«МУК 4.2.3144-13. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii в продуктах для питания детей раннего возраста. Дополнения и изменения к МУК 4.2.2428-08. Методические указания» (утв. Роспотребнадзором 26.11.2013)

Утверждаю
Вр.и.о. Руководителя
Федеральной службы
по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главного государственного
санитарного врача
Российской Федерации
А.Ю.ПОПОВА
26 ноября 2013 года

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ ENTEROBACTER SAKAZAKII В ПРОДУКТАХ ДЛЯ ПИТАНИЯ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА

ДОПОЛНЕНИЯ И ИЗМЕНЕНИЯ К МУК 4.2.2428-08

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.3144-13

1. Разработаны Федеральным государственным бюджетным учреждением «Научно-исследовательский институт питания» Российской Академии медицинских наук.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 октября 2013 г. N 3).
3. Утверждены вр.и.о. Руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 26 ноября 2013 г.
4. Введены впервые.
5. По тексту документа изменить название Enterobacter sakazakii и записать в следующей редакции «Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii)» или «Cronobacter spp.».
6. Раздел 1 «Общие положения и область применения» дополнить п. 1.7 и изложить его в следующей редакции: «1.7. Методические указания носят рекомендательный характер».
7. Раздел 2 «Сущность метода» изложить в следующей редакции:

«2. Сущность метода

2.1. Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие неселективные среды для предварительного обогащения проб, пересеве в жидкие селективные среды для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры. Ниже представлена методическая схема определения Cronobacter spp.

Таблица 1

СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯ СУХИХ ДЕТСКИХ СМЕСЕЙ НА НАЛИЧИЕ CRONOBACTER SPP.

Этап
Продолжительность инкубации, ч
Температура
1. Подготовка реактивов и материалов

2. Растворение навесок продукта в забуференной пептонной воде (ЗПВ) в соотношении 1:9 (при необходимости определения количества — навесок массой 100, 10 и 1 г в 3 колбы или пробирки с ЗПВ каждая), смешивание и инкубация 18 +/- 2
37 град. С
3. Посев 0,1 куб. см проинкубированной суспензии в селективный питательный бульон для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae и инкубация 24 +/- 2
44 град. С
4. Персеев 0,1 мл проинкубированного бульона для выделения Enterobacteriaceae на поверхность хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. или фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-agar) 24 +/- 2
44 град. С
5. Отбор 5 подозрительных на Cronobacter spp. колоний с поверхности хромогенного ESIA-агара, отбор всех типов колонии с поверхности фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-agar); пересев на триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) и инкубация 48 +/-2
25 град. С
6. Отбор колоний с желтым пигментом, микроскопия по Граму и подтверждение их видовой принадлежности по биохимическим тестам идентификации

7. Интерпретация результатов. При необходимости — подсчет наиболее вероятного числа (НВЧ) по количеству положительных проб в каждой из засеянных навесок продукта

2.2. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к E.sakazakii (Cronobacter spp.). Подтверждение принадлежности к Cronobacter spp. производится путем получения развернутых биохимических характеристик штаммов. Допускается использование тест-систем для биохимической дифференциации энтеробактерий API 20E, Rapid 20E, ID 32E (ф. «БиоМерье», Франция) и др. Определение биохимических характеристик, подтверждающих принадлежность выделенных штаммов к роду Cronobacter spp. и дифференцирующих их от близкородственных представителей энтеробактерий Enterobacter cloacae и Pantoea agglomerans, приведены в табл. 2.

Таблица 2

БИОХИМИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ CRONOBACTER SPP.

Тест или субстрат
Реакции
E. sakazakii (Cronobacter spp.)
E. cloacae
P. agglomerans
Желтый пигмент при 25 град. С
+
—
(+)
D-сорбит
—
+
(+)

+
(-)
—
Разжижение желатины (22 град. С)
—
—
+
Оксидаза
—
—
—
Лизиндекарбоксилаза
—
—
—
Аргининдигидролаза
+
+
—
Орнитиндекарбоксилаза
+
+
(-)
Утилизация цитратов
+
+
+
Реакция Фогес-Проскауэра
+
+
(+)
Индол
—
—
(-)
Глюкоза
+
+
+
Маннит
+
+
+
Лактоза
+
+
(+)
Сахароза
+
+
(+)
L-рамноза
+
+
0)
D-мелибиоза
+
+
+
Амигдалин
+
—
(-)
Подвижность
+
+
(+)
Мукоидный рост
+
+
+
Примечания:
«+» — 90-100% штаммов положительные; «(+)» — 21-89% штаммов положительные; «-» — 0-9% штаммов положительные; «(-)» — 10-24% штаммов положительные.

Ведущими дифференцирующими признаками Cronobacter spp. являются: — способность к образованию желтого пигмента при культивировании на неселективных средах при температуре 25 град. С; — наличие активности на хромогенных средах, содержащих ; — отсутствие способности к ферментации D-сорбита. Для дифференциации Cronobacter spp. от сорбитвариабельных и обладающих желтым пигментом представителей рода Pantoea agglomerans (Syn: Erwinia spp.) используется тест разжижения желатины.». 4. В разделе 3.3 «Реактивы и питательные среды» перечень питательных сред дополнить следующими наименованиями: — модифицированный лаурилсульфат триптозный бульон с ванкомицином (мЛСТ с ванкомицином); — Enterobacter sakazakii хромогенный агар или селективные хромогенные среды аналогичного назначения, соответствующие требованиями стандарта ISO/TS 22964:2006 IDF/RM 210:2006. 5. Раздел 4.2 «Приготовление питательных сред» дополнить пп. 4.2.6, 4.2.7 и 4.2.8 в следующей редакции:

«4.2.6. Забуференная пептонная вода

Состав среды
Концентрация, г/куб. дм
Хлорид натрия (NaCl)
5,0
Ферментативный гидролизат казеина
10,0
Двузамещенный фосфат натрия 12-водный 
9,0
Однозамещенный фосфат калия 
1,5

Компоненты растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН 7,0 +/- 0,2 при 25 град. С, и автоклавируют при 121 град. С в течение 15 мин.

4.2.7. Модифицированный лаурилсульфат триптозный бульон (мЛСТ) с ванкомицином

Состав среды
Концентрация, г/куб. дм
Хлорид натрия (NaCl)
34,0
Пептон ферментативный
20,0
Лактоза
5,0
Однозамещенный фосфат калия 
2,75
Двузамещенный фосфат калия 
2,75
Лаурилсульфат натрия 
0,1

Компоненты растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН 6,8 +/- 0,2 при 25 град. С, разливают по 10 мл в пробирки и автоклавируют при 121 град. С в течение 15 мин. Приготовление рабочего раствора ванкомицина: 10 мг ванкомицина растворяют в 10 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают и стерилизуют методом мембранной фильтрации. Готовый раствор ванкомицина может храниться при температуре от 0 до 5 град. С в течение 15 суток. Для получения готовой среды раствор ванкомицина вносят в каждую пробирку со стерильной основой мЛСТ в количестве 0,1 куб. см для получения конечной концентрации ванкомицина в готовой среде 10 мкг/куб. см. Готовая среда может храниться при температуре от 0 до 5 град. С в течение 1 суток.

4.2.8. Enterobacter sakazakii хромогенный агар 

Состав среды
Концентрация, г/куб. дм
Панкреатический гидролизат казеина (триптон) 7,0
Дрожжевой экстракт
3,0
Хлорид натрия (NaCl)
5,0
Деоксихолат натрия
0,6
 
0,15
Кристаллический фиолетовый
2 мг
Агар-агар
12,0-18,0 <>

<> В зависимости от способности агара к гелеобразованию.

Компоненты растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН 7,0 +/- 0,2 при 25 град. С и автоклавируют при 121 град. С в течение 15 мин. Стерилизованную агаровую среду охлаждают до температуры 44-47 град. С и разливают по 15 куб. см в стерильные чашки Петри. Готовая среда может храниться при температуре от 0 до 5 град. С в течение 1 суток.».

Примечание.
Нумерация пунктов дана в соответствии с официальным текстом документа.

5. Раздел 6 «Проведение анализа» изложить в следующей редакции:

«6. Проведение анализа

6.1. Пробы продуктов массой 100 г, 125 г или 137,5 г вносят в забуференную пептонную воду (ЗПВ) по п. 4.2.6 в соотношении 1:9 по объему. Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) град. С в течение (18 +/- 2) ч. 6.2. При количественном анализе общая масса (объем) навески должна быть не менее 400 г (куб. см). Из подготовленной по п. 5 пробы отбирают 4 навески (порции) продукта массой 100 г (куб. см) каждая для анализа. Производят посев каждой из трех навесок (порций) в 900 куб. см ЗПВ и перемешивают. Из четвертой навески (порции) массой (объемом) 100 г (куб. см) отбирают три навески (порции) продукта массой 10 г (куб. см) и производят посев в 90 куб. см ЗПВ и перемешивают. Из этой же пробы отбирают три навески (порции) продукта массой 1 г (куб. см) и производят посев в 9 куб. см ЗПВ. Для посева (при необходимости — предполагаемом высоком содержании Cronobacter spp. в продукте) меньших количеств продукта — 0,1 и 0,01 г, делают десятикратно убывающие разведения навески массой 10 г, и вносят по 1 куб. см (х 3) соответствующих разведений в 9 куб. см ЗПВ. Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) град. С в течение (22 +/- 2) ч. 6.3. После термостатирования проб продукта в среде для первичного накопления 0,1 куб. см суспензии пересевают в 10 куб. см модифицированного лаурилсульфат триптозного бульона с ванкомицином (арбитражная среда) или в 10 куб. см одной из жидких селективных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae по ГОСТ 29184-91 — среду Кесслер с глюкозой или буферный глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью, или бульон Мак-Конки. Посевы термостатируют при температуре 44 град. С в течение (24 +/- 2) ч. 6.4. Из посевов после термостатирования, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, делают пересев штрихом на поверхность хромогенного агара по п. 4.2.8 для выявления Cronobacter spp., содержащего (арбитражная среда), или на поверхность фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-arap). Чашки с агаризованной средой предварительно подсушивают. Посевы термостатируют при температуре 44 град. С в течение (24 +/- 2) ч. 6.5. При отсутствии роста на поверхности хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. или VRBG-arapa анализ прекращают и дают заключение об отсутствии Cronobacter spp. в исследованной пробе. 6.6. После этапа селективного обогащения проб для обнаружения Cronobacter spp. (п. 6.3) допускается использовать ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в соответствии с процедурой, изложенной в МУК 4.2.2872-11. При получении отрицательных результатов исследований образцов предварительно обогащенных жидких селективных сред с применением ПЦР анализ прекращают и дают заключение об отсутствии Cronobacter spp. в исследованной пробе. 6.7. При обнаружении на чашках хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. роста подозрительных культур для дальнейшего изучения отбирают 3-5 характерных колоний. При обнаружении на поверхности VRBG-агара роста дальнейшему изучению подвергают все обнаруженные варианты культур, для чего отбирают по 3-5 колоний каждого типа. 6.8. Отобранные для исследования 3-5 характерных колоний пересевают на поверхность триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом и термостатируют при температуре 25 град. С в течение (48 +/- 2) ч. В качестве положительного контроля используют референс-штамм E.sakazakii (Cronobacter spp.), типичный по фенотипическим свойствам. 6.9. Культуры, растущие на триптон-соевом агаре с образованием желтого или желто-коричневого пигмента, подвергают дальнейшему изучению для подтверждения принадлежности к Cronobacter spp.». 6. Раздел 10 «Нормативные ссылки» изложить в следующей редакции: 10.1. ГОСТ Р 54005-2010 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae». 10.2. ГОСТ ISO 7218-2011 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям». 10.3. ГОСТ Р 54004-2010 «Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний». 10.4. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов». 10.5. ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов». 10.6. ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе». 10.7. ГОСТ 26809-86 «Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу». 10.8. ГОСТ Р ИСО 707-2010 «Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб». 10.9. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». 10.10. МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов». 10.11. Стандарт ISO/TS 22964:2006 IDF/RM 210:2006 «Milk and milk products — Detection of Enterobacter sakazakii». 10.12. МУК 4.2.2872-11 «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий — возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией». 10.13. Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции».