«Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам. Методические указания. МУК 4.2.2495-09» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 01.04.2009) «Организация молекулярно-генетических исследований биологического материала из природных очагов геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Методические указания. МУК 4.2.2494-09» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 01.04.2009) <Письмо> Росздравнадзора от 01.04.2009 N 01И-173/09 «О порядке продления сроков эксплуатации рентгеновской аппаратуры»
Введен в действие с 1 июня 2009 года (пункт 4 данного документа). Текст документа
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
1 апреля 2009 г.
Дата введения:
1 июня 2009 года
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОПАСНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ (ЧУМА, СИБИРСКАЯ ЯЗВА, ХОЛЕРА, ТУЛЯРЕМИЯ, БРУЦЕЛЛЕЗ, САП, МЕЛИОИДОЗ)
К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2495-09
- Разработаны ФГУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт; ФГУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт; ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт; ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт; ФГУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»; ФГУЗ Противочумный центр Роспотребнадзора; Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
- Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 марта 2009 г. N 1).
- Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 1 апреля 2009 г.
- Введены в действие с 1 июня 2009 г.
- Введены взамен «Инструкции по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам», утвержденной Минздравом СССР, от 7 февраля 1989 г.
- Область применения
В настоящих Методических указаниях изложены стандартизированные методы определения чувствительности возбудителей особо опасных инфекций (ООИ) бактериальной природы к антибактериальным препаратам (АБП) методом серийных разведений (МСР), диско-диффузионным методом (ДДМ) и критерии интерпретации результатов с учетом биологических особенностей каждого вида микроорганизма. Методические указания предназначены для лабораторий, имеющих разрешение на работу с возбудителями опасных инфекционных болезней I-II и II-IV групп патогенности, противочумных станций, противочумных институтов и специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ) ФГУЗ противочумных институтов. В лабораториях Центров индикации и диагностики возбудителей особо опасных инфекционных болезней, Референс-центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней и Национальных центров верификации диагностической деятельности (в соответствии с Приказом Роспотребнадзора от 17.03.08 N 88) выполняют исследования по определению антибиотикочувствительности/устойчивости микроорганизмов I-II групп патогенности с использованием метода серийных разведений и диско-диффузионного метода. В лабораториях ФГУЗ, ЦГиЭ, СПЭБ, противочумных станций допускается применение только диско-диффузионного метода.
2. Нормативные и методические документы
- Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ.
- Международные медико-санитарные правила. ВОЗ, 2005.
- СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».
- СП 1.2.1318-03 «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами».
- СП 3.4.2318-08 «Санитарная охрана территории Российской Федерации».
- МУ 3.4.1030-01 «Организация, обеспечение и оценка противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий в случае завоза или возникновения особо опасных инфекций, контагиозных вирусных геморрагических лихорадок, инфекционных болезней неясной этиологии, представляющих опасность для населения Российской Федерации и международного сообщения».
- Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 17.03.08 N 88 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней».
- Специфическая индикация патогенных биологических агентов: Практическое руководство. М., 2006.
- СП 3.1.7.1380-03 «Профилактика чумы. Общие требования к эпидемиологическому надзору за чумой».
- Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации, 2004 г., N 7 «Об организации и проведении мероприятий по профилактике чумы».
- СП 3.1.089-96. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных: Сборник санитарных и ветеринарных правил. «Сибирская язва».
- СП 3.1.1086-02 «Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой».
- МУ 3.1.2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляремией».
- МУ 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры».
- МУ 3.1.7.1189-03 «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза у людей».
- МУК 4.2.2413-08 «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы».
- «Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза. Методические рекомендации». Волгоград, 1994.
- «Инструкция по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам». М., 1990.
- МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».
- Приказ МЗ РФ от 12.08.03 N 400 «О совершенствовании организационной работы специализированных противоэпидемических бригад противочумных учреждений».
- Распоряжение Правительства РФ от 21.05.07 N 642-р «О модернизации специализированных противоэпидемических бригад».
- Общие сведения
Антибиотикограмма возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы должна быть получена в течение срока идентификации культур, т.к. определяет выбор средств специальной экстренной профилактики и этиотропной терапии инфекции. Адекватность такого выбора зависит от стандартности и качества определения антибиотикограммы, критериев ее интерпретации, отработанных для определенного вида бактерий. Однако критерии оценки результатов определения чувствительности/устойчивости возбудителей особо опасных инфекций до настоящего времени предложены не были. Исследование чувствительности возбудителей ООИ к АБП должно максимально достоверно и в кратчайшие сроки обеспечить: — выбор средств специальной экстренной профилактики и этиотропной терапии инфекции; — обоснование необходимости смены антибактериального препарата на основе бактериологического контроля эффективности лечения у отдельного больного; — единые подходы к осуществлению наблюдения за распространением антибиотикорезистентности среди штаммов микроорганизмов — возбудителей ООИ; — оценку антибактериальной активности партий АБП, используемых для экстренной профилактики и лечения инфекций, а также новых антибиотиков, перспективных для расширения арсенала средств, применяемых для этиотропной терапии ООИ.
4. Обоснование для исследования чувствительности всех выделенных культур возбудителей ООИ к антибактериальным препаратам
Антибиотикорезистентность возбудителей различных инфекционных заболеваний является насущной проблемой как медицинской науки, так и клинической медицины. Особую опасность представляет множественная лекарственная устойчивость бактерий, чрезвычайно быстро распространяющаяся с помощью мигрирующих генетических элементов, содержащих гены лекарственной устойчивости и имеющих специализированные механизмы их передачи среди широкого круга бактерий. Некоторые микроорганизмы легко мутируют, приобретая резистентность к ряду антибиотиков (стрептомицину, рифампицину, налидиксовой кислоте и др.). Наличие антибиотикорезистентности обнаружено у природных штаммов чумного микроба. Все чаще встречаются сообщения о выделении стрептомициноустойчивых, тетрациклиноустойчивых вариантов возбудителя. Имеются факты регистрации резистентности к рифампицину, левомицетину и снижения чувствительности к гентамицину. От людей выделены культуры с плазмидами множественной лекарственной устойчивости. Большинство природных изолятов сибиреязвенного микроба чувствительно к АБП, однако описаны случаи выделения от больных и из других источников штаммов, устойчивых к пенициллину, амоксициллину, стрептомицину, тетрациклинам, рифампицину. Серьезным осложнением течения 7-й пандемии холеры является нарастание устойчивости возбудителя к традиционно применяемым для лечения инфекции препаратам-тетрациклинам, левомицетину, триметоприму/сульфаметоксазолу, фуразолидону, ампициллину и др. В настоящее время от больных выделяют культуры, имеющие от 3 до 10 маркеров резистентности, в т.ч. и к фторхинолонам (ципрофлоксацину, офлоксацину и др.). Природная устойчивость возбудителей бруцеллеза и туляремии к бета-лактамным антибиотикам, цефалоспоринам и сниженная чувствительность к химиопрепаратам возбудителей сапа и мелиоидоза затрудняет выбор АБП и их комбинаций для этиотропной терапии этих инфекций. Экспериментально доказана возможность получения штаммов чумного, сибиреязвенного, туляремийного микробов, устойчивых к АБП, что делает вероятным использование таких вариантов в целях биотерроризма. В процессе лечения ООИ антибактериальными препаратами спектр и степень антибиотикорезистентности возбудителей может меняться, что требует смены АБП или их комбинаций. Вышеизложенное определяет необходимость изучения антибиотикограммы каждой выделенной культуры, постоянного эпидемиологического надзора за чувствительностью/устойчивостью выделяемых культур возбудителей ООИ. Стандартизированное определение антибиотикограммы возбудителя и ее правильная интерпретация являются основой адекватного выбора антибиотиков для целей экстренной профилактики и лечения ООИ.
5. Методы определения чувствительности возбудителей ООИ к антибактериальным препаратам
5.1. Общая характеристика методов
Для определения чувствительности возбудителей ООИ к АБП используют метод серийных разведений препаратов в плотной питательной среде (МСР) и диско-диффузионный метод (ДДМ). Мерой чувствительности бактерий при использовании МСР является минимальная концентрация (МПК) АБП, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма. В соответствии с МУК 4.2.1890-04 исследуемые микроорганизмы в результате изучения их антибиотикограмм относят к одной из трех категорий: — чувствительный — рост и размножение бактерий подавляется при концентрациях АБП, создающихся в органах и тканях человека при рекомендуемых дозах и схемах применения. Лечение инфекции, вызванной микроорганизмом, относящимся к этой категории, обычно эффективно; — промежуточный — МПК АБП в отношении штаммов этой категории выше, чем в отношении чувствительных, но находится в пределах, достигаемых при максимально допустимых режимах дозирования. Лечение инфекции, вызванной микроорганизмом, относящимся к этой категории, может быть эффективным при применении АБП в повышенных дозах, однако не исключен отбор вариантов возбудителя, характеризующегося более высоким значением МПК, сопровождающегося отсутствием эффекта антибиотикотерапии; — устойчивый — штамм не подавляется при концентрациях АБП, создающихся в органах и тканях при рекомендуемых режимах дозирования. Использование АБП, к которому культура микроорганизмов устойчива, недопустимо. Основным количественным показателем, характеризующим микробиологическую активность АБП, является значение МПК, которое может быть получено при использовании МСР. Для определения МПК заданные концентрации АБП вносят в питательную среду. Питательную среду с двукратно увеличивающимися концентрациями АБП засевают исследуемой культурой микроорганизма, посевы инкубируют при оптимальной для данного вида возбудителя температуре в течение 18-48 ч и затем оценивают наличие или отсутствие видимого роста. Для получения антибиотикограммы микроорганизмов ДДМ используют стандартизированные условия (состав и количество среды, количество засеваемых микробных клеток, температура и сроки инкубирования, стандартные диски). В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК, т.к. существует линейная связь между логарифмом МПК, измеренной при использовании МСР, и диаметром зоны задержки роста при использовании ДДМ. Для окончательной характеристики чувствительности/устойчивости культур необходимо использовать МСР АБП в плотной питательной среде для получения наиболее достоверных результатов и адекватного выбора средств специальной экстренной профилактики и этиотропной терапии эпидемически опасных инфекционных заболеваний бактериальной природы. Необходима строгая стандартизация процедуры определения антибиотикограммы, внедрение внутреннего контроля качества на всех этапах исследования, использование критериев интерпретации результатов для каждого вида возбудителя ООИ.
5.2. Выбор контрольных штаммов
Выбор референтных (контрольных) штаммов определяется видом тестируемого микроорганизма. В качестве контрольных тест-штаммов используют типичные штаммы с хорошо изученными фенотипическими характеристиками, включая чувствительность к АБП, отличающиеся генетической стабильностью. К таковым относятся вакцинные штаммы Yersinia pestis EV НИИЭГ, Francisella tularensis 15, Brucella abortus 19BA, Bacillus anthracis СТИ, а также Vibrio cholerae non O1 KM 162 (P-9741), депонированный в качестве референтного антибиотикочувствительного тест-штамма в ГК ПБ РосНИПЧИ «Микроб», типичные штаммы буркхольдерий — Burkholderia mallei NCTC 10230 и Burkholderia pseudomallei CIP 6086. Контрольные штаммы, соответствующие каждому виду возбудителей ООИ, используют на этапах предварительного изучения качества питательных сред, применяемых при определении антибиотикочувствительности, контроля активности дисков с антибиотиками и АБП, для их последующего использования в случае эпидемических осложнений (МУ 3.4.1030-01). Для внутреннего контроля качества определения антибиотикограммы используют также эталонные референс-штаммы Escherichia coli ATCC 25922 (для возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза, холеры); Staphylococcus aureus ATCC 25923 (для возбудителя сибирской язвы); Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (для возбудителей сапа и мелиоидоза). Допустимые колебания значений МПК АБП и диаметров зон ингибиции роста всех вышеперечисленных контрольных штаммов на используемых для каждого вида возбудителя питательных средах представлены в таблицах соответствующих разделов документа. Для сохранения свойств и чистоты контрольные штаммы необходимо хранить в лиофилизированном состоянии. «Рабочие» культуры хранят в пробирках на скошенном агаре или в столбиках агара, оптимального для роста каждого вида микроорганизма, при 2-8 град. C с еженедельным пересевом. Исключением является контрольный штамм Vibrio cholerae non O1 KM 162 (Р-9741), который хранится в 0,3%-ном полужидком агаре при 18-20 град. C. Перед использованием для контроля качества определения антибиотикограммы референтный штамм двукратно пересевается.
5.3. Выбор питательных сред
Для оценки чувствительности микроорганизмов к АБП используют питательные среды, разрешенные к применению в Российской Федерации, в соответствии с биологическими особенностями каждого вида изучаемого микроорганизма (Прилож. 1). Стандартной средой является агар Мюллера-Хинтона (Muller-Hinton). Каждую партию питательных сред проверяют с использованием контрольного штамма на ростовые качества для тестируемого микроорганизма (рост при высеве на чашки с агаром — не менее 30% КОЕ), а также на соответствие рекомендуемого pH с помощью pH-метра. Последнее связано с изменением активности аминогликозидов, макролидов, тетрациклинов в зависимости от pH питательной среды. Выбранную питательную среду промышленного производства готовят в колбах в строгом соответствии с инструкцией изготовителя, затем разливают в градуированные бутылки емкостью 250 мл и автоклавируют. Остуженный до 48-50 град. C агар (при необходимости в него добавляют стерильные термолабильные добавки или растворы АБП) разливают в чашки Петри. Агар разливают по 25 мл в чашки диаметром 100 мм и по 20 мл в чашки диаметром 90 мм с тем, чтобы толщина агара составляла (4 +/- 0,5) мм. Чашки оставляют для застывания при комнатной температуре. Для приготовления чашек с агаром требуется горизонтальная поверхность. Чашки после подсушивания при комнатной температуре лучше использовать немедленно, однако возможно их приготовление за 24 ч до использования при условии хранения при 4-8 град. C. Допускается подсушивание при 37 град. C в течение 15 мин. перевернутых вверх дном чашек в термостате, предварительно обработанном 70 град.-ным спиртом.
5.4. Требования к культуре, используемой для инокуляции
Исследование на чувствительность культур микроорганизмов к АБП проводится одновременно с их индикацией и/или идентификацией. Необходимо использовать только чистые культуры бактерий или (при проведении специфической индикации) материал из 2-3-х изолированных морфологически типичных колоний возбудителя в первичном посеве пробы клинического материала от больного при выраженной симптоматике инфекции (например, водянистый стул у больных с алгидной формой холеры обычно содержит чистую культуру V. cholerae, так же как и пунктат из чумного бубона и т.д.).
Суспензию микроорганизмов готовят из агаровой культуры, выращенной на неселективной питательной среде при соответствующей температуре (28, 37 град. C), оптимальной для роста данного вида бактерий. Стандартизацию суспензии проводят по оптическому стандарту мутности (ОСО) ГИСК им.
8 9 Л.А.Тарасевича на 5-10 ед., что соответствует n х 10 — 10 КОЕ/мл в зависимости от вида возбудителя. ОСО приведен в соответствие с международным стандартом мутности. Инокулюм следует использовать в течение 15 мин. после приготовления.
5.5. Выбор антибактериальных препаратов
В соответствии с нормативной документацией средствами общей экстренной профилактики инфекции бактериальной природы (до определения вида возбудителя) являются доксициклин (тетрациклин), ципрофлоксацин (офлоксацин, пефлоксацин), рифампицин и триметоприм/сульфамонометоксин (торговое название — сульфатен) или триметоприм/сульфаметоксазол (бисептол, ко-тримоксазол и др.). Специальная экстренная профилактика и этиотропная терапия инфекции проводится уже в соответствии с установленной антибиотикограммой возбудителя, включающей данные о чувствительности к антибактериальным препаратам I и II групп. К АБП I группы относят антибиотики, наиболее эффективные при данной инфекции, вызванной антибиотикочувствительными типичными штаммами возбудителя. Чувствительность к этим препаратам определяют в первую очередь для обоснования специальной экстренной профилактики и этиотропной терапии инфекции. В число таких АБП обычно включены и препараты, используемые для целей общей экстренной профилактики. К дополнительным (II группа) АБП относят антибиотики, которые могут быть альтернативой препаратам I группы в случае регистрации к ним устойчивости, а также использоваться для получения антибиотикограмм выделенных штаммов возбудителя в рамках эпидемиологического надзора за чувствительностью определенного вида микроорганизма. При составлении наборов АБП в настоящем документе учтены закономерности перекрестной резистентности бактерий к различным представителям одной группы. Так, для определения чувствительности к фторхинолонам достаточно воспользоваться только ципрофлоксацином (или офлоксацином, или пефлоксацином и др.); к цефалоспоринам III поколения — цефтриаксоном (или цефотаксимом, или цефтазидимом). Партии АБП, используемые для осуществления общей, специальной экстренной профилактики и этиотропной терапии опасных инфекционных заболеваний, должны быть предварительно изучены на соответствие заявленной и фактической антибактериальной активности методом серийных разведений препаратов в плотной питательной среде (среда Мюллера-Хинтона) с использованием референс-штаммов.
5.6. Интерпретация результатов исследования
Интерпретация результатов оценки антибиотикочувствительности микроорганизма к АБП заключается в отнесении его к одной из трех категорий: чувствительный, промежуточный, устойчивый в соответствии с критериями, разработанными для данного вида бактерий. Интерпретация проводится путем сопоставления величин МПК и (или) диаметров зон ингибиции роста, полученных в результате исследования, с пограничными значениями этих параметров для чувствительных, промежуточных и устойчивых культур изучаемого вида возбудителя. Приведенные в МУК 4.2.1890-04 критерии интерпретации результатов определения чувствительности микроорганизмов III-IV групп патогенности к АБП разработаны на основе микробиологических, фармакокинетических, фармакодинамических факторов и клинических наблюдений. В настоящем документе проведена адаптация этих критериев к интерпретации результатов определения антибиотикограмм возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, холеры, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза. Изменение пограничных значений МПК и диаметров зон ингибиции роста бактерий для некоторых АБП явилось результатом сравнительного изучения данных in vitro, эффективности in vivo (экспериментальные модели инфекций), диапазонов значений МПК и диаметров зон ингибиции роста для 20-75 штаммов каждого вида микроорганизма, а также клинических наблюдений в практике противочумных учреждений и анализа данных современной отечественной и зарубежной литературы. Клинически ориентированные категории чувствительности и устойчивости бактерий к АБП не всегда коррелируют с микробиологическими, в связи с чем необходим бактериологический контроль эффективности этиотропной терапии инфекции у каждого пациента даже в случае улучшения симптоматики заболевания (через 2-3 сут. на фоне лечения).
5.7. Метод серийных разведений в агаре
Важным этапом МСР является приготовление растворов АБП. Растворы с высокими концентрациями препаратов (100000-10000-1000 мг/л) являются основными и могут храниться при 2-8 град. C в течение недели. Исключением являются растворы тетрациклинов, беталактамов, фуразолидона, сульфаниламидов, которые необходимо использовать ex tempore для внесения в питательные среды в необходимых концентрациях. Для приготовления основных растворов используют субстанции АБП с известной активностью. При отсутствии субстанций в экстренных случаях допускается использование препаратов в виде мелкодисперсных порошков, инъекционных форм препаратов. АБП взвешивают на электронных лабораторных весах с точностью до 4-го знака. Объем растворителя должен соответствовать количеству активного вещества в навеске. Расчет навески АБП для приготовления основного раствора проводят по формуле:
С х V теор. m АБ = ----------, теор. А
где:
m АБ - расчетная (теоретическая) навеска АБП, мг; теор. С - необходимая концентрация АБП, мкг/мл; V - объем растворителя для растворения теоретической навески, мл; теор.
А — активность АБП (количество активного вещества, содержащегося в субстанции), мкг/мг.
Взвесить точно расчетное количество порошка практически невозможно. Поэтому готовят близкую к расчетной навеску, а затем пересчитывают количество необходимого растворителя.
m АБ х V (мл) практ. теор. V = ------------------------, практ. m АБ (мг) теор.
где:
V - объем растворителя для растворения практической навески, мл; практ. m АБ - полученная навеска АБП, мг; практ. m АБ - расчетная (теоретическая) навеска АБП, мг; теор. V - объем растворителя для растворения теоретической навески, мл. теор.
Различия в растворимости АБП определяют необходимость использования растворителей (солюбилизаторов) в минимальном объеме и необходимого количества разбавителя (дистиллированная вода). Для растворения тетрациклинов, рифампицина, фуразолидона используют димексид, левомицетин растворяют в 96 град.-ном спирте. Приготовление основных растворов налидиксовой кислоты и фторхинолонов проводят в 1/2 от необходимого объема дистиллированной воды добавлением по капле 0,1 М КОН до полного растворения препаратов с последующим доведением растворителя до расчетного объема. Растворителем и разбавителем для других АБП служит дистиллированная вода. Для измерения объемов растворов антибиотиков используют калиброванные дозаторы и пипетки. Рабочие растворы АБП готовят на дистиллированной воде в концентрациях, необходимых для внесения в расплавленный и остуженный (до 48-50 град. C) агар (20 мл на одну чашку Петри) для создания в нем двукратно увеличивающихся концентраций (например: 1-2-4-8-16-32 мг/л) препарата в соответствии с пограничными значениями МПК для чувствительных и устойчивых штаммов данного вида микроорганизма. В зависимости от необходимого количества чашек Петри с каждой из концентраций АБП используют мерные широкогорлые флаконы на 50-100 мл, в которые наливают агар в объеме 20-40 мл и т.д. и добавляют раствор АБП (начиная с наименьшей концентрации), интенсивно размешивают и выливают в чашки Петри, на которых указана концентрация АБП. Контролем служит агаровая чашка без АБП. После застывания агара в чашках и их подсушивания на дне чашки делают надписи: дата посева, вид возбудителя, номер исследуемых культур. Испытуемые суспензии культур наносят на поверхность питательного агара без АБП (контроль) и с АБП (начиная с наименьшей концентрации) каплями легким касанием пипетки (~ 0,005 мл) или с помощью штампа-репликатора (~ 0,001 мл). Одновременно можно изучать до 25-50 культур, обязательно включая контрольные референс-штаммы, что обеспечивает достоверность данных антибиотикограммы. После полного впитывания капель суспензий в агар чашки переворачивают вверх дном и инкубируют при оптимальной для данного возбудителя температуре (28, 37 град. C) в течение 18-48 ч. Учет результатов проводят после появления роста тестируемых культур на агаре без АБП и при условии, что значения МПК для контрольных штаммов укладываются в рекомендуемый диапазон значений этого показателя для испытуемых АБП (таблицы в соответствующих разделах). Минимальная подавляющая концентрация (МПК) — это концентрация АБП в агаре, которая полностью подавляет рост культуры. По значению МПК исследуемая культура может быть отнесена к чувствительной, промежуточной, устойчивой в соответствии с критериями для изучаемого вида возбудителя (таблицы в соответствующих разделах).
5.8. Диско-диффузионный метод
Проверенный на пригодность с использованием эталонных антибиотикочувствительных штаммов питательный агар (приготовленный, расплавленный, остуженный, как указано ранее) разливают в чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности, в объеме 20 мл на чашку диаметром 90 мм, 25 мл — на чашку диаметром 100 мм, 60 мл — на чашку диаметром 150 мм. Толщина слоя агара должна составлять строго (4 +/- 0,5) мм. Эти требования следует выполнять обязательно, т.к. зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя. Перед использованием свежеприготовленных чашек или после хранения в холодильнике (7-10 сут. в запаянных полиэтиленовых пакетах) их необходимо подсушить при 37 град. C (в течение 15 мин.). При определении чувствительности культур микроорганизмов с помощью ДДМ необходимо использовать только стандартизированные качественные диски производственного изготовления. Каждую серию дисков с АБП контролируют с помощью референс-штаммов на соответствие заявленным концентрациям на питательной среде, прошедшей контроль качества. Диски, дающие диаметры зон ингибиции роста большие, чем допустимый диапазон значений для референс-культуры, выбраковываются, т.к. их использование может привести к отнесению антибиотикорезистентных штаммов к разряду чувствительных. Проверенные на пригодность серии дисков с АБП хранятся до истечения срока годности в герметичной упаковке при -18 град. C и ниже. Используемые в работе диски можно хранить в холодильнике (4-8 град. C). Картриджи должны быть плотно упакованными, чтобы не допустить попадания в них влаги. Флаконы с дисками (картриджи) следует извлекать из холодильника за 1 ч до начала работы и открывать только по достижении ими комнатной температуры, предотвращая тем самым образование конденсата влаги на дисках после открывания картриджа. Бактериальную суспензию необходимой концентрации наносят на агаровую чашку Петри в объеме 0,2-0,3 мл и распределяют равномерно по поверхности с помощью стерильного шпателя. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин. и затем наносят диски (не более 6 на чашку). Диски наносят стерильным пинцетом и слегка придавливают. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно составлять 15-20 мм. Чашки с посевом без дисков (контроль роста культуры) и с дисками инкубируют вверх дном 18-48 ч при температуре, оптимальной для роста изучаемого вида возбудителя (28, 37 град. C). Параллельно с тестируемыми культурами необходимо проводить внутренний контроль качества исследования — определение чувствительности референс-штамма к используемым АБП. Учет результатов проводится только при наличии сливного роста культуры на чашках без дисков и соответствия величин зон ингибиции роста контрольных штаммов значениям, приведенным в соответствующих таблицах. Измерение диаметров зон полного подавления видимого роста производят кронциркулем, штангенциркулем, с помощью линейки-лекала (с точностью до 1 мм) на чашках, помещенных кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом 45 град. Появление колоний в зоне задержки роста микроорганизмов может свидетельствовать или о загрязнении культуры посторонней микрофлорой, или о гетерогенности тестируемой культуры по признаку чувствительности/устойчивости к данному антибиотику. И в одном, и в другом случае исследование необходимо повторить с изучением чувствительности к АБП культур из колоний (если это не загрязнение), выросших в пределах диаметра зоны ингибиции роста. Интерпретацию результатов исследования следует провести с использованием таблиц, в которых даны пограничные значения диаметров зон ингибиции роста исследуемого микроорганизма конкретным АБП (разделы 6, 7, 8, 9, 10, 11). В паспорт каждой выделенной культуры необходимо вносить не только значения МПК, диаметров зон задержки роста, но и интерпретацию результатов исследований: штамм чувствительный, промежуточный или устойчивый.
6. Определение чувствительности чумного микроба (Yersinia pestis) к антибактериальным препаратам
6.1. Контрольные штаммы
Для стандартизации определения антибиотикограммы возбудителя чумы в качестве контрольных штаммов могут быть использованы: 1) вакцинный штамм чумного микроба — Yersinia pestis EV НИИЭГ, чувствительный к антибактериальным препаратам; 2) референс-штамм Escherichia coli ATCC 25922, рекомендованный для определения антибиотикочувствительности бактерий семейства Enterobacteriaceae, к которому относится и возбудитель чумы.
6.2. Питательные среды
Для определения чувствительности чумного микроба к антибактериальным препаратам МСР и ДДМ могут быть использованы: 1) агар Мюллера-Хинтона (Muller-Hinton), pH 7,3 +/- 0,2; 2) агар Хоттингера pH 7,2 +/- 0,1 (1,2-1,4 г/л аминного азота). Для ДДМ дополнительно можно использовать агар Гивенталя-Ведьминой (АГВ), pH 7,4 +/- 0,2. Каждая серия питательного агара перед использованием для определения антибиотикограммы возбудителя чумы должна быть проверена с использованием контрольных штаммов и АБП. Допустимые колебания значений МПК и диаметров зон ингибиции роста для контрольных штаммов представлены в табл. 6.1 и 6.2.
6.3. Антибактериальные препараты
Для определения антибиотикограммы чумного микроба, выделенного в природном очаге чумы или от больного, используют антибактериальные препараты, рекомендованные МУ 3.4.1030-01 для экстренной профилактики и лечения этой инфекции. Для МСР в плотной питательной среде выбирают серии двукратно увеличивающихся концентраций антибактериальных препаратов в соответствии с пограничными значениями МПК для чувствительных и устойчивых культур чумного микроба. Препараты первого ряда:
Стрептомицин 4 — 8 — 16 — 32 — 64 мг/л
Амикацин 4 — 8 — 16 — 32 — 64 мг/л
Гентамицин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л
Доксициклин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л
Ципрофлоксацин (или офлоксацин, пефлоксацин, ломефлоксацин, левофлоксацин) 0,06 — 0,125 — 0,25 — 0,5 — 1,0 мг/л Цефтриаксон (или цефотаксим) 0,5 — 1 — 2 — 4 мг/л Рифампицин 2 — 4 — 8 — 16 — 32 мг/л
Триметоприм/сульфаметоксазол 1 — 2 — 4 — 8 мг/л (по триметоприму). Препараты второго ряда:
Канамицин 4 — 8 — 16 — 32 — 64 мг/л
Нетилмицин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л
Тобрамицин 4 — 8 — 16 — 32 мг/л
Тетрациклин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л
Ампициллин 4 — 8 — 16 — 32 мг/л
Цефтазидим (или цефтибутен, цефиксим, цефепим) 0,5 — 1 — 2 — 4 мг/л Азтреонам 0,5 — 1 — 2 — 4 — 8 мг/л
Налидиксовая кислота 4 — 8 — 16 — 32 мг/л Левомицетин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л.
Налидиксовая кислота не рекомендуется для экстренной профилактики и лечения чумы, однако устойчивость чумного микроба к этому препарату может сопровождаться снижением эффективности фторхинолонов при сохранении к ним чувствительности in vitro. С целью экономии времени и средств для проведения исследования МСР могут применяться штампы-репликаторы, позволяющие изучить антибиотикограммы 25-50-ти штаммов одновременно с введением в исследование контрольного антибиотикочувствительного штамма, что повышает достоверность получаемых результатов. Для постановки ДДМ используют проверенные (на предварительно прошедшей контроль серии питательной среды) коммерческие диски с определенными концентрациями АБЦ (табл. 6.2).
6.4. Посевная доза, инокуляция, инкубация
При определении чувствительности возбудителя чумы к антибактериальным препаратам с помощью ДДМ используют суспензию микробных клеток из суточной агаровой культуры в 0,85%-ном изотоническом растворе хлорида натрия, стандартизированную по отраслевому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.
8 8 Тарасевича на 5 ед. — 5 х 10 м.к. (~ 1,5 х 10 КОЕ/мл). Суспензию наносят
7 на поверхность агара в объеме 0,2 мл (n х 10 КОЕ), равномерно распределяют стерильным шпателем. Через 10-15 мин. накладывают диски (не более шести на чашку диаметром 100 мм). Посевы инкубируют при 28 град. C. Предварительный учет проводят через 24 ч, окончательный — через 48 ч. Результаты учитывают при появлении сливного роста на контрольных чашках (без дисков). Диаметры зон задержки роста культуры вокруг дисков, включая диаметр самого диска, измеряют с точностью до 1 мм штангенциркулем, кронциркулем или специальной линейкой-лекалом.
8 Для МСР используют суспензию той же концентрации 5 х 10 м.к. (~ 1,5 х 8
10 КОЕ/мл), нанося небольшими каплями с помощью штампа-репликатора или касанием пипетки с тонким концом на чашки с питательной средой, содержащей различные концентрации антибактериальных препаратов, начиная с чашек,
5 содержащих минимальное количество антибиотиков. Посевная доза — n х 10 — 6
10 КОЕ. Посевы инкубируют при температуре 28 град. C. Учет через 36-48 ч. Чувствительность/устойчивость культур определяют по минимальной концентрации препарата, подавляющей рост возбудителя (МПК, мг/л) на среде культивирования при наличии роста в контроле (агар без антибиотика).
6.5. Критерии оценки чувствительности/устойчивости чумного микроба к антибактериальным препаратам
Интерпретацию результатов определения чувствительности штаммов чумного микроба проводят в соответствии с пограничными значениями МПК и диаметров зон подавления роста для чувствительных и устойчивых культур возбудителя (табл. 6.3). Между этими показателями находятся значения МПК для штаммов с промежуточной устойчивостью. Кроме того, сравнивают полученные результаты с одновременным определением МПК и диаметров зон подавления роста контрольных штаммов — Y. pestis EV НИИЭГ и E. coli ATCC 25922 (табл. 6.1, 6.2), а также с диапазонами значений для 75-ти антибиотикочувствительных штаммов Y. pestis, включающих 25 культур, выделенных в зоне действия Иркутского НИПЧИ в 2006 г. (табл. 6.4).
Таблица 6.1
ДОПУСТИМЫЕ КОЛЕБАНИЯ ЗНАЧЕНИЙ МПК АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ КОНТРОЛЬНЫХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI ATCC 25922 И YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ
Антибактериаль- Диапазон значений МПК, мг/л ный препарат
агар Мюллера-Хинтона агар Хоттингера pH 7,3 +/- 0,2 pH 7,2 +/- 0,1 E. coli ATCC Y. pestis EV E. coli ATCC Y. pestis EV 25922 НИИЭГ 25922 НИИЭГ 1 2 3 4 5 Стрептомицин 1-4 2-8 1-4 1-8 Канамицин 1-4 2-8 1-4 2-8 Амикацин 0,5-4,0 2-8 0,5-4,0 2-8 Гентамицин 0,25-1,0 0,25-2,0 0,25-1,0 0,25-1,0 Нетилмицин 0,25-1,0 0,25-2,0 0,25-1,0 0,25-1,0 Тобрамицин 0,25-1,0 0,5-2,0 0,25-1,0 0,25-1,0 Тетрациклин 0,5-2,0 0,5-2,0 0,5-2,0 0,5-2,0 Доксициклин 0,5-2,0 0,25-1,0 0,5-2,0 0,25-1,0 Левомицетин 2-8 1-4 2-8 1-4 Рифампицин 4-16 1-4 4-16 1-4 Ампициллин 2-8 0,5-1,0 2-8 0,5-1,0 Цефтриаксон 0,03-0,12 0,01-0,02 0,03-0,12 0,01-0,02 Цефотаксим 0,03-0,12 0,01-0,02 0,03-0,12 0,01-0,02 Цефтибутен 0,12-0,5 0,01-0,02 0,12-0,5 0,01-0,02 Цефтазидим 0,06-0,5 0,02-0,08 0,06-0,5 0,02-0,08 Цефиксим 0,25-1,0 0,08-0,16 0,25-1,0 0,08-0,16 Цефепим 0,016-0,12 0,02-0,04 0,016-0,12 0,02-0,04 Азтреонам 0,06-0,25 0,01-0,02 0,06-0,25 0,01-0,02 Налидиксовая 1-4 0,5-2,0 1-4 0,5-2,0
кислота
Ципрофлоксацин 0,004-0,016 0,01-0,02 0,004-0,016 0,01-0,04
Офлоксацин 0,015-0,12 0,005-0,01 0,015-0,12 0,005-0,01
Пефлоксацин 0,03-0,12 0,02-0,08 0,03-0,12 0,02-0,04
Ломефлоксацин 0,03-0,12 0,01-0,08 0,03-0,12 0,01-0,08
Левофлоксацин 0,008-0,06 0,005-0,01 0,008-0,06 0,005-0,01
Триметоприм/ 0,5/9,5-2/38 1/19-2/38 0,5/9,5-2/38 1/19-2/38 сульфаметоксазол
Таблица 6.2
ДОПУСТИМЫЕ КОЛЕБАНИЯ ЗНАЧЕНИЙ ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ДЛЯ КОНТРОЛЬНЫХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI ATCC 25922 И YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ
Антибактери- Содер- Диаметр зон подавления роста, мм альный жание препарат препа- агар агар Хоттингера АГВ рата в Мюллера-Хинтона pH 7,2 +/- 0,1 pH 7,4 +/- 0,2 диске, pH 7,3 +/- 0,2 мкг Е coli Y. pestis E. coli Y. pestis E. coli Y. pestis ATCC EV НИИЭГ ATCC EV НИИЭГ ATCC EV НИИЭГ 25922 25922 25922 1 2 3 4 5 6 7 8
Стрептомицин 30 17-25 17-23 17-25 19-25 17-25 19-26
Канамицин 30 17-25 18-23 17-25 19-25 17-25 19-26
Амикацин 30 19-26 19-23 19-26 20-26 19-26 20-30
Гентамицин 10 19-26 20-27 19-26 22-27 19-26 25-30
Нетилмицин 30 22-30 25-30 22-30 25-30 22-30 30-40
Тобрамицин 10 18-26 18-26 18-26 25-30 18-26 25-33
Тетрациклин 30 18-25 20-27 18-25 20-27 18-25 20-27
Доксициклин 10 18-24 20-27 18-24 20-27 18-24 20-27
Левомицетин 30 21-27 25-33 21-27 25-33 21-27 25-33
Рифампицин 5 8-10 15-22 8-10 15-20 8-10 15-20
Ампициллин 10 16-22 23-28 16-22 23-28 13-20 25-33
Цефтриаксон 30 29-35 30-40 29-35 30-40 29-35 30-40
Цефотаксим 30 29-35 30-40 29-35 30-40 29-35 30-40
Цефтибутен 30 27-35 30-40 27-35 35-45 27-35 30-40
Цефтазидим 30 25-32 28-35 25-32 30-35 25-32 30-35
Цефиксим 5 23-27 28-35 23-27 30-35 23-27 30-35
Цефепим 30 31-37 31-40 31-37 31-40 31-37 31-37
Азтреонам 30 28-36 29-37 28-36 30-36 28-36 30-35
Налидиксовая 30 22-28 28-35 22-28 30-35 22-28 28-35 кислота
Ципрофлокса- 5 30-40 30-35 30-40 30-35 30-40 30-35 цин
Офлоксацин 5 29-33 29-35 29-33 30-35 29-33 29-35
Пефлоксацин 10 28-35 29-35 28-35 29-35 28-35 30-35
Ломефлокса- 10 27-33 30-37 27-33 30-37 27-33 30-37 цин
Левофлокса- 5 29-37 30-40 29-37 30-40 29-37 30-40 цин
Триметоприм/ 1,25/ 23-29 23-28 23-29 23-28 23-29 23-28 сульфамето- 23,75 ксазол
Таблица 6.3
КРИТЕРИИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ YERSINIA PESTIS: ПОГРАНИЧНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА (ММ) И ВЕЛИЧИН МПК (МГ/Л) АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Антибактериальный Содержа- Диаметр зон Значение МПК, мг/л препарат ние в подавления роста, диске, мм мкг S R S R 1 2 3 4 5 6 Стрептомицин 30 >= 18 <= 13 <= 16 >= 64 Канамицин 30 >= 18 <= 13 <= 16 >= 64 Амикацин 30 >= 17 <= 14 <= 16 >= 64 Гентамицин 10 >= 17 <= 14 <= 4 >= 16 Нетилмицин 30 >= 19 <= 14 <= 4 >= 16 Тобрамицин 10 >= 17 <= 14 <= 8 >= 32 Тетрациклин 30 >= 19 <= 14 <= 4 >= 16 Доксициклин 10 >= 19 <= 14 <= 4 >= 16 Левомицетин 30 >= 19 <= 14 <= 4 >= 16 Рифампицин 5 >= 15 <= 13 <= 4 >= 32 Ампициллин 10 >= 19 <= 14 <= 8 >= 32 Цефтриаксон 30 >= 25 <= 20 <= 1 >= 4 Цефотаксим 30 >= 25 <= 20 <= 1 >= 4 Цефтибутен 30 >= 25 <= 20 <= 1 >= 4 Цефтазидим 30 >= 25 <= 20 <= 1 >= 4 Цефиксим 5 >= 25 <= 20 <= 1 >= 4 Цефепим 30 >= 25 <= 20 <= 1 >= 4 Азтреонам 30 >= 23 <= 17 <= 1 >= 8 Налидиксовая 30 >= 25 <= 20 <= 8 >= 32
кислота
Ципрофлоксацин 5 >= 25 <= 19 <= 0,1 >= 1
Офлоксацин 5 >= 25 <= 19 <= 0,1 >= 1
Пефлоксацин 10 >= 22 <= 17 <= 0,2 >= 2
Ломефлоксацин 10 >= 22 <= 17 <= 0,1 >= 1
Левофлоксацин 5 >= 22 <= 17 <= 0,1 >= 1
Триметоприм/ 1,25/ >= 21 <= 16 <= 2/38 >= 8/152 сульфаметоксазол 23,75 Примечание: S - чувствительный; R - устойчивый; значения МПК для штаммов
с промежуточной устойчивостью находятся между значениями для S и R культур.
Таблица 6.4
ДИАПАЗОН ЗНАЧЕНИЙ МПК АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ И ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ДЛЯ 75-ТИ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS
Антибактери- Содер- Диаметр зон подавления Значение МПК, мг/л альный жание роста, мм препарат препа- рата в агар агар АГВ агар агар диске, Мюллера- Хоттингера pH 7,4 Мюллера- Хоттингера мкг Хинтона pH 7,2 +/- 0,2 Хинтона pH 7,2 +/- pH 7,3 +/- 0,1 pH 7,3 +/- 0,1 +/- 0,2 0,2 1 2 3 4 5 6 7 Стрептомицин 30 18-24 20-27 20-25 2-8 1-8 Канамицин 30 18-24 20-27 25-30 2-8 2-8 Амикацин 30 20-26 22-30 25-30 2-8 2-8 Гентамицин 10 20-28 25-30 25-30 0,25-2 0,25-1 Нетилмицин 30 25-30 27-33 30-35 0,25-2 0,25-1 Тобрамицин 10 20-28 25-30 25-30 0,25-2 0,25-1 Тетрациклин 30 21-28 23-28 20-27 0,5-4 0,5-4 Доксициклин 10 20-28 20-27 20-27 0,25-1 0,25-1 Левомицетин 30 25-33 23-30 25-33 1-4 1-4 Рифампицин 5 15-22 15-20 15-20 1-4 1-4 Ампициллин 10 23-28 23-28 25-33 0,5-1,0 0,5-1,0 Цефтриаксон 30 30-40 30-40 30-40 0,005-0,02 0,005-0,02 Цефотаксим 30 30-40 30-40 30-40 0,005-0,02 0,005-0,02 Цефтибутен 30 30-40 35-45 35-40 0,01-0,02 0,01-0,02 Цефтазидим 30 28-35 30-35 30-35 0,02-0,08 0,02-0,08 Цефиксим 5 28-35 30-35 30-35 0,08-0,16 0,08-0,16 Цефепим 30 31-40 31-40 31-35 0,01-0,04 0,01-0,04 Азтреонам 30 29-35 30-35 30-35 0,01-0,02 0,01-0,02 Налидиксовая 30 30-35 30-35 30-35 0,5-2,0 0,5-2,0
кислота
Ципрофлокса- 5 30-40 30-40 30-40 0,01-0,04 0,01-0,04 цин
Офлоксацин 5 29-35 30-35 29-35 0,005-0,01 0,0025-0,01
Пефлоксацин 10 29-35 29-38 22-33 0,02-0,08 0,01-0,04
Ломефлокса- 10 28-34 30-40 27-37 0,01-0,08 0,01-0,08 цин
Левофлокса- 5 29-35 30-35 30-35 0,005-0,01 0,005-0,01 цин
Триметоприм/ 1,25/ 21-27 23-28 30-35 1/19-2/38 1/19-2/38 сульфамето- 23,75 ксазол
7. Определение чувствительности возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis) к антибактериальным препаратам
7.1. Контрольные штаммы
Для контроля точности и стандартности проведения исследования в каждом опыте необходимо использовать тест-культуру с известной чувствительностью к антибиотикам. Национальный Комитет Клинических Лабораторных Стандартов (NCCLS) рекомендует для этой цели использовать Staphylococcus aureus ATCC 25923. В качестве контрольного должен быть использован и вакцинный штамм B. anthracis СТИ, применяемый для иммунизации людей, основные биологические свойства которого, в т.ч. и антибиотикочувствительность, изучены наиболее полно.
7.2. Питательные среды
Для определения чувствительности B. anthracis к антибактериальным препаратам обоими методами (МСР и ДДМ) может быть использован агар Мюллера-Хинтона (pH 7,3 +/- 0,2) или агар Хоттингера (pH 7,2 +/- 0,1). Агар Гивенталя-Ведьминой (АГБ) для ДДМ используется только в случае отсутствия других питательных сред. Допустимые колебания значений МПК и диаметров зон ингибиции роста для контрольных штаммов представлены в табл. 7.1 и 7.2.
7.3. Антибактериальные препараты
Для определения чувствительности B. anthracis используют АБП, рекомендуемые для экстренной профилактики и лечения сибирской язвы. Препараты первого ряда, к которым в первую очередь определяют чувствительность сибиреязвенного микроба при выделении возбудителя от больного: бензилпенициллин, ампициллин, доксициклин, тетрациклин, ципрофлоксанин (или офлоксацин, пефлоксацин), рифампицин. В последние годы широкое применение получили антибиотики класса карбапенемов — меропенем, имипенем. Изучение чувствительности сибиреязвенного микроба к данным антибиотикам позволило рекомендовать эту группу препаратов для лечения септической формы сибирской язвы и в случае экстренной профилактики при ингаляционном заражении. К препаратам второго ряда относят антибиотики группы аминогликозидов, цефалоспоринов, макролидов. Следует отметить, что сибиреязвенный микроб чувствителен только к цефалоспоринам (ЦФ) I поколения (цефазолин и др.), тогда как к ЦФ II-IV поколения (цефуроксим, цефтазидим, цефтриаксон, цефотаксим) устойчив. Для МСР в плотной питательной среде выбирают серии двукратно увеличивающихся концентраций антибактериальных препаратов в соответствии с пограничными значениями МПК для чувствительных и устойчивых культур сибиреязвенного микроба на агаре Мюллера-Хинтона или агаре Хоттингера (табл. 7.3). Препараты первого ряда:
Ампициллин (или бензилпенициллин) 0,06 — 0,125 — 0,25 — 0,5 — 1 мг/л Доксициклин (или тетрациклин) 0,06 — 0,125 — 0,25 — 0,5 — 1 мг/л Ципрофлоксацин (или офлоксацин, пефлоксацин) 0,06 — 0,125 — 0,25 — 0,5 — 1 мг/л Рифампицин 0,06 — 0,125 — 0,25 — 0,5 — 1 мг/л Меропенем (или имипенем) 0,06 — 0,125 — 0,25 — 0,5 — 1 мг/л/ Препараты второго ряда:
Цефазолин (или цефалексин) 0,125 — 0,25 — 0,5 — 1 мг/л Эритромицин (или азитромицин) 0,5 — 1 — 2 — 4 мг/л Линкомицин 0,5 — 1 — 2 — 4 мг/л
Канамицин (или гентамицин, амикацин, стрептомицин) 0,25 — 0,5 — 1 — 2 — 4 мг/л. Для постановки ДДМ используют коммерческие диски с определенными концентрациями антибактериальных препаратов (табл. 7.3).
7.4. Посевная доза, инокуляция, инкубация
При определении чувствительности сибиреязвенного микроба с помощью ДДМ для посева используют типичные колонии из 16-18 ч. агаровых культур. Из выросших колоний готовят взвесь микробов в 0,85%-ном растворе хлорида натрия, доводя плотность инокулюма до 10 ед. по стандарту мутности ГИСК им.
7 Л.А.Тарасевича, что соответствует ~ 2 х 10 КОЕ/мл. Эту взвесь в объеме
6
0,3 мл (~ 6 х 10 КОЕ) наносят на поверхность питательной среды и равномерно распределяют шпателем. Чашки выдерживают 15 мин. при комнатной температуре для впитывания суспензии. Затем диски накладывают стерильным пинцетом на поверхность засеянной питательной среды на одинаковом расстоянии один от другого, отступив около 2 см от стенки чашки (не более 4 дисков на чашку диаметром 90-100 мм). Вновь выдерживают 15 мин. при комнатной температуре, а затем, перевернув чашки с посевами вверх дном, инкубируют при 37 град. C в течение 18-20 ч (не более). Измеряют диаметр зон задержки роста вокруг дисков, включая диаметр самого диска, с точностью до 1 мм. При расплывчатых краях зоны или при зонах с двойными контурами измеряют диаметр зоны по наиболее четкой границе. Для интерпретации полученных результатов пользуются табл. 7.3.
Для МСР используют суспензию той же концентрации микробных клеток, нанося небольшими каплями с помощью штампа-репликатора или касанием пипетки с тонким концом на агаровые пластинки с разными концентрациями антибактериальных препаратов, начиная с чашек с минимальным содержанием
4 5 антибиотиков. Посевная доза составляет ~ n х 10 — 10 КОЕ соответственно. Посевы инкубируют 18-24 ч при температуре 37 град. C. Чувствительность/ устойчивость культур определяют по минимальной концентрации препарата, подавляющей рост возбудителя (МПК, мг/л) на среде культивирования.
7.5. Критерии оценки чувствительности/устойчивости сибиреязвенного микроба к антибактериальным препаратам
Интерпретацию результатов определения чувствительности культур сибиреязвенного микроба проводят путем сопоставления их с пограничными значениями МПК и диаметров зон подавления роста возбудителя (табл. 7.3), адаптированными для сибиреязвенного микроба и выбранными с учетом диапазона значений МПК для 50-ти штаммов B. anthracis (табл. 7.4), соотнесения данных in vitro с эффективностью in vivo и значений терапевтического индекса, рассчитанных на основании концентраций антибиотика в организме при введении терапевтических доз в сопоставлении с МПК. Для адаптации использованы критерии чувствительности/устойчивости бактерий семейства Staphylococcus spp., представленные в МУК 4.2.1890-04. В табл. 7.3 даны пограничные значения МПК и зон подавления роста для чувствительных и устойчивых культур. Между этими показателями находятся значения для культур с промежуточной устойчивостью. Необходимо учитывать результаты определения МПК и зон подавления роста для контрольных штаммов B. anthracis СТИ и S. aureus ATCC 25923 на данной серии питательной среды. Изменения МПК и диаметров зон подавления роста для контрольных штаммов, выходящие за пределы допустимых значений (табл. 7.1 и 7.2), могут свидетельствовать о несоответствии качества сред или дисков с антибактериальными препаратами и потребовать их замены. Увеличение МПК для исследуемых штаммов по сравнению с контрольным штаммом B. anthracis СТИ может свидетельствовать о тенденции к нарастанию устойчивости культур, что требует изменения схемы терапии данным антибиотиком или использования для лечения и профилактики другого, более эффективного антибактериального препарата.
Таблица 7.1
ДОПУСТИМЫЕ КОЛЕБАНИЯ ЗНАЧЕНИЙ МПК АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ КОНТРОЛЬНЫХ ШТАММОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 25923 И BACILLUS ANTHRACIS СТИ
Антибактериальный Диапазон значений МПК, мг/л препарат агар Мюллера-Хинтона агар Хоттингера pH 7,3 +/- 0,2 pH 7,2 +/- 0,1 S. aureus B. anthracis S. aureus B. anthracis ATCC 25923 СТИ ATCC 25923 СТИ 1 2 3 4 5
Бензилпенициллин 0,008-0,128 0,002-0,016 0,008-0,128 0,002-0,004
Ампициллин 0,05-0,1 0,008-0,064 0,05-0,1 0,008-0,016
Цефазолин 0,25-0,5 0,125-0,25 0,25-0,5 0,06-0,12
Цефалексин 0,25-1,0 0,25-0,5 0,25-1,0 0,25-1,0
Эритромицин 0,25-1,0 0,25-0,5 0,25-1,0 0,5-1,0
Азитромицин 0,5-2,0 0,5-1,0 0,5-2,0 0,5-2,0
Линкомицин 0,125-0,25 1,0-4,0 0,125-0,25 1,0-2,0
Канамицин 0,25-1,0 0,06-0,12 0,5-1,0 0,06-0,24
Гентамицин 0,03-0,06 0,03-0,12 0,06-0,12 0,03-0,06
Стрептомицин 0,06-0,12 0,06-0,12 0,06-0,12 0,06-0,12
Амикацин 0,5-1,0 0,125-0,25 0,5-1,0 0,125-0,25
Тетрациклин 0,03-0,06 0,008-0,016 0,06-0,12 0,008-0,016
Доксициклин 0,008-0,016 0,008-0,016 0,03-0,06 0,008-0,016
Рифампицин 0,008-0,064 0,008-0,064 0,008-0,064 0,008-0,064
Ципрофлоксацин 0,004-0,016 0,004-0,016 0,004-0,016 0,004-0,016
Офлоксацин 0,125-0,25 0,05-0,1 0,125-0,25 0,05-0,1
Пефлоксацин 0,125-0,25 0,05-0,1 0,125-0,25 0,05-0,1
Ломефлоксацин 0,125-0,5 0,05-0,1 0,125-0,5 0,05-0,1
Меропенем 0,008-0,032 0,002-0,008 0,008-0,032 0,002-0,008
Имипенем 0,008-0,032 0,002-0,008 0,008-0,032 0,002-0,008
Таблица 7.2
ДОПУСТИМЫЕ КОЛЕБАНИЯ ЗНАЧЕНИЙ ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ДЛЯ КОНТРОЛЬНЫХ ШТАММОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 25923 И BACILLUS ANTHRACIS СТИ
Антибактери- Содер- Диаметр зон подавления роста, мм альный жание препарат препа- агар агар Хоттингера АГВ рата в Мюллера-Хинтона pH 7,2 +/- 0,1 pH 7,4 +/- 0,2 диске, pH 7,3 +/- 0,2 мкг S. aureus B. an- S. aureus B. an- S. aureus B. an- ATCC thracis ATCC thracis ATCC thracis 25923 СТИ 25923 СТИ 25923 СТИ 1 2 3 4 5 6 7 8 Бензилпеницил- 10 26-37 32-39 26-37 34-40 26-30 32-39
лин
Ампициллин 10 27-35 27-35 27-35 27-35 27-35 27-32
Цефазолин 30 29-35 29-35 29-35 29-35 29-35 29-35
Цефалексин 30 29-37 29-35 29-37 29-33 29-35 29-35
Эритромицин 15 22-30 18-24 22-30 18-24 22-30 18-24
Азитромицин 30 24-30 24-30 24-30 24-30 21-26 21-26
Линкомицин 15 22-32 22-30 22-32 22-30 22-32 22-30
Канамицин 30 19-26 22-30 19-26 22-30 19-26 19-26
Гентамицин 10 19-27 24-32 19-27 24-30 19-27 24-30
Стрептомицин 10 18-22 18-30 18-22 18-30 18-22 19-29
Амикацин 30 20-26 26-32 20-26 26-32 20-26 20-26
Тетрациклин 30 24-30 30-40 24-30 30-40 24-30 30-35
Доксициклин 10 23-29 30-40 23-29 30-40 23-29 27-32
Рифампицин 5 26-34 20-26 26-34 20-26 26-34 19-22
Ципрофлоксацин 5 22-30 27-35 22-30 27-35 22-30 25-30
Офлоксацин 5 24-28 27-35 24-28 27-35 24-28 23-30
Пефлоксацин 10 17-28 27-35 17-28 27-35 17-28 22-30
Ломефлоксацин 10 23-29 27-35 23-29 27-35 23-29 22-30
Меропенем 10 29-37 30-37 29-37 30-37 27-35 27-30
Таблица 7.3
КРИТЕРИИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ BACILLUS ANTHRACIS: ПОГРАНИЧНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА (ММ) И ВЕЛИЧИН МПК (МГ/Л) АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Антибактериальный Содержа- Диаметр зон Значение МПК, мг/л препарат ние пре- подавления роста, парата в мм диске, мкг S R S R 1 2 3 4 5 6 Бензилпенициллин 10 >= 26 <= 16 <= 0,1 >= 1,0 Ампициллин 10 >= 27 <= 16 <= 0,1 >= 1,0 Цефазолин 30 >= 29 <= 16 <= 0,2 >= 1,0 Цефалексин 30 >= 29 <= 16 <= 1,0 >= 4,0 Эритромицин 15 >= 24 <= 16 <= 1,0 >= 4,0 Азитромицин 30 >= 24 <= 16 <= 1,0 >= 4,0 Линкомицин 15 >= 23 <= 16 <= 1,0 >= 4,0 Канамицин 10 >= 19 <= 16 <= 1,0 >= 4,0 Гентамицин 10 >= 23 <= 16 <= 1,0 >= 4,0 Стрептомицин 10 >= 18 <= 16 <= 1,0 >= 4,0 Амикацин 30 >= 23 <= 16 <= 1,0 >= 4,0 Тетрациклин 30 >= 23 <= 16 <= 0,1 >= 1,0 Доксициклин 10 >= 23 <= 16 <= 0,1 >= 1,0 Рифампицин 5 >= 20 <= 13 <= 0,1 >= 1,0 Ципрофлоксацин 5 >= 17 <= 15 <= 0,1 >= 1,0 Офлоксацин 5 >= 19 <= 15 <= 0,1 >= 1,0 Пефлоксацин 10 >= 19 <= 15 <= 0,1 >= 1,0 Ломефлоксацин 10 >= 20 <= 15 <= 0,1 >= 1,0 Меропенем 10 >= 26 <= 15 <= 0,1 >= 1,0 Имипенем - - - <= 0,1 >= 1,0 Примечание: то же, что к табл. 6.3.
Таблица 7.4
ДИАПАЗОН ЗНАЧЕНИЙ МПК АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ И ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ДЛЯ 50-ТИ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ШТАММОВ B. ANTHRACIS
Антибактери- Содер- Диаметр зон подавления Значение МПК, мг/л альный жание роста, мм препарат препа- рата в агар Мюлле- агар агар Мюллера- агар диске, ра-Хинтона Хоттингера Хинтона Хоттингера мкг pH 7,3 +/- pH 7,2 +/- pH 7,3 +/- pH 7,2 +/- 0,1 0,2 0,1 0,2 Бензилпеницил- 10 26-30 34-46 0,002-0,064 0,002-0,064
лин
Ампициллин 10 27-35 27-35 0,008-0,064 0,008-0,016
Цефазолин 30 29-35 29-35 0,125-0,25 0,06-0,12
Цефалексин 30 29-35 29-33 0,25-1,0 0,25-1,0
Эритромицин 15 18-24 18-24 0,25-1,0 0,5-1,0
Азитромицин 30 24-30 24-30 0,5-2,0 0,5-2,0
Линкомицин 15 22-30 22-30 1,0-4,0 1,0-2,0
Канамицин 10 22-30 22-30 0,06-0,48 0,06-0,24
Гентамицин 10 24-32 24-30 0,03-0,12 0,03-0,06
Стрептомицин 10 18-30 18-30 0,06-0,12 0,06-0,12
Амикацин 30 26-32 26-32 0,125-0,25 0,125-0,25
Тетрациклин 30 30-40 30-40 0,008-0,016 0,008-0,016
Доксициклин 10 30-40 30-40 0,008-0,016 0,008-0,016
Рифампицин 5 20-26 20-26 0,008-0,064 0,008-0,064
Ципрофлоксацин 5 27-35 27-35 0,004-0,016 0,004-0,016
Офлоксацин 5 27-35 27-35 0,05-0,1 0,05-0,1
Пефлоксацин 10 27-35 27-35 0,05-0,1 0,05-0,1
Ломефлоксацин 10 27-35 27-35 0,05-0,4 0,05-0,4
Меропенем 10 30-37 30-37 0,002-0,008 0,002-0,008
Имипенем — — — 0,002-0,008 0,002-0,008
8. Определение чувствительности холерного вибриона (Vibrio cholerae) к антибактериальным препаратам
8.1. Контрольные штаммы
Одним из условий стандартизации определения антибиотикограммы микроорганизмов является использование в качестве контроля заведомо чувствительных референтных штаммов (оптимально — данного вида возбудителя), для которых отработаны допустимые диапазоны значений МПК и диаметров зон подавления роста культуры микроорганизма. Для изучения антибиотикограмм культур V. cholerae предложен антибиотикочувствительный референс-штамм V. cholerae non O1 KM 162 (P-9741), который с 1979 г. рекомендован для контроля качества питательных сред, используемых для выделения возбудителя холеры из исследуемого материала. В качестве контрольного может быть также использован и референс-штамм Escherichia coli ATCC 25922, рекомендованный для определения антибиотикочувствительности неприхотливых бактерий.
8.2. Питательные среды
Для определения чувствительности холерного вибриона к антибактериальным препаратам обоими методами (МСР и ДДМ) может быть использован агар Мюллера-Хинтона (Muller-Hinton), pH 7,3 +/- 0,2, или агар Хоттингера, pH 7,2 +/- 0,1 (1,2-1,4 г/л аминного азота, 1,5-2% агара), и для ДДМ — дополнительно агар Гивенталя — Ведьминой (АГВ), pH 7,4 +/- 0,2. Прежде чем использовать в работе серии питательных сред, необходимо произвести оценку соответствия значений МПК и диаметров зон подавления роста (это и контроль качества дисков) на используемой среде допустимым колебаниям величин этих показателей для контрольных штаммов микроорганизмов (табл. 8.1, 8.2).
8.3. Антибактериальные препараты
Для определения чувствительности/устойчивости холерного вибриона используют антибактериальные препараты, рекомендованные МУ 3.4.1030-01 для экстренной профилактики и лечения холеры. Препараты первого ряда — основные препараты, к которым определяют чувствительность/устойчивость холерного вибриона при выделении возбудителя от больного: доксициклин, ципрофлоксацин (или офлоксацин, пефлоксацин), триметоприм/сульфаметоксазол (или триметоприм/сульфамонометоксин), фуразолидон, гентамицин, налидиксовая кислота. Включение налидиксовой кислоты в число препаратов первого ряда определяется рекомендациями ВОЗ в связи с тем, что резистентность к этому препарату (МПК >= 128 мг/л) может сопровождаться повышением значений МПК фторхинолонов в 10-40 раз и приводить к снижению их эффективности. Препараты второго ряда, чувствительность/устойчивость к которым может служить целям дополнительного выбора препарата, одним из эпидемиологических маркеров для выявления источника, отслеживания путей распространения инфекции и контроля за изменением антибиотикограммы возбудителя в ходе эпидемического процесса: тетрациклин, левомицетин, ампициллин, стрептомицин, канамицин, рифампицин, цефтриаксон или цефотаксим. Для МСР в плотной питательной среде выбирают серии двукратно увеличивающихся концентраций антибактериальных препаратов в соответствии с пограничными значениями МПК для чувствительных и устойчивых культур холерного вибриона на агаре Мюллера-Хинтона или Хоттингера (табл. 8.3). Препараты первого ряда:
Доксициклин 1 — 2 — 4 — 8 мг/л
Ципрофлоксацин (или офлоксацин, пефлоксацин) 0,06 — 0,125 — 0,25 — 0,5 — 1 мг/л Налидиксовая кислота 2 — 4 — 8 — 16 мг/л Триметоприм/сульфаметоксазол (или триметоприм/сульфамонометоксин) 1 — 2 — 4 — 8 мг/л (по триметоприму) Фуразолидон 2 — 4 — 8 — 16 мг/л
Гентамицин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л.
Препараты второго ряда:
Тетрациклин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л
Левомицетин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л
Цефотаксим (или цефтриаксон) 0,5 — 1 — 2 — 4 мг/л Ампициллин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л
Стрептомицин 8 — 16 — 32 — 64 мг/л
Канамицин 8 — 16 — 32 — 64 мг/л
Рифампицин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л.
С помощью штампа-репликатора можно одновременно изучить антибиотикограммы 20-50-ти культур, включая контрольный антибиотикочувствительный штамм, что значительно экономит средства и время, обеспечивая наибольший объем информации. Для постановки ДДМ используют проверенные коммерческие диски с определенными концентрациями антибактериальных препаратов (табл. 8.2).
8.4. Посевная доза, инокуляция, инкубация
При определении чувствительности холерного вибриона к АБП с помощью ДДМ используют суспензию микробных клеток в 0,85%-ном изотоническом растворе хлорида натрия из 16-18 ч. чистой агаровой культуры возбудителя или 1-3-х типичных изолированных колоний (полиуглеводная среда или щелочной агар), стандартизированную по отраслевому оптическому стандарту мутности
8 ГИСК им. Л.А.Тарасевича на 5 ед. (~ 3,0 х 10 КОЕ/мл). Суспензию наносят
7 на поверхность агара в объеме 0,2-0,3 мл (~ n х 10 КОЕ), равномерно распределяют шпателем и ожидают полного впитывания в агар. Затем накладывают диски (не более шести на чашку диаметром 100 мм). Инкубацию посевов проводят при 37 град. C. Результаты можно учитывать при появлении сливного роста в контроле (агар без дисков). Предварительный учет можно осуществлять через 6-8 ч, окончательный — через 18 ч. Диаметры зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска, измеряют с точностью до 1 мм; предпочтительнее пользоваться штангенциркулем, кронциркулем или специальной линейкой-лекалом.
Для МСР используют суспензию той же концентрации микробных клеток/мл и с помощью штампа-репликатора или касанием пипетки с тонким концом наносят ее на агаровые пластины с разными концентрациями антибактериальных препаратов, начиная с чашек с минимальным содержанием антибиотиков.
5 6 Посевная доза составляет ~ n х 10 — 10 КОЕ соответственно. Посевы инкубируют при температуре 37 град. C. Учет отношения культуры к антибактериальным препаратам при такой величине посевной дозы можно проводить через 12-18 ч при наличии роста в контроле (агар без антибиотика). Чувствительность/устойчивость культур определяют по минимальной концентрации препарата, подавляющей рост возбудителя (МПК, мг/л) на среде культивирования.
8.5. Критерии оценки чувствительности/устойчивости холерного вибриона к антибактериальным препаратам
Интерпретацию результатов определения чувствительности культур холерного вибриона проводят в соответствии с пограничными значениями МПК и диаметров зон подавления роста возбудителя (табл. 8.3), адаптированными именно для этого вида микроорганизма, с учетом диапазона значений для 50-ти антибиотикочувствительных штаммов V. cholerae cholerae и eltor in vitro (табл. 8.4) и соотнесения данных in vitro с эффективностью in vivo, а также клиническими наблюдениями и особенностями фармакокинетики препарата. В табл. 8.3 даны пограничные значения МПК и диаметров зон подавления роста для чувствительных и устойчивых культур на агаре Мюллера-Хинтона, агаре Хоттингера и для ДДМ — дополнительно на АГВ. Между этими показателями находятся значения для культур с промежуточной устойчивостью. Необходимо учитывать также результаты определения МПК и диаметры зон подавления роста для контрольных штаммов (табл. 8.1, 8.2) на используемой серии питательной среды. Увеличение значений МПК препаратов для изучаемых штаммов холерного вибриона в сравнении с МПК для контрольного штамма может свидетельствовать о тенденции к нарастанию устойчивости культуры, что требует использования в клинике максимальных терапевтических доз, удлинения сроков их применения, а также обязательного контроля эффективности на фоне этиотропной терапии (исследование материала от больных на 2-3 день после начала лечения), что может потребовать замены используемого препарата на эффективный в случае выделения культуры возбудителя.
Таблица 8.1
ДОПУСТИМЫЕ КОЛЕБАНИЯ ЗНАЧЕНИЙ МПК АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ КОНТРОЛЬНЫХ ШТАММОВ E. COLI ATCC 25922 И V. CHOLERAE NON O1 KM 162
Антибактери- Диапазон значений МПК, мг/л альный препарат
агар Мюллера-Хинтона агар Хоттингера pH 7,3 +/- 0,2 pH 7,2 +/- 0,1 E. coli ATCC V. cholerae E. coli ATCC V. cholerae 25922 non O1 КМ 162 25922 non O1 KM 162 1 2 3 4 5 Доксициклин 0,5-2,0 0,25-1,0 0,5-2,0 0,25-1,0 Тетрациклин 0,5-2,0 0,5-1,0 0,5-2,0 0,5-1,0 Левомицетин 2- 8 1-4 2-8 1-4 Налидиксовая 1- 4 1-4 1-4 0,5-2,0
кислота
Ципрофлоксацин 0,004-0,016 0,001-0,06 0,004-0,03 0,001-0,03
Офлоксацин 0,015-0,12 0,004-0,03 0,001-0,02 0,004-0,03
Норфлоксацин 0,03-0,12 0,016-0,03 0,004-0,06 0,008-0,03
Пефлоксацин 0,03-0,12 0,004-0,03 0,016-0,12 0,002-0,016
Ломефлоксацин 0,03-0,12 0,016-0,03 0,016-0,06 0,004-0,03
Левофлоксацин 0,008-0,06 0,004-0,016 0,008-0,06 0,004-0,016
Рифампицин 4-16 1-4 4-16 1-4
Стрептомицин 4-8 4-8 2-8 4-8
Гентамицин 0,25-1,0 1-2 0,25-1,0 1-2
Канамицин 1-4 4-16 1-4 2-8
Нетилмицин 0,5-1,0 1-2 0,25-1,0 0,5-2,0
Амикацин 0,5-4,0 1-4 1-8 1-8
Тобрамицин 0,25-1,0 1-2 1-2 0,5-2,0
Ампициллин 2-8 2-8 2-8 2-8
Цефотаксим 0,03-0,12 0,016-0,06 0,03-0,12 0,008-0,06
Цефтриаксон 0,03-0,12 0,016-0,06 0,03-0,12 0,008-0,06
Фуразолидон 4-16 2-8 4-16 2-8
Триметоприм/ 0,5/9,5 1/19-2/38 0,5/9,5 1/19-2/38 сульфаметокса- зол
Таблица 8.2
ДОПУСТИМЫЕ КОЛЕБАНИЯ ЗНАЧЕНИЙ ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ДЛЯ КОНТРОЛЬНЫХ ШТАММОВ E. COLI ATCC 25922 И V. CHOLERAE NON O1 KM 162
Антибактери- Содер- Диаметр зон подавления роста, мм альный жание препарат препа- агар агар Хоттингера АГВ рата в Мюллера-Хинтона pH 7,2 +/- 0,1 pH 7,4 +/- 0,2 диске, pH 7,3 +/- 0,2 мкг E. coli V. cho- E. coli V. cho- E. coli V. cho- ATCC lerae ATCC lerae ATCC lerae 25922 non O1 25922 non O1 25922 non O1 KM 162 KM 162 KM 162 1 2 3 4 5 6 7 8 Доксициклин 10 16-19 20-30 16-19 20-25 16-19 20-25 Тетрациклин 30 18-25 25-30 18-25 23-29 18-26 20-25 Левомицетин 30 21-27 25-30 21-27 25-30 19-27 25-30 Налидиксовая 30 22-28 25-32 22-28 25-32 22-28 25-32
кислота
Ципрофлоксацин 5 30-40 30-40 30-40 30-40 30-40 30-40
Офлоксацин 5 29-33 30-40 27-33 30-40 27-33 30-40
Норфлоксацин 10 28-35 30-35 28-35 30-40 28-35 30-40
Пефлоксацин 10 29-33 30-35 30-40 30-40 29-35 30-40
Ломефлоксацин 10 27-33 30-40 28-35 35-45 28-35 30-40
Левофлоксацин 5 29-37 29-35 28-35 30-40 28-35 30-40
Рифампицин 5 8-10 21-27 8-15 20-27 7-11 20-27
Стрептомицин 30 15-20 17-20 17-25 17-25 14-19 18-25
Гентамицин 10 19-26 21-25 19-26 21-30 21-30 21-30
Канамицин 30 17-25 20-25 17-25 18-25 15-19 18-25
Нетилмицин 30 22-30 21-25 22-30 21-30 22-30 21-30
Амикацин 30 19-26 18-25 19-26 18-25 19-26 18-25
Тобрамицин 10 18-26 20-25 18-26 20-25 18-26 20-30
Ампициллин 10 16-22 16-22 16-22 16-22 16-22 16-22
Цефотаксим 30 29-35 30-40 29-35 30-40 29-35 30-40
Цефтриаксон 30 29-35 30-40 29-35 30-40 29-35 30-40
Фуразолидон 300 20-25 18-25 20-25 18-25 22-29 18-25
Триметоприм/ 1,25/ 23-29 20-25 19-25 21-28 19-25 21-28 сульфаметокса- 23,75 зол
Таблица 8.3
КРИТЕРИИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ V. CHOLERAE O1 И O139 СЕРОГРУПП: ПОГРАНИЧНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА (ММ) И МПК (МГ/Л) АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Антибактериальный Содер- Диаметр зон Значение МПК, мг/л препарат жание подавления в роста, мм диске, мкг S R S R 1 2 3 4 5 6 Доксициклин 10 >= 19 <= 17 <= 2,0 >= 4,0 Тетрациклин 30 >= 19 <= 17 <= 4,0 >= 8,0 Левомицетин 30 >= 23 <= 19 <= 4,0 >= 16,0 Налидиксовая 30 >= 20 <= 18 <= 4,0 >= 16,0
кислота
Ципрофлоксацин 5 >= 25 <= 19 <= 0,1 >= 1,0
Офлоксацин 5 >= 25 <= 15 <= 0,1 >= 1,0
Пефлоксацин 10 >= 22 <= 16 <= 0,1 >= 1,0
Норфлоксацин 10 >= 22 <= 19 <= 0,1 >= 1,0
Ломефлокацин 10 >= 22 <= 19 <= 0,1 >= 1,0
Левофлоксацин 5 >= 22 <= 19 <= 0,1 >= 1,0
Рифампицин 5 >= 20 <= 13 <= 4,0 >= 16,0
Стрептомицин 30 >= 15 <= 12 <= 16,0 >= 32,0
Гентамицин 10 >= 16 <= 12 <= 4,0 >= 8,0
Канамицин 30 >= 17 <= 15 <= 16,0 >= 32,0
Амикацин 30 >= 17 < 15 <= 8,0 >= 16,0
Тобрамицин 10 >= 17 < 12 <= 4,0 >= 16,0
Нетилмицин 30 >= 19 < 17 <= 4,0 >= 8,0
Ампициллин 10 >= 17 <= 13 <= 4,0 >= 16,0
Цефотаксим 30 >= 25 < 15 <= 1,0 >= 4,0
Цефтриаксон 30 >= 25 < 15 <= 1,0 >= 4,0
Фуразолидон 300 >= 18 < 15 <= 4,0 >= 16,0
Триметоприм/ 1,25/ >= 20 < 15 <= 2,0/38,0 >= 8,0/152,0 сульфаметоксазол 23,75
Примечание: то же, что к табл. 6.3.
Таблица 8.4
ДИАПАЗОН ЗНАЧЕНИЙ МПК АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ И ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ДЛЯ 50-ТИ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ШТАММОВ V. CHOLERAE O1 СЕРОГРУППЫ
Антибактери- Содер- Диаметр зон подавления Значение МПК, мг/л альный жание роста, мм препарат препа- рата в агар агар АГВ агар агар Хоттингера диске, Мюллера- Хоттин- pH 7,4 Мюллера-Хинтона pH 7,2 +/- 0,1 мкг Хинтона гера +/- 0,2 pH 7,3 +/- 0,2 pH 7,3 pH 7,2 +/- 0,2 +/- 0,1 1 2 3 4 5 6 7 Доксициклин 10 18-25 18-25 18-25 0,25-0,5 0,25-0,5 Тетрациклин 30 20-25 20-25 20-25 0,5-2,0 0,5-1,0 Левомицетин 30 25-30 23-29 25-30 0,5-2,0 1-2 Налидиксовая 30 25-32 25-32 25-35 0,5-1,0 0,5-2,0
кислота
Ципрофлокса- 5 30-40 30-40 30-40 0,001-0,004 0,002-0,004 цин
Офлоксацин 5 29-35 29-35 29-35 0,002-0,03 0,002-0,004
Норфлоксацин 10 30-40 30-40 30-40 0,001-0,016 0,002-0,004
Пефлоксацин 10 30-40 30-40 30-40 0,004-0,03 0,004-0,016
Ломефлокса- 10 30-40 30-40 30-40 0,002-0,03 0,002-0,004 цин
Левофлокса- 5 29-35 29-35 29-35 0,004-0,03 0,002-0,004 цин
Рифампицин 5 20-27 20-27 20-27 0,5-2,0 0,5-1,0
Стрептомицин 30 19-29 20-30 18-25 2-16 4-8
Гентамицин 10 21-25 21-30 21-30 0,25-2,0 0,5-1,0
Канамицин 30 20-25 20-25 20-25 2-16 2-8
Нетилмицин 30 21-30 21-30 21-30 0,5-1,0 0,5-1,0
Амикацин 30 18-25 18-25 18-25 2-16 2-8
Тобрамицин 10 20-25 20-30 20-30 0,5-2,0 1-2
Ампициллин 10 16-22 16-22 16-22 0,5-4,0 1-4
Цефотаксим 30 30-40 30-40 30-40 0,002-0,12 0,002-0,03
Цефтриаксон 30 30-40 30-40 30-40 0,002-0,12 0,002-0,03
Фуразолидон 300 18-25 18-25 18-25 1-4 2-4
Триметоприм/ 1,25/ 20-25 20-25 20-25 0,5/9,5-2,0/38,0 0,5/9,5-1,0/19,0 сульфамето- 23,75 ксазол
9. Определение чувствительности туляремийного микроба (Francisella tularensis) к антибактериальным препаратам
9.1. Контрольные штаммы
В качестве контрольных штаммов для определения антибиотикочувствительности туляремийного микроба предлагается использовать штамм Escherichia coli ATCC 25922 (для контроля качества дисков) и вакцинный штамм Francisella tularensis 15 (для контроля качества питательных сред и качества дисков).
9.2. Питательные среды
В качестве оптимальных питательных сред для выращивания и определения антибиотикочувствительности штаммов туляремийного микроба трех основных подвидов (subsp. nearctica, mediaasiatica, holarctica) предлагается использовать следующие среды: 1. Агар Мюллера-Хинтона с добавлением следующих ростовых компонентов (г/л среды): MgSO4 — 0,05; FeSO4 — 0,1; L-цистеин — 0,6; лимоннокислый натрий — 1,2; KCl — 2; K2HPO4 — 4; глюкоза — 15. Стерильные (кипячение 20 мин.) ростовые добавки вносят в растопленный и остуженный агар перед разливанием его в чашки Петри. 2. Эритрит-агар с добавлением вышеперечисленных ростовых компонентов. 3. Агар АДЭТ (Прилож. 1). В связи с тем, что данная среда не подлежит автоклавированию и содержит ряд антибиотиков, она может быть использована только для ДДМ. 4. Агар LB (г/л): триптон Bacto — 10; дрожжевой экстракт Bacto — 5; NaCl — 10 с добавлением ростовых добавок (п. 1). Целесообразность включения в работу разнообразных питательных сред определяется различными техническими и материальными возможностями лабораторий, допущенных к исследованию возбудителя туляремии. Перед использованием питательных сред для контроля их качества и контроля качества используемых дисков необходимо провести определение соответствия значений МПК и диаметров зон подавления роста для контрольных штаммов микроорганизмов (табл. 9.1 и 9.2).
9.3. Антибактериальные препараты
Для определения чувствительности/устойчивости возбудителя туляремии используют антибактериальные препараты, применяемые для профилактики и лечения туляремии. Препараты первого ряда — основные препараты, к которым проводят определение чувствительности бактерий: доксициклин, ципрофлоксацин (офлоксацин, пефлоксацин, ломефлоксацин, левофлоксацин), стрептомицин, гентамицин, рифампицин. Препараты второго ряда — чувствительность/устойчивость к которым может определяться для дополнительного выбора, а также для проведения мониторинга чувствительности/устойчивости возбудителя: амикацин, канамицин, налидиксовая кислота. Для МСР в плотной питательной среде готовят серии двукратно увеличивающихся концентраций антибактериальных препаратов, ориентируясь на пограничные значения МПК для чувствительных и устойчивых штаммов туляремийного микроба на рекомендуемых питательных средах. Препараты первого ряда:
Доксициклин — 2 — 4 — 8 — 16 мг/л
Ципрофлоксацин (или офлоксацин, пефлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин) — 0,12 — 0,25 — 0,5 — 1 — 2 мг/л Стрептомицин — 2 — 4 — 8 — 16 мг/л
Гентамицин — 2 — 4 — 8 — 16 мг/л
Рифампицин — 1 — 2 — 4 — 8 мг/л.
Препараты второго ряда:
Амикацин — 4 — 8 — 16 — 32 мг/л
Канамицин — 4 — 8 — 16 — 32 мг/л
Налидиксовая кислота — 2 — 4 — 8 — 16 мг/л. С целью экономии времени и средств для проведения исследования МСР могут применяться штампы-репликаторы, позволяющие проводить изучение 25-50 культур одновременно, включая контрольные штаммы. При определении антибиотикограмм бактерий ДДМ используют проверенные коммерческие диски с определенными концентрациями антибактериальных препаратов.
9.4. Посевная доза, инокуляция, инкубация
При определении чувствительности с помощью ДДМ используют суспензию микробных клеток в 0,85%-ном растворе хлорида натрия, приготовленную из 24 ч. агаровой культуры F. tularensis.
Суспензию стандартизируют по отраслевому стандарту мутности ГИСК им.
8 9 Л.А.Тарасевича на 5 ед., что соответствует n х 10 — 10 КОЕ/мл туляремийного микроба в зависимости от используемых штаммов и питательных
7 8 сред. Суспензию наносят на поверхность агара в объеме 0,3 мл (n х 10 — 10 КОЕ), равномерно распределяют шпателем и выдерживают до полного впитывания в агар. После этого накладывают диски (не более 6 на чашку диаметром 100 мм). Посевы инкубируют при 37 град. C в течение 24-48 ч. Результаты учитывают только в случае появления сливного роста на контрольных чашках (без дисков). Диаметр зон задержки роста бактерий вокруг дисков (включая диаметр самого диска) измеряют с точностью до 1 мм линейкой-лекалом или штангенциркулем.
Для МСР используют суспензию той же концентрации м.к./мл, которую наносят небольшими каплями с помощью штампа-репликатора или касанием
6
пипетки (посевная доза n х 10 КОЕ) на чашки с питательной средой, содержащей различные концентрации антибактериальных препаратов, начиная с чашки с минимальным содержанием антибиотика. Посевы инкубируют при 37 град. C в течение 24-48 ч. Учет результатов проводят при наличии роста культуры на контрольных чашках (без антибиотика). Чувствительность/устойчивость культур оценивают по минимальной концентрации препарата, подавляющей рост микробов (МПК, мг/л).
9.5. Критерии оценки чувствительности/устойчивости туляремийного микроба к антибактериальным препаратам
Интерпретацию результатов определения чувствительности штаммов F. tularensis проводят в соответствии с пограничными значениями МПК и диаметрами зон задержки роста для чувствительных и устойчивых культур (табл. 9.3), адаптированными именно для этого вида микробов, на конкретной питательной среде с учетом диапазона значений для 20-ти антибиотикочувствительных штаммов F. tularensis (табл. 9.4). Увеличение значений МПК препаратов или же уменьшение диаметра зон подавления роста изучаемых штаммов туляремийного микроба по сравнению с этими показателями для контрольных штаммов может свидетельствовать о тенденции к нарастанию устойчивости микроорганизмов и требует использования максимальных терапевтических доз и удлинения сроков их применения.
Таблица 9.1
ДОПУСТИМЫЕ КОЛЕБАНИЯ ЗНАЧЕНИЙ МПК АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ КОНТРОЛЬНЫХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI ATCC 25922 И FRANCISELLA TULARENSIS 15
Антибактери- Диапазон значений МПК, мг/л альный
препарат агар агар LB с ростовыми эритрит-агар с ростовыми Мюллера-Хинтона с добавками добавками ростовыми добавками pH 7,1 +/- 0,1 pH 7,2 +/- 0,1 pH 7,3 +/- 0,2 E. coli F. tularen- E. coli F. tularen- E. coli F. tularen- ATCC 25922 sis 15 ATCC 25922 sis 15 ATCC 25922 sis 15 Гентамицин 2-4 1-2 2-4 1-2 2-4 1-2 Амикацин 4-8 2-4 4-8 2-4 4-8 2-4 Канамицин 4-8 2-4 4-8 2-4 4-8 2-4 Стрептомицин 4-8 1-2 4-8 1-2 4-8 1-2 Доксициклин 0,5-2,0 0,5-1,0 1-2 1-2 1-2 1-2 Налидиксовая 1 - 4 1-2 1-4 1-2 1-4 1-2
кислота
Ципрофлокса- 0,016-0,032 0,06-0,12 0,016-0,032 0,06-0,12 0,016-0,032 0,06-0,12 цин
Офлоксацин 0,06-0,12 0,12-0,25 0,06-0,12 0,12-0,25 0,06-0,12 0,12-0,25
Пефлоксацин 0,06-0,12 0,12-0,25 0,06-0,12 0,12-0,25 0,06-0,12 0,12-0,25
Ломефлокса- 0,12-0,5 0,12-0,25 0,12-0,5 0,12-0,25 0,12-0,5 0,12-0,5 цин
Левофлокса- 0,012-0,03 0,03-0,06 0,012-0,03 0,03-0,06 0,012-0,033 0,06-0,12 цин
Рифампицин 4-16 0,25-0,5 4-16 0,25-0,5 4-16 0,5-1,0
Таблица 9.2
ДОПУСТИМЫЕ КОЛЕБАНИЯ ЗНАЧЕНИЙ ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ДЛЯ КОНТРОЛЬНЫХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI ATCC 25922 И FRANCISELLA TULARENSIS 15
Антибактери- Со- Диаметр зон подавления роста, мм альный держа- препарат ние агар агар LB с эритрит-агар с АДЭТ пре- Мюллера-Хинтона ростовыми ростовыми pH 7,2 +/- 0,1 парата с ростовыми добавками добавками в добавками pH 7,1 +/- 0,1 pH 7,2 +/- 0,1 диске, pH 7,3 +/- 0,2 мкг E. coli F. tula- E. coli F. tula- E. coli F. tula- E. coli F. tula- ATCC rensis ATCC rensis ATCC rensis ATCC rensis 25922 15 25922 15 25922 15 25922 15 Гентамицин 10 16-25 25-30 16-25 25-30 16-25 25-30 16-25 25-30 Амикацин 30 16-25 25-30 16-25 25-30 16-25 25-30 16-25 25-30 Канамицин 30 16-25 25-30 16-25 25-30 16-25 25-30 16-25 25-30
Стрептомицин 30 15-25 25-30 15-25 25-30 15-25 25-30 16-25 25-30
Доксициклин 10 16-20 25-30 16-20 25-30 16-20 25-30 16-20 25-30
Налидиксовая 30 22-28 25-30 22-28 25-30 22-28 25-30 22-28 25-30 кислота
Ципрофлокса- 5 30-35 30-35 30-35 30-35 30-35 30-35 30-35 30-35 цин
Офлоксацин 5 25-30 30-35 25-30 30-35 25-30 30-35 25-30 30-35
Пефлоксацин 10 25-30 30-35 25-30 30-35 25-30 30-35 25-30 30-35
Ломефлокса- 10 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30 цин
Левофлокса- 5 25-30 30-35 25-30 30-35 25-30 30-35 25-30 30-35 цин
Рифампицин 5 8-10 25-30 8-10 25-30 8-10 25-30 8-10 25-30
Таблица 9.3
КРИТЕРИИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ FRANCISELLA TULARENSIS: ПОГРАНИЧНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА (ММ) И ВЕЛИЧИН МПК (МГ/Л) АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Антибактериальный Содержа- Диаметр зон Значение МПК, мг/л препарат ние подавления роста, препарата мм в диске, мкг S R S R Гентамицин 10 >= 25 <= 20 <= 4 >= 16 Амикацин 30 >= 25 <= 20 <= 8 >= 32 Канамицин 30 >= 25 <= 20 <= 8 >= 32 Стрептомицин 30 >= 25 <= 20 <= 4 >= 16 Доксициклин 10 >= 25 <= 20 <= 4 >= 16 Налидиксовая 30 >= 25 <= 20 <= 4 >= 16
кислота
Ципрофлоксацин 5 >= 30 <= 25 <= 0,25 >= 1
Офлоксацин 5 >= 30 <= 25 <= 0,25 >= 1
Пефлоксацин 10 >= 30 <= 25 <= 0,25 >= 1
Ломефлоксацин 10 >= 25 <= 20 <= 1 >= 2
Левофлоксацин 5 >= 30 <= 25 <= 0,25 >= 1
Рифампицин 5 >= 25 <= 20 <= 2 >= 8
Примечание: то же, что к табл. 6.3.
Таблица 9.4
ДИАПАЗОН ЗНАЧЕНИЙ МПК АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ И ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ДЛЯ 20-ТИ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ШТАММОВ FRANCISELLA TULARENSIS ТРЕХ ОСНОВНЫХ ПОДВИДОВ (SUBSP. NEARCTICA, MEDIAASIATICA, HOLARCTICA)
Антибактери- Содер- Диаметр зон подавления роста, мм Значение МПК, мг/л альный жание препарат препа- агар агар LB с эритрит- АДЭТ агар агар LB с эритрит- рата в Мюллера- ростовыми агар с pH 7,2 Мюллера- ростовыми агар с диске, Хинтона с добавками ростовыми +/- 0,1 Хинтона с добавками ростовыми мкг ростовыми pH 7,1 добавками ростовыми pH 7,1 +/- добавками добавками +/- 0,1 pH 7,2 добавками 0,1 pH 7,2 +/- pH 7,3 +/- 0,1 pH 7,3 +/- 0,1 +/- 0,2 0,2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Гентамицин 10 26-30 25-33 25-33 25-36 0,5-2,0 1-2 0,5-2,0 Амикацин 30 26-30 25-30 25-30 25-35 2-4 1-4 2-4 Канамицин 30 25-35 25-35 25-35 29-35 1-4 2-4 1-4 Стрептомицин 30 25-30 25-30 25-30 25-30 1-2 1-2 1-2 Доксициклин 10 25-35 25-35 25-35 25-35 0,25-1,0 0,5-2,0 1-2 Налидиксовая 30 25-38 25-38 25-38 25-38 1-4 1-4 1-4
кислота
Ципрофлокса- 5 30-38 30-35 30-35 30-38 0,03-0,12 0,03-0,12 0,03-0,12 цин
Офлоксацин 5 30-38 30-38 30-38 30-38 0,06-0,12 0,06-0,25 0,06-0,25
Пефлоксацин 10 30-38 30-38 30-38 30-38 0,06-0,25 0,06-0,25 0,12-0,25
Ломефлокса- 10 25-35 25-35 25-35 25-35 0,12-0,25 0,12-0,25 0,12-0,5 цин
Левофлокса- 5 30-40 30-40 30-40 30-40 0,016-0,06 0,016-0,06 0,03-0,12 цин
Рифампицин 5 25-38 25-35 25-35 25-35 0,25-0,5 0,25-0,5 0,25-1
10. Определение чувствительности бруцелл (Brucella spp.) к антибактериальным препаратам
10.1. Контрольные штаммы
В качестве контрольных для определения антибиотикочувствительности бруцелл предлагается использовать штамм Escherichia coli ATCC 25922 и вакцинный штамм B. abortus 19 BA (для контроля качества питательных сред, качества дисков, стандартизации определения антибиотикограммы). Диапазоны значений МПК и зон подавления роста для контрольных штаммов представлены в табл. 10.1 и 10.2.
10.2. Питательные среды
В качестве оптимальных питательных сред для выращивания и определения антибиотикочувствительности штаммов возбудителя бруцеллеза трех видов (B. abortus, B. suis, B. melitensis) предлагается использовать: 1. Агар Мюллера-Хинтона (pH 7,3 +/- 0,2). 2. Агар Мюллера-Хинтона с добавлением следующих ростовых компонентов (г/л среды): MgSO4 — 0,05; FeSO4 — 0,1; L-цистеин — 0,6; лимоннокислый натрий — 1,2; KCl — 2; K2HPO4 — 4; глюкоза — 15. Стерильные (кипячение 20 мин.) ростовые добавки вносят в растопленный и остуженный агар перед разливанием его в чашки Петри. 3. Эритрит-агар.
4. Эритрит-агар с добавлением вышеперечисленных ростовых компонентов. 5. Агар LB (г/л): триптон Bacto — 10; дрожжевой экстракт Bacto — 5; NaCl — 10 с добавлением ростовых добавок (п. 2). Использование среды Мюллера-Хинтона и эритрит-агара без ростовых добавок позволяет проводить учет результатов через 48 ч; добавление в перечисленные среды ростовых добавок сокращает срок учета до 24 ч. Целесообразность включения в работу разнообразных питательных сред определяется различными техническими и материальными возможностями лабораторий, допущенных к исследованию возбудителя бруцеллеза. Перед использованием питательных сред для контроля их качества и используемых дисков необходимо провести определение соответствия значений МПК и диаметров зон подавления роста для контрольных штаммов микроорганизмов (табл. 10.1 и 10.2).
10.3. Антибактериальные препараты
Для определения чувствительности/устойчивости возбудителя бруцеллеза используют антибактериальные препараты, применяемые для профилактики и лечения бруцеллеза. Препараты первого ряда — основные препараты, к которым проводят определение чувствительности бактерий: гентамицин, стрептомицин, доксициклин, рифампицин, ципрофлоксацин (офлоксацин, пефлоксацин, ломефлоксацин, левофлоксацин). Препараты второго ряда, чувствительность/устойчивость к которым может определяться для дополнительного выбора средств этиотропной терапии и эпидемиологического надзора за антибиотикочувствительностью/устойчивостью: амикацин, канамицин, тетрациклин, налидиксовая кислота. Для МСР в плотной питательной среде готовят серии двукратно увеличивающихся концентраций антибактериальных препаратов, ориентируясь на пограничные значения МПК для чувствительных и устойчивых штаммов бруцелл на рекомендуемых питательных средах. Препараты первого ряда:
Гентамицин, стрептомицин 4 — 8 — 16 — 32 мг/л Ципрофлоксацин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л (или офлоксацин, пефлоксацин, ломефлоксацин 4 — 8 — 16 — 32 мг/л; или левофлоксацин 1 — 2 — 4 — 8 мг/л) Доксициклин 2 — 4 — 8 — 16 — 32 мг/л
Рифампицин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л.
Препараты второго ряда:
Амикацин, канамицин 8 — 16 — 32 — 64 мг/л Тетрациклин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л
Налидиксовая кислота 16 — 32 — 64 — 128 мг/л. С целью экономии времени и средств для проведения исследования могут применяться штампы-репликаторы, позволяющие проводить изучение 25-50 штаммов одновременно с включением контрольного антибиотикочувствительного штамма. При определении антибиотикограмм бактерий ДДМ используют проверенные коммерческие диски с определенными концентрациями антибактериальных препаратов.
10.4. Посевная доза, инокуляция, инкубация
При определении чувствительности с помощью ДДМ используют суспензию микробных клеток в 0,85%-ном растворе хлорида натрия, приготовленную из 24 ч. агаровой культуры возбудителя.
Суспензию стандартизируют по отраслевому стандарту мутности ГИСК им.
8 Л.А.Тарасевича на 5 ед. (~ n х 10 КОЕ/мл). Суспензию наносят на
7 поверхность агара в объеме 0,3 мл (n х 10 КОЕ), равномерно распределяют шпателем и выдерживают до полного впитывания в агар. После этого накладывают диски (не более 6 на чашку диаметром 100 мм). Посевы инкубируют при 37 град. C в течение 24-48 ч. Результаты учитывают только в случае появления сливного роста на контрольных чашках (без дисков). Диаметр зон задержки роста бактерий вокруг дисков (включая диаметр самого диска) измеряют с точностью до 1 мм линейкой-лекалом или штангенциркулем.
Для МСР используют суспензию той же концентрации м.к./мл, которую наносят небольшими каплями с помощью штампа-репликатора или касанием
5 6 пипетки (посевная доза n х 10 — 10 КОЕ) на чашки с питательной средой, содержащей различные концентрации антибактериальных препаратов, начиная с чашки с минимальным содержанием антибиотика. Посевы инкубируют при 37 град. C в течение 24-48 ч. Использование среды Мюллера-Хинтона и эритрит-агара без ростовых добавок позволяет проводить учет результатов через 48 ч; добавление в перечисленные среды ростовых добавок сокращает срок учета до 24 ч. Учет результатов проводят при наличии роста культуры на контрольных чашках (без антибиотика). Чувствительность/устойчивость культур оценивают по минимальной концентрации препарата, подавляющей рост микробов (МПК, мг/л).
10.5. Критерии оценки чувствительности/устойчивости возбудителя бруцеллеза к антибактериальным препаратам
Интерпретацию оценки определения чувствительности штаммов Brucella проводят в соответствии с пограничными значениями МПК и диаметрами зон задержки роста для чувствительных и устойчивых культур (табл. 10.3), адаптированными именно для этого вида микробов, на конкретной питательной среде с учетом диапазона значений для 20-ти штаммов бруцелл (табл. 10.4). Увеличение значений МПК препаратов или же уменьшение диаметров зон подавления роста изучаемых штаммов возбудителя бруцеллеза по сравнению с этими показателями для контрольных штаммов (табл. 10.1, 10.2) может свидетельствовать о тенденции к нарастанию устойчивости микроорганизмов и требует использования максимальных терапевтических доз и удлинения сроков их применения.
Таблица 10.1
ДОПУСТИМЫЕ КОЛЕБАНИЯ ЗНАЧЕНИЙ МПК АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ КОНТРОЛЬНЫХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI ATCC 25922 И BRUCELLA ABORTUS 19 BA
Антибактери- Диапазон значений МПК, мг/л альный
препарат агар Мюллера-Хинтона с агар LB с ростовыми эритрит-агар с ростовыми ростовыми добавками добавками добавками (или без них) (или без них) pH 7,1 +/- 0,1 pH 7,2 +/- 0,1 pH 7,3 +/- 0,2 E. coli ATCC В. abortus E. coli ATCC В. abortus E. coli ATCC В. abortus 25922 19 BA 25922 19 BA 25922 19 BA 1 2 3 4 5 6 7 Гентамицин 2-4 1-2 2-4 1-2 2-4 2-4 Амикацин 4-8 2-4 4-8 2-4 4-8 4-8 Канамицин 4-8 2-4 4-8 2-4 4-8 4-8 Стрептомицин 4-8 2-4 4-8 1-2 4-8 2-4 Доксициклин 0,5-2,0 1-2 1-4 2-4 1-4 1-2 Тетрациклин 0,5-2,0 1-2 1-4 1-2 1-4 1-2 Налидиксовая 1-4 8-16 1-4 8-16 1-4 8-16
кислота
Ципрофлокса- 0,016-0,032 0,5-1,0 0,016-0,032 1-2 0,016-0,032 1-2 цин
Офлоксацин 0,06-0,12 1-2 0,06-0,12 1-2 0,06-0,12 2-4
Пефлоксацин 0,06-0,12 2-4 0,06-0,12 2-4 0,06-0,12 2-4
Ломефлокса- 0,12-0,5 2-4 0,12-0,5 2-4 0,12-0,5 2-4 цин
Левофлокса- 0,012-0,03 0,5-1,0 0,012-0,03 0,25-0,5 0,012-0,03 0,5-1,0 цин
Рифампицин 4-16 1-2 4-16 1-2 4-16 2-4
Таблица 10.2
ДОПУСТИМЫЕ КОЛЕБАНИЯ ЗНАЧЕНИЙ ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ДЛЯ КОНТРОЛЬНЫХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI ATCC 25922 И BRUCELLA ABORTUS 19 BA
Антибактериаль- Содер- Диаметр зон подавления роста, мм ный препарат жание
препа- агар Мюллера- агар LB с эритрит-агар с рата в Хинтона с ростовы- ростовыми ростовыми диске, ми добавками (или добавками добавками мкг без них) pH 7,1 +/- 0,1 (или без них) pH 7,3 +/- 0,2 pH 7,2 +/- 0,1 E. coli В. abortus E. coli В. abortus E. coli В. abortus ATCC 19 BA ATCC 19 BA ATCC 19 BA 25922 25922 25922 Гентамицин 10 15-25 20-25 15-25 20-25 15-25 20-25 Амикацин 30 15-25 20-25 15-25 20-25 15-25 20-25 Канамицин 30 15-25 20-25 15-25 20-25 15-25 20-25 Стрептомицин 30 15-25 20-25 15-25 20-25 15-25 20-25 Доксициклин 10 16-20 20-25 16-20 20-25 16-20 20-25 Тетрациклин 30 16-20 25-30 16-20 25-30 16-20 25-30 Налидиксовая 30 22-28 15-20 22-28 15-20 22-28 15-20
кислота
Ципрофлоксацин 5 30-35 25-30 30-35 25-30 30-35 25-30
Офлоксацин 5 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30
Пефлоксацин 10 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30
Ломефлоксацин 10 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30
Левофлоксацин 5 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30 25-30
Рифампицин 5 8-10 20-25 8-10 20-25 8-10 20-25
Таблица 10.3
КРИТЕРИИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ШТАММОВ BRUCELLA SPP.: ПОГРАНИЧНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА (ММ) И ВЕЛИЧИН МПК (МГ/Л) АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Антибактериальный Содержа- Диаметр зон Значение МПК, мг/л препарат ние подавления роста, препарата мм в диске, мкг S R S R Гентамицин 10 >= 20 <= 15 <= 8 >= 32 Амикацин 30 >= 20 <= 15 <= 16 >= 64 Канамицин 30 >= 20 <= 15 <= 16 >= 64 Стрептомицин 30 >= 20 <= 15 <= 8 >= 32 Доксициклин 10 >= 20 <= 15 <= 4 >= 32 Тетрациклин 30 >= 25 <= 20 <= 4 >= 16 Налидиксовая 30 >= 15 <= 10 <= 32 >= 128
кислота
Ципрофлоксацин 5 >= 30 <= 25 <= 4 >= 16
Офлоксацин 5 >= 25 <= 20 <= 8 >= 32
Пефлоксацин 10 >= 25 <= 20 <= 8 >= 32
Ломефлоксацин 10 >= 25 <= 20 <= 8 >= 32
Левофлоксацин 5 >= 30 <= 25 <= 2 >= 4
Рифампицин 5 >= 15 <= 10 <= 8 >= 16
Примечание: то же, что к табл. 6.3.
Таблица 10.4
ДИАПАЗОН ЗНАЧЕНИЙ МПК АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ И ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ДЛЯ 20-ТИ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ШТАММОВ
BRUCELLA SPP.
Антибактери- Содер- Диаметр зон подавления роста, Значение МПК, мг/л альный жание мм препарат препа- рата в агар агар LB с эритрит- агар агар LB с эритрит- диске, Мюллера- ростовыми агар с Мюллера- ростовыми агар с мкг Хинтона с добавками ростовыми Хинтона с добавками ростовыми ростовыми pH 7,1 добавками ростовыми pH 7,1 добавками добавками +/- 0,1 (или без добавками +/- 0,1 (или без (или без них) (или без них) них) pH 7,2 них) pH 7,2 pH 7,3 +/- 0,1 pH 7,3 +/- +/- 0,1 +/- 0,2 0,2 1 2 3 4 5 6 7 8 Гентамицин 10 20-30 20-30 20-30 1-4 1-2 2-4 Амикацин 30 20-30 20-30 20-30 2-4 2-4 4-8 Канамицин 30 20-30 20-30 20-30 2-4 2-4 4-8 Стрептомицин 30 20-25 20-25 20-25 1-4 0,5-2,0 2-4 Доксициклин 10 20-30 20-30 20-30 0,5-2,0 0,5-4,0 0,5-2,0 Тетрациклин 30 25-30 25-30 25-30 0,5-2,0 0,5-2,0 1-2 Налидиксовая 30 15-20 15-20 15-20 8-16 8-16 8-16
кислота
Ципрофлокса- 5 30-35 30-35 28-35 0,25-1,0 0,5-2,0 0,5-2,0 цин
Офлоксацин 5 30-35 30-35 27-35 0,5-2,0 1-2 1-2
Пефлоксацин 10 30-35 30-35 27-35 1-4 1-4 2-4
Ломефлокса- 10 25-35 25-35 25-35 2-8 2-8 2-8 цин
Левофлокса- 5 30-35 30-35 30-35 0,5-1,0 0,25-0,5 0,5-1,0 цин
Рифампицин 5 15-25 15-25 15-25 1-2 1-2 2-4
11. Определение чувствительности возбудителей сапа и мелиоидоза (Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei) к антибактериальным препаратам
11.1. Контрольные штаммы
Для стандартизации определения антибиотикограммы микроорганизмов необходимо использовать в качестве контроля референтные штаммы, обладающие стандартной для данного вида антибиотикочувствительностью, для которых известны допустимые диапазоны значений МПК и диаметров зон подавления роста культуры. Из культур 27 видов буркхольдерий для изучения антибиотикограмм принципиальное значение имеют типичные штаммы двух эпидемически значимых видов — Burkholderia mallei NCTC 10230 и Burkholderia pseudomallei CIP 6086. У этих штаммов подробно изучены фенотипические свойства, и они имеются практически во всех учреждениях, получивших разрешение на проведение исследований с патогенными буркхольдериями. Под вышеуказанными номерами культуры штаммов зарегистрированы в Английской национальной коллекции типовых культур (NCTC). Для контроля качества дисков и сред возможно также использование референтного для не ферментирующих глюкозу бактерий штамма Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
11.2. Питательные среды
Для определения чувствительности патогенных буркхольдерий к антибактериальным препаратам обоими методами (МСР и ДДМ) может быть использован агар Мюллера-Хинтона (Muller-Hinton) pH 7,3 +/- 0,2, для выращивания культур используют мясопептонный агар (МПА), pH 6,8 +/- 0,2. Прежде чем использовать в работе серии питательной среды, необходимо произвести оценку соответствия значений МПК и диаметров зон подавления роста (это и контроль качества дисков) на испытуемой серии среды допустимым величинам этих показателей для контрольных штаммов микроорганизмов (табл. 11.1 и 11.2).
11.3. Антибактериальные препараты
Для определения чувствительности/устойчивости патогенных буркхольдерий используют антибактериальные препараты, рекомендуемые в настоящее время для экстренной профилактики и лечения сапа и мелиоидоза. Препараты первого ряда — основные препараты, к которым определяют чувствительность/устойчивость возбудителей сапа и мелиоидоза при выделении от больного или из внешней среды: доксициклин, триметоприм/сульфаметоксазол, левомицетин, цефтазидим, имипенем (меропенем), рифампицин. Применяют их, как правило, в разных сочетаниях: триметопримом/сульфаметоксазол + доксициклин, цефтазидим + доксициклин, доксициклин + левомицетин + рифампицин и др. Основным лечебным препаратом при лечении острых форм начиная с 1982 г. является цефтазидим, особенно в комбинации с триметоприм/сульфаметоксазолом. При этом сочетании возникновение резистентных форм отмечается в редчайших случаях. Препараты группы карбапенемов обладают наиболее низкой величиной МПК и хорошей бактерицидной активностью. Препараты второго ряда включают амоксициллин/клавулановую кислоту (амоксиклав) и некоторые фторхинолоны (ципрофлоксацин, спарфлоксацин). Амоксиклав оказался первым эффективным препаратом, применяемым per os. Ципрофлоксацин — препарат с бактерицидным эффектом, он хорошо проникает внутрь эукариотических клеток и рекомендуется для поддерживающей терапии в сочетании с цефтазидимом. Для МСР выбирают серии двукратно уменьшающихся концентраций антибактериальных препаратов в соответствии с пограничными значениями МПК для изучаемых видов буркхольдерий. Препараты первого ряда:
Доксициклин 2 — 4 — 8 — 16 мг/л
Триметоприм/сульфаметоксазол 0,5 — 1 — 2 — 4 мг/л (по триметоприму) Цефтазидим 4 — 8 — 16 — 32 мг/л
Имипенем (меропенем) 2 — 4 — 8 — 16 мг/л Рифампицин 2 — 4 — 8 — 16 — 32 мг/л
Левомицетин 4 — 8 — 16 — 32 мг/л
Препараты второго ряда:
Амоксициллин/клавулановая кислота 2/1 — 4/2 — 8/4 — 16/8 мг/л Ципрофлоксацин (или спарфлоксацин, ломефлоксацин, офлоксацин) 0,5 — 1 — 2 — 4 — 8 мг/л Цефтриаксон (или цефепим) 4 — 8 — 16 — 32 — 64 мг/л Пиперациллин 8 — 16 — 32 — 64 мг/л
Сульфаметоксазол 5 — 100 — 200 — 400 мг/л. Для постановки ДДМ используют проверенные коммерческие диски с определенными концентрациями антибактериальных препаратов (табл. 11.3).
11.4. Посевная доза, инокуляция, инкубация
Для приготовления инокулюма используют суточную культуру бактерий, выросших на плотной питательной среде (МПА). Суспензию стандартизируют по отраслевому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича на 5 ед., что
8
соответствует ~ 2 х 10 КОЕ/мл. При определении чувствительности штаммов Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei с помощью ДДМ суспензию наносят на поверхность агара в о бъеме 0,2-0,3 мл, равномерно распределяют
7 шпателем и ожидают полное впитывание в агар (посевная доза 4-6 х 10 КОЕ). Затем накладывают диски (не более 6 штук на чашку диаметром 100 мм). Инкубацию посевов проводят при температуре 37 град. C. Результаты можно учитывать через 18-24 ч. Диаметры зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска (стандарт — 6,35 мм), измеряют с точностью до 1 мм, используя штангенциркуль или специальную линейку-лекало.
Для МСР используют суспензию той же концентрации микробных клеток (n х 8
10 КОЕ/мл), нанося небольшими каплями с помощью пипетки с тонким концом на агаровые пластины с разными концентрациями антибактериальных препаратов, начиная с чашек с минимальным содержанием антибиотика. Посевная доза при
6
этом составляет около n х 10 КОЕ. Посевы инкубируют при температуре 37 град. C. Учет результатов исследований можно проводить через 18-24 ч при наличии выраженного роста культуры в контроле (агаровая среда без антибиотика). Чувствительность/устойчивость культур определяют по минимальной концентрации препарата, подавляющей рост возбудителя (МПК, мг/л) на среде культивирования.
11.5. Критерии оценки чувствительности/устойчивости возбудителей сапа и мелиоидоза
к антибактериальным препаратам
Интерпретацию результатов определения чувствительности патогенных буркхольдерий проводят в соответствии с пограничными значениями МПК и зон подавления роста бактерий (табл. 11.3), адаптированными именно для данного рода микроорганизмов, с учетом диапазона значений для всех изученных штаммов видов, входящих в род Burkholderia, и соотнесения данных in vitro с клинической эффективностью, а также особенностями фармакокинетики препарата. Основой для адаптации послужили критерии чувствительности/устойчивости для бактерий семейства Pseudomonas spp. (МУК 4.2.1890-04), к которым до последнего времени относили возбудителей сапа и мелиоидоза. Диапазон значений МПК химиопрепаратов и диаметров зон подавления роста коллекционных штаммов патогенных буркхольдерий приведен в табл. 11.4. Данные свидетельствуют о гетерогенности изученных штаммов по признаку чувствительности/устойчивости к антибактериальным препаратам, что позволяет проводить оптимальный выбор комбинаций на основе данных антибиотикограммы с учетом синергидного характера их действия.
Таблица 11.1
ДОПУСТИМЫЕ КОЛЕБАНИЯ ЗНАЧЕНИЙ МПК АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ КОНТРОЛЬНЫХ ШТАММОВ P. AERUGINOSA ATCC 27853, B. MALLEI NCTC 10230 И B. PSEUDOMALLEI CIP 6086 НА СРЕДЕ МЮЛЛЕРА-ХИНТОНА
Антибактери- Диапазон значений МПК, мг/л альный
препарат P. aeruginosa B. mallei NCTC 10230 B. pseudomallei ATCC 27853 CIP 6086 1 2 3 4 Амоксициллин/ - 1,35/0,65-2,67/1,33 2,67/1,33-5,34/2,67
клавулановая кислота
Пиперациллин — 16-32 16-32
Имипенем 1-4 0,25-0,5 0,5-1,0
Меропенем 0,25-1,0 0,25-0,5 0,5-1,0
Доксициклин — 0,5-2,0 0,5-1,0
Левомицетин — 4-8 4-8
Рифампицин 16-64 2-4 8-16
Ципрофлоксацин 0,25-1,0 0,5-1,0 1-2
Офлоксацин 1-8 1-2 2-4
Ломефлоксацин 1-4 0,5-1,0 2-4
Спарфлоксацин 0,5-2,0 1-2 2-4
Цефепим 1-8 2-4 4-8
Цефтазидим 1-4 2-4 8-16
Цефтриаксон 8-64 8-16 16-32
Сульфаметокса- — 4-8 16-32 зол
Триметоприм/ 8/152-32/608 0,15/2,85-0,3/5,7 0,6/11,4-1,2/23,8 сульфаметокса- зол
Таблица 11.2
ДОПУСТИМЫЕ КОЛЕБАНИЯ ЗНАЧЕНИЙ ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ДЛЯ КОНТРОЛЬНЫХ ШТАММОВ P. AERUGINOSA ATCC 27853, B. MALLEI NCTC 10230 И B. PSEUDOMALLEI CIP 6086 НА СРЕДЕ МЮЛЛЕРА-ХИНТОНА
Антибактериальный Содержание Диаметр зон подавления роста, мм препарат препарата в диске, мкг P. aeruginosa B. mallei B. pseudomallei ATCC 27853 NCTC 10230 CIP 6086 Амоксициллин/ 20/10 - 27-28 26-27
клавулановая кислота
Пиперациллин 75 — 23-25 20-22
Имипенем 10 20-28 29-30 29-30
Меропенем 10 27-33 28-30 28-30
Доксициклин 10 — 19-20 19-20
Левомицетин 30 — 19-20 20-22
Рифампицин 30 — 20-22 19-20
Ципрофлоксацин 5 25-33 26-28 28-30
Офлоксацин 5 17-21 25-27 25-27
Ломефлоксацин 10 22-28 20-23 22-23
Спарфлоксацин 5 21-29 28-30 28-30
Цефепим 30 24-30 16-17 14-15
Цефтазидим 30 22-29 15-17 14-15
Цефтриаксон 30 17-23 19-20 14-15
Сульфаметоксазол 200 — 20-22 18-20
Триметоприм/ 1,25/23,75 — 25-26 20-22 сульфаметоксазол
Таблица 11.3
КРИТЕРИИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ РОДА BURKHOLDERIA: ПОГРАНИЧНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА (ММ) И ВЕЛИЧИН МПК (МГ/Л) АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Антибактериальный Содержа- Диаметр зон Значение МПК, препарат ние подавления роста, мг/л препарата мм в диске, мкг S R S R Амоксициллин/ 20/10 >= 21 <= 14 <= 4/2 >= 16/8
клавулановая кислота
Пиперациллин 75 >= 33 <= 25 <= 16 >= 64
Имипенем 10 >= 16 <= 13 <= 4 >= 16
Меропенем 10 >= 16 <= 13 <= 4 >= 16
Доксициклин 10 >= 16 <= 12 <= 4 >= 16
Левомицетин 30 >= 18 <= 12 <= 8 >= 32
Рифампицин 30 >= 19 <= 14 <= 4 >= 16
Ципрофлоксацин 5 >= 21 <= 16 <= 1 >= 4
Офлоксацин 5 >= 16 <= 12 <= 2 >= 8
Ломефлоксацин 10 >= 22 <= 18 <= 2 >= 8
Спарфлоксацин 5 >= 20 <= 16 <= 1 >= 2
Цефепим 30 >= 18 <= 14 <= 8 >= 32
Цефтазидим 30 >= 18 <= 14 <= 8 >= 32
Цефтриаксон 30 >= 21 <= 13 <= 8 >= 64
Сульфаметоксазол 200 >= 17 <= 12 <= 100 >= 350
Триметоприм/ 1,25/ >= 16 <= 10 <= 2/38 >= 4/76 сульфаметоксазол 23,75 Примечание: то же, что к табл. 6.3.
Таблица 11.4
ДИАПАЗОН ЗНАЧЕНИЙ МПК АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ И ДИАМЕТРОВ ЗОН ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ДЛЯ 14 ШТАММОВ B. MALLEI И 40 ШТАММОВ B. PSEUDOMALLEI
(НА СРЕДЕ МЮЛЛЕРА-ХИНТОНА)
Антибактери- Содер- Диаметр зон Значение МПК, мг/л альный жание подавления роста, мм препарат препа- рата в B. mallei B. pseudo- B. mallei B. pseudomallei диске, mallei мкг Амоксициллин/ 20/10 26-32 20-31 0,6/0,3-2,65/1,3 2,65/1,3-5,3/2,65
клавулановая кислота
Пиперациллин 75 20-30 16-31 4-16 2-16
Имипенем 10 28-35 28-32 0,125-0,5 0,5-2,0
Меропенем 10 24-35 25-32 0,125-1,0 0,25-4,0
Доксициклин 10 16-22 14-22 0,25-4,0 0,5-4,0
Левомицетин 30 14-25 14-22 4-64 4-64
Рифампицин 30 18-24 16-22 2-16 4-64
Ципрофлоксацин 5 18-30 16-30 0,025-8,0 1-16
Офлоксацин 5 22-28 18-28 0,5-8,0 1-8
Ломефлоксацин 10 24-30 20-28 0,5-2,0 1-4
Спарфлоксацин 5 18-30 16-30 1-8 2-8
Цефепим 30 14-20 13-18 2-32 4-32
Цефтазидим 30 15-26 14-22 2-16 1-64
Цефтриаксон 30 14-22 13-22 8-32 8-64
Сульфаметокса- 200 16-24 14-24 2-64 12-64 зол
Триметоприм/ 1,25/ 22-28 16-28 0,15/2,85-1,2/23,8 0,3/5,7-4/76 сульфаметокса- 23,75 зол
Приложение
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСОБО ОПАСНЫХ ИНФЕКЦИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ
- Среды для определения чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителя чумы 1.1. Среда (агар) Мюллера-Хинтона сухая (Производитель: НИЦФ, г. Санкт-Петербург). 1.2. Среда (агар) Мюллера-Хинтона М173 (Производитель: Himedia, Индия). 1.3. Агар Хоттингера, pH 7,2 +/- 0,1, с содержанием 1,2-1,4 г/л аминного азота (Производитель: отделы питательных сред противочумных институтов). 1.4. Питательная среда для культивирования чумного микроба сухая (Производитель: ФГУЗ Иркутский НИПЧИ). 1.5. Питательная среда для определения антибиотикочувствительности микроорганизмов сухая (типа АГВ) (Производитель: ФГУП «ГНЦПМ», г. Оболенск). 1.6. Сухой питательный агар АГВ (Производитель: ФГУП «ГНЦПМ», г. Махачкала).
- Среды для определения чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителя сибирской язвы Пункты: 1.1, 1.2, 1.3, 1.5, 1.6.
- Среды для определения чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителя холеры Пункты: 1.1, 1.2, 1.3, 1.5, 1.6.
- Среды для определения чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителя бруцеллеза 4.1. Агар Мюллера-Хинтона (п.п. 1.1, 1.2) с добавлением ростовых компонентов (г/л среды): MgSO4 — 0,05; FeSO4 — 0,1; L-цистеин — 0,6; лимоннокислый натрий — 1,2; KCl — 2; K2HPO4 — 4; глюкоза — 15. Стерильные (кипячение 20 мин.) ростовые добавки вносят в растопленный и остуженный агар перед разливанием его в чашки Петри. 4.2. Питательная среда для выделения и культивирования бруцелл сухая (эритрит-агар) (Производитель: ФГУП, ГНЦПМ, г. Махачкала) с добавлением ростовых компонентов по прописи п. 4.1. 4.3. Агар LB (г/л): триптон Bacto — 10; дрожжевой экстракт Bacto — 5; NaCl — 10 с добавлением ростовых компонентов по прописи п. 4.1.
- Среды для определения чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителя туляремии 5.1. Пункты: 4.1, 4.2, 4.3. 5.2. Питательная среда для выделения возбудителя туляремии сухая (АДЭТ) (Производитель: НИПЧИ, г. Ростов-на-Дону).
- Среды для определения чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителей сапа и мелиоидоза Пункты: 1.1, 1.2.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АБП — антибактериальные препараты
АГВ — агар Гивенталя — Ведьминой
ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения ДДМ — диско-диффузионный метод
КОЕ — колониеобразующая единица
МПК — минимальная концентрация АБП, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма МСР — метод серийных разведений
МФА — метод флюоресцирующих антител
ПБА — патогенный биологический объект
ПЦР — полимеразная цепная реакция
РНГА — реакция непрямой гемагглютинации ATCC — American Type Culture Collection — Американская коллекция типовых культур микроорганизмов CA SFM — Comite de l’Antibiogramme de la Societe Francaise de Microbiologie — Комитет по антибиотикограммам Французского общества микробиологов
Введен в действие с 1 июня 2009 года (пункт 3 данного документа). Текст документа
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
1 апреля 2009 г.
Дата введения —
1 июня 2009 года
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОРГАНИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ИЗ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2494-09
- Разработаны ФГУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора, ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН, ФГУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Воронежской области, Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
- Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 марта 2009 г. N 1).
- Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко и введены в действие 1 июня 2009 г.
- Введены впервые.
- Область применения
1.1. Методические указания предназначены для использования специалистами органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами лечебно-профилактических организаций, научно-исследовательских институтов и других заинтересованных организаций. 1.2. В настоящих Методических указаниях определены основные правила сбора полевого и клинического материала, предназначенного для анализа на хантавирусы методом ПЦР. Описаны порядок упаковки, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологических образцов, зараженных или подозрительных на зараженность хантавирусами. Предложены унифицированные методические подходы для проведения молекулярно-генетических исследований по генотипированию хантавирусов.
2. Нормативные ссылки
2.1. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». 2.2. СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности». 2.3. МУ 3.1.1029-01 «Отлов, учет и прогноз численности мелких млекопитающих и птиц в природных очагах инфекций». 2.4. МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности». 2.5. СП 3.1.099-96 «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом».
3. Общие положения
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) — вирусный нетрансмиссивный зооноз, широко распространенный в Евразии, а в России занимающий первое место по заболеваемости среди природно-очаговых инфекций. Возбудители ГЛПС — вирусы Пуумала, Хантаан, Сеул, Добрава и Амур — относятся к роду Hantavirus (семейство Bunyaviridae), который включает в настоящее время более 30 различных хантавирусных серотипов или генотипов. Большинство из них являются патогенными для человека. Хантавирусы эволюционно тесно связаны с определенными видами грызунов из семейств Arvicolinae и Murinae (полевки, мыши, крысы). Вирусы передаются преимущественно респираторным путем, а источником заражения людей служат теплокровные носители, выделяющие вирус с экскретами во внешнюю среду. На территории России эпидемически активные очаги ГЛПС расположены в основном в умеренных широтах европейской части и на Дальнем Востоке. Более 95% случаев заражения ГЛПС происходят в европейских очагах, приуроченных к лесным ландшафтам. Здесь циркулирует хантавирус Пуумала, основным резервуаром которого в природе является европейская рыжая полевка (Myodes glareolus). Наиболее активная очаговая территория расположена в оптимуме ареала рыжей полевки — в широколиственных и хвойно-широколиственных лесах Приуралья и Среднего Поволжья. Почти 90% всех зарегистрированных случаев заражения ГЛПС в Российской Федерации приходится на Приволжский федеральный округ. В дальневосточных регионах России ГЛПС вызывается хантавирусами Хантаан, Амур и Сеул, природным резервуаром которых являются полевая мышь (Apodemus agrarius), восточно-азиатская мышь (Apodemus peninsulae) и серая крыса (Rattus norvegicus) соответственно. Полученные в последнее десятилетие данные существенно меняют сложившиеся представления об этиологической природе заболеваемости ГЛПС на европейской части России, где ранее все случаи заражения ГЛПС связывали с вирусом Пуумала. В ходе комплексных клинико-эпидемиологических, эпизоотологических и лабораторных исследований были выявлены природные очаги, где циркулируют ранее неизвестные, высоко патогенные для человека вирусы — возбудители ГЛПС, относящиеся к двум иммунологически и генетически отличающимся подтипам вируса Добрава. Один из них обнаружен в популяции кавказской лесной мыши (Apodemus ponticus) в субтропической зоне Краснодарского края (Большой Сочи), другой — у полевых мышей (Apodemus agrarius) в центральных областях европейской части России. Установлено, что штаммы из этих регионов имеют существенные биологические отличия, характеризуются значительной генетической разнородностью и различным уровнем вирулентности. В последние годы были обнаружены новые природные очаги вируса Добрава на территории Самарской, Астраханской и Омской областей. Однако окончательный вывод об ареале подвидов вируса Добрава и нозоареале ГЛПС — ДОБ на территории России можно будет сделать лишь после проведения более широких исследований. Многообразие клинических проявлений, а также существование стертых и атипичных клинических форм при ГЛПС нередко затрудняет дифференциальную диагностику болезни, в связи с чем для верификации диагноза необходимы лабораторные исследования. Для специфической диагностики ГЛПС в России широко применяются 2 вида диагностикумов: для проведения непрямого МФА (для серодиагностики ГЛПС у больных) и ИФА для выявления хантавирусного антигена. В свете задач по совершенствованию специфической диагностики ГЛПС, повышения качества и эффективности проводимых исследований, своевременного реагирования в случае возникновения эпидемических проявлений хантавирусных инфекций на территории Российской Федерации актуальным является более широкое применение молекулярно-генетических методов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является практически единственным методом, позволяющим осуществлять прямую детекцию хантавирусов в полевом и клиническом материале. Преимущества молекулярно-генетических методов приобретают особое значение при изучении хантавирусов, поскольку эти вирусы плохо размножаются в клеточных культурах, не обладают цитопатическим действием и не имеют удачной лабораторной модели инфекции. В некоторых случаях геном хантавирусов был охарактеризован задолго до того, как были выделены хантавирусные штаммы, либо, когда выделение вируса вовсе не представлялось возможным.
4. Сбор, хранение и транспортирование
материалов, предназначенных для исследования молекулярно-генетическими методами
4.1. Мониторинг за возбудителями ГЛПС, исследование биологического материала иммунологическими методами проводят на базе федеральных государственных учреждений здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъектах Российской Федерации. Проведение ПЦР осуществляется в специализированных лабораториях, имеющих необходимый набор помещений, укомплектованных сертифицированным ПЦР-оборудованием в строгом соответствии с требованиями МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности». Исследования проводят врачи, прошедшие обучение на курсах повышения квалификации и получившие сертификат специалиста по генодиагностике инфекционных заболеваний. Порядок ПЦР-исследований материала, подозрительного на зараженность хантавирусами, проводимых на базе специализированных лабораторий, определен ниже (п.п. 4.2-4.4, 6.1-6.5). 4.2. Сбор клинического материала осуществляет медицинский персонал лечебно-профилактического учреждения, обученный правилам работы с ООИ. Наиболее информативным клиническим материалом для исследования методом ПЦР является кровь (плазма крови) от больных ГЛПС, полученная не позднее 8 сут. от начала заболевания. Взятие крови у больных пациентов проводится в герметично закрывающуюся пробирку с 6%-ным раствором ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) в соотношении 1:20 или пробирку с 3,8%-ным раствором цитрата натрия в соотношении 1:9. Использование гепарина в качестве антикоагулянта не допускается. Для получения плазмы закрытые пробирки с кровью несколько раз переворачивают для смешивания с консервантом и затем центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 3-5 мин. Чтобы не допускать повторного замораживания проб, аликвоты плазмы предварительно разливают по 200-300 мкл в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл. Для выделения РНК используют 100 мкл плазмы крови, остаток материала замораживают и сохраняют при температуре минус 20 град. C до конца исследования. 4.3. Сбор полевого материала для исследования на хантавирусы, а также отлов мышевидных грызунов и учет их численности проводится в соответствии с нормативными методическими документами. Пункты учета и отлова выбираются в соответствии с возможностью изучения относительной численности и видового состава мелких млекопитающих в совокупности с наибольшим числом доступных стаций (открытых и закрытых лугополевых, лесокустарниковых, околоводных). В выбранных стациях в вечерние часы зоологами выставляются линии из больших или малых ловушек. В утренние часы следующего дня производится выемка мелких млекопитающих из ловушек, учет и упаковывание в тканевые мешочки или прочные одноразовые полиэтиленовые пакеты (каждая особь в отдельную упаковку). Далее в лаборатории ООИ проводят вскрытие зверьков в следующем порядке. При вскрытии животных под контролем опытного зоолога проводится определение возрастного и полового состава добытых особей, их репродуктивной активности, уточнение видовой принадлежности. Для проведения лабораторных исследований на хантавирусы от каждого зверька в стерильные одноразовые пробирки (типа «Эппендорф») отдельно отбирают: легкое, сердце, печень, полоску фильтровальной бумаги, пропитанную кровью из грудной полости или сердца. Пробирки нумеруются согласно протоколу вскрытия и замораживаются в сосуде Дьюара (в жидком азоте) или в сумке-холодильнике с сухим льдом. С целью предотвращения контаминации место разреза перед вскрытием зверька тщательно протирают одноразовым ватно-марлевым тампоном, обильно смоченным 96%-ным спиртом. Во время вскрытия зверьков используют два набора стерильных пинцетов и ножниц. Одним набором делают разрез кожи и подкожной клетчатки, вторым — брюшной и грудной стенок, отбор частей легкого, печени и сердца. После вскрытия каждого зверька оба набора инструментов тщательно протирают ватно-марлевым тампоном, пропитанным антисептиком, и стерилизуют в пламени спиртовки. При исследовании полевого материала методом ПЦР готовят суспензии органов, для чего кусочки ткани размером 1-2 см растирают стерильно пестиком в фарфоровой ступке, постепенно добавляя 1-2 мл 0,15 М раствора натрия хлорида. Для каждого образца используется стерильный инструментарий и отдельный набор из пестика и ступки. Для выделения РНК используют 150 мкл суспензии, остаток материала замораживают и сохраняют при температуре минус 20 град. C до конца исследования. 4.4. Упаковка, условия хранения и транспортирования материалов для проведения лабораторной диагностики ГЛПС должны соответствовать требованиям нормативных методических документов. Все материалы, доставляемые для исследования в лабораторию, должны быть герметично упакованы в плотно закрывающиеся пластмассовые пробирки или флаконы с завинчивающимися крышками, помещенными в полиэтиленовый пакет с ватой (или другим гигроскопичным материалом). В полиэтиленовый пакет вкладывают бланк направления с указанием: наименования направляющего учреждения, Ф.И.О. больного, его возраста и местожительства, предварительного диагноза, вида материала, даты и времени взятия материала. Все пробирки, флаконы и прочие емкости должны быть маркированы в соответствии с направляемым списком. Герметично закрытые полиэтиленовые пакеты помещают в термоконтейнер (термос) с охлаждающими элементами или пакетами со льдом. 4.5. После забора клинического материала в больничном стационаре образцы крови с консервантом доставляются в ПЦР-лабораторию в охлажденном состоянии не позднее 12 ч с момента взятия, образцы плазмы — не позднее 2 сут. (при температуре не выше 2-4 град. C). При транспортировании и хранении материалов следует избегать повторного размораживания проб. При необходимости образцы полевого и клинического материалов (суспензии органов и плазму крови) можно хранить в течение 3-6 мес. при температуре не выше минус 20 град. C.
5. Рекомендуемые наборы реактивов, оборудования и расходных материалов для проведения анализа методом ПЦР
5.1. На этапах подготовки проб для исследования и анализа результатов ПЦР необходимо использовать только сертифицированные наборы реактивов (Прилож. 3). Использование сертифицированных тест-систем и наборов реактивов возможно только для научных целей. 5.2. При проведении ПЦР-исследований рекомендуется использовать оборудование и расходные материалы, перечень которых приводится в МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности».
6. Схема проведения ПЦР-исследований полевого и клинического материала на наличие хантавирусов
Для исследований полевого и клинического материала методом ПЦР применяется традиционная схема анализа, включающая экстракцию РНК, обратную транскрипцию, постановку ПЦР и учет результатов. Требования и рекомендации по использованию необходимых наборов реактивов, оборудования и расходных материалов для проведения ПЦР-исследований приведены выше (п.п. 5.1, 5.2). 6.1. Описание методики выделения РНК из плазмы крови. РНК из плазмы крови выделяют методом нуклеосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата. Для этого в каждую пробирку вносят по 450 мкл лизирующего раствора (в состав которого входят: гуанидинтиоцианат — 5,2 М; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты — Na2-ЭДТА — 12,5 мМ; трис-(оксиметил)-аминометан-гидрохлорид-трис-HCl — 10 мМ; тритон Х-100 — 2%) и добавляют 100 мкл исследуемого образца, используя наконечники с аэрозольным барьером. Плотно закрытые пробирки с пробами тщательно перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 с при 5 тыс. об./мин. на микроцентрифуге для удаления капель. В каждую пробирку отдельным наконечником добавляют по 30 мкл ресуспендированного сорбента, представляющего собой 40%-ную суспензию силикагеля в деионизованной воде, и оставляют в штативе на 5 мин., периодически встряхивая содержимое на вортексе. Для осаждения сорбента все пробирки центрифугируют при 10 тыс. об./мин. в течение 30 с на микроцентрифуге. Затем проводят удаление супернатанта, используя для этого вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. Далее в каждую пробирку добавляют по 400 мкл раствора для отмывки (состоящего из: гуанидинтиоцианата — 5,0 М; Na2-ЭДТА — 0,0125 М; трис-HCl — 0,01 М), перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента и центрифугируют 30 с при 10 тыс. об./мин. Удаляют супернатант, как описано выше. Добавляют в пробирки по 500 мкл 70%-ного раствора этилового спирта, тщательно ресуспендируют сорбент на вортексе и центрифугируют 30 с при 12 тыс. об./мин. После удаления супернатанта повторяют отмывку спиртом аналогичным способом. Добавляют в пробирки по 400 мкл ацетона, тщательно ресуспендируют сорбент на вортексе и центрифугируют 30 с при 10 тыс. об./мин. После тщательного удаления супернатанта из каждой пробирки их помещают с открытыми крышками в термостат при температуре 60 град. C на 7 мин. для подсушивания сорбента. В заключение в пробирки добавляют по 50 мкл раствора для элюции (трис-HCl 0,01 М; Na2-ЭДТА — 0,001 М) и прогревают в термостате при 56 град. C в течение 7 мин., периодически встряхивая на вортексе. Центрифугируют пробирки при 12 тыс. об./мин. в течение 2 мин. Полученный супернатант используют для постановки реакции обратной транскрипции и ПЦР. 6.2. Описание методики выделения РНК из суспензий внутренних органов мелких млекопитающих. Для экстракции РНК из легочных суспензий используют двухэтапную экстракцию РНК. На первом этапе: в пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающимися или плотно закрывающимися крышками вносят по 400 мкл лизирующего раствора (в состав которого входят: гуанидинтиоцианат — 25%; цитрат натрия — 0,12 мМ (рН = 7,0); саркозил натрия — 0,26%; кислый фенол — 44% и меркаптоэтанол — 0,35%). В пробирки с лизирующим буфером добавляют по 150 мкл образца, используя наконечник с аэрозольным барьером. Плотно закрывают крышки и перемешивают на вортексе. Далее к лизированным образцам добавляют 30 мкл ацетата натрия — 0,1 М (рН = 4,0), перемешивают на вортексе и центрифугируют 5 с при 10 тыс. об./мин. В эти же пробирки добавляют 300 мкл буфера (кислый фенол), перемешивают на вортексе и центрифугируют 5 с при 10 тыс. об./мин. Далее вносят в пробирки по 100 мкл хлороформа, встряхивают на вортексе в течение 1 мин. и помещают в холодильник при 2-8 град. C на 10 мин. Затем центрифугируют пробирки в течение 10 мин. при 12-14 тыс. об./мин. Для проведения второго этапа экстракции осторожно вынимают пробирки из центрифуги и, не задевая промежуточной фазы, переносят 450 мкл водной фазы в пробирку, содержащую 450 мкл лизирующего буфера и 30 мкл сорбента, и последовательно повторяют все процедуры экстракции РНК, описанные выше в п. 6.1 (методика выделения РНК из плазмы крови). 6.3. Описание методики проведения обратной транскрипции для получения кДНК. Обратную транскрипцию проводят со случайными праймерами. Готовится общая реакционная смесь из расчета количества анализируемых образцов. Для этого в пробирку с 0,02 М дитиотрейтолом (ДТТ) добавляют 125 мкл реакционной смеси, содержащей: дезоксинуклеозидтрифосфаты — дНТФ в концентрации 0,002 М; трис-(оксиметил)-аминометан-гидрохлорид (трис-HCl) — 0,1 М; калия хлорид — 0,15 М; магния хлорид — 0,006 М; случайные праймеры — 3 ОЕ/мл. К полученному раствору добавляют 6 мкл ревертазы (MMLV) в концентрации 200 Ед./мкл и все реагенты аккуратно перемешивают на вортексе 1-2 с. Реакция проводится в реакционном буфере в объеме 60 мкл (с учетом 30 мкл пробы). Для этого в каждую пробирку вносят по 30 мкл готовой реакционной смеси и добавляют 30 мкл РНК-пробы, затем все осторожно перемешивают и помещают в термостат при 37 град. C на 30 мин. В результате реакции обратной транскрипции получают кДНК, которую используют для последующей постановки ПЦР. 6.4. Описание методики проведения ПЦР. Реакция проводится в растворе следующего состава: смесь дНТФ в концентрации 1 мМ; фермент ДНК-полимераза «ДиаТак» — 0,1 ед./мкл, трис-HCl — 0,17 М; аммония сульфат — 42 мМ; магния сульфат — 7,5 мМ; бычий сывороточный альбумин — 0,25 г/л; Tween-20 — 0,025%; глицерин — 20%; ксиленцианол — 0,02% и смесь из двух праймеров Hant S/F — Hant S/R или Hant M/F — Hant M/R (Прилож. 4), каждый в концентрации 3 пмоль/мкл. Реакция проводится в реакционном буфере в объеме 25 мкл (с учетом 10 мкл кДНК) при использовании режима «горячего старта». При этом реакционная смесь (нижняя), содержащая праймеры и дезоксинуклеозидтрифосфаты, должна быть отделена слоем воска от верхней реакционной смеси, содержащей ПЦР-буфер и фермент. Расплавление воска и перемешивание смесей происходит только после запуска программы, что улучшает качество анализа в целом. ПЦР проводят на амплификаторах с применением активного режима термоциклирования. Оптимальные температурно-временные параметры на приборе (типа «Терцик») следующие: денатурация 95 град. C в течение 5 мин., затем 95 град. C — 10 с, 62 град. C — 10 с, 72 град. C — 10 с — 2 цикла; 95 град. C — 10 с, 60 град. C — 10 с, 72 град. C — 10 с — 2 цикла; 95 град. C — 10 с, 58 град. C — 15 с, 72 град. C — 15 с — 38 циклов, заключительная элонгация 72 град. C — 3 мин. 6.5. Описание методики учета результатов ПЦР методом электрофореза. Продукты амплификации, полученные в ПЦР, анализируют методом горизонтального электрофореза в агарозном геле и 1 х ТБЕ (трисборатном) буфере. Готовят рабочий электрофорезный ТБЕ-буфер, состоящий из: трис-HCl — 0,9 М; Na2-ЭДТА — 0,02 М; борной кислоты — 0,9 М; этидия бромида — 20 мкг/мл. В стеклянную колбу из термостойкого стекла на 250 мл помещают 1,8 г агарозы, добавляют 100 мл рабочего буфера и нагревают до полного растворения агарозы. Затем расплавленный гель охлаждают до 65-70 град. C и заливают в подготовленную заранее форму камеры с гребенкой (толщина геля около 0,6 см). Для анализа ПЦР-продукта используют 10-15 мкл пробы, которую вносят в лунки геля. Продолжительность электрофореза составляет 18-20 мин. После проведения электрофореза гель переносят на трансиллюминатор и фотографируют с помощью видеосистемы (типа «Gel Doc 2000»). Длина специфических амплифицированных фрагментов кДНК при использовании универсальных праймеров Hant S/F — Hant S/R (Прилож. 4) составляет для вируса Пуумала 475 п.н., для вируса Тула — 466 п.н., для вирусов Добрава, Сеул, Хантаан — 463 п.н.; при использовании универсальных праймеров Hant M/F — Hant M/R (Прилож. 4) длина специфически амплифицированного фрагмента для всех вирусов комплекса ГЛПС составляет 327 п.н. 6.6. Подтверждающее тестирование образцов на ГЛПС и генотипирование хантавирусов осуществляется в Референс-центре на базе ГУ ИПиВЭ им. М.П.Чумакова РАМН (Прилож. 1). Для этого необходимо собрать материал от грызунов и больных людей, как указано в п.п. 4.2-4.3. Собранный материал должен быть предварительно протестирован с помощью одной из сертифицированных тест-систем, перечисленных в Прилож. 2. Протестированный материал, упакованный согласно п. 4.4, направляется в Референс-центр по указанному адресу (Прилож. 1).
7. Генотипирование хантавирусов и интерпретация полученных результатов
Известно, что метод секвенирования считается «золотым стандартом» для типирования вирусов. Учитывая высокое разнообразие и недостаточную изученность спектра хантавирусов, циркулирующих на территории России, является целесообразным проведение секвенирования кДНК хантавирусов. Пробы с высокой вирусной нагрузкой, полученные в результате ПЦР с обратной транскрипцией, могут быть секвенированы на базе лаборатории, оснащенной необходимым оборудованием. После визуального учета на электрофорезе качества полученных ампликонов оставшуюся часть пробы (15-20 мкл) подвергают очистке. Для этого амплификат переносят в пробирку объемом 1,5 мл, смешивают с равным объемом смеси фенол — хлороформ (1:1) и перемешивают до образования эмульсии. Для разделения водной и органической фаз образцы центрифугируют на настольной центрифуге в течение 15-30 с при 12000 об./мин. Затем верхний (водный) слой переносят в новую пробирку, добавляют повторно равный объем смеси фенол — хлороформ (1:1), перемешивают и центрифугируют в том же режиме. После этого отбирают водную фазу, добавляют одну десятую объема 3 М натрия ацетата и тщательно перемешивают. Добавляют два объема охлажденного во льду 96%-ного этанола, перемешивают и охлаждают 10 мин. при 0 град. C. После центрифугирования (в режиме — 10 мин. при 12000 об./мин.) удаляют надосадочную жидкость, полученный осадок промывают 70%-ным этанолом, подсушивают и растворяют в 50 мкл буфера (трис-HCl 0,01 М; Na2-ЭДТА — 0,001 М). После очистки проб проводят их секвенирование, используя для этого капиллярный автоматический секвенатор (типа «ABI-3100 PRISM») и соответствующий ему набор реактивов. В качестве инициирующих олигонуклеотидов для секвенирования используют универсальные праймеры (Прилож. 4), с помощью которых были получены амплифицированные в ПЦР фрагменты ДНК. Полученные последовательности нуклеотидов анализируют с помощью программы «MEGA». Нуклеотидные последовательности новых РНК-изолятов сравнивают с полными нуклеотидными последовательностями S- и (или) М-сегментов штаммов хантавирусов, зарегистрированных в международной базе данных «GenBank», или ранее выявленными изолятами, нуклеотидные последовательности которых лежат в области, ограниченной универсальными праймерами (Прилож. 4). Для сравнения рекомендуется использовать РНК-изоляты (фрагменты М- и S-сегментов) хантавирусов Добрава, Пуумала и Тула, выявленные на территории России в 2003-2008 гг., имеющие следующие номера в «GenBank»: DQH64647-64671; DQH64673-64687; DQ061259; DQ061265-DQ061269; EU549802-549815; EU562892-563018; EU652421-EU652443. Использование для амплификации и секвенирования хантавирусов рекомендуемых универсальных праймеров имеет ряд преимуществ: — позволяет пополнить уже имеющуюся информационную базу данных, включающую более 200 РНК-изолятов хантавирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации; — значительно упрощает и ускоряет процедуру секвенирования (за счет возможности использования коротких фрагментов генома для сравнения); — позволяет интерпретировать полученные результаты, т.е. определять географическую принадлежность новых РНК-изолятов, оценивать степень гетерогенности существующих в природе популяций, выявлять уровень сходства и различий «новых» от ранее выявленных штаммов. Информация, полученная в результате генотипирования хантавирусов, является эпидемиологически значимой, может представлять особую важность при определении эпидемического потенциала природных очагов ГЛПС и оценке уровня опасности «новых» штаммов для человека. Унификация методических подходов для проведения молекулярно-генетических исследований предоставляет возможность создания единой информационной базы данных, позволяющей анализировать, интерпретировать и сопоставлять новую информацию с ранее полученными результатами.
Список сокращений
ГЛПС — геморрагическая лихорадка с почечным синдромом ДОБ — вирус Добрава
ПУУ — вирус Пуумала
ИФА — иммуноферментный анализ
МФА — метод иммунофлуоресценции
ОТ-ПЦР — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией кДНК — комплементарная ДНК
ООИ — особо опасные инфекции
н.п. — нуклеотидная последовательность
п.н. — пара нуклеотидов
Приложение N 1
КООРДИНАТЫ РЕФЕРЕНС-ЦЕНТРА, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩЕГО ДОПОЛНИТЕЛЬНОЕ ПОДТВЕРЖДАЮЩЕЕ ТЕСТИРОВАНИЕ И ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ВИРУСОВ КОМПЛЕКСА ГЛПС
- Референс-центр по мониторингу за полиомиелитом, ГЛПС, клещевым вирусным энцефалитом на базе ГУ ИПиВЭ им. М.П.Чумакова РАМН. 142782, Московская обл., Ленинский р-н, пос. Институт полиомиелита. Тел.: (495)439-90-94. Факс: (495)439-93-21. E-mail: [email protected], [email protected]
Приложение N 2
ПЕРЕЧЕНЬ
СЕРТИФИЦИРОВАННЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ПОДТВЕРЖДЕНИЯ ДИАГНОЗА ГЛПС У БОЛЬНЫХ ЛЮДЕЙ И ПРОВЕДЕНИЯ СКРИНИНГОВЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НА НАЛИЧИЕ ХАНТАВИРУСНОГО АНТИГЕНА У НОСИТЕЛЕЙ ХАНТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
«Культуральный поливалентный диагностикум ГЛПС для непрямого МФА» — для выявления специфичных антител в сыворотках крови больных людей (производства ГУ ИПиВЭ им. М.П.Чумакова РАМН) «Иммуноферментная тест-система (Хантагност)» — для выявления хантавирусного антигена (производства ГУ ИПиВЭ им. М.П.Чумакова РАМН)
Приложение N 3
ПЕРЕЧЕНЬ
НАБОРОВ РЕАКТИВОВ, РЕКОМЕНДУЕМЫХ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА НА ГЛПС
Для проведения молекулярно-генетических исследований биологического материала на ГЛПС возможно использование любых сертифицированных наборов реактивов, предназначенных для выделения РНК, постановки ПЦР, обратной транскрипции и электрофореза. Пример комплектации сертифицированных наборов реагентов (производства ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора»), необходимых для проведения ПЦР-исследований на хантавирусы: — «РИБО-сорб» — комплект реагентов, предназначенный для выделения РНК/ДНК из клинического материала методом аффинной сорбции на частицах силикагеля; — «РИБО-золь-В» — для выделения РНК из клинического материала (лейкоцитов крови, суспензий клеток, гомогенизированных биоптатов) методом гуанидин-фенол-хлороформовой экстракции; — «Реверта» — комплект реагентов, предназначенный для получения кДНК на матрице РНК; — «ЭФ-200» — комплект реагентов, предназначенный для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле. Тест-система «АмплиСенс(R) Хантавир» (производства ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора»), предназначенная для выявления РНК хантавирусов комплекса ГЛПС в полевом и в клиническом материале методом ПЦР, так же, как и другие ПЦР тест-системы, доступные для потребителя, но не имеющие сертификата и государственной регистрации, могут быть использованы только для научных целей.
Приложение N 4
НАБОРЫ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГЕНОТИПОВ ХАНТАВИРУСОВ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Наименование Нуклеотидная последовательность Позиция Штамм, сегмент
5′ — 3′ генома
Универсальные праймеры для детекции вирусов комплекса ГЛПС
Hant M/F ATC(T/A)ATAGAIGGTGCATGGIGTTCTG 2971-2996 Dobrava, SK/Aa AY961616, Hant M/R CCACATT1AGGTGCICCATCATC 3297-3275 М-сегмент Hant S/F TT(C/T)AA(G/A)GATGACA(C/G)CTCATT 475-501 Puumala, TGAGGAT CG17/Baskiria- 2001 AF442613, Hant S/R C(T/A)GGTGC(A/C)CA(A/G)GCAAA(T/G) 949-928 S-сегмент ACCCA
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ
ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ
ПИСЬМО
1 апреля 2009 г.
N 01И-173/09
О ПОРЯДКЕ ПРОДЛЕНИЯ СРОКОВ ЭКСПЛУАТАЦИИ РЕНТГЕНОВСКОЙ АППАРАТУРЫ
В эксплуатации лечебно-профилактических учреждений РФ насчитывается более 35 тысяч рентгенодиагностических аппаратов различного назначения, часть из которых исчерпала установленный ресурс и подлежит утилизации. По оценке специалистов Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития, в целях рациональной организации рентгенодиагностической службы РФ и обеспечения радиационной безопасности пациентов в соответствии с Федеральным законом N 3-ФЗ от 9 января 1996 года «О радиационной безопасности населения» необходимо при продлении срока действия технического паспорта на рентгеновские кабинеты с оборудованием, исчерпавшим установленный в документации срок службы, проведение оценки технического состояния указанного оборудования с целью решения вопроса о его дальнейшем использовании. Информация о возможности продления сроков эксплуатации медицинской техники доведена до сведения органов управления здравоохранением в субъектах Российской Федерации письмом от 19.04.2006 N 0100/4476-06-32 Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Возможностями и ресурсами для оказания научно-методической помощи, проведения экспертизы результатов испытаний аппаратуры, исчерпавшей ресурс, и решения вопроса о возможной эксплуатации и модернизации располагают следующие научные медицинские учреждения: — Федеральное государственное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» Росздравнадзора, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, стр. 16. Тел. 210-80-02, тел./факс: 8-499-503-96-52; — Государственное учреждение здравоохранения «Научно-практический центр медицинской радиологии», г. Москва, ул. Средняя Калитниковская, д. 28. Тел. 678-54-95. Прошу руководителей органов исполнительной власти в сфере здравоохранения субъектов Российской Федерации принять во внимание настоящие рекомендации.
Руководитель
Н.В.ЮРГЕЛЬ
Департамента здравоохранения г. Москвы от 02.04.2009 N 31/101-инф.
След.Государственный доклад Роспотребнадзора «О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2008 году» «Результаты радиационно-гигиенической паспортизации в субъектах Российской Федерации за 2008 год (Радиационно-гигиенический паспорт Российской Федерации)» (утв. Роспотребнадзором)
Товары
-
Современная эндодонтия
342 ₽
-
ECG Tutor
342 ₽
-
Книги по химии 12
342 ₽
-
Endocrinology Books
342 ₽
-
Книги по биологии 1
479 ₽
-
Interactive radiology review and Assessment
684 ₽
-
Endocrinology Books
342 ₽
-
Immunology Books 5
342 ₽
-
Neurology Books 5
342 ₽