исследуемый образец перед определением разводят до ожидаемой активности 1 МЕ/мл. Определение можно проводить в кинетическом режиме и по конечной точке, в пробирках (макрометод) и в микропланшетах (микрометод). Калибровка
При проведении каждого определения проводят построение калибровочной кривой. Разведение стандартного образца готовят в 2 этапа: предварительное разведение до активности 1-2 МЕ/мл и конечные разведения для построения калибровочной зависимости в диапазоне 0-2 МЕ/мл. После разведения определение следует провести в течение 30 мин. Ход определения
Определение в пробирках
200 мкл разбавленного стандартного, контрольного или исследуемого образца вносят в пробирки, инкубируют в течение 3-4 мин. при температуре 37 °С, прибавляют 50 мкл предварительно прогретого реактива факторов, инкубируют в течение 2-4 мин. при температуре 37 °С и прибавляют 50 мкл раствора хромогена. Определение в микропланшетах
В лунки микропланшета вносят по 50 мкл разбавленного стандартного, контрольного или исследуемого образца, инкубируют в течение 3-4 мин. при 37 °С, прибавляют 50 мкл предварительно прогретого реактива факторов, инкубируют в течение 2-4 мин. при температуре 37 °С и прибавляют 50 мкл раствора хромогена. Кинетический метод определения
После прибавления раствора хромогена в течение 2-10 мин. измеряют изменение оптической плотности раствора при 405 нм. Определение по конечной точке
После прибавления раствора хромогена смесь продолжают инкубировать при температуре 37 °С в течение 2-10 мин., после чего для остановки реакции прибавляют 50 мкл 20% уксусной или 2% лимонной кислоты. Измеряют оптическую плотность раствора против буфера при 405 нм. Расчеты
Строят зависимость изменения оптической плотности в минуту (для кинетического метода) или оптической плотности (для определения по конечной точке) разведений стандартного раствора от концентрации в них фактора VIII. Активность в исследуемом образце определяют по калибровочной кривой с учетом предварительного разведения образца.

Фактор IX

Клоттинговый метод Определение активности фактора IX проводят с использованием человеческой плазмы, дефицитной по фактору IX. Источником фосфолипидов, необходимых для осуществления свертывания, является АЧТВ-реагент. Для разведения стандарта и препаратов используют NaCl-имидазоловый буферный pH 7,3 с добавлением 0,1% раствора бычьего или человеческого альбумина. Для построения калибровочного графика готовят серию последовательных разведений стандарта в интервале от 0,3 до 1 МЕ/мл. Препарат разводят до концентрации менее 1 МЕ/мл. Анализируют 3 разведения препарата. Для каждого образца измерение времени свертывания проводят минимум 2 раза. Измерение проводят в течение 1 ч после разведения препарата. Анализ проводят при температуре () °С. В пластиковую пробирку вносят 100 мкл плазмы, дефицитной по фактору IX, 100 мкл разведения стандарта или препарата и 100 мкл АЧТВ-реагента и инкубируют при температуре () °С в течение 2 мин. Время свертывания фиксируют с момента прибавления к смеси 100 мкл предварительно прогретого до температуры () °С 0,025 М раствора кальция хлорида. В зависимости от техники постановки анализа объемы реагентов могут варьироваться в соответствующей пропорции. Калибровочный график строят в полулогарифмических координатах. По логарифмической оси абсцисс откладывают значения активности фактора IX, по оси ординат — время свертывания соответствующих разведений стандарта. Активность фактора IX для каждого разведения испытуемого образца находят по калибровочному графику. Активность FIX (A) в исследуемом образце рассчитывают по формуле:

A = Ax · k,

Фактор X

Клоттинговый метод Определение активности фактора X проводят с использованием человеческой плазмы, дефицитной по фактору X. Процесс свертывания активируется добавлением к смеси кальция тромбопластина. Для разведения стандарта и препаратов используют NaCl-имидазоловый буферный раствор pH 7,3 с добавлением 0,1% раствора человеческого или бычьего альбумина. Для построения калибровочного графика готовят серию последовательных разведений стандарта фактора X в интервале от 0,3 до 1 МЕ/мл. Препарат разводят до концентрации менее 1 МЕ/мл. Анализируют 3 разведения препарата. Для каждого образца измерение времени свертывания проводят минимум 2 раза. Измерение проводят непосредственно после разведения препарата. Анализ проводят при температуре () °С. В пластиковую пробирку вносят 50 мкл плазмы, дефицитной по фактору X, и 50 мкл разведения стандарта или препарата. Смесь инкубируют при () °С в течение 120-240 с. Время свертывания определяют с момента добавления к смеси 200 мкл предварительно прогретого до температуры () °С кальция тромбопластина. В зависимости от техники постановки анализа объемы реагентов могут варьироваться в соответствующей пропорции. Калибровочный график строят в полулогарифмических координатах. По логарифмической оси абсцисс откладывают значения активности фактора X, по оси ординат — время свертывания соответствующих разведений стандарта. Активность фактора X для каждого разведения испытуемого образца находят по калибровочному графику. Активность фактора X (A) в исследуемом образце рассчитывают по формуле:

A = Ax · k,

2. Хромогенный метод
Фактор X активируют с помощью полученного из змеиного яда FX-активатора. Активированный фактор X (FXa) селективно расщепляет хромогенный субстрат FXa-1 N—бензилоксикарбонил-D-аргинил-L-глицил-L-аргинин-4-нитроанилида дигидрохлорид, N-бензоил-L-изолейцил-L-глутамил-глицил-L-аргинин-4-нитроанилида гидрохлорид, метансульфонил-D-лейцил-глицил-L-аргинин-4-нитроанилид, метоксикарбонил-D-циклогексилаланил-глицил-L-аргинин-4-нитроанилида ацетат с образованием n-нитроанилина. Образцы исследуют фотометрическим методом при 405 нм. Количество фактора X пропорционально увеличению оптической плотности раствора. Определение фактора X хромогенным методом осуществляют с помощью специальных тестовых наборов. Анализ выполняется в соответствии с инструкцией к набору. Стандартный образец и препарат предварительно разводят плазмой, дефицитной по фактору X, до концентрации ~ 1 МЕ/мл (основное разведение). Из основного разведения готовят с помощью буферного раствора 3 разведения стандартного образца (в соответствии с инструкцией) и 3 разведения препарата. Каждое разведение стандартного образца определяют двухкратно, полученные значения используют для построения калибровочного графика. Испытуемые образцы определяют трехкратно. Испытания проводят в ручном режиме с использованием пластиковых пробирок или микропланшет при температуре () °С или в автоматическом режиме с использованием коагулометра. Для проведения испытаний в ручном режиме в лунки микропланшета вносят по 12,5 мкл каждого разведения испытуемого препарата или стандартного образца, в каждую лунку прибавляют по 25 мкл специфического активатора фактора X из яда гадюки Рассела и инкубируют при температуре () °С в течение 90 с, после чего в каждую лунку вносят по 150 мкл рабочего разведения хромогенного субстрата фактора X. Определяют скорость изменения оптической плотности при длине волны 405 нм непрерывно в течение 3 мин. и рассчитывают среднюю скорость изменения оптической плотности (А/мин.) или измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм через последовательные интервалы времени (например, через 30 с) и строят график зависимости оптической плотности от времени и рассчитывают A/мин. как угол наклона прямой. Из значений A/мин. каждого индивидуального разведения стандартного образца и испытуемого препарата рассчитывают активность испытуемого препарата.

Фактор Виллебранда

Определение активности фактора Виллебранда проводят методом агглютинации или иммуноферментным методом. Активность фактора Виллебранда определяется путем сравнения его активности с активностью стандартного образца. Метод агглютинации
Метод основан на определении коферментной активности фактора Виллебранда при агглютинации суспензии тромбоцитов в присутствии ристоцетина A. Испытание может проводиться количественными методами с использованием автоматизированного оборудования или полуколичественным методом путем визуальной оценки агглютинации в серии разведений. Полуколичественный метод
Из стандартного образца и восстановленного раствора препарата готовят последовательные разведения в 0,9% растворе натрия хлорида с 1-5% раствором альбумина человека до ожидаемого содержания фактора Виллебранда 0,5, 1,0 и 2,0 МЕ/мл. По 0,05 мл каждого разведения стандартного образца и исследуемого препарата наносят на предметное стекло, добавляют по 0,1 мл суспензии тромбоцитов с ристоцетином и перемешивают в течение 1 мин. В качестве отрицательного контроля используют раствор разведения. После 1 мин. инкубации при комнатной температуре визуально оценивают агглютинацию тромбоцитов. Максимальное разведение, при котором происходит агглютинация тромбоцитов, является титром ристоцетиновой коферментной активности образца. Количественный метод
Готовят не менее 2 серий последовательных разведений стандартного и испытуемого образцов с помощью буфера для разведения до ожидаемого содержания фактора Виллебранда 0,5, 1,0 и 2,0 МЕ/мл. Определение проводят в соответствии с инструкцией производителя автоматизированного оборудования. Получают значения зависимости изменения оптического поглощения (степени мутности раствора) от активности фактора Виллебранда. Определение содержания фактора Виллебранда в испытуемом препарате осуществляют с использованием коэффициентов линейного уравнения зависимости оптической плотности раствора от содержания фактора Виллебранда в стандартном образце. Иммупофермептный метод
Метод основан на определении коллаген-связывающей активности фактора Виллебранда. При специфическом связывании фактора Виллебранда с фибриллами коллагена и последующем связывании поликлональных антител к фактору Виллебранда, конъюгированных с ферментом, после добавления хромогенного субстрата образуется хромофор, который может быть количественно определен спектрофотометрическим методом. Существует линейная зависимость между связыванием коллагена с фактором Виллебранда и оптической плотностью. Определение проводят с использованием тест-систем, разрешенных к применению в практике здравоохранения России в соответствии с инструкциями по применению. Для испытаний готовят не менее 3 последовательных серий разведений стандартного и испытуемого образцов с помощью буфера для разведения до ожидаемого содержания фактора Виллебранда 1,0 МЕ/мл. Далее проводят испытания в соответствии с инструкцией производителя используемой тест-системы.

Активированные факторы свертывания крови

Определение проводят коагулометрическим методом. Для испытаний готовят восстановленный раствор препарата. При наличии в препарате гепарина его нейтрализуют добавлением протамина сульфата из расчета 10 мкг протамина сульфата на 1 ME гепарина. Готовят разведения препарата 1:10 и 1:100 с помошью трис-буферного раствора pH 7,5. В 3 пробирки вносят по 0,1 мл стандартной плазмы человека и по 0,1 мл раствора фосфолипидов, помещают в водяную баню с температурой () °С на 60 с, после чего в первую пробирку добавляют 0,1 мл трис-буферного раствора (контрольная проба), во вторую — 0,1 мл испытуемого препарата в разведении 1:10, в третью пробирку — 0,1 мл испытуемого препарата в разведении 1:100. Далее к содержимому каждой пробирки немедленно добавляют по 0,1 мл нагретого до температуры 37 °С раствора кальция хлорида 3,7 г/л. Отмечают время формирования сгустка от момента добавления раствора кальция хлорида. Критерием приемлемости результатов является время коагуляции в контрольной пробе в интервале от 200 до 350 с.

Специфическая удельная активность
Специфическую активность факторов свертывания рассчитывают по формуле:

Определение активности антитромбина III

Хромогенный метод
Метод определения активности ATIII основан на его способности нейтрализовать тромбин в присутствии гепарина. К образцу, содержащему ATIII, добавляют избыточные количества гепарина и тромбина. Образующийся комплекс ATIII-гепарин нейтрализует количество тромбина, пропорциональное количеству ATIII. Оставшийся тромбин селективно расщепляет хромогенный субстрат с образованием n-нитроанилина, абсорбцию которого определяют при 405 нм. Таким образом, количество ATIII обратно пропорционально величине поглощения свободного n-нитроанилина в образце. Определение активности ATIII проводят с помощью коммерческих тестовых систем. Для построения калибровочного графика используют стандартный образец ATIII или плазму-калибратор, аттестованную по международному стандарту. Стандартный образец или плазму-калибратор растворяют в дистиллированной воде согласно указаниям в инструкции. Зависимость величины оптической плотности от активности ATIII линейна в интервале активности ATIII от 0,1 до 1,0 МЕ/мл. Используя буфер с гепарином, готовят 4 разведения стандартного образца или плазмы-калибратора с активностью ATIII от 0,1 до 1,0 МЕ/мл. Анализ проводят при температуре 37 °С согласно схеме, приведенной в инструкции к набору. Для каждого разведения трижды определяют величину оптической плотности при 405 нм и в линейных координатах строят калибровочный график зависимости абсорбции от активности ATIII. Готовят 2 разведения исследуемого образца с ориентировочной активностью ATIII менее 1,0 МЕ/мл. Определение активности ATIII в испытуемых образцах проводят при температуре 37 °С согласно указаниям в инструкции к набору. Активность ATIII в испытуемых разведениях находят по калибровочному графику. Активность ATIII в исследуемом образце определяют как:

A = Ax · k,

где: Ax — активность ATIII в соответствующем разведении; k — разведение образца.

Количественное определение гепарина

Клоттинговый метод Метод основан на способности гепарина за счет ингибирования ряда факторов удлинять время свертывания нормальной плазмы. Для проведения анализа используют нормальную человеческую плазму, стандартный образец гепарина, АЧТВ-реагент и раствор хлористого кальция 0,025 М. В качестве разбавителя стандартного и испытуемых образцов используют 0,9% раствор натрия хлорида. Стандартный образец гепарина растворяют в дистиллированной воде согласно указаниям в инструкции. Готовят 3 разведения стандартного образца с активностью гепарина 0,3, 0,4 и 0,5 МЕ/мл. Образцы стандарта с данными активностями должны удлинять время свертывания нормальной плазмы минимум в 1,5 раза, в противном случае следует использовать разведения с большей активностью гепарина. Параллельно готовят 3 разведения исследуемого образца таким образом, чтобы ориентировочно активность гепарина в данных разведениях попадала в интервал активности гепарина в разведениях стандартного образца. Анализ проводят с помощью автоматического или полуавтоматического коагулометра в пластиковых пробирках при температуре 37 °С. В пробирку вносят 100 мкл нормальной человеческой плазмы, 100 мкл разведения стандартного или исследуемого образца или 100 мкл 0,9% раствора натрия хлорида (холостой опыт), добавляют по 100 мкл АЧТВ-реагента и инкубируют смесь в течение 120-240 с при температуре () °С. Затем в пробирку вносят 100 мкл предварительно прогретого до температуры 37 °С 0,025 М раствора кальция хлорида и фиксируют время свертывания образца. В зависимости от техники постановки анализа объемы реагентов могут быть изменены с соблюдением пропорции. Время свертывания нормальной плазмы (холостой опыт) должно составлять 25-40 с. Для каждого разведения стандартного и исследуемого образцов время свертывания определяют трижды.
Хромогенный метод Метод основан на расщеплении хромогенного субстрата, специфического для активированного фактора X (FXa). При внесении в образец, содержащий гепарин, избыточных количеств ATIII и FXa происходит ингибирование количества FXa, пропорционального количеству гепарина. Оставшийся FXa отщепляет от специфического хромогенного субстрата n-нитроанилин, абсорбцию которого определяют при 405 нм. Таким образом, величина абсорбции обратно пропорциональна количеству гепарина. Данным методом определяют содержание как нефракционированного, так и низкомолекулярного гепарина в анти-Xa единицах. Количество гепарина хромогенным методом определяют с помощью коммерческих тестовых систем. Для построения калибровочного графика используют стандартный образец гепарина или плазму-калибратор, аттестованную по международному стандарту. Стандартный образец или плазму-калибратор разводят в дистиллированной воде согласно инструкции. Готовят 4 разведения стандартного образца с концентрацией гепарина менее 1 анти-Xa ед/мл, используя буфер для разведения pH 8,4. Анализ проводят при температуре 37 °С в соответствии с инструкцией к набору. Для каждого разведения трижды определяют абсорбцию при 405 нм, после чего в линейных координатах строят калибровочный график зависимости величины поглощения от концентрации гепарина. Зависимость линейна в диапазоне концентраций гепарина 0-1,0 анти-Xa ед/мл. Для исследуемого образца готовят 2 разведения с концентрацией гепарина менее 1 анти-Xa ед/мл. Анализ проводят согласно инструкции к набору при температуре 37 °С. Для каждого разведения величину абсорбции определяют трижды. Определение проводят в ручном режиме с использованием пластиковых пробирок, микропланшет или в автоматическом режиме с использованием коагулометра. Для проведения испытаний в ручном режиме в лунки микропланшета вносят по 20 мкл стандартной плазмы человека и 20 мкл раствора антитромбина III. Далее в эти лунки вносят соответственно по 20, 60, 100 и 140 мкл испытуемого или стандартного препарата и доводят объем раствора в каждой лунке до 200 мкл буфером (активность гепарина в конечной реакционной смеси 0,02-0,08 МЕ/мл). По 40 мкл из каждой лунки планшета переносят во вторую серию лунок, в которые добавляют по 20 мкл раствора бычьего фактора Xa и инкубируют при температуре () °С в течение 30 с, после чего в лунки добавляют по 40 мкл раствора хромогенного субстрата фактора Xa и вновь инкубируют при температуре () °С в течение 3-15 мин., измеряя скорость расщепления субстрата путем постоянного измерения оптической плотности при длине волны 405 нм (кинетический режим) или после остановки реакции добавлением 20% (об/об) раствора уксусной кислоты ледяной (конечная точка определения). Содержание гепарина в испытуемом разведении определяют по калибровочному графику с учетом разведения. При проведении исследований в автоматическом режиме с использованием коагулометра получают значения зависимости изменения оптической плотности от концентрации гепарина.

В соответствии с Приказом Минздрава России от 21.11.2014 N 768 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Иммуноэлектрофорез в агаровом геле
ОФС.1.8.2.0002.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для исследования антигенного состава биологических материалов, а также для определения чистоты, качественного и количественного состава иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) методом иммуноэлектрофореза (ИЭФ) в агаровом геле, сочетающим методы зонального электрофореза и иммунодиффузию. В процессе иммуноэлектрофореза в гелях или на пленках из ацетата целлюлозы с помощью методов простой или двойной иммунодиффузии происходит реакция между растворимыми белками и специфическими по отношению к ним преципитирующими антителами. Количественное определение белков можно осуществлять с помощью электрофореза в среде, содержащей антитела (электроиммуноанализ, электроиммунодиффузия, ракетный иммуноэлектрофорез). Антигенную природу белковых компонентов можно исследовать путем их сравнения с известными маркерами. Эффективность иммунохимических тестов зависит от специфичности используемых антасывороток, а также от их титра и сродства к антигенам. Обычно иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание электрофореза в агаровом (или агарозном) геле с последующей двойной иммунодиффузией в той же среде. При двухмерной двойной иммунодиффузии антиген и антитела, помещенные в круглые или прямоугольные углубления в геле, мигрируют навстречу друг другу, в результате чего при встрече образуются линии (дуги) преципитации. Положение полос преципитации зависит от коэффициента диффузии антигена, его концентрации относительно антител (скорость диффузии антитела можно рассматривать как постоянную). Определенное соотношение концентраций антигена и антител, которое является оптимальным для образования преципитата называется зоной эквивалентности. При этом получаются четкие линии преципитации. Концентрация (титр) антител в иммунной сыворотке также может значительно варьировать. Возможна ситуация, при которой зоны эквивалентности для разных компонентов смеси не будут перекрываться. Для подбора эквивалентного соотношения антиген-антитело иммуноэлектрофорез многокомпонентных смесей рекомендуется проводить при нескольких относительных концентрациях антиген-антитело, так как при использовании только одной такой концентрации можно не обнаружить те или иные компоненты.

Метод иммуноэлектрофореза в агаровом геле

Обработанную спиртом стеклянную пластину размером 90×120 мм помешают строго горизонтально на предметный столик. Охлажденный до температуры () °С агаровый гель наносят на стеклянную пластину в количестве 18,0-20,0 мл. После застывания при комнатной температуре через 20-30 мин. на пластине образуется агаровый слой толщиной 2,0-2,5 мм. После застывания геля в нем по специальному трафарету вырезают 6-7 лунок диаметром 1-2 мм. Лунки заполняют испытуемым образцом в объеме, не превышающем объем лунки (по 2 лунки на каждый испытуемый образец). При этом в верхнюю и нижнюю лунки стеклянной пластинки с гелем вносят контрольный образец — нормальную сыворотку крови человека («Стандартный образец тест-системы для определения фракционного (антигенного) состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза» или иной контрольный образец в соответствии с указаниями в фармакопейной статье или нормативной документации), окрашенный пиронином Б (или иным красителем, указанным в фармакопейной статье или в нормативной документации). В мерный цилиндр вместимостью 1000 мл вносят 500 мл веронал-мединалового или боратного буферного раствора, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают. Полученный раствор (или иной буферный раствор указанный в фармакопейной статье или нормативной документации) наливают в электродные секции камеры прибора для электрофореза. Пластину с подготовленным гелем помещают в прибор для электрофореза и соединяют с буферным раствором в электродных камерах прибора с помощью нескольких слоев фильтровальной бумаги. В случае конструкции прибора для электрофореза, предусматривающей соединение агара на пластине с электродным буфером с помощью агаровых столбиков, пластину устанавливают в уравновешенный прибор и заливают расплавленным агаром до его соединения с агаровыми столбиками и образования слоя геля толщиной 1-2 мм. Прибор для электрофореза накрывают крышкой и включают источник питания (напряжение 70-200 В, сила тока 10-40 мА). Электрофорез проводят в течение 1,5-3 ч до момента, когда пятно пиронина Б, соответствующее миграции альбумина, будет находиться на расстоянии 20-25 мм от лунки. После проведения электрофореза с помощью специального трафарета между лунками в агаровом геле вырезают продольные «канавки» (параллельные направлению миграции). В «канавки» вносят по 0,25 мл преципитирующуей антисыворотки: против сывороточных белков крови человека (при проведении испытаний фракционного состава) или поливалентную сыворотку против сывороточных белков крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи (для подтверждения подлинности). Пластину с агаровым гелем помещают во влажную камеру и выдерживают при температуре () °С в течение 24-48 ч. Для отмывания белков, не вступивших в реакцию преципитации, пластину с агаром помещают в кюветы, заливают 0,9% раствором натрия хлорида и выдерживают в течение 16-18 ч. Раствор меняют 3-4 раза. Затем пластину извлекают из 0,9% раствора натрия хлорида, накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в 0,9% растворе натрия хлорида и высушивают на воздухе до превращения агарового геля в тонкую пленку. После этого пластину с высушенным гелем накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в 0,9% растворе натрия хлорида, не оставляя пузырьков воздуха, и высушивают при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре не выше 40 °С. После высушивания пластинки фильтровальную бумагу смачивают водой и аккуратно удаляют. Для окрашивания белков используют краситель амидочерный 10Б или другой пригодный краситель (в соответствии с указаниями в фармакопейной статье или нормативной документации), помещая пластину в кювету с красящим раствором на 30-40 мин. Затем пластину промывают в растворе для отмывки агара (2% раствор уксусной кислоты или иной раствор, в соответствии с указаниями в нормативной документации) в течение 15-40 мин. до полного отсутствия окрашенного фона и снова высушивают при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре не выше 40 °С. Липопротеиды окрашивают Суданом черным В. Для окрашивания полностью высушенные пластины помещают на 3 ч в красящий раствор, затем обесцвечивают 50% этанолом до полного просветления фона. Липопротеиды окрашиваются в темно-синий цвет. Следует проводить окрашивание полностью высушенного препарата, так как судан черный В нерастворим в воде и окрашивает влажный гель. Учет результатов при исследовании фракционного состава препаратов иммуноглобулинов человека проводят визуально путем сравнения электрофореграммы испытуемого образца с электрофореграммой контрольного образца — нормальной сыворотки крови человека («Стандартный образец тест-системы для определения фракционного (антигенного) состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза» или иной контрольный образец в соответствии с указаниями в нормативной документации), которая должна проявлять регламентированное количество линий преципитации с сывороткой против сывороточных белков крови человека (не менее 15 линий преципитации при использовании «Стандартного образца тест-системы для определения фракционного (антигенного) состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза»). Основной компонент препарата иммуноглобулинов человека должен соответствовать иммуноглобулину G (Ig G) нормальной сыворотки крови человека. Учет результатов при проведении исследований по подтверждению подлинности препаратов крови человека проводят визуально путем выявления линий преципитации с сывороткой против сывороточных белков крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи. Должны выявляться линии преципитации только с сывороткой против сывороточных белков крови человека. Примечания
1. Приготовление 0,05М веронал-мединалового буферного раствора (pH ), В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,38 г веронала, 8,76 г мединала, добавляют воды очищенной до метки и перемешивают до полного растворения. 2. Приготовление 0,05М боратного буферного раствора (pH ). В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 6,7 г борной кислоты, 13,4 г натрия тетраборнокислого 10-водного, добавляют воды очищенной до метки и перемешивают. 3. Приготовление 1,25% агарового геля. Приготовление агарового геля осуществляют одним из следующих способов: а) Для приготовления 1,25% агарового геля используют 0,05М веронал-мединаловый буфер (pH ) с удвоенной концентрацией солей (соответственно, 2,76 г веронала и 17,52 г мединала на 1000 мл воды очищенной). b) Для приготовления 1,25% агарового геля используют боратный буферный раствор (pH ) с удвоенной концентрацией солей (соответственно: 13,4 г борной кислоты и 26,8 г натрия тетраборнокислого 10-водного на 1000 мл воды очищенной). В химический стакан вместимостью 1000 мл вносят 12,5 г агара, добавляют 500 мл воды очищенной и оставляют для набухания геля в течение часа при температуре () °С. Стакан с содержимым помещают в кипящую водяную баню и выдерживают до полного расплавления агара. Объем раствора геля доводят водой до 500 мл, затем добавляют равный объем веронал-мединалового или боратного буферного раствора (или иного буферного раствора, указанного в фармакопейной статье или в нормативной документации). Раствор агара фильтруют через 2-3 слоя марли, прибавляют тиомерсал до концентрации 100 мкг/мл и разливают во флаконы по 40-50 мл (количество, необходимое на две пластинки). Расплавленный агар должен быть прозрачным. 4. Приготовление красящего раствора амидочерного 10Б. Приготовление раствора красителя осуществляют одним из следующих способов: a) В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,0 г амидочерного 10Б, 450 мл 0,1М раствора уксусной кислоты, 550 мл 0,1М раствора натрия ацетата и перемешивают. b) В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,0 г амидочерного 10Б, 100 мл уксусной кислоты ледяной, доводят объем до метки водой очищенной и перемешивают. Через 12 ч фильтруют через бумажный фильтр. 5. Приготовление красящего раствора судан черный В. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,2 г Судана черного В, 20 мл 1М раствора натрия гидроксида, 380 мл воды очищенной и доводят объем раствора этанолом абсолютным до метки и перемешивают. Смесь непродолжительное время кипятят, охлаждают до комнатной температуры, и после остывания краситель переливают в темную склянку с притертой пробкой. Реактив хранят при комнатной температуре в течение 3 мес. 6. Приготовление 2% раствора уксусной кислоты для отмывки агара. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 20,0 мл уксусной кислоты ледяной, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Реактив хранят при комнатной температуре в течение 3 мес.

В соответствии с Приказом Минздрава России от 21.11.2014 N 768 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Иммунодиффузия в геле
ОФС.1.8.2.0001.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод, используемый для определения подлинности (видоспецифичности) лекарственных препаратов. Принцип метода иммунодиффузии в геле заключается в том, что в результате реакции антигена с антителом, взятых в эквивалентном соотношении образуется преципитат в виде линий преципитации. Подлинность (видоспецифичность) подтверждается образованием линии преципитации с антигенами сыворотки, содержащей только видоспецифичные белки (например, при подтверждении видоспецифичности препаратов крови человека с сывороткой, преципитирующей белки крови человека).

Проведение испытания

Обработанную спиртом стеклянную пластину размером 26×75 мм или 90×120 мм или стеклянную чашку Петри диаметром 100 мм (в соответствии с указаниями нормативной документации) помещают строго горизонтально на предметный столик. Расплавленный агар (температура () °С) наносят на стеклянную пластину (или стеклянную чашку Петри) в количестве, достаточном для формирования слоя толщиной 2,4-2,6 мм (например, на стекло размером 26×75 мм необходимо нанести 5,5-6,0 мл). Стеклянную пластину (или стеклянную чашку Петри) на 30-40 мин. помещают во влажную камеру эксикатора с небольшим количеством воды для застывания агара. В застывшем агаровом геле по трафарету готовят лунки для реагентов (рис. 1), используя трубки-пробойники, изготовленные из латуни или нержавеющей стали, с заточенным концом со стороны внутреннего диаметра (2-3 мм) или используют стандартные штампы. Расстояние между внешними краями лунок должно быть равно 5-6 мм. Агаровые пробки из лунок аккуратно удаляют с помощью поперечно-срезанной пастеровской пипетки, не допуская отслаивания геля от стекла. Лунки заполняют образцами в соответствии со схемой (рис. 1) в объеме, не превышающем объем лунки (объем вносимых образцов указывают в нормативной документации).

Рисунок 1. Схема нанесения реагентов

1 — сыворотка, преципитирующая видоспецифичные белки (например, белки крови человека при подтверждении видоспецифичности препаратов крови человека); 2 — стандартный реагент (например, контрольная сыворотка крови человека при подтверждении видоспецифичности препаратов крови человека); 3, 4, 6 — сыворотки, преципитирующие иные белки (например, белки крови лошади, свиньи, крупного рогатого скота при подтверждении видоспецифичности препаратов крови человека); 5 — отрицательный контроль (0,9% раствор натрия хлорида); 7 — исследуемый препарат.

Стеклянную пластину (или стеклянную чашку Петри) с агаровым гелем помещают во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре в течение 24 ч или при температуре () °С в течение 48 ч. Учет результатов проводят визуально путем выявления линий преципитации. Подтверждением специфичности иммунодиффузии является наличие линии преципитации стандартного реагента и соответствующей сыворотки, преципитирующей видоспецифичные белки. Например, при подтверждении видоспецифичности препаратов крови человека должны выявляться линии преципитации сыворотки, преципитирующей белки крови человека, с исследуемым препаратом и с контрольной сывороткой крови человека (рис. 2).

Рисунок 2. Учет полученных результатов при подтверждении видоспецифичности препаратов крови человека

1 — сыворотка, преципитирующая белки крови человека; 2 — контрольная сыворотка крови человека (стандартный реагент); 3 — сыворотка, преципитирующая белки крови лошади; 4 — сыворотка, преципитирующая белки крови свиньи; 5 — отрицательный контроль (0,9% раствор натрия хлорида); 6 — сыворотка, преципитирующая белки крови крупного рогатого скота; 7 — исследуемый препарат.

Примечание.
1. Приготовление агарового геля.
В химический стакан вместимостью 1000 мл вносят 12,5 г агара, добавляют 500 мл 0,9% раствора натрия хлорида и оставляют для набухания геля в течение 1 ч при комнатной температуре. Стакан с содержимым помещают в кипящую водяную баню и выдерживают до полного расплавления агара. Объем раствора геля доводят 0,9% раствором натрия хлорида до метки и перемешивают. Раствор агара фильтруют через марлю (2-3 слоя) и разливают во флаконы. Расплавленный агар должен быть прозрачным. Срок годности охлажденного агарового геля 1 мес. при температуре хранения () °С. Допустимо применение агарового геля иного состава в соответствии с указаниями в нормативной документации.

В соответствии с Приказом Минздрава России от 21.11.2014 N 768 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Иммуноглобулины и сыворотки (антитела) гетерологичные ОФС.1.8.1.0004.15
Взамен ГФ X, ст. 607

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на иммуноглобулины и сыворотки (антитела) гетерологичные (далее — сыворотки), которые представляют собой лекарственные средства, содержащие очищенные иммуноглобулины или их фрагменты, полученные из сыворотки или плазмы крови животных различных видов, иммунизированных соответствующими антигенами. Сыворотки содержат специфические антитела, нейтрализующие или связывающие антигены, использованные для иммунизации животных. В качестве антигенов могут служить микробные или другие токсины, бактерии, вирусы, яды (змей, пауков, скорпионов), некоторые ткани человека. Сыворотки могут содержать антитела к одному (моновалентные сыворотки) или нескольким (поливалентные сыворотки) антигенам. Поливалентные сыворотки получают иммунизацией животного несколькими видами антигенов или объединением нескольких моновалентных сывороток. Сыворотки выпускают в виде жидких или лиофилизированных препаратов, предназначенных для введения внутримышечно, подкожно, внутривенно, а также в спинномозговой канал.

ПРОИЗВОДСТВО

Требования к животным-продуцентам.
Животные, используемые для приготовления сывороток, должны быть абсолютно здоровыми и свободными от гельминтов и инфекционных агентов, перечисленных в утвержденном перечне заболеваний, в том числе, от возбудителей заболеваний, специфичных для мест разведения животных. В качестве животных-продуцентов не допускается использование крупного рогатого скота из районов, в которых обнаружено заболевание губчатой энцефалопатией. Животные, получавшие антибиотики, могут быть использованы для получения сыворотки только после периода времени, необходимого для полного выведения антибиотика из организма. Антибиотики пенициллинового ряда не должны применяться для лечения животных — продуцентов. Животные-продуценты при поступлении должны пройти карантин, а лошади и крупный рогатый скот (дополнительно) — вакцинацию столбнячным анатоксином. Иммунизация животных.
При иммунизации животных антиген может быть введен с адъювантом. Во время цикла иммунизации проводят постоянный контроль здоровья животных и регулярное определение выработки специфических антител. Если у животных проявляются патологические процессы, не характерные для применяемого антигена, использование всех животных в группе приостанавливают до тех пор, пока не будет установлено, что это не повлияет на безопасность и эффективность конечного продукта. При иммунизации животных-продуцентов живыми микроорганизмами между последней иммунизацией и кровопусканием должен быть выдержан период времени, достаточный для элиминации введенных микроорганизмов. Сбор крови или плазмы.
Сбор крови или плазмы проводят путем венепункции или плазмафереза в условиях асептики. Место для сбора крови или плазмы должно быть изолировано от места содержания животных. Допускается объединение плазмы, полученной от нескольких животных. Полученная плазма должна быть стерильной. Получение иммуноглобулинов или их фрагментов. Иммуноглобулины или их фрагменты получают методами солевого фракционирования и ферментной обработки, с использованием различных методов очистки от балластных белков и примесей (хроматографии, мембранной фильтрации, ферментации и других соответствующих химических и физических методов), обеспечивающих получение продукта, свободного от контаминации, агрегатов и фрагментов сывороточных белков, влияющих на безопасность и качество. Технологический процесс получения иммуноглобулинов или их фрагментов должен быть валидирован. Для продуктов, представленных фрагментами иммуноглобулина, для гарантии регламентированной фрагментации указывают методы, подтверждающие правильность установленных нормативных требований.

ИСПЫТАНИЯ

Описание. Жидкий препарат — бесцветный или с желтоватым оттенком, прозрачный или слабо опалесцирующий раствор; лиофилизированный препарат — белый или слегка желтый порошок или аморфная, гигроскопическая масса. Подлинность. Подлинность подтверждают иммунологическими методами (иммунный электрофорез, метод иммунодиффузии в геле и др.). Для подтверждения подлинности может использоваться метод количественного определение активности. Прозрачность. Прозрачный или слегка опалесцирующий раствор, если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации. Указывают метод определения. Определение проводят в соответствии с ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей». Цветность. Бесцветный или с желтоватым оттенком раствор. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Степень окраски жидкостей». Потеря в массе при высушивании. Для лиофилизированных препаратов не более 3%. Определение проводят гравиметрическим методом в соответствии с ОФС «Потеря в массе при высушивании». Время растворения. Не более 20 мин. для лиофилизированных препаратов. Методику определения указывают в нормативной документации. pH. От 5,0 до 7,2. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия». Извлекаемый объем. Должен быть не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС «Извлекаемый объем для лекарственных форм для парентерального применения». Осмоляльность. Не более 240 мОсмол/кг. Определение проводят в соответствии с ОФС «Осмолярность» в препаратах, предназначенных для внутривенного введения с указанием растворителя и его объема. Содержание белка. Нормативные требования указывают в нормативной документации. Определение проводят колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Определение белка». Стерильность. Должен быть стерильным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Стерильность». Пирогенность. Должен быть апирогенным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность». Указывают тест-дозу, допустимые пределы изменений температуры у животных. Вводят 1 мл препарата на 1 кг массы кролика. Для лиофилизированных препаратов указывают растворитель и его объем. Бактериальные эндотоксины. Нормативные требования, требования к пробоподготовке препарата, тест-дозе в весовых, объемных или других единицах указывают в нормативной документации. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Бактериальные эндотоксины». Аномальная токсичность. Должен быть нетоксичным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность». Указывают тест-дозы, способ введения и время наблюдения. Специфическая активность. Указывают требования к показателю специфической активности и описывают метод ее количественного определения. Специфическую активность жидких препаратов выражают в количестве антител в единице объема. Для лиофилизированных препаратов указывают активность содержимого первичной упаковки или активность, приходящуюся на единицу объема после растворения в определенном объеме растворителя. Количественное содержание антител выражают в Международных единицах (ME). Описание метода включает требования к животным (вид, линия, масса, пол, количество); описание схемы и метода введения препарата, указание на использование стандартных образцов (при необходимости), величины используемых доз; требование к реагентам, тест-токсинам и вирусам, их дозам; сроки наблюдения и учитываемые показатели, методы расчета и статистической обработки результатов (при необходимости). При определении специфической активности методами in vitro приводят описание методики, требования к реагентам, учитываемые показатели. Удельная активность (если предусмотрено). Требования указывают в фармакопейной статье или нормативной документации. Удельная активность выражается в количестве единиц активности (например, ME), на установленное количество белка. Показатель определяют по формуле путем деления активности, приходящейся на единицу объема, на количество белка, находящегося в том же объеме. Вещества, вносимые в препарат. Если препарат содержит консерванты, стабилизаторы или наполнители, указывают их допустимое количество в единице объема (для жидких препаратов) или содержимого первичной упаковки (для лиофилизированных препаратов) и методы определения. Количество консерванта не должно быть меньше установленного эффективного минимума и не превышать заявленную величину более чем на 15%. Стабилизатор. Количество стабилизатора должно быть не меньше 80% и не больше 120% от заявленной величины. Содержание стабилизатора определяют с помощью подходящего физико-химического метода. Растворители и реагенты, выпускаемые в комплекте с препаратом. В комплекте со специфической сывороткой выпускается сыворотка соответствующего вида животного, разведенная 1:100, которая предназначена для постановки внутрикожной пробы с целью выявления чувствительности человека к лекарственному препарату, если это предусмотрено инструкцией по применению. В качестве растворителей для лиофилизированных препаратов, используют растворители, разрешенные к медицинскому применению при соответствующем пути введения, которые не влияют на качество препарата. Требования к качеству растворителя должно быть определены в нормативной документации производителя, в которую должны быть включены все показатели качества для контроля растворителя. Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты». Транспортирование и хранение. В защищенном от света месте при температуре от 2 до 8 °С. Жидкие лекарственные средства не допускается замораживать.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ

ПРИКАЗ
от 23 января 2015 г. N 80

ОБ УТВЕРЖДЕНИИ РЕГЛАМЕНТА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ УЧАСТНИКОВ СИСТЕМЫ ЛЬГОТНОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ

В целях исполнения Федерального закона от 17.07.1999 N 178-ФЗ «О государственной социальной помощи» (с последующими изменениями), Закона Московской области от 23.03.2006 N 36/2006-ОЗ «О социальной поддержке отдельных категорий граждан в Московской области» (с последующими изменениями) в части лекарственного обеспечения отдельных категорий граждан, приказываю: 1. Утвердить прилагаемый Регламент взаимодействия участников системы льготного лекарственного обеспечения (далее — Регламент). 2. Управлению организации лекарственной помощи, начальникам Управлений координации деятельности медицинских и фармацевтических организаций NN 1-15 (далее — Управления NN 1-15), главным врачам медицинских организаций, руководителям фармацевтических организаций, директору ГБУ МО «Мособлмедсервис» обеспечить неукоснительное исполнение Регламента, утвержденного п. 1 настоящего приказа. 3. Управлению организационной и документационной работы обеспечить опубликование настоящего приказа на официальном сайте Министерства здравоохранения Московской области. 4. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на первого заместителя министра здравоохранения Московской области Д.С.Маркова.

Министр здравоохранения
Московской области
Н.В.СУСЛОНОВА

Приложение
к приказу Министерства
здравоохранения
Московской области
от 23 января 2015 г. N 80

РЕГЛАМЕНТ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ УЧАСТНИКОВ СИСТЕМЫ ЛЬГОТНОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ

I. Общие положения

Регламент регулирует взаимодействие участников системы льготного лекарственного обеспечения отдельных категорий граждан лекарственными препаратами, специализированными продуктами лечебного питания и медицинскими изделиями (далее — лекарственные препараты и медицинские изделия) в рамках программы обеспечения необходимыми лекарственными препаратами за счет средств бюджетов Российской Федерации и Московской области.
Регламент разработай с целью определения единых требований по обеспечению реализации льготного лекарственного обеспечения в соответствии с Федеральным законом от 17.07.1999 N 178-ФЗ «О государственной социальной помощи» в целях совершенствования льготного лекарственного обеспечения граждан, имеющих право на получение государственной социальной помощи в виде набора социальных услуг, необходимыми лекарственными препаратами, постановлением Правительства РФ от 30.07.1994 N 890, постановлениями Правительства Московской области и нормативно-методическими документами Министерства здравоохранения Российской Федерации (Минздравсоцразвития РФ). Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития, Министерства здравоохранения Московской области. Действие Регламента распространяется на осуществление реализации программ льготного лекарственного обеспечения населения Московской области за счет средств бюджетов Российской Федерации и Московской области, в том числе для лечения больных злокачественными новообразованиями лимфоидной, кроветворной и родственных им тканей, гемофилией, муковисцидозом, гипофизарным нанизмом, болезнью Гоше, рассеянным склерозом, а также после трансплантации органов и (или) тканей.

II. Взаимодействие сторон, участвующих в реализации мер социальной поддержки по лекарственному обеспечению отдельных категорий граждан

Управление организации лекарственной помощи Министерства здравоохранения Московской области: 1.1. Ежемесячно формирует и утверждает сводную заявку Московской области на лекарственные препараты и медицинские изделия (в разрезе фармацевтических организаций) на основании ежемесячных плановых заявок Управлений NN 1-15 на соответствующий период. 1.2. Устанавливает график представления и защиты Управлениями NN 1-15 ежемесячных плановых заявок на лекарственные препараты и медицинские изделия. 1.3. Направляет в ГБУ МО «Мособлмедсервис» утвержденную сводную заявку Московской области на лекарственные препараты и медицинские изделия (за исключением лекарственных препаратов, назначаемых по решениям врачебных комиссии медицинских организаций) через портал Единой региональной информационной системы (далее — ЕРИС). 1.4. Принимает решение, в исключительных случаях, об обеспечении в рамках государственного контракта необходимыми лекарственными препаратами и медицинскими изделиями отдельных категорий граждан по внеплановым срочным заявкам должностных лиц муниципальных образований, ответственных за лекарственное обеспечение, с направлением заявок в ГБУ МО «Мособлмедсервис» на бумажном носителе. 1.5. Осуществляет анализ и контроль соответствия объемов поставок в фармацевтические организации лекарственных препаратов и медицинских изделий, не превышающих заявленную потребность для обеспечения отдельных категорий граждан, проживающих на территории муниципальных образований Московской области. 1.6. Осуществляет анализ остатков лекарственных препаратов в фармацевтических организациях с целью перераспределения для обеспечения рецептов, принятых на отсроченное обслуживание. 1.7. Организует рассмотрение документов, представленных Управлениями NN 1-15, для принятия решения о предоставлении отдельным категориям граждан лекарственных препаратов и медицинских изделий, не вошедших в Перечень, утверждаемый Министерством здравоохранения Московской области (далее — Министерство). При положительном решении организует их закупку. 1.8. Согласовывает от имени Министерства на портале ЕРИС Регистр врачей (фельдшеров), имеющих право на выписку рецептов для обеспечения отдельных категорий граждан.
Управления NN 1-15: 2.1. Координируют деятельность участников процесса обеспечения необходимыми лекарственными препаратами льготных категорий граждан, проживающих на территории муниципальных образований. 2.2. Контролируют обоснованность назначения лекарственных препаратов, выписку рецептов, потребность отдельных категорий граждан, проживающих на территории муниципальных образований, в лекарственных препаратах и медицинских изделиях для составления заявок на портале ЕРИС. 2.3. Осуществляют мероприятия по взаимодействию между фармацевтическими и медицинскими организациями по вопросу лекарственного обеспечения отдельных категорий граждан. 2.4. Осуществляют контроль работы врачебных комиссий медицинских организаций по рассмотрению обоснованности назначения и выписке рецептов на лекарственные препараты и медицинские изделия для обеспечения отдельных категорий граждан. 2.5. Ежемесячно формируют на портале ЕРИС заявки (плановые и дополнительные) на лекарственные препараты и медицинские изделия в разрезе фармацевтических организаций, расположенных на территории муниципальных образований. 2.6. Обосновывают (защищают) заявки на лекарственные препараты и медицинские изделия по установленным Министерством здравоохранения Московской области критериям. 2.7. Доводят до сведения руководителей медицинских и фармацевтических организаций утвержденные Министерством заявки на лекарственные препараты и медицинские изделия. 2.8. Осуществляют анализ и контроль соответствия объемов поставок в фармацевтические организации лекарственных препаратов и медицинских изделий, не превышающих заявленную потребность для обеспечения отдельных категорий граждан, проживающих на территории муниципальных образований Московской области. 2.9. Осуществляют контроль обеспечения граждан лекарственными препаратами по рецептам, принятым на отсроченное обслуживание. 2.10. На основании представленных фармацевтическими организациями данных о рецептах,, принятых на отсроченное обслуживание, формируют и направляют в Управление организации лекарственной помощи Министерства внеплановые срочные заявки на бумажном носителе по форме, определенной настоящим Регламентом (приложение 1). 2.11. Несут ответственность за составление заявок на лекарственные препараты и медицинские изделия, для обеспечения отдельных категорий граждан. 2.12. Осуществляют контроль за остатками лекарственных препаратов и. медицинских изделий в фармацевтических организациях и несут персональную ответственность за своевременное и рациональное их использование с целью недопущения списания лекарственных препаратов по окончанию срока годности в результате их невостребованности. 2.13. Информируют Управление организации лекарственной помощи Министерства о фактах выявления в аптечных организациях невостребованных остатков лекарственных препаратов и медицинских изделий, доставленных в рамках государственного контракта, для последующего их перераспределения (не позднее, чем за три месяца до окончания срока годности). 2.14. Осуществляют контроль формирования медицинскими организациями регистра региональных льготников, обратившихся по вопросам оказания медицинской помощи в части лекарственного обеспечения. 2.15. Осуществляют контроль лекарственного обеспечения федеральных льготников, имеющих право на получение набора, социальных услуг, на основании Паспорта врачебного участка, утвержденного приказом Минздравсоцразвития России от 22.11.2004 N 255 «О порядке оказания первичной медико-санитарной помощи гражданам, имеющим право на получение набора социальных услуг». 2.16. Осуществляют мониторинг лекарственного обеспечения на основании отчетов, формируемых на портале ЕРИС. 2.17. Осуществляют работу с обращениями граждан по вопросам лекарственного обеспечения.
Медицинские организации, участвующие в реализации мер социальной поддержки по обеспечению лекарственными препаратами и медицинскими изделиями отдельных категорий граждан: 3.1. Осуществляют выписку рецептов отдельным категориям граждан в соответствии с утвержденными перечнями, на основании установленных стандартов лечения отдельных нозологий. 3.2. Формируют на основании проводимого анализа сложившейся выписки рецептов муниципального образования и отпуска лекарственных препаратов по отдельным нозологиям потребность в лекарственных препаратах и медицинских изделий для обеспечения отдельных категорий граждан, проживающих на территории муниципальных образований, с направлением ее в Управления NN 1-15. 3.3. Взаимодействуют с фармацевтическими организациями, осуществляющими отпуск лекарственных препаратов и медицинских изделий отдельным категориям граждан, в части согласования плановой заявки для обеспечения отдельных категорий граждан, поживающих на территории муниципального образования, с учетом товарных остатков, сформировавшихся в предыдущие периоды. 3.4. Несут ответственность за обоснованность назначения лекарственных препаратов и медицинских изделий и достоверность оформления рецептурных бланков. 3.5. Обеспечивают ведение Паспорта врачебного участка, утвержденного приказом Минздравсоцразвития России от 22.11.2004 N 255 «О порядке оказания первичной медико-санитарной помощи гражданам, имеющим право на получение набора социальных услуг». 3.6. Организуют работу врачебных комиссий медицинских организаций по рассмотрению обоснованности назначения и выписки рецептов на лекарственные препараты и медицинские изделия для обеспечения отдельных категорий граждан. 3.7. Осуществляют формирование регистра региональных льготников, обратившихся по вопросам оказания медицинской помощи в части лекарственного обеспечения. 3.8. Осуществляют работу с обращениями граждан по вопросам лекарственного обеспечения.
Фармацевтические организаций, осуществляющие отпуск лекарственных препаратов и медицинских изделий отдельным категориям граждан: 4.1. Осуществляют отпуск лекарственных препаратов и медицинских изделий отдельным категориям граждан по рецептам, выписанным врачами (фельдшерами) медицинских организаций. 4.2. В случае отсутствия необходимого лекарственного препарата в фармацевтической организации на момент обращения гражданина принимают рецепт на отсроченное обслуживание. 4.3. Осуществляют учет принятых, рецептов в соответствии с письмом Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития от 24.01.2006 N 01И-22/06 «О ведении журнала «отсроченного обеспечения», информируют пациентов при поступлении препаратов. 4.4. Регулярно осуществляют обмен данными в Единой региональной информационной системе по электронным накладным и обслуженным рецептам с целью получения актуализированных остатков лекарственных препаратов и медицинских изделий в режиме on-line. 4.5. Обеспечивают ежедневный компьютерный учет обеспеченных, поставленных на отсроченное обслуживание и аннулированных льготных рецептов и передачу соответствующей информации в ЦОД. 4.6. Осуществляют отпуск по рецептам лекарственных препаратов и медицинских изделий в первую очередь с наименьшим сроком годности. 4.6. Несут персональную ответственность за сроки годности лекарственных препаратов и медицинских изделий. 4.7. Формируют реестры рецептов на лекарственные препараты, отпущенные отдельным категориям граждан, имеющим право на получение государственной социальной помощи, раздельно по финансовым потокам не позднее первых 5-ти рабочих дней месяца, следующего за отчетным. 4.8. Ежемесячно в срок до 10-го числа месяца, следующего за отчетным, представляют в ГБУ МО «Мособлмедсервис» реестры и первые экземпляры рецептов на лекарственные препараты и медицинские изделия, отпущенные отдельным категориям граждан. 4.9. В соответствии с установленными требованиями осуществляют хранение вторых экземпляров реестров и рецептов на лекарственные препараты и медицинские изделия, отпущенные отдельным категориям граждан. 4.10. Обеспечивают хранение лекарственных препаратов и медицинских изделий в соответствии с приказом Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 N 706н «Об утверждении правил хранения лекарственных средств». 4.11. Осуществляют раздельное хранение лекарственных препаратов и медицинских изделий но видам льгот и финансовым потокам. 4.12. Информируют врачей медицинских организаций о наличии лекарственных препаратов и медицинских изделий (два раза в неделю).
ГБУ МО «Мособлмедсервис»: 5.1. Представляет в Министерство в электронном виде информацию о поступлении на склад лекарственных препаратов в соответствии с заключенными государственными контрактами и договорами (по необходимости и по мере поступления товара). 5.2. Представляет в Министерство сведения по государственным контрактам, но которым нарушены сроки поставки лекарственных препаратов и медицинских изделий. 5.3. Осуществляет в рамках государственного контракта поставку в фармацевтические организации, утвержденные приказом Министерства, лекарственных препаратов и медицинских изделий в соответствии со сводной ежемесячной заявкой по Московской области и внеплановыми срочными заявками. 5.4. Формирует реестры рецептов па основании данных, представляемых фармацевтическими организациями, и далее сводный реестр рецептов Московской области на лекарственные средства и изделия медицинского назначения, отпущенные отдельным категориям граждан. 5.5. Представляет в Министерство на электронном носителе не позднее 20-го числа месяца, следующего за отчетным, сводные реестры рецептов на лекарственные препараты и медицинские изделия в разрезе фармацевтических организаций и в целом по Московской области.

Приложение
к Регламенту

Поставщик ______________________________________________ Муниципальное образование ______________________________

Внеплановая срочная заявка на лекарственные средства для обеспечения отдельных категорий граждан

Ф.И.О. (полностью)
Диагноз МКБ
Наименование лекарственного препарата с указанием лекарственной формы, дозировки и фасовки Количество (уп.)
Наименование аптечной организации
Вид льготы (федеральная, региональная, 7 нозологий, орфанные заболевания)

МНН
ТН

Подпись лица, ответственного за лекарственное обеспечение в муниципальном образовании

М.П.

Исполнитель (Ф.И.О., телефон)

Федеральный закон от 23.02.2013 N 15-ФЗ (ред. от 26.04.2016) «Об охране здоровья граждан от воздействия окружающего табачного дыма и последствий потребления табака»

СвязанныеСообщения

Приказ Росстандарта от 01.11.2012 N 676-ст «О введении в действие межгосударственного стандарта»

Федеральный закон от 23.02.2013 N 15-ФЗ (ред. от 26.04.2016) "Об охране здоровья граждан от воздействия окружающего табачного дыма и последствий потребления табака"

Добавить комментарий Отменить ответ

Товары

Товары

Свежие записи

Добро пожаловать!

Восстановите ваш пароль

Федеральный закон от 23.02.2013 N 15-ФЗ (ред. от 26.04.2016) «Об охране здоровья граждан от воздействия окружающего табачного дыма и последствий потребления табака»

СвязанныеСообщения

Приказ Росстандарта от 01.11.2012 N 676-ст «О введении в действие межгосударственного стандарта»

Федеральный закон от 23.02.2013 N 15-ФЗ (ред. от 26.04.2016) "Об охране здоровья граждан от воздействия окружающего табачного дыма и последствий потребления табака"

Добавить комментарий Отменить ответ

Товары

Товары

Метки

Свежие записи

Добро пожаловать!

Восстановите ваш пароль