«Газохроматографический метод количественного определения ароматических аминосоединений (анилин, N-метиланилин, О-толуидин, N,N-диметиланилиН, N-этиланилин, N,N-диэтиланилин) в биосредах (кровь). Методические указания. МУК 4.1.767-99» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.07.1999)
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 июля 1999 года
Дата введения —
6 сентября 1999 года
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОСОЕДИНЕНИЙ (АНИЛИН, N-МЕТИЛАНИЛИН, О-ТОЛУИДИН, N,N-ДИМЕТИЛАНИЛИН, N-ЭТИЛАНИЛИН, N,N-ДИЭТИЛАНИЛИН) В БИОСРЕДАХ (КРОВЬ)
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.767-99
- Разработаны под редакцией академика РАЕН, д.м.н., проф. Зайцевой Н.В., к.б.н. Улановой Т.С., к.б.н. Нурисламовой Т.В., Карнажицкой Т.Д., Суетиной Г.Н., Поповой Н.В., Митрофановой В.М., Плаховой Л.В., Рудаковой Е.А. (ПНИКИ детской экопатологии).
- Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 6 июля 1999 г.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 «Методики выполнения измерений» и ГОСТа Р 1.5-92 «Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов». Методика анализа метрологически аттестована и обеспечивает определение ароматических аминосоединений в крови в диапазоне концентраций:
анилин
0,035 — 0,2 мкг/куб. см;
N-метиланилин
0,030 — 0,3 мкг/куб. см;
о-толуидин
0,035 — 4,2 мкг/куб. см;
N,N-диметиланилин
0,040 — 0,6 мкг/куб. см;
N-этиланилин
0,045 — 0,3 мкг/куб. см;
КД-диэтиланилин
0,075 — 0,3 мкг/куб. см.
Особенностью токсического действия ароматических аминосоединений являются функциональные нарушения центральной нервной системы, печени. Ароматические аминосоединения вызывают дерматиты, экземы и развитие аллергии.
АНИЛИН Мол. масса — 93,12
Анилин — маслянистая прозрачная светло-желтая жидкость со специфическим запахом. — 184,4 °С, — минус 5,89 °С. Анилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. Анилин относится ко 2 классу опасности.
N-МЕТИЛАНИЛИН Мол. масса — 107,50
N-метиланилин — маслянистая прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом. — 195,7 °С, — минус 57,0 °С. N-метиланилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. N-метиланилин относится к 3 классу опасности.
О-ТОЛУИДИН Мол. масса — 107,15
О-толуидин — маслообразная прозрачная жидкость от светло-желтого до красновато-коричневого цвета. — 199,7 °С, — минус 24,4 °С. О-толуидин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. О-толуидин относится ко 2 классу опасности.
N,N-ДИМЕТИЛАНИЛИН Мол. масса — 121,18
N,N-диметиланилин — маслянистая прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом. — 194,0 °С, — 2,45 °С. N,N-диметиланилин растворим в органических растворителях и малорастворим в воде. N,N-диметиланилин относится ко 2 классу опасности.
N-ЭТИЛАНИЛИН Мол. масса — 121,1
N-этиланилин — маслянистая прозрачная жидкость с желтым оттенком со специфическим запахом. — 204,7 °С. N-этиланилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. N-этиланилин относится к 4 классу опасности.
N,N-ДИЭТИЛАНИЛИН Мол. масса — 149,23
N,N-диэтиланилин — маслянистая прозрачная жидкость желтоватого цвета со специфическим запахом. — 216,27 °С. — минус 38,8 °С. N,N-диэтиланилин растворим в органических растворителях и малорастворим в воде. N,N-диэтиланилин относится к 4 классу опасности.
ХЛОРОФОРМ Мол. масса — 119,38
Хлороформ — бесцветная жидкость с характерным сладковатым запахом. — 61,15 °С, — минус 63,5 °С. Хлороформ растворим в этаноле, эфире, бензоле, ацетоне и сероуглероде, малорастворим в воде. Хлороформ относится ко 2 классу опасности. Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью результата измерений:
анилин
18,1%;
N-метиланилин
14,8%;
о-толуидин
15,0%;
N,N-диметиланилин
12,9%;
N-этиланилин
13,5%;
N,N-диэтиланилин
14,5%
при доверительной вероятности 0,95.
СУЩНОСТЬ МЕТОДА
Методика основана на предварительном концентрировании анализируемых соединений из биологического материала экстракцией хлороформом и последующем газохроматографическом анализе хлороформенного экстракта. Измерение концентрации ароматических аминосоединений выполняют методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием. Определению не мешают ацетон, ароматические углеводороды и алифатические спирты. Длительность анализа, включая экстракцию пробы, — 35 мин.
СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ
При выполнении применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.
Средства измерений
Хроматограф газовый с пламенно-ионизационным детектором
Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические ГОСТ 24104-80Е
Секундомер «Агат»
ГОСТ 5072-79Е
Микрошприцы МШ-10
ТУ 5Е2.833.106
Посуда лабораторная стеклянная
ГОСТ 1770-84
Колбы мерные, вместимостью 1000 куб. см ГОСТ 1770-74Е
Пипетки вместимостью 1, 5, 10 куб. см
ГОСТ 20292-74
Пробирки с притертыми пробками вместимостью 10 куб. см ГОСТ 1770-74Е.
Вспомогательные устройства
Хроматографическая колонка стальная длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм
Бидистиллятор
ГОСТ 15150-69
Редуктор кислородный
ТУ-26-05-235-70.
Центрифуга ОП-8УХЛ42, 7000 об./мин.
Материалы
Гелий в баллоне
ТУ 51-940-80
Водород технический
ГОСТ 3022-80
Воздух в баллоне
ГОСТ 11882-73.
Реактивы
3% OV-1 на хроматоне N-супер фракции 0,16 — 0,20 мм — неподвижная фаза для заполнения хроматографической колонки
Анилин ч.д.а.
ГОСТ 5810-78
N-метиланилин технический
ТУ 6-02-571-81
N,N-диметиланилин ч.д.а.
ГОСТ 5855-78
О-толуидин ч.д.а.
ГОСТ 10205-73
N-этиланилин технический
ТУ 6214-12-37-77
N,N-диэтиланилин ч.д.а.
ГОСТ 10162-75
Хлороформ фарм.
ГОСТ 20015-88
Вода дистиллированная
ГОСТ 6709-72.
ТРЕБОВАНИЯ К БЕЗОПАСНОСТИ
Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям «Пожарных норм проектирования зданий и сооружений» (СНиП ПА-5-700) и «Санитарных норм проектирования промышленных предприятий» (СН 245-71) и СНиП-74. При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76. При работе необходимо соблюдать «Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях», утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М., 1981), и «Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением», утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989). При работе с реактивом соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.
ТРЕБОВАНИЯ К КВАЛИФИКАЦИИ ОПЕРАТОРА
К выполнению измерений допускаются лица, прошедшие специализацию по работе на газовом хроматографе.
УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ
При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия: — температура воздуха (20 +/- 5) °С;
— атмосферное давление 630 — 800 мм рт. ст.; — влажность воздуха — не более 80% при температуре 25 °С. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.
ПОДГОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЙ
Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка хроматографической колонки, приготовление стандартных смесей, установление градуировочной характеристики.
Приготовление стандартных смесей
Для построения градуировочного графика собирают кровь у контрольной группы и готовят серию рабочих стандартных растворов. Исходный стандартный раствор для градуировки: в колбу вместимостью 1000 куб. см вводят по 10 куб. см каждого из аминосоединений. Весовое содержание аминосоединений в исходном стандартном растворе составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества): анилин — 10,22 мкг/куб. см, N-метиланилин — 9,86 мкг/куб. см, о-толуидин — 9,99 мкг/куб. см, N,N-диметиланилин — 9,56 мкг/куб. см, N-этиланилин — 9,63 мкг/куб. см, N,N-диэтиланилин — 9,35 мкг/куб. см. Срок хранения — 5 ч.
Подготовка хроматографической колонки
Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, гексаном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелия) с расходом 55 куб. см/мин. при температуре 300 °С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.
Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной калибровки. Она выражает зависимость площади пика на хроматограмме (кв. мм) от массы аминосоединений (мкг) и строится по 5 сериям стандартных растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из 5 стандартных растворов, готовят в мерных пробирках объемом 5 куб. см, добавляют по 1 куб. см и вносят исходный стандартный раствор в соответствии с таблицей. Срок хранения — 3 ч.
Таблица
СТАНДАРТНЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ АМИНОСОЕДИНЕНИЙ (ФРАГМЕНТ ШКАЛЫ)
Номер смеси для градуировки
1
2
3
4
5
АНИЛИН
Объем исходного стандартного
раствора (10,22 мкг/куб. см), куб. мм
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
Содержание анилина в 1 куб. см крови, мкг/куб. см 0,024
0,040
0,060
0,080
0,10
N-МЕТИЛАНИЛИН
Объем исходного стандартного раствора (9,863 мкг/куб. см), куб. мм 2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
Содержание N-метиланилина в 1 куб. см крови, мкг/куб. см 0,019
0,039
0,059
0,078
0,099
О-ТОЛУИДИН
Объем исходного стандартного раствора (9,99 мкг/куб. см), куб. мм 2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
Содержание о-толуидина в 1 куб. см крови, мкг/куб. см 0,019
0,039
0,060
0,079
0,099
N,N-ДИМЕТИЛАНИЛИН
Объем исходного стандартного раствора (9,56 мкг/куб. см), куб. мм 2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
Содержание N,N-диметиланилина в 1 куб. см крови, мкг/куб. см 0,019
0,038
0,057
0,076
0,095
N-ЭТИЛАНИЛИН
Объем исходного стандартного раствора (9,626 мкг/куб. см), куб. мм 2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
Содержание N-этиланилина в 1 куб. см крови, мкг/куб. см 0,019
0,038
0,058
0,077
0,096
N,N-ДИЭТИЛАНИЛИН
Объем исходного стандартного раствора (9,35 мкг/куб. см), куб. мм 2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
Содержание N,N-диэтиланилина в 1 куб. см крови, мкг/куб. см 0,019
0,037
0,056
0,075
0,094
В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 10 куб. мм каждого стандартного раствора и анализируют в условиях:
температура термостата колонок
110 °С,
температура испарителя
180 °С,
температура детектора
120 °С,
расход газа-носителя (гелия)
55 куб. см/мин.,
расход водорода
33 куб. см/мин.,
расход воздуха
300 куб. см/мин.,
шкала измерителя тока
10 х А,
скорость диаграммной ленты
240 мм/ч,
время удерживания: хлороформа
1 мин. 45 с,
анилина
6 мин. 15 с,
N-метиланилина
9 мин.,
о-толуидина
9 мин. 15 с,
N,N-диметиланилина
9 мин. 50 с,
N-этиланилина
11 мин.,
N,N-диэтиланилина
20 мин.
Пробы крови, содержащие различные концентрации анализируемых соединений, экстрагируют 2 куб. см хлороформа с последующим кипячением в течение 15 с. Белок удаляют центрифугированием при 7000 об./мин. Полученные экстракты хроматографируют при определенной чувствительности прибора. На полученной хроматограмме определяют площади пиков аминосоединений и по средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику. Градуировку проверяют 1 раз в неделю и при смене партии реактивов.
Отбор проб
Отбор проб венозной крови в объеме 10 куб. см производится в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой. Анализ крови проводить сразу или хранить в холодильнике не более 5 суток.
ВЫПОЛНЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЙ
Пробы, содержащие 1 куб. см крови, экстрагируют 2 куб. см хлороформа с последующим кипячением в течение 15 с. После удаления белков центрифугированием при 7000 об./мин. в течение 15 мин. проводят количественное определение анализируемых соединений в подготовленных пробах по калибровочному графику.
ВЫЧИСЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
Количественное определение (С) проводят методом абсолютной калибровки (мкг/куб. см). Расчет концентраций аминосоединений проводят по формуле:
,
где:
А — количество компоненты, найденное по калибровочному графику, мкг;
- объем экстрагента, куб. см.
- объем экстрагируемой жидкости, куб. см.
- объем хроматографируемой пробы, куб. мм.
ВНУТРЕННИЙ ОПЕРАТИВНЫЙ КОНТРОЛЬ
Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).
Контроль сходимости выходных сигналов
Контролируемым параметром является относительный размах выходных сигналов хроматографа при вводах трех параллельных проб градуировочного раствора. Контроль осуществляется при проведении градуировки, при периодическом контроле градуировочных коэффициентов, а также при выполнении измерений. Результат контроля признается положительным при выполнении условия:
,
где:
S — площадь пика в кв. мм;
- среднее арифметическое значение площади пиков при вводе 3 параллельных проб градуировочного раствора.
Оперативный контроль точности
Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля. Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50 — 150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X’. Результаты анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X’ получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д. Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:
,
где:
С — добавка к пробе в виде раствора с концентрацией мкг/куб. см;
- норматив оперативного контроля погрешности, мкг/куб. см. При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают:
,
где: и — характеристики погрешностей для исходной пробы и пробы с добавкой, мкг/куб. см;
и .
При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают, что:
.
При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.
