Цветной геном дёшево и быстро

Расшифрованы полные геномы ещё двух человек: нигерийца и китайца. Детальный анализ первых «цветных» геномов ещё впереди, однако быстрота и дешевизна расшифровки уже обещают скорое наступление эпохи персональной геномики. Как будет выглядеть эта эпоха, неясно.

От открытия Грегором Менделем законов наследования внешних признаков до описания материальной базы этой самой наследственности – ДНК – прошло 90 лет. За последующие полвека ученые не только сумели разобраться в особенностях работы генетического аппарата, но и научились в какой-то степени управлять этими процессами. Однако большинству из нас больше знакомы не фундаментальные открытия, объясняющие принципы работы биологических систем, а технологические прорывы, демонстрирующие могущество и великолепие науки.

Яркий пример – завершившийся в 2004 году проект «Геном человека», который вроде бы не принес новых принципиальных знаний о работе, но при этом добавил десятки миллиардов килобайт информации в непрерывно пополняемые базы данных. Впервые было представлено не лоскутное одеяло из расшифрованных фрагментов ДНК множества людей, а геном одного конкретного человека – одного из первооткрывателей структуры самой ДНК Джеймса Уотсона. Примерно год назад была завершена расшифровка другого полного генома – одного из пионеров расшифровки Крейга Вентера.

В четверг, на радость лишившемуся работы из-за «неполиткорректных» высказываний Уотсону, этот короткий список пополнился азиатом и негром.

В расшифрованном геноме нигерийца ученые нашли 4 миллиона одиночных замен нуклеотидов, отличающих его от Уотсона и Вентера – так называемых «снипов» (SNP, однонуклеотидных полиморфизмов. Кроме того, учёные выделили около 400 тысяч отличий другого рода – так называемых CNV-замен, в которых целые фрагменты ДНК из многих нуклеотидов переставляются, появляются в нескольких копиях или вовсе удаляются из генома.

Китаец от двух европеоидов с известными геномами отличается меньше – в его ДНК нашли 3 миллиона «снипов». Возможно, уже скоро мы услышим комментарий на этот счёт от Джеймса Уотсона, который до сих пор не особо стеснялся утверждать, что представители разных рас обладают разными умственными способностями, заложенными в их генах.

В последнем выпуске Nature сразу две исследовательские команды сообщили о завершении проектов по определению полных последовательности двух человеческих геномов с помощью относительно дешевого и очень быстрого метода компании Illumina. На расшифровку каждого генома со всеми подготовительными работами ушло менее двух недель.

Герои повествования в этих двух историях остались анонимными, известно лишь, что объект исследования Дэвида Бентли и его коллег – мужчина народности йоруба, проживающий в Нигерии, а учёные под руководством Чжунь Вана расшифровали геном жителя Пекина, также мужчины. Детальный анализ всех этих отличий ещё впереди. Однако не менее интересно и то, как были прочитаны геномы.

Лоскутный геном

В основе всех современных методик расшифровки генома лежит один и тот же принцип. Выделенную и очищенную ДНК сначала «амплифицируют» – превращают во множество количество копий, потом разрезают на многочисленные кусочки, разделяют на отдельные нити, а затем «считывают» нуклеотидные последовательности. Вновь воедино их соединяют уже в памяти суперкомпьютеров с помощью сложных математических алгоритмов.

Чтобы понять, на что похоже такая процедура, представьте себе хорошую сельскую или даже небольшую районную библиотеку. В десятках тысячах томов, её составляющих, как раз будет примерно 3 миллиарда букв – столько пар нуклеотидов имеется в ДНК, содержащихся в каждой клеточке нашего организма. Так вот, все эти десятки тысяч книги надо сначала размножить, превратив в миллионы томов, затем порезать на страницы, порвать на лоскуты и тщательно перемешать. После этого вам предлагается восстановить книги всей библиотеки.

Помогает в этом очевидно нелёгком деле именно первый шаг – «размножение» исходной библиотеки.

Хотя отдельные страницы были порваны на клочки случайным образом, в конечном месиве всякая фраза присутствует многократно, при том все эти повторяющиеся фрагменты перекрываются. Это и позволяет восстановить целостность.

Отличаются использующиеся сейчас 4 метода: компаний Applied Biosystems, Illumina, Roche и Helicos – лишь размером клочков и методами, которые используются для считывания букв. Почти 20 лет назад Уотсон и его коллеги, участвовавшие в «Геноме человека», решили дробить ДНК на цепочки длиной в 400–800 пар оснований – несколько строчек текста в нашей аналогии. Авторы последних работ смогли ограничиться кусочками строк всего по 30–35 букв в каждом.

Однако сравнение не вполне уместно. Нашим современникам существенно проще – во-первых, у них уже есть два опорных генома, с которыми можно сравнивать кусочки считанного текста – в конце концов, они у людей не так сильно отличаются. А во-вторых, возможности вычислительной техники за последнее десятилетие расширились многократно, особенно если их скорректировать по доступности и стоимости.

Мостики, краски и химия

Увеличение скорости считывания генома – по-настоящему большое достижение. И дело не только в том, что миллионы лоскутов с текстом генетического кода сейчас считываются параллельно. Изобретение, позволившее расправиться с целым геномом меньше чем за месяц, – так называемый метод «мостиков».

К каждому фрагменту ДНК с обоих концов прикрепляют известные олигонуклеотиды (короткие цепочки, состоящие всего из нескольких нуклеотидов). Затем благодаря этим олигонуклеотидам эти ниточки растягивают над тонкими горизонтальными плашками – получается действительно что-то вроде мостиков. Естественно, все эти описанные реакции присоединения объясняются химическими взаимодействиями и не требуют какого-либо контроля со стороны ученых. Единственное, что от них требуется, – добавить нужные ферменты, управляющие реакциями в нужное время и в нужной концентрации.

Благодаря такой самостоятельности все мостики выстраиваются на плашке за несколько секунд, а на одной стандартной пластине в установке компании Illumina помещаются около 80 миллионов цепочек.

После этого на плашку добавляют раствор из отдельных нуклеотидов, крепко сшитых (опять же химической связью) с разноцветными флуорофорами – светящимися молекулами, притом каждому нуклеотиду соответствует свой цвет. Ученые выжидают время, необходимое для присоединения очередного нуклеотида комплементарно второй цепочке ДНК, после чего убирают раствор свободных «светлячков» и смотрят, какой именно нуклеотид присоединился в ту или иную точку плашки.

Затем процедура «добавление красок – смыв – фоторегистрация» повторяется до тех пор, пока все располагающиеся на плашке последовательности не будут расшифрованы. В установке компании Illumina это происходит 30–35 раз – в зависимости от того, на какой длины участки была разрезана исследуемая ДНК.

Быстро, дёшево, надёжно

Опубликованная в Nature работа Дэвида Бентли была посвящена не только описанию генетических отличий негра от Уотсона, но и изучению надёжности использованного метода. Чтобы оценить её, команда из почти двух сотен ученых протестировала оборудование на хорошо изученном участке ДНК длиной 162 572 пар оснований, кодирующем гены так называемого главного комплекса гистосовместимости.

Точность метода составила 99,96%, что вполне удовлетворяет современными требованиям. Тем более что «сомнительные» 0,04% располагались там же, где дают сбои и другие методы расшифровки.

По мнению авторов работ, опубликованных в Nature, эра индивидуальной геномики не за горами. И уже очень скоро она станет вполне доступной обычным людям.

Международный проект «Геном человека» 1989–2004 годов обошёлся в $300 миллионов, расшифровка генома Вентера по патентованной методике стоила, по слухам, примерно $1 миллиард. По сравнению с этими суммами $500 тысяч, потраченные на китайца и нигерийца, – ничто, особенно если учесть, что лишь $100 тысяч ушли на расходные материалы – реактивы и им подобное.

Корпорация Applied Biosystems, основной конкурент Illumina, обещает, что уже следующее поколение её секвенирующих машин снизит стоимость определения последовательности ДНК до $10 тысяч за человеческий геном, а некоторые рассчитывают и на $5 тысяч. И намерены делать это быстрее, чем за сутки.

Впрочем, проклятого разочарования от встречи с мечтой, похоже, не избежать и в случае с геномом.

Чем доступнее становится индивидуальный геном, тем больше учёные начинают задаваться вопросом: «А зачем он нужен?».

Результаты сотен и тысяч работ, едва ли не каждый день обнаруживающих в последние годы очередные «гены» рака, болезни Альцгеймера, диабета и многих других врождённых заболеваний, очень редко обладают реальной предсказательной силой. Так что практическая польза от них под большим вопросом.

Ну узнали вы, что риск заболеть раком желудка у вас на 50% выше, чем у соседа. И что? Не будете есть солёное и сладкое и когда-нибудь умрёте в ресторане от сердечного приступа – с досады от того, что самое вкусное блюдо вам нельзя?

Впрочем, подобные соображения можно высказать по поводу едва ли не любой отрасли технического и медицинского прогресса. По мнению многих учёных, хотя эра индивидуальной геномики и рядом, как она будет выглядеть, пока неясно. Фантазировать можно сколько угодно, но проще дождаться. Судя по последнему номеру Nature, ждать осталось недолго.