Письмо Минздрава РСФСР от 12.10.1989 N 21-08/11-297 «О повышении качества люминесцентно-микроскопических исследований материала для обнаружения микобактерий туберкулеза (МБТ)»

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

ПИСЬМО

12 октября 1989 г.

N 21-08/11-297

О ПОВЫШЕНИИ КАЧЕСТВА ЛЮМИНЕСЦЕНТНО — МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ
МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА (МБТ)

Практическими и научно — исследовательскими учреждениями приобретен достаточно большой положительный опыт по совершенствованию люминесцентной микроскопии для диагностики бактериовыделения у больных туберкулезом, позволяющий повысить результативность указанного анализа, сократить затраты рабочего времени в отдельных моментах исследования и обезопасить персонал при работе с вирулентной культурой. Руководителем микробиологической лаборатории НПО «Фтизиопульмонология» д-р мед. наук В.М.Должанским, зав. лабораторией Московского противотуберкулезного диспансера N 4 Н.Ф.Жаком и врачом Е.М.Морель на основании анализа опыта применения люминесцентной микроскопии в противотуберкулезных учреждениях подготовлены предложения по совершенствованию существующего метода. В зависимости от возможностей лабораторий окраска мазка производится по Хагеманну или по Бою. Последний метод нашел меньшее число последователей из-за дефицитности и высокой стоимости одного из основных красителей (родамина), поэтому в настоящем письме акцент сделан на окраску по Хагеманну, но учтены и особенности окраски по Бою. Окраска по Бою сложнее окраски по Хагеманну и много дороже. Ее внедрение во многих лабораториях определяется большим объемом информации, получаемой микроскопистом при использовании данной методики: снижается риск выдачи положительного ответа при обнаружении сапрофитной флоры, появляется возможность дифференцировать возраст микобактериальных клеток и т.д. Однако тонкая дифференцировка, достигаемая при окраске по Бою, требует и дополнительных затрат времени. Так, при изготовлении мазка из осадка материала, подготовленного для посева, необходимо прямо на предметном стекле проверить рН суспензии и добиться его значения в 6,5-7,0 единиц (проверяется мелкими лакмусовыми бумажками). Для подщелачивания используют 0,5% раствор NaOH, для подкисления — 0,5% раствор HCl. Для окраски по Хагеманну эта процедура необязательна. При всех видах окраски абсолютно необходима плотная фиксация мазка на стекле. Жидкий материал (мочу, экскрет после ингаляций, ликвор и т.д.) обязательно наносят на предметные стекла, предварительно смазанные взбитым яичным белком. В условиях холодильника такие стекла хранятся неограничено долго и могут заготавливаться впрок. Не следует спешить с термальной фиксацией мазка. Вначале мазок подсушивают на воздухе — на нем не должно оставаться мелких капель — затем фиксируют в сухожаровом шкафу при 90 град. С в течение 30 минут. Отсчет времени начинают с момента достижения температуры 90 град. При этом происходит не только хорошая фиксация материала, но и дальнейшая работа с мазком становится безопасной. Оригинальный метод окраски разработан в Московском противотуберкулезном диспансере N 4. В настоящее время этим простым и надежным методом пользуются практически все лаборатории Москвы.

Реактивы: 1) 10% раствор Na3PO4

               2) 5% раствор карболовой кислоты               3) 0,1% раствор аурамина Для лучшего растворения аурамин в течение суток выдерживается в термостате. Перед употреблением растворы аурамина и карболовой кислоты профильтровываются через обеззоленный бумажный фильтр. Эти растворы готовят из расчета недельной потребности.               4) 3% солянокислый спирт               5)Раствор кислого фуксина:  390 мл  дистиллированной 

воды, 1 грамм кислого фуксина и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Перед употреблением кислый фуксин профильтровать через обеззоленный бумажный фильтр. Растворы солянокислого спирта и кислого фуксина можно готовить впрок. Отличием от рутинного метода Хагеманна нужно считать 2 основных момента:а) раствор аурамина готовят без добавления карболовой кислоты и б) мазок перед окраской заливают раствором карболовой кислоты, что выравнивает рН всей поверхности мазка, улучшает и ускоряет проникновение краски в клетку возбудителя, а это способствует хорошему свечению клеток по всей просматриваемой площади. Ход работы (экономный вариант). Материал обрабатывается 10% раствором Na3PO4 18-24 часа в термостате. На следующий день из плевательниц осторожно сливают верхний слой жидкости, горлышко плевательницы фламбируют на пламени горелки, осторожно перемешивают содержимое плевательницы и разливают по центрифужным пробиркам. Горлышко центрифужки фламбируют на пламени горелки. Если материал идет на посев и бактериоскопию, содержимое плевательницы разливают в две центрифужки.

Приготовление мазков

Центрифугирование — 2000 об/мин. 15 минут. Надосадочную жидкость полностью сливают. Горлышко центрифужки фламбируют на пламени горелки. Осадок энергично взбалтывают и 1-2 капли через край наносят на предметное стекло. Горлышко центрифужки фламбируют на пламени. Донышком центрифужки на предметном стекле делают не толстый круглый или овальный мазок. Окраска: а) мазки раскладывают на рельсы и заливают 5% раствором карболовой кислоты на 2 минуты. Через 2 минуты р-р карболовой кислоты с мазков сливают, торец стекла высушить фильтровальной бумагой; б) без промывки мазков на них наносят 0,1 р-р аурамина на 2 минуты; в) мазки промывают с тыльной стороны проточной водой; г) обесцвечивание 3% солянокислым спиртом дважды по 2 минуты; д) промывка с тыльной стороны струйкой воды; е) мазки заливают р-ром кислого фуксина на 2 минуты; ж) промывка стекол с мазками с тыльной стороны. Сушка на воздухе.

Микроскопия

Аналогично можно готовить мазки для окраски по Цилю — Нильсену взамен исследования флотационного кольца, но при этом исключается обработка мазков карболовой кислотой. Метод информативен, прост, позволяет экономить лабораторную посуду, повысить производительность труда, рекомендуется к повсеместному внедрению.