"МУК 4.2.2879-11. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах. Дополнения и изменения 1 к МУК 4.2.2429-08. Методические указания" (утв. Роспотребнадзором 26.06.2011) "Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах. Методические указания. МУК 4.2.2429-08" (утв. Роспотребнадзором 29.10.2008) (ред. от 26.06.2011) "МУК 4.2.2878-11. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах. Дополнения и изменения 1 к МУК 4.2.2321-08. Методические указания" (утв. Роспотребнадзором 24.06.2011) "Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах. Методические указания. МУК 4.2.2321-08" (утв. Роспотребнадзором 24.01.2008) (ред. от 24.06.2011) Приказ Минздрава МО от 21.06.2011 N 504 "О реализации мероприятий подпрограммы "Модернизация здравоохранения Московской области на 2011-2012 годы" (вместе с "Информацией по подготовке и реализации мероприятий подпрограммы "Модернизация здравоохранения Московской области на 2011-2012 годы")

Введен в действие с 26 июня 2011 года.
Текст документа

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
26 июня 2011 года

Дата введения —
с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВЫХ
ЭНТЕРОТОКСИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

ДОПОЛНЕНИЯ И ИЗМЕНЕНИЯ 1 К МУК 4.2.2429-08

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2879-11

Разработаны Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания; ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития; ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» при участии фирмы «BioMerieux».
Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).
Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 26 июня 2011 г.
Введены в действие с 26 июня 2011 г.
Введены впервые.

Внести дополнения и изменения в МУК 4.2.2429-08: 1. Раздел 1 «Область применения» дополнить пунктом 1.5 следующего содержания: «1.5. Настоящие методические указания устанавливают также метод качественного обнаружения стафилококковых энтеротоксинов типов A, B, C1, C2, C3, D, E (при совместном определении) в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, в мясе и мясопродуктах; в птице и птицепродуктах) на основе фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов при использовании данного метода составляет не менее 1,0 мкг/кг». 2. В разделе 3 «Сущность метода» пункт 3.1 изложить в следующей редакции: «3.1. Методы основаны на детекции СЭТ, продуцируемых Staphylococcus aureus и другими коагулазоположительными стафилококками, в подготовленной соответствующим образом пробе пищевого продукта путем постановки иммунохимических тестов непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющего обнаруживать эпидзначимые типы стафилококковых энтеротоксинов A (СЭА) или B (СЭВ) при раздельном определении (тест-системы по ВФС 42-235 и 42-236, ВС 89), а также энтеротоксины типов A, B, C, D и E при совместном дифференцированном и недифференцированном определении». 3. Раздел 3 «Сущность метода» дополнить пунктами 3.5, 3.6 и 3.7 следующего содержания: «3.5. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (ФС-ИФА) стафилококковых энтеротоксинов основан на связывании СЭТ, экстрагированных из пищевого продукта, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, конъюгированных щелочной фосфатазой и флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата). Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм дважды для каждого образца: перед внесением субстрата (фон) и после накопления продуктов гидролиза — флюоресцентного 4-метил-умбеллиферола, который катализируется щелочной фосфатазой. 3.6. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы, позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферола при 450 нм и тест-наборы, в состав которых входят наконечники, сенсибилизированные антителами к СЭТ типов A, B, C, D, E, используемые в качестве пипетирующего устройства; и стрипы из 10 лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюоресцентного анализа. 3.7. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы и тест-наборы, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке». 4. Раздел 4 «Требования к выполнению анализов» изложить в новой редакции:

«4. Требования к выполнению анализов

4.1. Условия безопасного проведения работ

При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на приборы. Анализатор должен находиться в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила: — не использовать наконечники с поврежденной упаковкой; — не использовать поврежденные стрипы;
— не использовать набор по истечении срока годности; — не смешивать реактивы из различных партий; — положительный контроль и стандарт содержат очищенный стафилококковый энтеротоксин. При работе соблюдать осторожность. Работать в защитной одежде, перчатках, очках. При попадании внутрь следует немедленно обратиться к врачу; — реактивы содержат натрия азид, который со свинцом и медью образует взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их накопления; — пролитые жидкости необходимо тщательно вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие отбеливатель; — анализаторы необходимо регулярно чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

4.2. Требования к квалификации специалистов

Выполнение измерений может проводить специалист, способный после освоения техники иммуноферментного анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности.

4.3. Условия выполнения измерений

Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях: — температура окружающего воздуха (20 +/- 5) °С; — атмосферное давление (97 +/- 10) кПа; — относительная влажность (65 +/- 15) %». 5. Раздел 5 «Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы»: Пункт 5.1 «Средства измерений и вспомогательное оборудование» дополнить следующей позицией: «Автоматический иммуноферментный анализатор типа VTDAS BioMerieux(R) или mini VTDAS BioMerieux(R), Франция или аналогичного типа». Пункт 5.2 «Лабораторная посуда и инструменты» дополнить следующими позициями: «Шприцы на 20 мл
Пипетка одноразовая на 500 мкл
Пакет для гомогенизации с фильтром
Центрифужные пробирки на 50 мл».
Раздел 5.3 «Реактивы и материалы» дополнить следующими позициями: «Набор реагентов типа «VIDAS(R)Staph enterotoxin II (SET2), BioMerieux(R), Франция или с аналогичными характеристиками Набор реагентов типа RIDASCREEN(R) SET Total (R-Biopharm AG, Германия) или с аналогичными характеристиками Индикатор pH (бумажный)
Трихлоруксусная кислота 90% (5,5 N)
Буфер ТРИС 0,3 М, pH 8,0
Раствор NaOH 1 N и 4 N
Соляная кислота 5 N».
6. В разделе 5 пункт 5.5 «Состав набора реагентов для иммуноферментного определения стафилококковых энтеротоксинов A, B, C, D, E» изложить в новой редакции: «В состав набора для дифференцированного определения СЭТ типов A, B, C, D, E входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 12 проб с идентификацией энтеротоксинов (включая положительный контроль). Набор для твердофазного иммуноферментного анализа СЭТ A, B, C, D, E содержит:

Микротитровальный планшет (12 х 8), 96 лунок, 1 шт. сенсибилизированные специфическими антителами к энтеротоксинам стафилококка (SET)
Положительный контроль, готовый к использованию, содержит 1 шт. энтеротоксины стафилококка A, B, C, D, E, по 2 нг/мл каждого токсина, 1,25 мл
Коньюгат антител к SET с пероксидазой хрена, готовый к 1 шт. использованию, 11 мл: красная крышка
Субстрат, содержит пероксид карбамида, 7 мл: зеленая крышка

 Хромоген, содержит тетраметилбензидин, 7 мл: голубая крышка           1 шт. Стоп-реагент, содержит 1 N серную кислоту, 14 мл: желтая крышка       1 шт. Моющий буфер, pH 7,2, концентрат, 10х, 100 мл, коричневая крышка      1 шт.

В состав набора типа RIDASCREEN(R) SET Total для недифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 96 проб (включая положительные и отрицательные контроли) без идентификации типов энтеротоксинов. Тест-набор для недифференцированного определения SET содержит:

 Отрицательный контроль, готовый к использованию, 2 мл                 1 шт. Коньюгат 1 антител к SET, готовый к использованию, 11 мл              1 шт. Коньюгат 2 с пероксидазой, готовый к использованию, 11 мл             1 шт. Субстрат/хромоген, содержит тетраметилбензидин, 10 мл                 1 шт. Стоп-реагент, содержит 1 N серную кислоту, 14 мл                      1 шт. Моющий буфер, pH 7,2, концентрат, 10х, 100 мл                         1 шт.

7. Раздел 5 дополнить пунктом 5.7. в следующей редакции:

«5.7. Состав тест-набора для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа

В состав набора должны входить материалы и реагенты в количествах, достаточных для исследования 26 проб и 4 контрольных образцов. Набор содержит следующие компоненты, готовые к использованию (табл. 1).

Таблица 1

   Компоненты набора  Обозна-                    Состав                                           чение                                                                                                                               30 стрипов для      STR     См. табл. 2

определения СЭТ

  30 наконечников с   SPR     На внутреннюю поверхность наконечников SPR(R)   конъюгированными            нанесены антитела к стафилококковым             антителами                  энтеротоксинам                                                                                                              Стандарт            S1      Очищенный энтеротоксин А (< 1,0 нг/мл) + кон-   (1 флакон х 6 мл)           сервант + белковые стабилизаторы. Доверитель-                               ный интервал указан на калибровочной карте                                                                                  Положительный       C1      Очищенный энтеротоксин А (< 1,0 нг/мл) +        контроль                    консервант + белковые стабилизаторы.            определения                 Доверительный интервал указан на                (1 флакон х 6 мл)           калибровочной карте                                                                                                         Отрицательный       C2      ТРИС-забуференный физиологический раствор       контроль                    (150 ммоль/л) - Твин pH 7,6 + консервант.       определения (1              Максимальное приемлемое значение указано на     флакон х 6 мл)              калибровочной карте MLE после следующего:                                   "Control C2 (-) Test Value Range"                                                                                           Концентрат буфера   R1      ТРИС* 2,5 моль/л - Твин 10 г/л - MIT 10 г/л     для экстракции СЭТ          pH 8,0

(1 флакон х 55 мл)

  1 калибровочная карта       Лист спецификаций с фабричными установками                                  для калибровки тестов, для данной партии                                    реагентов

1 инструкция

Состав стрипа (табл. 2). Каждый стрип в тест-наборе для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа состоит из 10 лунок, запечатанных фольгой, на которую нанесен штрих-код, несущий информацию о типе анализа, номере партии и сроке годности. Фольга перфорирована над лункой для внесения образца. Последняя лунка представляет собой кювету, в которой происходит считывание результата. Прочие лунки содержат реактивы для анализа.

Таблица 2

Лунка Реактивы и назначение

1 Лунка для внесения 500 мкл образца

  2           Предпромывочный буфер (400 куб. мм): NaCl-ТРИС (150                мм) - Твин pH 7,6 - белковый стабилизатор +                        консервант

3-4-5-7-8-9 Промывочный буфер (600 куб. мм): NaCl - ТРИС (150

мм) - Твин pH 7,6 + консервант

  6           Коньюгат (400 куб. мм): меченные щелочной фосфатазой               антитела к стафилококковым энтеротоксинам +                        консервант                                                                                                                10          Кювета, содержащая субстрат (300 куб. мм):                         4-метил-умбелиферил-фосфат (0,6 мм) + диэтаноламин*                (0,62 моль/куб. дм или 6,6%, pH 9,2) + консервант

8. Название раздела 6 изложить в следующей редакции: "6. Проведение испытаний методом твердофазного иммуноферментного анализа". 9. В разделе 6 пункт 6.7. изложить в следующей редакции:

"6.7. Проведение анализа

6.7.1. Проведение анализа для совместного дифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов типов A, B, C, D, E методом твердофазного иммуноферментного анализа

6.7.1.1. Вставить в рамку планшета стрипы в количестве, соответствующем количеству проб, подготовленных для анализа. 6.7.1.2. Добавить по 100 куб. мм исследуемого раствора в лунки A - G соответствующего стрипа, в лунку H добавить 100 мм положительного контроля, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре. 6.7.1.3. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку и тщательно выбить капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. С помощью 8-канальной пипетки заполнить лунки по 250 куб. мм готового моющего буфера и снова вылить жидкость. Выбить лунки, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок моющим буфером еще три раза. 6.7.1.4. Добавить в каждую лунку по 100 куб. мм коньюгата, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре. 6.7.1.5. Провести процедуру, описанную в п. 6.7.1.3. 6.7.1.6. Добавить по 50 куб. мм субстрата и 50 куб. мм хромогена в каждую лунку. Осторожно перемешать вручную и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. 6.7.1.7. Добавить в каждую лунку по 100 куб. мм стоп-реагента и осторожно перемешать вручную. В течение 30 мин. после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм ("бланк" или нулевое считывание по воздуху).

6.7.2. Проведение анализа для совместного недифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов методом твердофазного
иммуноферментного анализа

6.7.2.1. Вставить в рамку планшета стрипы в количестве, соответствующем количеству проб, подготовленных для анализа. 6.7.2.2. Добавить по 100 куб. мм исследуемых проб и контролей в соответствующие лунки стрипа, используя новый наконечник для каждой пробы. Закрыть лунки пленкой и инкубировать в течение 30 мин. при температуре (36 +/ 1) °С. 6.7.2.3. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку и тщательно выбить капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. С помощью 8-канальной пипетки заполнить лунки по 300 куб. мм готового моющего буфера и снова вылить жидкость. Выбить лунки, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок моющим буфером еще 4 раза. 6.7.2.4. Добавить в каждую лунку по 100 куб. мм коньюгата 1, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 30 мин. при температуре (36 +/- 1) °С. 6.7.2.5. Провести процедуру, описанную в п. 6.7.2.3. 6.7.2.6. Добавить в каждую лунку по 100 куб. мм коньюгата 2, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 30 мин. при температуре (36 +/- 1) °С. 6.7.2.7. Провести процедуру, описанную в п. 6.7.2.3. 6.7.2.8. Добавить по 100 куб. мм субстрата/хромогена в каждую лунку. Осторожно перемешать вручную и инкубировать при температуре (36 +/- 1) °С в течение 15 мин. в темноте. Немедленно просмотреть результаты. 6.7.2.9. Изменение цвета в лунках планшета из красного в голубой указывает на присутствие стафилококковых энтеротоксинов в пробах. Осторожно перемешать пробы вручную круговыми движениями микропланшета по поверхности стола для равномерного распределения окраски раствора в лунках. 6.7.2.10. Добавить в каждую лунку по 100 куб. мм стоп-реагента и осторожно перемешать вручную. Изменение цвета из голубого в желтый указывает на присутствие стафилококковых энтеротоксинов в пробах. Измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм". 10. В разделе 6, пункте 6.8, подпункт 6.8.1 дополнить абзацем следующего содержания: "При совместном недифференцированном определении СЭТ методом твердофазного иммуноферментного анализа пороговую величину оптической плотности также устанавливают путем прибавления 0,15 к среднему значению оптической плотности, измеренной в лунках с отрицательным контролем". 11. Раздел 6 дополнить пунктом 6.10 в следующей редакции:

"6.10. Идентификация стафилококковых энтеротоксинов

При получении положительных результатов анализа с применением недифференцированного определения СЭТ методом твердофазного иммуноферментного анализа тип присутствующего в исследуемой пробе энетротоксина может быть установлен путем повторного дифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов типов A, B, C, D, E (п. 6.7.1)". 12. Текст методических указаний дополнить разделом 7 в следующей редакции:

"7. Проведение фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа для качественного недифференцированного определения СЭТ типов A, B, C1, C2, C3, D и E

7.1. Подготовка к анализу

7.1.1. Приготовление буфера для экстракции

Содержимое флакона R1 (концентрат буфера для экстракции) растворить в стерильной деминерализованной воде до конечного объема 1000 куб. см, тщательно перемешать. Буфер может храниться в течение 3 месяцев при температуре 2 - 8 °С. Концентрат буфера можно разделить на аликвоты и разводить по частям в зависимости от частоты использования и скорости потребления.

7.1.2. Приготовление 90%-го раствора трихлоруксусной кислоты

Растворить 90 г трихлоруксусной кислоты в 40 мл деминерализованной воды. Довести конечный объем до 100 куб. см. Хранить раствор 1 месяц при температуре 18 - 25 °С.

7.1.3 Измерение pH экстрактов

Для измерения pH использовать трехцветный бумажный индикатор pH с точностью определения не менее 0,5 единиц pH.

7.2. Проведение экстракции

7.2.1. Общий протокол экстракции СЭТ

Внести 25 г образца пищевого продукта и 25 куб. см буфера для экстракции в пакет для гомогенизации типа стомайкер. Гомогенизировать в течение 3 мин. на высокой скорости до получения гомогенной суспензии, оставить на 15 мин. при комнатной температуре. Центрифугировать пробу в течение 15 мин. при 3000 - 5000 g и температуре 18 - 25 °С. Пропустить супернатант через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Измерить pH фильтрата и, при необходимости, довести его до 7,5 - 8,0, используя раствор 1 N NaOH. Отобрать 500 мкл готового экстракта для проведения анализа.

7.2.2. Молочные продукты (кисломолочные продукты, сухое молоко, сыры)

Внести 25 г образца в 40 куб. см деминерализованной воды нагретой до температуры (38 +/- 2) °С. Гомогенизировать в течение 3 мин. на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Оставить на 30 мин. при 18 - 25 °С. Измерить pH и, при необходимости, довести его до 3,5 - 4,0, используя раствор 5 N HCl. Центрифугировать 15 мин. при 3000 - 5000 об./мин. и температуре 18 - 25 °С. Измерить pH надосадочной жидкости и, при необходимости, довести его до 7,5 - 8,0, используя раствор 1 N NaOH. Центрифугировать повторно 15 мин. при 3000 - 5000 g и температуре 18 - 25 °С. При необходимости профильтровать как описано в п. 7.2.1. Отобрать 500 мкл готового экстракта для проведения анализа.

7.2.3. Молоко

Отобрать 25 куб. см пробы и довести pH до 3,5 - 4,0, используя 5 N HCl. Далее экстракцию СЭТ проводить как указано в п. 7.2.2.

7.2.4. Сырые мясо и мясопродукты, готовые мясные изделия, морепродукты

Гомогенизировать 25 г образца в 25 куб. см деминерализованной воды в течение 3 мин. на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Если суспензия слишком плотная, добавить еще 25 куб. см деминерализованной воды и гомогенизировать повторно. Отобрать весь экстракт. Измерить pH и, при необходимости, довести его до pH 4,0, используя раствор 5 N HCl. Оставить на 15 - 30 мин. при 18 - 25 °С. Центрифугировать 15 мин. при 3000 - 5000 g и температуре 18 - 25 °С. Пропустить надосадочную жидкость через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Измерить pH фильтрата и, при необходимости, довести его до 7,5 - 8,0, используя раствор 1 N NaOH. При наличии осадка центрифугировать повторно. Отобрать 500 куб. мм готового экстракта для проведения анализа.

7.2.5. Экстракция СЭТ из концентрированных пищевых продуктов (концентраты готовых блюд, сублимированные пищевые продукты)

Концентрированные продукты следует развести в соответствии с рекомендациями изготовителя. Измерить pH конечного продукта и, при необходимости, довести его до 7,5 - 8,0, используя раствор 1 N NaOH. При наличии осадка центрифугировать 15 мин. при 3000 - 5000 g и температуре 18 - 25 °С, пропустить надосадочную жидкость через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Отобрать 500 куб. мм готового экстракта для проведения анализа.

7.2.6. Экстракция СЭТ из сухих (дегидратированных) продуктов

Сухие продукты (кроме сухого молока) восстановить в дистиллированной воде до объема, указанного изготовителем. Оставить на 1 ч при температуре 18 - 25 °С, далее экстракцию СЭТ проводить как указано в п. 7.2.1.

7.2.7. Концентрирование проб трихлоруксусной кислотой

Метод используется для увеличения концентрации СЭТ при исследовании молочных продуктов, в том числе сыров. Приготовить раствор трихлоруксусной кислоты в соответствии с п. 7.1.2. Внести 25 г образца в 40 куб. см деминерализованной воды нагретой до температуры (38 +/- 2) °С. Гомогенизировать в течение 3 мин. на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Оставить на 30 мин. при 18 - 25 °С. Измерить pH и, при необходимости, довести его до 3,5 - 4,0, используя раствор 5 N HCl. Центрифугировать 15 мин. при 3000 - 5000 об./мин. и температуре 18 - 25 °С. Измерить pH надосадочной жидкости и, при необходимости, довести его до 7,5 - 8,0, используя раствор 1 N NaOH. Измерить объем надосадочной жидкости (V). Добавить к надосадочной жидкости 90%-й водный раствор трихлоруксусной кислоты до его конечной концентрации 5%. Гомогенизировать и оставить на 30 мин. при 18 - 25 °С. Центрифугировать 30 мин. при 3000 - 5000 g и температуре 18 - 25 °С. Осторожно удалить надосадочную жидкость. Растворить осадок в 0,3 М буфере ТРИС, pH 8,0, в объеме, соответствующем 1/10 начального объема надосадочной жидкости V, обработанной трихлоруксусной кислотой. При необходимости довести pH до 7,5 - 8,0, используя раствор 4 N NaOH. При таком значении pH молочный раствор прозрачен. При наличии твердых частиц центрифугировать повторно 15 мин. при 3000 - 5000 g и температуре 18 - 25 °С. Отобрать 500 куб. мм готового экстракта для проведения анализа.

7.3. Хранение экстрактов

Определение СЭТ с использованием наборов для проведения фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа следует проводить сразу после экстракции. Если нет возможности провести тест сразу, экстракты (кроме молочных продуктов) могут храниться при температуре не выше - 19 °С в течение 7 суток.

7.4. Проведение анализа на автоматическом иммуноферментном анализаторе

Перед использованием наборов и реактивов новой партии в прибор необходимо ввести спецификации. Для этого используется калибровочная карта. Если не провести эту процедуру до проведения анализа, прибор не сможет распечатать результат. Процедуру необходимо проводить только один раз для каждой партии реактивов (лота). Данные с калибровочной карты вводят автоматически или вручную. Перед проведением анализа необходимое количество компонентов тест-набора оставить при комнатной температуре на 30 мин. 7.4.1. Стандарт перед использованием необходимо тщательно перемешать. Тестирование стандарта необходимо для подтверждения сохранности набора при транспортировании и хранении. Стандарт должен тестироваться в каждом наборе. Результаты тестирования хранятся в течение 2 недель и автоматически используются для анализа результатов теста. Рекомендуется тестирование стандарта в 2 стрипах. 7.4.2. Положительный и отрицательный контроли перед использованием тщательно перемешивают. Контроли тестируются в каждом наборе. Тестирование контролей необходимо для занесения пределов теста в компьютер. 7.4.3. В прибор вводят соответствующую информацию для создания рабочего листа. 7.4.4. Вносят 500 куб. мм готового экстракта в лунку для внесения образца на стрипе тест-набора. 7.4.5. Вносят 500 куб. мм стандарта и контролей в 1 лунку (отдельно для каждого) стрипа. 7.4.6. Вставляют стрипы и конусы в соответствующие отделения прибора, которые указаны в рабочем листе. Следует убедиться, что на стрипе и конусе указаны соответствующие буквы кода данного анализа. 7.4.7. Анализ проводят в соответствии с инструкцией, изложенной в руководстве пользователя. 7.4.8. Анализ полностью автоматизирован, длительность составляет 80 мин.

7.5. Интерпретация результатов

Оптический сканер прибора измеряет флюоресценцию дважды в оптической кювете для каждого образца. Первый раз измеряется фон субстрата и кюветы перед внесением в нее субстрата. Второй раз флюоресценция измеряется после внесения субстрата в конус и образования флюоресцирующего продукта в результате ферментативной реакции на поверхности конуса. Вычитание фона кюветы из последнего измерения дает относительную величину флуоресценции - ОВФ (Relative Fluorescence Value) тестируемого образца. Интерпретация значений ОВФ проводится прибором автоматически согласно формуле:

Результат теста = ОВФ образца / ОВФ стандарта.

В качестве стандарта в системе используют очищенный стафилококковый энтеротоксин типа A. Результаты тестирования для образца и контролей сравниваются со значениями ОВФ, хранящимися в базе данных: < 0,13, >= 0,13. Если полученное значение меньше 0,13, то результат интерпретируется как отрицательный. Если значение теста равно или выше 0,13, то результат интерпретируется как положительный. Результаты также считаются недействительными, если (1) значение ОВФ фона выше ожидаемого значения или (2) нет информации о значениях ОВФ стандарта. В первом случае возможно загрязнение субстрата, в связи с чем необходимо провести повторное тестирование образца с новым стрипом. Во втором случае должен быть протестирован новый стандарт из той же партии и результаты теста должны быть пересчитаны по этому стандарту. На принтер выводится информация - тип теста, номер образца, дата и время анализа, номер партии и дата окончания срока годности набора, значения ОВФ, результат и его интерпретация".

Изменения, внесенные Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011, введены в действие с 26 июня 2011 года. Текст документа

Дата введения:
15 декабря 2008 года

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВЫХ ЭНТЕРОТОКСИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2429-08

(в ред. Дополнений и изменений 1,
утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)

Разработаны ГУ Научно-исследовательский институт питания РАМН; ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.
Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 октября 2008 г.
Введены в действие с 15 декабря 2008 г.
Введены впервые.
Область применения

1.1. Настоящие Методические указания устанавливают метод качественного определения стафилококковых энтеротоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, мясе и мясопродуктах; птице и птицепродуктах) на основе твердофазного иммуноферментного анализа. 1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в порядке, установленном Правительством Российской Федерации. 1.3. Методы предназначены для исследования пищевых продуктов при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора и контроля, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи. 1.4. Согласно настоящим Методическим указаниям предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов соответствует диапазону массовых концентраций от 0,2 до 2,0 мкг/кг (в зависимости от типа токсина и вида продукта), что ниже уровня 100-200 нг наиболее распространенного из числа известных иммунологических типов стафилококкового энтеротоксина типа A, обусловливающего развитие стафилотоксикоза у человека. 1.5. Настоящие методические указания устанавливают также метод качественного обнаружения стафилококковых энтеротоксинов типов A, B, C1, C2, C3, D, E (при совместном определении) в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, в мясе и мясопродуктах; в птице и птицепродуктах) на основе фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов при использовании данного метода составляет не менее 1,0 мкг/кг. (п. 1.5 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)

2. Определения, обозначения и сокращения

СЭТ - стафилококковые энтеротоксины.
СЭА - стафилококковый энтеротоксин типа A. СЭВ - стафилококковый энтеротоксин типа B. ИФА - иммуноферментный анализ.
ИГ, IgG - иммуноглобулины.
Кг - конъюгат.
ОП - оптическая плотность.
Стандартный образец состава - стандартный образец, воспроизводящий значения величин, характеризующих содержание определенных компонентов (ГОСТ 8.315). Калибровочный раствор - раствор компонента, приготовленный из стандартного образца состава и необходимый для проведения испытания.

3. Сущность метода

3.1. Методы основаны на детекции СЭТ, продуцируемых Staphylococcus aureus и другими коагулазоположительными стафилококками, в подготовленной соответствующим образом пробе пищевого продукта путем постановки иммунохимических тестов непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющего обнаруживать эпидзначимые типы стафилококковых энтеротоксинов A (СЭА) или B (СЭВ) при раздельном определении (тест-системы по ВФС 42-235 и 42-236, ВС 89), а также энтеротоксины типов A, B, C, D и E при совместном дифференцированном и недифференцированном определении. (п. 3.1 в ред. Дополнений и изменений 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011) 3.2. Принцип метода. Определение СЭТ происходит за счет специфического взаимодействия стафилококковых иммуноглобулинов к различным типам СЭТ, адсорбированных на планшете, со стафилококковыми энтеротоксинами, содержащимися в исследуемом материале. Образовавшийся комплекс "антитело + антиген" выявляют с помощью конкурирующих стафилококковых иммуноглобулинов (конъюгатов), меченых пероксидазой. Образующийся аналитический сигнал, зависящий от результатов взаимодействия комплекса "антитело + антиген" с конъюгатом на поверхности ячеек планшета и выражающийся в ферментации субстрата - ортофенилендиамина (при раздельном определении СЭТ типов A и B) или тетраметилбензидина (при совместном определении СЭТ типов A, B, C, D и E) с изменением его окраски, измеряется по регистрируемому значению оптической плотности при длинах волн 492 и 450 нм соответственно. Схема анализа представлена в табл. 1.

Таблица 1

СХЕМА АНАЛИЗА

                      Последовательность этапов ИФА                                      при определении стафилококковых энтеротоксинов

Отбор, подготовка проб и экстракция СЭА и СЭВ

Сенсибилизация планшетов иммуноглобулинами

Отмывка планшетов от непрореагировавших иммуноглобулинов

Взаимодействие иммуноглобулинов с антигеном (СЭА или СЭВ)

Отмывка планшетов от непрореагировавшего антигена

Взаимодействие комплекса "антиген - антитело" с конъюгатом

Отмывка планшетов от непрореагировавшего конъюгата

Внесение субстрата

Учет результатов

3.3. Для проведения раздельного определения используются тест-системы иммуноферментные для определения стафилококковых энтеротоксинов типов A и B в виде лиофилизированных компонентов. 3.4. Для проведения совместного определения СЭТ используются тест-системы иммуноферментные для одновременного определения стафилококковых энтеротоксинов типов A, B, C, D, E с использованием набора реагентов RIDASCREEN(R) SET A, B, C, D, E или других зарегистрированных в Российской Федерации в установленном порядке тест-систем иммуноферментных с аналогичными характеристиками. 3.5. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (ФС-ИФА) стафилококковых энтеротоксинов основан на связывании СЭТ, экстрагированных из пищевого продукта, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, конъюгированных щелочной фосфатазой и флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата). Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм дважды для каждого образца: перед внесением субстрата (фон) и после накопления продуктов гидролиза - флюоресцентного 4-метил-умбеллиферола, который катализируется щелочной фосфатазой. (п. 3.5 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011) 3.6. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы, позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферола при 450 нм и тест-наборы, в состав которых входят наконечники, сенсибилизированные антителами к СЭТ типов A, B, C, D, E, используемые в качестве пипетирующего устройства; и стрипы из 10 лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюоресцентного анализа. (п. 3.6 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011) 3.7. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы и тест-наборы, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке. (п. 3.7 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)

4. Требования к выполнению анализов

(раздел в ред. Дополнений и изменений 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)

4.1. Условия безопасного проведения работ

При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на приборы. Анализатор должен находиться в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила: - не использовать наконечники с поврежденной упаковкой; - не использовать поврежденные стрипы;
- не использовать набор по истечении срока годности; - не смешивать реактивы из различных партий; - положительный контроль и стандарт содержат очищенный стафилококковый энтеротоксин. При работе соблюдать осторожность. Работать в защитной одежде, перчатках, очках. При попадании внутрь следует немедленно обратиться к врачу; - реактивы содержат натрия азид, который со свинцом и медью образует взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их накопления; - пролитые жидкости необходимо тщательно вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие отбеливатель; - анализаторы необходимо регулярно чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

4.2. Требования к квалификации специалистов

4.3. Условия выполнения измерений

Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях: - температура окружающего воздуха (20 +/- 5) град. С; - атмосферное давление (97 +/- 10) кПа; - относительная влажность (65 +/- 15) %.

5. Средства измерений, вспомогательное
оборудование, посуда, реактивы и материалы

5.1. Средства измерений и вспомогательное оборудование

Фотометр вертикального типа с диапазоном измерения оптической плотности 0,0-2,5 в комплекте с интерференционным светофильтром для длин волн 490-492 нм и 450 нм
Центрифуга лабораторная
Шкаф сушильный любого типа, обеспечивающий постоянство температуры (130 +/- 5) град. C по НД Шкаф холодильный любого типа, обеспечивающий постоянство температуры по НД
Весы лабораторные аналитические общего назначения и образцовые с наибольшим пределом взвешивания 200 г, не ниже 2-го класса точности ГОСТ 24104-88 Дозаторы пипеточные автоматические с диапазоном объема доз 20-200 мкл, 200-1000 мкл и
дискретности установки доз 5 мкл ТУ 64-16-55-90 Дистиллятор типа ДЭ-4-2 по НД
pH-метр по НД
Гомогенизатор ножевой или перистальтический типа "Стомайкер" Ступки фарфоровые с пестиками
Автоматический иммуноферментный анализатор типа VTDAS BioMerieux(R) или mini VTDAS BioMerieux(R), Франция или аналогичного типа
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)

Допускается использование оборудования, приборов и средств измерений, закупаемых по импорту, зарегистрированных в Госреестре РФ, соответствующих перечисленным по техническим характеристикам и позволяющих воспроизводить метрологические характеристики, указанные в настоящих Методических указаниях.

5.2. Лабораторная посуда и инструменты

Посуда мерная лабораторная: ГОСТ 1770-74 цилиндры исполнения 2 вместимостью 1000 куб. см; цилиндры исполнения 3 вместимостью 25 и 100 куб. см; пробирки исполнения 1 вместимостью 10 куб. см; колбы исполнения 2 вместимостью 100, 500 и 1000 куб. см

 Пипетки 2-1-50 или 2-2-50                                     ГОСТ 20292-74 Посуда лабораторная стеклянная:                               ГОСТ 25336-82

колбы конические вместимостью 50-1000 куб. см Пинцеты, скальпели, ножницы
Стерильные фильтр-насадки
на шприц, диаметр пор 0,2 мкм (типа Millipore low protein binding Millex-GV-filters)
Автоматические пипетки на
50, 100 мкл и 1 мл с наконечниками
Шприцы на 20 мл
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Пипетка одноразовая на 500 мкл
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Пакет для гомогенизации с фильтром
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Центрифужные пробирки на 50 мл
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)

5.3. Реактивы и материалы

Бычий сывороточный альбумин по НД ТУ 6-09-10-342-75 Тест-система иммуноферментная для определения стафилококкового энтеротоксина типа A по ВФС 42-235, ВС 89 с чувствительностью 2 нг/куб. см Тест-система иммуноферментная для определения стафилококкового энтеротоксина типа B по ВФС 42-236, ВС 89 с чувствительностью 1 нг/куб. см

 Спирт этиловый ректифицированный                          ГОСТ 11547-80 Кислота серная концентрированная, хч                      ГОСТ 4204-77 Вода дистиллированная                                     ГОСТ 6709-72 Водорода перекись, хч                                     ГОСТ 10929-76 о-Фенилендиамин по НД Калий хлористый                                           ГОСТ 4234-64 Натрий углекислый                                         ГОСТ 84-76 или натрий углекислый безводный                           ГОСТ 83-79 Натрий двууглекислый                                      ГОСТ 2156-76 Натрий хлористый                                          ГОСТ 4233-77

Натрий гидроокись
ТРИС-буфер

 Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный 12-водный           ГОСТ 4172-76 Калий фосфорно-кислый однозамещенный                      ГОСТ 4198-75 Твин-20 по НД Кислота лимонная 1-водная                                 ГОСТ 3652-69

Наборы реагентов для иммуноферментного определения стафилококковых энтеротоксинов RIDASCREEN(R) SET A, B, C, D, E (ф. "R-Biopharm AG", Германия) н-Гептан
Фосфатный (PBS) буфер, pH 7,4
(0,55 г NaH2PO4 х H2O + 2,85 г Na2HPO4 х 2H2O + 8,7 г NaCl растворить в дистиллированной воде и довести до объема 1000 мл)
Набор реагентов типа "VIDAS(R)Staph enterotoxin II (SET2), BioMerieux(R), Франция или с аналогичными характеристиками
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Набор реагентов типа RIDASCREEN(R) SET Total (R-Biopharm AG, Германия) или с аналогичными характеристиками
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Индикатор pH (бумажный)
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Трихлоруксусная кислота 90% (5,5 N)
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Буфер ТРИС 0,3 М, pH 8,0
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Раствор NaOH 1 N и 4 N
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Соляная кислота 5 N
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)

5.4. Состав тест-систем для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В

Тест-система иммуноферментная для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В представляет собой следующие наборы: 1) иммуноглобулины к стафилококковому энтеротоксину, выделенные из сыворотки крови (кроличьей), сухие (ИГ) в ампулах; 2) иммуноглобулины к стафилококковому энтеротоксину, выделенные из сыворотки крови (кроличьей), ковалентно связанные с пероксидазой хрена, сухие, конъюгат (Кг) в ампулах; 3) стафилококковый энтеротоксин (СЭ) ампулированный; 4) о-фенилендиамин (ОФД) сухой;
5) Твин-20 или тритон Х-100 (жидкий);
6) бычий сывороточный альбумин (БСА);
7) смесь солей для приготовления карбонат-бикарбонатного буферного раствора (КББР), раствор N 1; 8) смесь солей для приготовления фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР), раствор N 2; 9) смесь содей для приготовления цитратно-фосфатного буферного раствора (ЦФБР), раствор N 3; 10) планшеты для иммуноферментного анализа (ИФА) однократного применения; 11) гидроперит в таблетках;
12) планшет 96-ячеечный полистироловый наборный по НД. Тест-системы из сухих реагентов хранят в защищенном от света месте при температуре (6 +/- 2) град. C. Срок годности при условии соблюдения правил хранения - 2 года с момента выпуска. В случае несоответствия используемых наборов требованиям специфичности и снижения активности биологических компонентов применение наборов данной серии прекращают.

5.5. Состав набора реагентов для иммуноферментного определения стафилококковых энтеротоксинов A, B, C, D, E

(п. 5.5 в ред. Дополнений и изменений 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)

В состав набора для дифференцированного определения СЭТ типов A, B, C, D, E входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 12 проб с идентификацией энтеротоксинов (включая положительный контроль). Набор для твердофазного иммуноферментного анализа СЭТ A, B, C, D, E содержит:

 Хромоген, содержит тетраметилбензидин, 7 мл: голубая крышка           1 шт. Стоп-реагент, содержит 1 N серную кислоту, 14 мл: желтая крышка       1 шт. Моющий буфер, pH 7,2, концентрат, 10х, 100 мл, коричневая крышка      1 шт.

 Отрицательный контроль, готовый к использованию, 2 мл                 1 шт. Коньюгат 1 антител к SET, готовый к использованию, 11 мл              1 шт. Коньюгат 2 с пероксидазой, готовый к использованию, 11 мл             1 шт. Субстрат/хромоген, содержит тетраметилбензидин, 10 мл                 1 шт. Стоп-реагент, содержит 1 N серную кислоту, 14 мл                      1 шт. Моющий буфер, pH 7,2, концентрат, 10х, 100 мл                         1 шт.

Примечание.
Нумерация пунктов дана в соответствии с Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011.

5.7. Состав тест-набора для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа

(п. 5.7 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)

Таблица 1

   Компоненты набора  Обозна-                    Состав                                           чение                                                                                                                               30 стрипов для      STR     См. табл. 2

определения СЭТ

  30 наконечников с   SPR     На внутреннюю поверхность наконечников SPR(R)   конъюгированными            нанесены антитела к стафилококковым             антителами                  энтеротоксинам                                                                                                              Стандарт            S1      Очищенный энтеротоксин А (< 1,0 нг/мл) + кон-   (1 флакон х 6 мл)           сервант + белковые стабилизаторы. Доверитель-                               ный интервал указан на калибровочной карте                                                                                  Положительный       C1      Очищенный энтеротоксин А (< 1,0 нг/мл) +        контроль                    консервант + белковые стабилизаторы.            определения                 Доверительный интервал указан на                (1 флакон х 6 мл)           калибровочной карте                                                                                                         Отрицательный       C2      ТРИС-забуференный физиологический раствор       контроль                    (150 ммоль/л) - Твин pH 7,6 + консервант.       определения (1              Максимальное приемлемое значение указано на     флакон х 6 мл)              калибровочной карте MLE после следующего:                                   "Control C2 (-) Test Value Range"                                                                                           Концентрат буфера   R1      ТРИС* 2,5 моль/л - Твин 10 г/л - MIT 10 г/л     для экстракции СЭТ          pH 8,0

(1 флакон х 55 мл)

  1 калибровочная карта       Лист спецификаций с фабричными установками                                  для калибровки тестов, для данной партии                                    реагентов

1 инструкция

Таблица 2

Лунка Реактивы и назначение

1 Лунка для внесения 500 мкл образца

  2           Предпромывочный буфер (400 куб. мм): NaCl-ТРИС (150                мм) - Твин pH 7,6 - белковый стабилизатор +                        консервант

3-4-5-7-8-9 Промывочный буфер (600 куб. мм): NaCl - ТРИС (150

мм) - Твин pH 7,6 + консервант

  6           Коньюгат (400 куб. мм): меченные щелочной фосфатазой               антитела к стафилококковым энтеротоксинам +                        консервант                                                                                                                10          Кювета, содержащая субстрат (300 куб. мм):                         4-метил-умбелиферил-фосфат (0,6 мм) + диэтаноламин*                (0,62 моль/куб. дм или 6,6%, pH 9,2) + консервант

6. Проведение испытаний методом твердофазного иммуноферментного анализа

(в ред. Дополнений и изменений 1,
утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)

6.1. Отбор проб

Примечание.
ГОСТ Р 51446-99 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов" утратил силу с 1 января 2010 года в связи с изданием Приказа Ростехрегулирования от 18.12.2008 N 480-ст.

Отбор проб для анализа следует проводить в соответствии с ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) "Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований" или МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов".

6.2. Подготовка проб к анализу
(при раздельном определении СЭА и СЭВ)

Из асептично отобранных образцов пищевых продуктов готовят пробы к анализу и экстрагируют СЭТ, учитывая физическое состояние продуктов, следующим образом: а) экстракция СЭТ из твердых продуктов. Из произвольно отобранных точечных проб из 5 мест партии массой нетто 25 г каждая, готовят среднюю пробу массой 125 г, измельчают режущим инструментом, добавляют 125 куб. см стерильного забуференного физиологического раствора с pH 7,4, содержащего 8,5 г натрия хлорида, 0,55 г NaH2PO4 х H2O и 2,85 г Na2HPO4 х H2O на 1000 мл дистиллированной воды, и гомогенизируют до получения однородной массы. В полученном гомогенате с помощью 1 N раствора соляной кислоты устанавливают pH 4,5, затем центрифугируют гомогенат при 8000-9000 об./мин. в течение 45 мин. при охлаждении (допускается проводить центрифугирование при температуре не выше 15 град. C). После центрифугирования слой жира, собирающийся на поверхности надосадочной жидкости, удаляют шпателем или стеклянной палочкой. После удаления жира надосадочную жидкость (не менее 5 куб. см) переносят в новую стерильную пробирку, устанавливают в ней рН 7,3 +/- 0,1 при помощи 1 N раствора NaOH, осадок удаляют. К полученному таким образом экстракту добавляют Твин-20 до конечной концентрации 0,1% и бычий сывороточный альбумин (или нормальную кроличью сыворотку) до конечной концентрации 2,5% и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.; б) экстракция СЭТ из сыров. Из произвольно отобранных точечных проб сыра из 5 мест от партии массой нетто 25 г каждая готовят среднюю пробу массой 125 г, измельчают режущим инструментом, добавляют 125 куб. см стерильного 0,25 М ТРИС-буфера с pH 8,0, содержащего 30,28 г ТРИС гидроксиметиламинометана на 1000 мл дистиллированной воды, и гомогенизируют до получения однородной массы в течение 3 мин. при высокой скорости. Доводят pH до 4,0 с помощью 6 N раствора соляной кислоты. Гомогенат центрифугируют в течение 10 мин. при 3500 g, отделяют супернатант (не менее 5 куб. см) и доводят в нем рН до 7,0-8,0 6 N раствором NaOH; в) экстракция СЭТ из жидких продуктов и сухих молочных продуктов. В объединенной пробе молока объемом 125 куб. см с помощью 1 N раствора соляной кислоты устанавливают pH 4,5, затем центрифугируют образец при 8000-9000 об./мин. в течение 45 мин. при охлаждении. В надосадочной жидкости (не менее 5 куб. см) доводят рН до 7,0-8,0 6 N раствором NaOH. Образец сухого молока (25 г) смешивают с 125 куб. см 0,25 М ТРИС-буфера с рН 8,0 и гомогенизируют до получения однородной массы в течение 3 мин. при высокой скорости. Доводят pH до 4,0 с помощью 6 N раствора соляной кислоты. Гомогенат центрифугируют в течение 10 мин. при 3500 g, отделяют супернатант (не менее 5 куб. см) и доводят в нем pH до 7,0-8,0 6 N раствором NaOH.

6.3. Подготовка лабораторной посуды

Лабораторную стеклянную посуду следует мыть хромовой смесью, многократно промывать водопроводной водой и ополаскивать дистиллированной водой. Сушить посуду следует в сушильном шкафу.

6.4. Подготовка прибора к работе

Подготовку и проверку фотометра проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации и техническим описанием к прибору.

6.5. Проведение анализа при использовании тест-систем для определения стафилококковых энтеротоксинов типов A и B

6.5.1. Подготовка к проведению анализа

6.5.1.1. Раствор N 1. Карбонатно-бикарбонатный буферный раствор (КББР) 0,05 М, pH 9,5 +/- 0,1. Навеску солей из пакета с надписью "раствор N 1" разводят в 150 куб. см дистиллированной воды. Хранить при температуре (4 +/- 2) град. C в течение месяца. 6.5.1.2. Раствор N 2. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР) 0,1 М, pH 7,2 +/- 0,1. Навеску солей из пакета с надписью "раствор N 2" растворяют в 500 куб. см дистиллированной воды и доводят объем до 3 куб. дм. Хранить при температуре (4 +/- 2) град. C в течение месяца. 6.5.1.3. Раствор N 2А. К 1 куб. дм раствора N 2 добавляют 0,5 куб. см детергента (Твин-20 или тритон Х-100). Раствор N 2А хранению не подлежит. 6.5.1.4. Раствор N 2Б. Содержимое флакона с этикеткой "БСА" растворяют в 50 куб. см раствора N 2А. Хранению не подлежит. 6.5.1.5. Раствор N 3. ЦФБР 0,1 М, pH 5,5 +/- 0,1. Содержимое пакетика с надписью "лимонная кислота" (пакет N 3) 0,32 г растворяют в 25 куб. см дистиллированной воды. Содержимое пакета с надписью "натрий фосфорно-кислый 12-водный" 1,65 г также растворяют в 25 куб. см дистиллированной воды. Хранить по отдельности, не более двух недель. Перед употреблением растворы смешивают в соотношении 1:1. 6.5.1.6. Раствор N 4. Содержимое 1 ампулы с этикеткой "ИГ" растворяют в 1 куб. см дистиллированной воды, далее доводят объем до 30 куб. см раствором N 1. Одна ампула "ИГ" расходуется на 1 планшет. 6.5.1.7. Раствор N 5. Содержимое 1 ампулы с этикеткой "СЭА" или "СЭВ" растворяют в 1 куб. см дистиллированной воды. Исходный раствор СЭА и СЭВ можно хранить при температуре (4 +/- 2) град. C в течение 1 месяца. Рабочий раствор СЭА и СЭВ с конечной концентрацией 1 нг/куб. см готовят из исходного, используя раствор N 2А. Хранению не подлежит. 6.5.1.8. Раствор N 6. Содержимое ампулы с этикеткой "Кг" разводят в 1 куб. см дистиллированной воды, далее доводят до 10 куб. см раствором N 2Б. Хранению не подлежит. 6.5.1.9. Раствор N 7. Растворяют 4-5 мг ОФД в 10 куб. см раствора N 3. Раствор N 7 готовят за 10 мин. до использования, хранят в темном месте при комнатной температуре. (Содержимое флакона ОФД рассчитано на 50 куб. см, т.е. на 5 планшетов.) 6.5.1.10. Раствор N 8. Одну таблетку гидроперита растворяют в 10 куб. см дистиллированной воды. Полученный 30%-й раствор перекиси водорода хранят в темном месте при температуре (4 +/- 2) град. C. Срок хранения 1 месяц. 6.5.1.11. Раствор N 9. Смешивают 10 куб. см раствора N 7 и 0,17 куб. см раствора N 8, разведенного дистиллированной водой 1:10 (или 50 куб. см раствора N 7 и 0,85 куб. см 3%-го раствора перекиси водорода). Готовят непосредственно перед внесением в лунки. Хранению не подлежит. 6.5.1.12. Раствор N 10. Раствор серной кислоты в концентрации 1,5 моль/куб. дм растворяют 1,5 куб. см концентрированной (хч) серной кислоты в 15 куб. см дистиллированной воды. Хранят при температуре (20 +/- 2) град. C.

6.5.2. Подготовка проб к измерениям

Приготовление рабочих растворов исследуемых образцов. Экстракты из проб продуктов, полученные по п. 6.2, вносят в количестве 1,0 куб. см в пробирки и наносят маркировку, соответствующую номерам проб.

6.5.3. Проведение испытаний

6.5.3.1. Сорбция стафилококковых иммуноглобулинов на планшет. В ячейки планшета вносят с помощью автоматического дозатора пипеточного по 0,25 куб. см раствора N 4. Сенсибилизацию планшетов иммуноглобулинами проводят в течение 2 ч при температуре (37 +/- 2) град. C или 18-24 ч при температуре (4 +/- 2) град. C. 6.5.3.2. По окончании сорбции иммуноглобулины удаляют из ячеек планшета сильным встряхиванием перевернутого планшета и отмывают 4 раза по 5 мин. раствором N 2А (промывной раствор вносят до края ячеек), вытряхивают и высушивают постукиванием по фильтровальной бумаге. 6.5.3.3. Внесение на планшет положительного контроля. В ячейки А-1, В-1 вносят по 0,1 куб. см раствора N 5 (положительный контроль). В ячейки С-1, Д-1 вносят по 0,1 куб. см раствора N 2А (отрицательный контроль). В остальные ячейки планшета вносят по 0,1 куб. см исследуемого материала. 6.5.3.4. Планшеты выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 2) град. C в течение 1 ч, затем жидкость из ячеек удаляют в емкость с 6%-м раствором перекиси водорода, отмывают 5 раз и подсушивают, как указано в п. 6.5.3.2. 6.5.3.5. В каждую ячейку планшета вносят по 0,1 куб. см раствора N 6. 6.5.3.6. Планшеты выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 2) град. C в течение 1 ч. 6.5.3.7. Удаляют жидкость из ячеек планшета встряхиванием и отмывают 6 раз, как указано в п. 6.5.3.2. 6.5.3.8. В каждую ячейку планшета вносят по 0,1 куб. см раствора N 9. 6.5.3.9. Планшеты выдерживают в темноте при температуре (20 +/- 2) град. C в течение 30 мин. до появления слабо-желтой окраски в контрольных ячейках (С-1, Д-1). 6.5.3.10. Реакцию останавливают внесением в ячейки по 0,1 куб. см раствора N 10. В ячейках, где прошла реакция, появляется окрашивание от желтого до оранжево-коричневого. В ячейках, где исследуемые пробы не содержат энтеротоксина, окраска отсутствует или светло-желтая. 6.5.3.11. Для каждого типа энтеротоксина следует использовать отдельный планшет, повторное использование планшета не допускается.

6.5.4. Учет результатов анализа

6.5.4.1. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности (ОП) на вертикальном фотометре при длине волны 492 нм. Результаты записей оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами вариантов. 6.5.4.2. Величина оптической плотности в ячейках с положительным контролем - специфическим антигеном (А-1, В-1) - должна составлять не менее 0,30 +/- 0,05; в ячейках с отрицательным контролем (С-1, Д-1) - не более 0,10 +/- 0,05. Значения ОП в двух параллельных определениях одной и той же пробы не должны различаться более чем на 0,05. 6.5.4.3. Для всех ячеек-дублей рассчитывают средние арифметические значения оптической плотности (ОП) и находят отношения полученных к среднему значению оптической плотности для контроля. 6.5.4.4. Результат определения считается положительным, если ОП в исследуемом материале в 2 раза и более превосходит среднее арифметическое из двух значений ОП отрицательного контроля. 6.5.4.5. По результатам двух параллельных определений рассчитывают среднее арифметическое значение ОП в исследуемом образце. Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого, то среднее арифметическое принимают за результат анализа. В противном случае анализ следует повторить. 6.5.4.6. В протоколах анализа по раздельному определению СЭТ результаты представляют в виде: - СЭА или СЭВ обнаружены в образце массой 125 г (в 5 образцах по 25 г); - СЭА или СЭВ не обнаружены в образце массой 125 г (в 5 образцах по 25 г).

6.6. Проведение анализа при совместном определении стафилококковых энтеротоксинов A, B, C, D, E

Перед использованием набора необходимо довести температуру всех реагентов до комнатной, сразу после использования охладить все реагенты до температуры 2-8 град. C. В процессе выполнения анализа не допускать высыхания лунок планшета. Воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. На всех стадиях инкубации следует избегать воздействия прямого солнечного света. При инкубации рекомендуется прикрыть планшет крышкой. 6.6.1. Приготовление моющего буфера. Для приготовления моющего буфера смешивают 1 часть концентрированного моющего буфера и 9 частей дистиллированной воды (например, 10 мл концентрата и 90 мл дистиллированной воды). Если во флаконе с концентрированным буфером образовались кристаллы, следует предварительно их растворить, нагревая флакон в водяной бане при 37 град. C. Срок хранения готового моющего буфера при температуре 2-8 град. C составляет не более четырех недель. Температуру моющего буфера перед его использованием необходимо довести до комнатной. 6.6.2. Подготовка планшета. Фольгированная упаковка планшета открывается со стороны застежки. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2-8 град. C. 6.6.3. Положительный контроль. В качестве положительного контроля используют смесь энтеротоксинов A, B, C, D, E (концентрация каждого энтеротоксина составляет 2 нг/мл), раствор входит в комплект набора в готовом к использованию виде.

6.7. Проведение анализа

(п. 6.7 в ред. Дополнений и изменений 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)

6.7.2.1. Вставить в рамку планшета стрипы в количестве, соответствующем количеству проб, подготовленных для анализа. 6.7.2.2. Добавить по 100 куб. мм исследуемых проб и контролей в соответствующие лунки стрипа, используя новый наконечник для каждой пробы. Закрыть лунки пленкой и инкубировать в течение 30 мин. при температуре (36 +/ 1) град. С. 6.7.2.3. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку и тщательно выбить капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. С помощью 8-канальной пипетки заполнить лунки по 300 куб. мм готового моющего буфера и снова вылить жидкость. Выбить лунки, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок моющим буфером еще 4 раза. 6.7.2.4. Добавить в каждую лунку по 100 куб. мм коньюгата 1, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 30 мин. при температуре (36 +/- 1) град. С. 6.7.2.5. Провести процедуру, описанную в п. 6.7.2.3. 6.7.2.6. Добавить в каждую лунку по 100 куб. мм коньюгата 2, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 30 мин. при температуре (36 +/- 1) град. С. 6.7.2.7. Провести процедуру, описанную в п. 6.7.2.3. 6.7.2.8. Добавить по 100 куб. мм субстрата/хромогена в каждую лунку. Осторожно перемешать вручную и инкубировать при температуре (36 +/- 1) град. С в течение 15 мин. в темноте. Немедленно просмотреть результаты. 6.7.2.9. Изменение цвета в лунках планшета из красного в голубой указывает на присутствие стафилококковых энтеротоксинов в пробах. Осторожно перемешать пробы вручную круговыми движениями микропланшета по поверхности стола для равномерного распределения окраски раствора в лунках. 6.7.2.10. Добавить в каждую лунку по 100 куб. мм стоп-реагента и осторожно перемешать вручную. Изменение цвета из голубого в желтый указывает на присутствие стафилококковых энтеротоксинов в пробах. Измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм.

6.8. Обработка результатов измерения

6.8.1. Определение пороговой величины. Для каждой пробы отдельно вычисляется среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках F и G (отрицательный контроль). Для того чтобы получить пороговую величину, к этому среднему значению следует добавить 0,15.

Пример: Отрицательный контроль 1 = 0,08

             Отрицательный контроль 2 = 0,10             Среднее значение = 0,09             Пороговая величина = 0,09 + 0,15 = 0,24.

При совместном недифференцированном определении СЭТ методом твердофазного иммуноферментного анализа пороговую величину оптической плотности также устанавливают путем прибавления 0,15 к среднему значению оптической плотности, измеренной в лунках с отрицательным контролем. (абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011) 6.8.2. Область достоверности (контроль качества анализа): 1) оптическая плотность, измеренная в лунках с положительным контролем, должна быть равна или больше 0,5; 2) средняя оптическая плотность, измеренная в лунках F и G (отрицательный контроль), должна быть равна или меньше 0,3; 3) если условия 1 и 2 не соблюдаются, результаты не подлежат интерпретации. 6.8.3. Интерпретация результатов. Результат интерпретируется как отрицательный, если величина оптической плотности ниже пороговой. Результат интерпретируется как положительный, если величина оптической плотности выше пороговой или равна ей.

6.9. Учет результатов анализа

В протоколах анализа по совместному определению СЭТ результаты представляют в виде: - СЭТ типов A, B, C, D и E обнаружены в образце массой 125 г (в 5 образцах по 25 г); - СЭТ типов A, B, C, D и E не обнаружены в образце массой 125 г (в 5 образцах по 25 г).

6.10. Идентификация стафилококковых энтеротоксинов

(п. 6.10 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)

7. Проведение фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа для качественного недифференцированного определения СЭТ типов A, B, C1, C2, C3, D и E

(раздел введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)

7.1. Подготовка к анализу

7.1.1. Приготовление буфера для экстракции

Содержимое флакона R1 (концентрат буфера для экстракции) растворить в стерильной деминерализованной воде до конечного объема 1000 куб. см, тщательно перемешать. Буфер может храниться в течение 3 месяцев при температуре 2-8 град. С. Концентрат буфера можно разделить на аликвоты и разводить по частям в зависимости от частоты использования и скорости потребления.

7.1.2. Приготовление 90%-го раствора трихлоруксусной кислоты

Растворить 90 г трихлоруксусной кислоты в 40 мл деминерализованной воды. Довести конечный объем до 100 куб. см. Хранить раствор 1 месяц при температуре 18-25 град. С.

7.1.3 Измерение pH экстрактов

Для измерения pH использовать трехцветный бумажный индикатор pH с точностью определения не менее 0,5 единиц pH.

7.2. Проведение экстракции

7.2.1. Общий протокол экстракции СЭТ

Внести 25 г образца пищевого продукта и 25 куб. см буфера для экстракции в пакет для гомогенизации типа стомайкер. Гомогенизировать в течение 3 мин. на высокой скорости до получения гомогенной суспензии, оставить на 15 мин. при комнатной температуре. Центрифугировать пробу в течение 15 мин. при 3000-5000 g и температуре 18-25 град. С. Пропустить супернатант через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Измерить pH фильтрата и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. Отобрать 500 мкл готового экстракта для проведения анализа.

7.2.2. Молочные продукты (кисломолочные продукты, сухое молоко, сыры)

Внести 25 г образца в 40 куб. см деминерализованной воды нагретой до температуры (38 +/- 2) град. С. Гомогенизировать в течение 3 мин. на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Оставить на 30 мин. при 18-25 град. С. Измерить pH и, при необходимости, довести его до 3,5-4,0, используя раствор 5 N HCl. Центрифугировать 15 мин. при 3000-5000 об./мин. и температуре 18-25 град. С. Измерить pH надосадочной жидкости и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. Центрифугировать повторно 15 мин. при 3000-5000 g и температуре 18-25 град. С. При необходимости профильтровать как описано в п. 7.2.1. Отобрать 500 мкл готового экстракта для проведения анализа.

7.2.3. Молоко

Отобрать 25 куб. см пробы и довести pH до 3,5-4,0, используя 5 N HCl. Далее экстракцию СЭТ проводить как указано в п. 7.2.2.

7.2.4. Сырые мясо и мясопродукты, готовые мясные изделия, морепродукты

Гомогенизировать 25 г образца в 25 куб. см деминерализованной воды в течение 3 мин. на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Если суспензия слишком плотная, добавить еще 25 куб. см деминерализованной воды и гомогенизировать повторно. Отобрать весь экстракт. Измерить pH и, при необходимости, довести его до pH 4,0, используя раствор 5 N HCl. Оставить на 15-30 мин. при 18-25 град. С. Центрифугировать 15 мин. при 3000-5000 g и температуре 18-25 град. С. Пропустить надосадочную жидкость через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Измерить pH фильтрата и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. При наличии осадка центрифугировать повторно. Отобрать 500 куб. мм готового экстракта для проведения анализа.

Концентрированные продукты следует развести в соответствии с рекомендациями изготовителя. Измерить pH конечного продукта и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. При наличии осадка центрифугировать 15 мин. при 3000-5000 g и температуре 18-25 град. С, пропустить надосадочную жидкость через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Отобрать 500 куб. мм готового экстракта для проведения анализа.

7.2.6. Экстракция СЭТ из сухих (дегидратированных) продуктов

Сухие продукты (кроме сухого молока) восстановить в дистиллированной воде до объема, указанного изготовителем. Оставить на 1 ч при температуре 18-25 град. С, далее экстракцию СЭТ проводить как указано в п. 7.2.1.

7.2.7. Концентрирование проб трихлоруксусной кислотой

Метод используется для увеличения концентрации СЭТ при исследовании молочных продуктов, в том числе сыров. Приготовить раствор трихлоруксусной кислоты в соответствии с п. 7.1.2. Внести 25 г образца в 40 куб. см деминерализованной воды нагретой до температуры (38 +/- 2) град. С. Гомогенизировать в течение 3 мин. на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Оставить на 30 мин. при 18-25 град. С. Измерить pH и, при необходимости, довести его до 3,5-4,0, используя раствор 5 N HCl. Центрифугировать 15 мин. при 3000-5000 об./мин. и температуре 18-25 град. С. Измерить pH надосадочной жидкости и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. Измерить объем надосадочной жидкости (V). Добавить к надосадочной жидкости 90%-й водный раствор трихлоруксусной кислоты до его конечной концентрации 5%. Гомогенизировать и оставить на 30 мин. при 18-25 град. С. Центрифугировать 30 мин. при 3000-5000 g и температуре 18-25 град. С. Осторожно удалить надосадочную жидкость. Растворить осадок в 0,3 М буфере ТРИС, pH 8,0, в объеме, соответствующем 1/10 начального объема надосадочной жидкости V, обработанной трихлоруксусной кислотой. При необходимости довести pH до 7,5-8,0, используя раствор 4 N NaOH. При таком значении pH молочный раствор прозрачен. При наличии твердых частиц центрифугировать повторно 15 мин. при 3000-5000 g и температуре 18-25 град. С. Отобрать 500 куб. мм готового экстракта для проведения анализа.

7.3. Хранение экстрактов

7.4. Проведение анализа на автоматическом иммуноферментном анализаторе

7.5. Интерпретация результатов

Результат теста = ОВФ образца / ОВФ стандарта.

Приложение
(рекомендуемое)

ФОРМА ТАБЛИЦЫ ДЛЯ ЗАПИСИ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА

  Маркировка          Значения ОП         ОП исследуемого образца/ СЭА  СЭВ    варианта                                      ОП контроля                             показания по ячейкам среднее

Введен в действие с 24 июня 2011 года.
Текст документа

Дата введения:
с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

ДОПОЛНЕНИЯ И ИЗМЕНЕНИЯ 1 К МУК 4.2.2321-08

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2878-11

Разработаны Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания, ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве" при участии фирмы "BioMerieux".
Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).
Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24.06.2011.
Введены в действие с момента утверждения.
Введены впервые.

Внести дополнения и изменения в МУК 4.2.2321-08: 1. Раздел 1 "Общие положения и область применения" дополнить абзацем 1.3 следующего содержания: "1.3. Настоящие Методические указания устанавливают методы определения бактерий рода Campylobacter в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения на основе бактериологического анализа (качественного и количественного с идентификацией до вида), а также фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (качественного недифференцированного суммарного определения бактерий видов C. jejuni, C. coli, C. lari, обусловливающих основную часть ОКИ кампилобактериозной природы у человека)". 2. Раздел 2 "Сущность метода" изложить в новой редакции:

"2. Сущность методов

2.1. Бактериологический метод определения бактерий рода Campylobacter основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие селективные среды, содержащие антибиотики и аэротолерантные добавки, с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры. Все этапы инкубации посевов осуществляются в микроаэрофильных условиях. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к видам бактерий рода Campylobacter. 2.2. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа бактерий рода Campylobacter основан на связывании бактериальных антигенов, находящихся в бульоне обогащения, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), последующем удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, меченных щелочной фосфатазой, и флюоресцентно-меченого субстрата и измерении флюоресценции продукта гидролиза флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата), который катализируется щелочной фосфатазой. Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм. 2.2.1. Для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические анализаторы, позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферона при 450 нм, и тест-наборы, в состав которых входят сенсибилизированные антителами наконечники, используемые в качестве пипетирующего устройства, и стрипы из 10 лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюоресцентного анализа, зарегистрированные в РФ в установленном порядке. Предел обнаружения бактерий рода Campylobacter при использовании данного метода соответствует 1 клетке на 25 г (при наличии предобогащения). 2.2.2. Для определения бактерий рода Campylobacter методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют анализаторы иммуноферментные и тест-наборы, зарегистрированные в РФ в установленном порядке и обеспечивающие проведение измерений с характеристиками специфичности и чувствительности, указанными в п. п. 1.3 и 2.2.1". 3. В разделе 3 "Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды" пункт 3.1 "Аппаратура и инструментарий" дополнить строкой:

Автоматический ИФА-анализатор для
фермент-связанного флюоресцентного
иммуноанализа типа VIDAS(R) или
miniVIDAS(R), или с аналогичными
характеристиками, подобный BioMerieux,
Франция, или аналог.

4. В разделе 3 пункт 3.2 "Лабораторная посуда и материалы" дополнить строками:

Пакет для гомогенизации с фильтром, подобный BioMerieux, Франция, или аналог
Набор реагентов для определения бактерий рода Campylobacter типа VIDAS(R) Campylobacter (CAM) или с аналогичными характеристиками, подобный BioMerieux, Франция, или аналог.

5. Раздел 3 "Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды" дополнить пунктом 3.5 в следующей редакции:

"3.5. Состав тест-набора для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа

В состав тест-набора входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 26 проб и 4 контрольных образцов, состоящий из следующих компонентов:

30 стрипов для STR Готовы к использованию определения бактерий рода Campylobacter

30 наконечников SPR Готовы к использованию. На внутреннюю

                      поверхность наконечников нанесены антитела                         к поверхностным антигенам Campylobacter                                                                           Стандарт        S1  Готов к использованию. Очищенный и инактиви-   (1 фл. по 6 мл)     рованный антиген Campylobacter + консервант                        + белковые стабилизаторы. Доверительный                            интервал указан на калибровочной карте

Положительный C1 Готов к использованию. Очищенный и инактиви-

  контроль            рованный антиген Campylobacter + консервант    определения         + белковые стабилизаторы. Доверительный        (1 фл. по 6 мл)     интервал указан на калибровочной карте

Отрицательный C2 Готов к использованию. Забуференный

  контроль            физиологический раствор - твин + консервант.   определения         Максимальное приемлемое значение указано на    (1 фл. по 6 мл)     калибровочной карте                                                                                               1 калибровочная     Лист спецификаций с фабричными установками     карта               для калибровки тестов

1 инструкция

3.5.1. Состав стрипа для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Каждый стрип в тест-наборе состоит из 10 лунок, запечатанных фольгой, на которую нанесен штрих-код, несущий информацию о типе анализа, номере партии и сроке годности. Фольга перфорирована над лункой для внесения образца. Последняя лунка представляет собой кювету, в которой происходит считывание результата. Прочие лунки содержат реактивы для анализа. Распределение лунок в стрипе:

Лунка Реактивы

  1           Лунка для внесения образца: внесите 0,5 куб. см                    бульона обогащения (обогащенной культуры), стандарта               или контроля                                                                                                              2           Предпромывочный буфер (400 куб. мм): забуференный                  физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л)                pH 7,6 + консервант

3 - 4 - 5 - Промывочный буфер (600 куб. мм): забуференный 7 - 8 - 9 физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л)

pH 7,6 + консервант

  6           Конъюгат (400 куб. мм): антитела (IgG) к                           Campylobacter, меченные щелочной фосфатазой +                      консервант                                                                                                                10          Кювета, содержащая субстрат (300 куб. мм):                         4-метил-умбелиферил-фосфат (0,6 М/л) + диэтаноламин                (0,62 М/л или 6,6%, pH 9,2) + консервант

3.5.2. Для определения бактерий рода Campylobacter методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа допускается использование другого оборудования и тест-наборов аналогичного назначения, зарегистрированных в РФ в установленном порядке, с аналогичными характеристиками чувствительности и специфичности". 6. Раздел 4 "Подготовка к анализу" дополнить пунктом 4.3 в следующей редакции:

"4.3. Требования к выполнению фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа

4.3.1. Условия безопасного проведения работ При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор. Анализатор должен находиться в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила: - не использовать наконечники с поврежденной упаковкой; - не использовать поврежденные стрипы;
- не использовать набор по истечении срока годности; - не смешивать реактивы из различных партий; - пролитые жидкости необходимо тщательно вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие отбеливатель; - анализаторы необходимо регулярно чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации приборов. Тест-набор содержит едкий реактив диэтаноламин, а также натрия азид, который со свинцом и медью образует взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их накопления. 4.3.2. Требования к квалификации специалистов Выполнение измерений может проводить специалист, способный после освоения техники иммуноферментного анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности. 4.3.3. Условия выполнения измерений
Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях: - температура окружающего воздуха (20 +/- 5) °С; - атмосферное давление (97 +/- 10) кПа; - относительная влажность (65 +/- 15)%". 7. Раздел 7 дополнить пунктом 7.3 в следующей редакции:

"7.3. Проведение фермент-связанного
флюоресцентного иммуноанализа

7.3.1. Подготовка анализатора к работе: - Перед использованием реактивов новой партии в анализатор вводят (автоматически или вручную) спецификации реактивов, используя калибровочную карту, входящую в каждый набор. Процедуру необходимо проводить только один раз для каждой партии реактивов. - Для каждой новой партии реактивов проводят калибровку прибора, используя стандарт, входящий в состав набора. Калибровку проводят после ввода данных партии, но не реже одного раза в 14 дней. Для этого в отдельные стрипы вносят по 0,5 куб. см реактива C1, C2 и в два стрипа реактив S1 из тест-набора. Необходимо ввести информацию об образце и контролях в анализатор для создания рабочего листа. Установить стрипы и наконечники в анализатор и запустить программу. Эта операция необходима для построения точной калибровочной кривой и компенсации вариаций, которые могут возникнуть при хранении набора. Стандарт S1 необходимо тестировать в двукратной повторности согласно руководству по эксплуатации прибора. Результаты должны находиться в пределах установленного диапазона, указанного на калибровочной карте. Если результат не соответствует диапазону, следует повторить калибровку. 7.3.2. Подготовка образцов к фермент-связанному флюоресцентному иммуноанализу Отобрать в пробирку 1 - 2 куб. см бульона обогащения, инкубированного по п. 7.1 МУК 4.2.2321-08, закрыть и нагревать на водяной бане (15 +/- 1) мин. при 95 - 100 °С. Охладить 10 мин., перемешать и внести 0,5 куб. см в стрип из тест-набора. Оставшуюся часть бульона хранят в холодильнике при 2 - 4 °С для подтверждения положительных образцов. 7.3.3. Проведение фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа Перед проведением анализа необходимое количество компонентов тест-набора оставить при комнатной температуре на 30 мин. Для каждого анализа используется 1 стрип и 1 наконечник из тест-набора. В открытую лунку стрипа вносят 0,5 куб. см термостатированного образца по п. 7.3.2. Далее стрипы и наконечники устанавливают в анализатор, вводят название соответствующих образцов и запускают анализ. Время анализа приблизительно 70 мин. 7.3.4. Интерпретация результатов
Оптический сканер прибора измеряет флюоресценцию дважды в оптической кювете для каждого образца. Первый раз измеряется фон субстрата и кюветы перед внесением в нее субстрата. Второй раз флюоресценция измеряется после внесения субстрата в конус и образования флюоресцирующего продукта в результате ферментативной реакции на поверхности конуса. Вычитание фона кюветы из последнего измерения дает относительную величину флуоресценции - ОВФ (Relative Fluorescence Value) тестируемого образца. Интерпретация значений ОВФ проводится прибором автоматически согласно формуле:

[Результат теста = ОВФ образца / ОВФ стандарта]

Результат теста Интерпретация

< 0,1 Отрицательный

>= 0,1 Положительный

Результат теста со значением меньше порогового указывает на то, что образец не содержит антигена Campylobacter либо содержит его в концентрации ниже порога определения. Результат теста со значением, равным или больше порогового, свидетельствует о том, что образец загрязнен бактериями рода Campylobacter. В этом случае следует провести подтверждение положительного результата по п. 7.3.5. Результаты также считаются недействительными, если (1) значение ОВФ фона выше ожидаемого значения или (2) нет информации о значениях ОВФ стандарта. В первом случае возможно загрязнение субстрата, в связи с чем необходимо провести повторное тестирование образца с новым стрипом. Во втором случае должен быть протестирован новый стандарт из той же партии и результаты теста должны быть пересчитаны по этому стандарту. На принтер выводится информация - тип теста, номер образца, дата и время анализа, номер партии и дата окончания срока годности набора, значения ОВФ, результат и его интерпретация. 7.3.5. Подтверждение положительного результата Подтверждение положительного результата проводят путем высева 0,1 мл хранившегося в холодильнике бульона обогащения, полученного по п. 7.3.2, на поверхность одной из селективных сред (по п. 4.2.2). Инкубацию образцов проводят при температуре (42 +/- 1) °С в течение 20 - 24 ч, при отсутствии роста инкубировать еще 24 ч. При наличии характерных колоний необходимо провести идентификацию до 5 подозрительных колоний на принадлежность к бактериям рода Campylobacter по п. 8.1. При получении противоречивых результатов (положительных альтернативным методом, не подтвержденных стандартным методом) для проверки следует использовать дополнительные методы".

Изменения, внесенные Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 24.06.2011, введены в действие с 24 июня 2011 года. Текст документа

Дата введения:
с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2321-08

(в ред. Дополнений и изменений 1,
утв. Роспотребнадзором 24.06.2011)

Разработаны: Государственным учреждением Научно-исследовательским институтом питания Российской Академии медицинских наук (В.А.Тутельян, С.А.Хотимченко, С.А.Шевелева, Н.Р.Ефимочкина, Ж.Н.Шурышева), Федеральным Государственным учреждением науки Государственным научным центром прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора (И.А.Дятлов, М.В.Храмов), Федеральным Государственным учреждением науки "Федеральный Научный Центр гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана" Роспотребнадзора (Г.М.Трухина), Управлением Роспотребнадзора по г. Москве (Н.Н.Филатов, И.И.Пискарева), ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве" (О.В.Захарова, Н.Я.Салова).
Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Протокол от 06.12.2007 N 3.
Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г.Онищенко 24.01.2008.
Введены впервые.
ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

1.1. Настоящие Методические указания устанавливают порядок контроля и методы определения бактерий рода Campylobacter - возбудителей пищевых токсикоинфекций и острых кишечных заболеваний в пищевых продуктах при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи. Проведение контроля на бактерии рода Campylobacter позволит оценить степень загрязненности пищевой продукции и получить реальную картину ситуации в Российской Федерации, дать оценку эффективности принимаемых мер в целях обеспечения ее безопасности в плане новых и вновь возникающих возбудителей инфекций с пищевым путем передачи для здоровья и жизни человека. 1.2. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, а также лабораторную диагностику заболеваний с пищевым путем передачи. Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке. 1.3. Настоящие Методические указания устанавливают методы определения бактерий рода Campylobacter в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения на основе бактериологического анализа (качественного и количественного с идентификацией до вида), а также фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (качественного недифференцированного суммарного определения бактерий видов C. jejuni, C. coli, C. lari, обусловливающих основную часть ОКИ кампилобактериозной природы у человека). (п. 1.3 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 24.06.2011)

2. СУЩНОСТЬ МЕТОДОВ

(раздел в ред. Дополнений и изменений 1, утв. Роспотребнадзором 24.06.2011)

3. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, РЕАКТИВЫ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

3.1. Аппаратура и инструментарий

Анализатор потенциометрический, погрешность ГОСТ 19881-74 измерений pH +/- 0,01
Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80 П или ТУ 9452-010-00141798-2002 других марок, позволяющий поддерживать
температуру (160 +/- 5) град. C
Термостат, позволяющий поддерживать рабочую ТУ 9452-002-00141798-97 температуру 37 град. C с отклонением от заданной +/- 1 град. C
Термостат, позволяющий поддерживать рабочую ТУ 9452-002-00141798-97 температуру 42 град. C с отклонением от заданной +/- 1 град. C

 Баня водяная с подогревом                        ГОСТ 12026-76 Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4       ГОСТ 24104-88Е

класса точности, с наибольшим пределом
взвешивания 200 г
Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, ТУ 9443-076-07502348-96 МБР-1, МБР-3, МБС
Стерилизаторы паровые медицинские или ГОСТ Р 500444-92 аналогичные
Дистиллятор, обеспечивающий качество ТУ 4952-007-33142130-2000 дистиллированной воды в соответствии
с ГОСТ 6709-90
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 ТУ 16-535-84 или других видов
Холодильник бытовой электрический с ГОСТ 16317-87 морозильной камерой

 Пинцет медицинский                               ГОСТ 21241-89 Ножницы медицинские                              ГОСТ 21239-89 Скальпель хирургический, 15 см                   ГОСТ 21240-89 Штативы для пробирок Часы механические сигнальные                     ГОСТ 3145-84 Электроплитка                                    ГОСТ 14919-83

Универсальная лабораторная центрифуга
(20000 x g) с охлаждением типа SIGMA 2-16К Стационарный анаэробный инкубатор или
CO2-инкубатор (Flow Lab.)
или система для анаэробного культивирования с манометром (анаэростат) (HiMedia LE 001) Отсасыватель хирургический типа ХО-450-1 ТУ РЯГК 941624.001 ТУ АО "Элема" (г. Новосибирск)
или стерильные газонепроницаемые пакеты для контейнеров-анаэростатов HiMedia LE 010 Зажимы для контейнеров анаэростатов HiMedia LE 011
Контейнеры для анаэробного культивирования HiMedia LE 007, LE 008 или LE 009
Гомогенизатор перистальтического типа "Микс-2", "Сломайкер" или других наименований AES Lab., Cat.N AESAP 1066.
Автоматический ИФА-анализатор для
фермент-связанного флюоресцентного
иммуноанализа типа VIDAS(R) или
miniVIDAS(R), или с аналогичными
характеристиками, подобный BioMerieux,
Франция, или аналог.
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 24.06.2011)

3.2. Лабораторная посуда и материалы

 Бумага фильтровальная лабораторная                          ГОСТ 120260-76 Бутылки стеклянные для химических реактивов                 ГОСТ 15844-92 Кастрюли эмалированные                                      ГОСТ 24778-81

Примечание.
Взамен ГОСТ 9412-77 введен в действие с 1 января 1996 года ГОСТ 9412-93 "Марля медицинская. Общие технические условия".

 Марля медицинская                                           ГОСТ 9412-77 Колбы плоскодонные конические или круглые разной            ГОСТ 1770-74 вместимости Флаконы стеклянные                                          ТУ 64-2-281-84 Воронки стеклянные                                          ГОСТ 25336-82 Вата медицинская гигроскопическая                           ГОСТ 5556-81 Пипетки емкостью 1, 2, 5 и 10 куб. см                       ГОСТ 29227-91 Пробирки типов П1, П2                                       ГОСТ 25336-82 Стекла предметные для микропрепаратов                       ГОСТ 6672-75 Спиртовки лабораторные стеклянные                           ГОСТ 23932-90 Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до            ГОСТ 13646-68

100 град. C (цена деления шкалы 1 град. C) Термоконтейнер (сумка-холодильник)
Петли бактериологические
Чашки биологические (Петри) ГОСТ 23932-90 Маркеры по стеклу
Отраслевой стандартный образец мутности ОСО 42-28-85-04П на 10 ед. НИИ СКМБП им. Тарасевича Роспотребнадзора Газогенераторные пакеты для кампилобактерий объемом 3,5 литра HiMedia LE 002 D
Смесь газов: кислорода (O2) - 5%, двуокиси углерода ТУ 6-16-2956-92 (CO2) - 10%, азота (N2) - 85% в баллонах Обхваты резиновые
Пакет для гомогенизации с фильтром, подобный BioMerieux, Франция, или аналог
Набор реагентов для определения бактерий рода Campylobacter типа VIDAS(R) Campylobacter (CAM) или с аналогичными характеристиками, подобный BioMerieux, Франция, или аналог.
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 24.06.2011)

Допускается использование другой аппаратуры, инструментария, лабораторной посуды и материалов аналогичного назначения для проведения исследований в соответствии с данным документом. Аппаратура, инструментарий, лабораторная посуда и материалы импортного производства должны иметь разрешение уполномоченных органов Российской Федерации на их применение.

3.3. Реактивы и питательные среды

3.3.1. Реактивы, компоненты сред

Натрий гиппурат (содержание основного вещества 99%) Acros 41170
Нингидрин (содержание основного вещества 99%) Riedel-de Haen 33437
Раствор перекиси водорода 3%-й водный
Дистиллированная вода ГОСТ 6709-90 Диски для выявления оксидазы HiMedia DD018 Натрий фосфорнокислый двухзамещенный Na2HPO4 ГОСТ 4193-75 (безводный), чда
Натрий фосфорнокислый однозамещенный гидрат ГОСТ 4198-75 NaHPO4 х H2O
Натрия хлорид ГОСТ 4233-77 Набор реактивов для окраски по Граму

 Масло иммерсионное для микроскопии                 ГОСТ 31739-78 Спирт этиловый ректификованный                     ГОСТ 5962-67 Агар-агар микробиологический                       ГОСТ 17206-96 Пептон                                             ГОСТ 13805-76

Мясной экстракт
Кровь баранья дефибринированная стерильная ЗАО "Эколаб", Россия

 Натрий пировинограднокислый, ч                     ТУ 6-09-08-990-75 Железо (II) сернокислое                            ГОСТ 4148-66 Натрий метабисульфит                               ГОСТ 10.575-76

Или ростовая (аэротолерантная) добавка для кампилобактерий следующего состава:
натрия пируват - 125,0 мг, натрия
метабисульфит - 125,0 мг, железа (II) сульфат - 125,0 мг HiMedia FD 009
Добавка антибиотиков для кампилобактерий-I (по Блэйзер-Вонг): полимиксин В - 1250 МЕ, ванкомицин - 5,0 мг, триметоприм - 2,5 мг, амфотерицин В - 1,0 мг, цефалотин - 7,5 мг HiMedia FD006
Добавка антибиотиков для кампилобактерий-II (по Бутцлеру), модифицированная, следующего состава:
банутрацин - 12500 МЕ, колистина сульфат - 5000 ЕД, амфотерицин В - 5,0 мг, цефазолина натриевая соль - 7,5 мг, новобиоцин - 2,5 мг HiMedia FD165 Добавка антибиотиков модифицированная III (по Дойлу): ванкомицин - 7,50 мг, триметоприма лактат - 2,50 мг, амфотерицин В - 5,00 мг, полимиксина В сульфат - 10000 МЕ HiMedia FD159 Добавка антибиотиков для кампилобактерий-IV (по Престону) модифицированная: полимиксина В сульфат - 2500 МЕ, рифампицин - 5,00 мг, триметоприма лактат - 5,00 мг, амфотерицин В - 5,00 мг HiMedia FD158
Добавка антибиотиков для кампилобактерий-V: цефоперазон - 16,00 мг HiMedia FD067
Добавка антибиотиков для селективного выделения термофильных кампилобактерий (САТ): цефоперазон - 4,0 мг, тейкопланин - 2,0 мг, амфотерицин В - 5,0 мг HiMedia FD145
Селективная добавка антибиотиков для ТУ 9398-057-7895326-2007 кампилобакагара: полимиксин В - 1 мг,
рифампицин - 5 мг, амфотерицин В - 1,5 мг, ристомицин - 5 мг, ФГУН ГНЦ ПМБ (Оболенск) Диски с цефалотином (Ch 30) HiMedia SD050 Диски с налидиксовой кислотой (Na 30)
HiMedia SD050
Тетраметил-пара-фенилендиамин (гидрохлорид) ТУ 6-09-1903-77 (C10H16N2 х 2HCl)

 Ацетон                                             ГОСТ 2768-84 Спирт бутиловый нормальный, чда                    ГОСТ 6006-51 Кислота соляная, хч                                ГОСТ 3118-77 Натрия гидроокись, чда                             ГОСТ 4328-77.

3.3.2. Среды питательные

3.3.2.1. Обогащающие бульоны
Основа бульона для накопления кампилобактерий (Престона) HiMedia M 899
Основа бульона для накопления кампилобактерий (Дойла) HiMedia M 916
Основа бульона для бруцелл HiMedia M 348.

3.3.2.2. Агаровые среды
Основа агара Престон HiMedia M 939
Основа угольного селективного агара для кампилобактерий HiMedia M 887
Основа колумбийского кровяного агара HiMedia

тм
M 144 BD BBL
Основа агара Мюллера-Хинтона HiMedia M 173

тм
BD BBL
Кампилобакагар ТУ 9398-057-7895326-2007 "Питательные среды", ФГУН ГНЦ ПМБ (Оболенск) Трехсахарный железосодержащий агар (ТСА) HiMedia M 021/М 0211
Или среда N 13 Трехсахарный железосодержащий ТУ 9398-013-7895326-2006. агар ФГУН ГНЦ ПМБ (Оболенск)
Допускается использование других коммерческих питательных сред и диагностических препаратов аналогичного состава и назначения для проведения исследований в соответствии с данным документом. Питательные среды и диагностические препараты импортного производства должны иметь разрешение уполномоченных органов Российской Федерации на их применение. При их приготовлении следует руководствоваться рекомендациями изготовителя. 3.3.2.3. Тест-системы биохимические для видовой идентификации API CAMPY, BioMerieux (или тест-системы аналогичного назначения других изготовителей, обеспечивающие выполнение видовой идентификации кампилобактерий).

3.4. Тест-штаммы микроорганизмов

Тест-штаммы Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari, типичные по культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам, паспортизированные и депонированные в установленном порядке, ФГУН ГНЦ ПМБ (Оболенск). Штаммы необходимо сохранять в лиофильно высушенном виде. При регулярном использовании допускается сохранять в полужидком агаре для бруцелл в пробирках с плотно притертыми пробками, в защищенном от света месте, при температуре (5 +/- 1) град. C с еженедельным пересевом.

3.5. Состав тест-набора для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа

(п. 3.5 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 24.06.2011)

30 стрипов для STR Готовы к использованию определения бактерий рода Campylobacter

30 наконечников SPR Готовы к использованию. На внутреннюю

                      поверхность наконечников нанесены антитела                         к поверхностным антигенам Campylobacter                                                                           Стандарт        S1  Готов к использованию. Очищенный и инактиви-   (1 фл. по 6 мл)     рованный антиген Campylobacter + консервант                        + белковые стабилизаторы. Доверительный                            интервал указан на калибровочной карте

Положительный C1 Готов к использованию. Очищенный и инактиви-

  контроль            рованный антиген Campylobacter + консервант    определения         + белковые стабилизаторы. Доверительный        (1 фл. по 6 мл)     интервал указан на калибровочной карте

Отрицательный C2 Готов к использованию. Забуференный

  контроль            физиологический раствор - твин + консервант.   определения         Максимальное приемлемое значение указано на    (1 фл. по 6 мл)     калибровочной карте                                                                                               1 калибровочная     Лист спецификаций с фабричными установками     карта               для калибровки тестов

1 инструкция

Лунка Реактивы

  1           Лунка для внесения образца: внесите 0,5 куб. см                    бульона обогащения (обогащенной культуры), стандарта               или контроля                                                                                                              2           Предпромывочный буфер (400 куб. мм): забуференный                  физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л)                pH 7,6 + консервант

3 - 4 - 5 - Промывочный буфер (600 куб. мм): забуференный 7 - 8 - 9 физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л)

pH 7,6 + консервант

  6           Конъюгат (400 куб. мм): антитела (IgG) к                           Campylobacter, меченные щелочной фосфатазой +                      консервант                                                                                                                10          Кювета, содержащая субстрат (300 куб. мм):                         4-метил-умбелиферил-фосфат (0,6 М/л) + диэтаноламин                (0,62 М/л или 6,6%, pH 9,2) + консервант

4. ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ

4.1. Приготовление растворов и реактивов

4.1.1. Изотонический раствор хлорида натрия Натрия хлорид - 85,0 г.
Дистиллированная вода - 1,0 л.
Растворить натрия хлорид в дистиллированной воде, стерилизовать автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. 4.1.2. Реактив для обнаружения оксидазы Тетраметил-пара-фенилендиамин (гидрохлорид) - 0,1 г. Стерильная дистиллированная вода - 10 мл. Растворить тетраметил-пара-фенилендиамин (гидрохлорид) в дистиллированной воде, использовать непосредственно после приготовления. 4.1.3. Фосфатный буферный раствор для приготовления раствора гиппурата натрия Двухзамещенный фосфорнокислый натрий Na2HPO4 (безводный) - 12,0 г. Однозамещенный фосфорнокислый натрий NaHPO4 х H2O - 2,2 г. Натрия хлорид - 85,0 г.
Дистиллированная вода - 1,0 л.
Растворить ингредиенты в небольшом объеме дистиллированной воды в колбе. После растворения довести объем дистиллированной водой до 1,0 литра. В случае необходимости довести pH до 7,4-7,5 с помощью 0,1 н HCl или 0,1 н NaOH. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. 4.1.4. Раствор гиппурата натрия
Натрий гиппурат (содержание основного вещества 99%) - 10,0 г. Фосфатный буферный раствор - 1,0 л.
Растворить гиппурат натрия в стерильном буферном растворе. Разлить в пробирки по 0,4 мл. Хранить при температуре минус 20 град. C не более 1 месяца. Перед использованием разморозить при комнатной температуре. 4.1.5. Раствор нингидрина
Нингидрин (содержание основного вещества 99%) - 10,0 г. Ацетон - 25 мл.
Бутиловый спирт - 25 мл.
Растворить нингидрин в смеси ацетона и бутилового спирта. Хранить в защищенном от света месте при температуре (5 +/- 1) град. C не более 3 месяцев. 4.1.6. Аэротолерантная добавка
Натрий пировинограднокислый - 6,25 г.
Железо (II) сернокислое - 6,25 г.
Натрий метабисульфит - 6,25 г.
Стерильная дистиллированная вода - 100 мл. Растворить натрий пировинограднокислый в 10-20 мл стерильной дистиллированном воды, после растворения довести объем воды до 100 мл. Добавить железо (II) сернокислое и натрия метабисульфит. Разлить в пробирки по 4 мл. Хранить в защищенном от света месте при температуре минус 20 град. C не более 1 месяца. Раствор чрезвычайно чувствителен к воздействию света, после добавления в питательные среды рекомендуется сохранять их в защищенном от света месте. 4.1.7. Приготовление растворов и реактивов для окраски препаратов по Граму Производят согласно требованиям ГОСТ 10444.1 или в соответствии с инструкцией по применению.

4.2. Приготовление питательных сред

Селективность сред для выделения бактерий рода Campylobacter по отношению к сопутствующей микрофлоре достигается путем включения в их состав антибиотиков: цефоперазона, колистина, амфотерицина В, ванкомицина, триметоприма, полимиксина и других. С целью повышения аэротолерантности и снижения окислительно-восстановительного потенциала сред в них добавляют дефибринированную баранью кровь в количестве не менее 7% к объему или древесный уголь, а также восстанавливающие агенты: натрия пируват, натрия метабисульфит, железо (II) сульфат. Так как бактерии рода Campylobacter являются микроаэрофильными микроорганизмами, крайне важно предотвращать попадание кислорода в питательные среды для их культивирования, для чего необходимо соблюдать следующие правила: - предпочтительней использовать свежеприготовленные среды, срок хранения питательных сред не должен превышать двух недель в условиях холодильника; - перемешивание компонентов готовых сред (при растворении добавок антибиотиков, перемешивании крови), самих сред после добавления в них компонентов проводить способом, исключающим попадание в них пузырьков воздуха; - подсушивание поверхности чашек перед посевом в термостате осуществлять с закрытыми крышками при температуре 42 град. C в течение 2-3 часов. Среды промышленного изготовления, поименованные в п. 3.3.2, готовятся согласно прилагаемым инструкциям или прописям на этикетках. Допускается применение сред лабораторного приготовления по п.п. 4.2.1.1, 4.2.2.1 из отдельных компонентов.

4.2.1. Приготовление бульонов

4.2.1.1. Селективный бульон (Престона) для накопления кампилобактерий. Состав основы среды:

Ингредиенты Количество, г

Пептон 10,0

Мясной экстракт 10,0

Натрия хлорид 5,0

Агар 1,0

Вода 1000,0

Растворить основные компоненты в дистиллированной воде. При необходимости подогреть до кипения для полного растворения частиц. В случае необходимости установить pH 7,5 +/- 0,2 с помощью 0,1 н HCl или 0,1 н NaOH. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. Остудить до 45-50 град. C. Приготовление полной среды:
перед использованием в 1000 мл бульона асептически добавить: 70 мл стерильной дефибринированной крови барана; растворенное в 50%-ном растворе ацетона содержимое двух флакончиков с добавкой антибиотиков для кампилобактерий IV (по Престону) или I (по Блэйзер-Вонг) или растворенное в 50%-ном растворе этанола содержимое двух флакончиков с добавкой антибиотиков II (по Бутцлеру) и растворенное в стерильной дистиллированной воде содержимое двух флакончиков ростовой добавки для кампилобактерий, или 4 мл аэротолерантной добавки по п. 4.1.6 тщательно перемешать и разлить среду в соответствующие емкости в количествах, необходимых для проведения исследования. 4.2.1.2. Селективный бульон (Дойла) для накопления кампилобактерий. Состав основы среды:

Ингредиенты Количество, г/л

Гидролизат казеина 10,0

Пептический перевар животной ткани 10,0

Дрожжевой экстракт 2,0

Глюкоза 1,0

Натрия хлорид 5,0

Натрия бисульфит 0,1

Натрия сукцинат 3,0

L-цистеина гидрохлорид 0,1

pH (при 25 град. C) 7,0 +/- 0,2

Используют готовую основу среды промышленного изготовления указанного состава. Приготовление осуществляют согласно прописи на этикетке. Растворить сухую основу порошка в дистиллированной воде. При необходимости подогреть до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. Остудить до температуры 45 град. C. Приготовление полной среды:
перед использованием в 500 мл бульона асептически добавить 35 мл стерильной дефибринированной крови барана, а также растворенное в 50%-ном растворе этанола содержимое 1 флакончика с добавкой антибиотиков модифицированной III (по Дойлу). Тщательно перемешать и разлить в соответствующие емкости в количествах, необходимых для проведения исследования. 4.2.1.3. Бульон для бруцелл (неселективный). Состав основы среды:

Ингредиенты Количество, г/л

Гидролизат казеина 10,0

Пептический перевар животной ткани 10,0

Дрожжевой экстракт 2,0

Глюкоза 1,0

Натрия хлорид 5,0

Натрия бисульфит 0,1

pH (при 25 град. C) 7,0 +/- 0,2

4.2.2. Приготовление агаровых сред

4.2.2.1. Селективный агар Престона.
Состав основы среды:

Ингредиенты Количество, г

Пептон 10,0

Мясной экстракт 10,0

Натрия хлорид 5,0

Агар-агар 12,0

Вода 1000,0

pH (при 25 град. C) 7,5 +/- 0,2

Растворить основные компоненты в дистиллированной воде. При необходимости довести до кипения для полного растворения частиц. В случае необходимости установить pH 7,5 +/- 0,2 с помощью 0,1 н HCl или 0,1 н NaOH. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. Остудить до 45-50 град. C. Приготовление полной среды:
перед использованием в 1000 мл расплавленного и остуженного до 45-50 град. C агара асептически добавить: 70 мл стерильной дефибринированной крови барана; растворенное в 50%-ном растворе ацетона содержимое двух флакончиков с добавкой антибиотиков для кампилобактерий IV (по Престону) или I (по Блэйзер-Вонг), или растворенное в 50%-ном растворе этанола содержимое двух флакончиков с селективной добавкой для кампилобактерий II (по Бутцлер) и растворенное в воде содержимое двух флакончиков ростовой добавки для кампилобактерий, или 4 мл аэротолерантной добавки по п. 4.1.6, тщательно перемешать и разлить среду в стерильные чашки Петри слоем толщиной 4-5 мм. 4.2.2.2. Угольный селективный агар для кампилобактерий. Состав основы среды:

Ингредиенты Количество, г/л

Гидролизат казеина 3,0

Пептический перевар животной ткани 10,0

Мясной экстракт 10,0

Натрия хлорид 5,0

Железа сульфат 0,25

Натрия пируват 0,25

Уголь древесный бактериологический 4,0

Агар-агар 12,0

pH (при 25 град. C) 7,0 +/- 0,2

Используют готовую основу среды промышленного изготовления указанного состава. Приготовление осуществляют согласно прописи на этикетке. Растворить порошок сухой основы в дистиллированной воде. Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. Остудить до 45-50 град. C. Приготовление полной среды:
в 500 мл расплавленного и остуженного до 45-50 град. C агара асептически добавить растворенное в 2 мл стерильной дистиллированной воды содержимое 1 флакончика с добавкой антибиотиков САТ или растворенное в 2 мл стерильной дистиллированной воды содержимое 1 флакончика с добавкой антибиотиков-V. Тщательно перемешать и разлить в стерильные чашки Петри слоем толщиной 4-5 мм. 4.2.2.3. Кампилобакагар.
Состав основы среды:

Ингредиенты Количество, г/л

Панкреатический гидролизат казеина 5,0

Кислотный гидролизат казеина 20,0

Агар 15,0 +/- 3,0

Натрий углекислый 0,1 - 0,4

Используют готовую основу среды промышленного изготовления указанного состава. Приготовление осуществляют согласно прописи на этикетке. Растворить порошкообразную сухую основу в дистиллированной воде. Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. Остудить до 45-50 град. C. Приготовление полной среды:
перед использованием в 1000 мл расплавленного и остуженного до 45-50 град. C агара асептически добавить 70 мл стерильной дефибринированной крови барана. Содержимое флакона с селективной добавкой антибиотиков для кампилобакагара растворить в 1,5 мл стерильной дистиллированной воды с добавлением 5-7 капель 96%-ного этилового спирта. Полученную смесь антибиотиков в количестве двух флаконов добавить в агар, тщательно перемешать и разлить в стерильные чашки Петри слоем толщиной 4-5 мм. 4.2.2.4. Полужидкий бульон для бруцелл (неселективный). Состав основы бульона:

Ингредиенты Количество, г/л

Гидролизат казеина 10,0

Пептический перевар животной ткани 10,0

Дрожжевой экстракт 2,0

Глюкоза 1,0

Натрия хлорид 5,0

Натрия биосульфат 0,1

pH (при 25 град. C) 7,0 +/- 0,2

К готовой основе среды промышленного изготовления указанного состава добавить агар из расчета 2,0 г/л среды, далее приготовление осуществлять согласно прописи на этикетке. Растворить порошкообразную сухую основу в дистиллированной воде. Довести до кипения для полного растворения частиц, тщательно перемешать, разлить по пробиркам из расчета 5 мл на 1 пробирку. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. 4.2.2.5. Колумбийский кровяной агар (неселективный). Состав основы среды:

Ингредиенты Количество, г/л

Пептон (специальный) 23,0

Крахмал кукурузный 1,0

Натрия хлорид 5,0

Агар-агар 15,0

pH (при 25 град. C) 7,3 +/- 0,2

Ингредиенты Количество, г/л

Мясной настой 300,0

Гидролизат казеина 17,5

Крахмал 1,5

Агар-агар 17,0

pH (при 25 град. C) 7,3 +/- 0,2

Ингредиенты, г/л Среды:

N 13 ТСА

Пептический перевар животной ткани 10,0 20,0

Гидролизат казеина 10,0 -

Дрожжевой экстракт 3,0 3,0

Мясной экстракт 3,0 3,0

Лактоза 10,0 10,0

Сахароза 10,0 10,0

Глюкоза 1,0 1,0

Натрия хлорид 5,0 5,0

Железа сульфат 0,2 -

Железа (III) цитрат - 0,3

Натрия тиосульфат 0,3 -

  Натрия тиосульфат (х 5H O)                   -              0,3                                    2                                                                                                                                Феноловый красный                            0,024          0,024                                                                                       Агар-агар                                    12,0           12,0

pH (при 25 град. C) 7,4 +/- 0,2

Используют готовые основы сред промышленного изготовления с указанным составом. Приготовление осуществляют согласно прописям на этикетках. Растворить порошкообразную сухую основу в дистиллированной воде. Подогреть до кипения для полного растворения частиц. Тщательно перемешать и разлить в пробирки для тестирования. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 град. C в течение 15 мин. Остудить среду в наклонном положении при комнатной температуре для формирования скоса и столбика высотой 2,5 см.

4.3. Требования к выполнению фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа

(п. 4.3 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 24.06.2011)

5. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

5.1. Общие положения по отбору и подготовке проб

Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов", МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов", ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96), а также в соответствии с действующими ГОСТ и НД на конкретные виды продуктов. Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования и минимально вдвое превышать размер аналитического(их) образца(ов). Учитывая, что кампилобактерии чрезвычайно чувствительны к воздействию факторов окружающей среды, таких как высушивание, снижение pH, нагревание, воздействие УФ-лучей и длительное хранение, при отборе проб пищевых продуктов на наличие бактерий рода Campylobacter необходимо соблюдать следующие правила: - отбор проб и их доставку в лабораторию для исследования проводят в максимально короткие сроки, по возможности не более 1 часа; - отбор проб твердых пищевых продуктов осуществляют в стерильные газонепроницаемые пакеты, удаляют избыток воздуха, герметизируют путем перекручивания свободных краев пакета и фиксации при помощи обхвата. Пробы жидких продуктов отбирают в герметично закрывающуюся стерильную стеклянную посуду; - доставку проб в лабораторию осуществляют в термоконтейнере с охлаждающими вкладышами (сумке-холодильнике); - до проведения анализа пробы сохраняют в защищенном от света месте при температуре (5 +/- 1) град. C. Пробы замороженных продуктов размораживают в защищенном от света месте при температуре (5 +/- 1) град. C в течение не более 18 ч. или в течение 1 ч. при температуре (19 +/- 1) град. C; - после вскрытия упаковки пробы подвергают исследованию немедленно, приготовление объединенной пробы, навесок продукта и посев осуществляют в максимально короткие сроки. Для приготовления объединенной пробы продукт измельчают, но активное перемешивание измельченной пробы не рекомендуется.

5.2. Отбор и подготовка проб мяса птицы и птицепродуктов, мяса, мясных полуфабрикатов, колбасных изделий и других мясопродуктов

Отбор и подготовку проб мяса птицы и птицепродуктов, мяса, мясных полуфабрикатов, колбасных изделий и других мясопродуктов проводят по ГОСТ Р 50396.0-92 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям". Отбор и подготовку проб мяса, субпродуктов, мясных полуфабрикатов, колбасных изделий и других мясных продуктов проводят по ГОСТ 21237 "Мясо. Методы бактериологического анализа", ГОСТ 4288 "Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленного мяса", ГОСТ 9958, ГОСТ 9792 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц". Отобранные образцы измельчают в перистальтическом гомогенизаторе или вручную в фарфоровой ступке, доводят до однородной консистенции по ГОСТ 26669-85, из измельченной суспензии составляют навеску необходимой массы.

5.3. Отбор и подготовка проб молока,
молочных продуктов, сыров, мороженого

Отбор и подготовку проб проводят согласно ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа". Кисломолочные продукты, сыр, творог, творожные изделия и пастообразные продукты тщательно измельчают и подвергают нейтрализации; масло сливочное и мороженое растапливают при температуре не выше 45 град. C до сметанообразной консистенции, после чего от пробы отбирают навеску не менее 50 г, которую центрифугируют при 20000 х g (с охлаждением) в течение 40 мин. Удаляют супернатант и слой жира, исследованию подвергают седимент (осадок).

6. СОЗДАНИЕ МИКРОАЭРОФИЛЬНЫХ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Оптимальная газовая среда для культивирования бактерий рода Campylobacter имеет состав: двуокись углерода (CO2) - 10%, кислород (O2) - 5%, азот (N2) - 85%. Для ее создания можно использовать следующие способы. 6.1. С использованием газовой смеси вышеуказанного состава заводского изготовления. 6.1.1. Вариант 1. Посевы помещают в систему для анаэробного культивирования (анаэростат), закрывают, откачивают воздух до уровня, соответствующего отметкам минус 0,9-1,0 атмосфера по шкале манометра. Процедуру откачивания содержимого и заполнения пространства газовой смесью необходимо повторить дважды, после чего анаэростат помещают в термостат с температурой (42 +/- 1) град. C. 6.1.2. Вариант 2. Посевы помещают в контейнеры для анаэробного культивирования определенного объема, затем в стерильные газонепроницаемые пакеты. Пакеты заполняют газовой смесью, вручную вытесняют избыток смеси из пакета. Заполнение-вытеснение повторяют дважды, оканчивают заполнением, после чего пакет герметизируют, перекручивая свободные края с последующей фиксацией их специальным зажимом или резиновым обхватом и помещают в термостат с температурой (42 +/- 1) град. C. 6.2. С использованием газогенераторных пакетов для кампилобактерий, которые после вскрытия помещают либо в анаэростат, либо в газонепроницаемые пакеты. Газогенераторные пакеты рассчитаны на определенный объем анаэростата (газонепроницаемых пакетов), что необходимо учитывать при их применении. Инкубирование посевов проводят при температуре (42 +/- 1) град. C. 6.3. Культивирование посевов допускается осуществлять также в анаэробном инкубаторе или CO2-инкубаторе, позволяющем поддерживать температуру (42 +/- 1) град. C.

7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

7.1. Качественное определение

Метод определения бактерий рода Campylobacter предусматривает определение их наличия или отсутствия в навеске (порции) пищевых продуктов определенной массы или объема (10, 25 или 50 г (куб. см)), для чего необходимое количество подготовленной пробы вносят в 9-кратный объем обогащающего бульона по п.п. 4.2.1.1 или 4.2.1.2 (при исследовании жидких молочных продуктов супернатант, приготовленный согласно п. 5.3, предварительно растворяют в 10 мл обогащающего бульона и добавляют к 90 мл обогащающего бульона). Полученное разведение предварительно инкубируют в течение 4 ч. при 37 град. C, а в случае посевов замороженных продуктов или продуктов, которые хранились более 10 дней, - в течение 3 ч. при температуре 32 град. C, потом 2 ч. при температуре 37 град. C. Затем посевы продолжают инкубировать в течение 18-24 ч. при температуре 42 град. C. После этого делают пересев петлей на поверхность агара по п.п. 4.2.1.1, 4.2.2.2 или 4.2.2.3 и вновь инкубируют при температуре 42 град. C. Длительность инкубации посевов может составлять до 48 ч. при необходимом ежесуточном контроле роста культуры. Инкубация на всех этапах осуществляется в микроаэрофильных условиях. Основные этапы исследования пищевых продуктов для качественного определения бактерий рода Campylobacter представлены в табл. 1.

Таблица 1

СХЕМА ПРОЦЕДУРЫ КАЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАМПИЛОБАКТЕРИЙ

N Название этапа Суть процедуры этапа

    1    Приготовление     Асептическое взвешивание или отмеривание                  навески           необходимого объема пробы                                                                                                        2    Посев             В 9-кратный объем жидкой среды - обогащающего                               бульона, инкубация в микроаэрофильных условиях

3 Предварительное 3.1. Для продуктов, замороженных и хранившихся

         обогащение (в     более 10 дней, - 3 ч. при 32 град. C, затем 2 ч.          микроаэрофильных  при 37 град. C;                                           условиях)         3.2. Для прочих продуктов - 4 ч. при 37 град. C                                                                                  4    Обогащение (в     Изменение температуры инкубации на 42 град. C -           микроаэрофильных  термостатирование в течение 18-24 ч.                      условиях)                                                                                                                                          5    Пересев           Инокуляция на поверхность селективного агара и                              инкубация в микроаэрофильных условиях 24-48 ч.                              при 42 град. C                                                                                                                   6    Подтверждение     Идентификация выросших колоний до рода и                                    выдача предварительного ответа

7 Учет результатов Идентификация колоний до вида и выдача

окончательного ответа

7.2. Количественное определение

При количественном анализе общая масса (объем) навески должна быть не менее 100 г (куб. см). Из подготовленной по п. 5.2 пробы отбирают 4 навески (порции) продукта массой 10 г (куб. см) каждая для анализа. Производят посев каждой из трех навесок (порций) в 90 мл обогащающего бульона, осторожно перемешивают. Перемешивание продукта производят способом, исключающим попадание пузырьков воздуха. Перемешивание пипеткой путем вдувания и выдувания воздуха не допускается. Из четвертой навески (порции) массой (объемом) 10 г (куб. см) готовят разведение 1:10, для посевов десятикратно убывающих количеств продукта - 1,0, 0,1 и ниже. Для этого из колбы с полученным разведением 1:10 переносят последовательно по 10 мл в три колбы с 90 мл и по 1 мл в три пробирки с 9 мл обогащающего бульона. При необходимости (при предполагаемом высоком содержании кампилобактерий в продукте) производят посев по 0,1 мл из разведения 1:10 в три пробирки с 9 мл обогащающего бульона. Производят перемешивание вышеупомянутым способом. Для каждого разведения используют новую стерильную пипетку. Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведения с питательной средой должно составлять не менее 1:9. Таким образом, от каждого из испытуемых образцов должно быть засеяно не менее трех масс (объемов) продукта в трехкратной повторности: 10 г (куб. см) х 3; 1 г (куб. см) х 3; 0,1 г (куб. см) х 3; а при необходимости - четвертая в количестве 0,01 г (куб. см) х 3 раза. Допускается использовать для посева только разведения продукта, при этом засеянные массы будут составлять 1 г (куб. см) (трехкратно); 0,1 г (трехкратно); 0,01 г (трехкратно). Дальнейший анализ всех исследуемых масс (объемов) проводят по схеме качественного определения кампилобактерий (см. табл. 1, этапы 3-7), при этом пересев каждой из засеянных колб (пробирок) на плотные среды допускается осуществлять на одну чашку Петри с делением на 3 сектора. Схема процедуры посева приведена в Прилож. 1.

7.3. Проведение фермент-связанного
флюоресцентного иммуноанализа

(п. 7.3 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 24.06.2011)

7.3.1. Подготовка анализатора к работе: - Перед использованием реактивов новой партии в анализатор вводят (автоматически или вручную) спецификации реактивов, используя калибровочную карту, входящую в каждый набор. Процедуру необходимо проводить только один раз для каждой партии реактивов. - Для каждой новой партии реактивов проводят калибровку прибора, используя стандарт, входящий в состав набора. Калибровку проводят после ввода данных партии, но не реже одного раза в 14 дней. Для этого в отдельные стрипы вносят по 0,5 куб. см реактива C1, C2 и в два стрипа реактив S1 из тест-набора. Необходимо ввести информацию об образце и контролях в анализатор для создания рабочего листа. Установить стрипы и наконечники в анализатор и запустить программу. Эта операция необходима для построения точной калибровочной кривой и компенсации вариаций, которые могут возникнуть при хранении набора. Стандарт S1 необходимо тестировать в двукратной повторности согласно руководству по эксплуатации прибора. Результаты должны находиться в пределах установленного диапазона, указанного на калибровочной карте. Если результат не соответствует диапазону, следует повторить калибровку. 7.3.2. Подготовка образцов к фермент-связанному флюоресцентному иммуноанализу Отобрать в пробирку 1-2 куб. см бульона обогащения, инкубированного по п. 7.1 МУК 4.2.2321-08, закрыть и нагревать на водяной бане (15 +/- 1) мин. при 95 - 100 град. С. Охладить 10 мин., перемешать и внести 0,5 куб. см в стрип из тест-набора. Оставшуюся часть бульона хранят в холодильнике при 2-4 град. С для подтверждения положительных образцов. 7.3.3. Проведение фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа Перед проведением анализа необходимое количество компонентов тест-набора оставить при комнатной температуре на 30 мин. Для каждого анализа используется 1 стрип и 1 наконечник из тест-набора. В открытую лунку стрипа вносят 0,5 куб. см термостатированного образца по п. 7.3.2. Далее стрипы и наконечники устанавливают в анализатор, вводят название соответствующих образцов и запускают анализ. Время анализа приблизительно 70 мин. 7.3.4. Интерпретация результатов
Оптический сканер прибора измеряет флюоресценцию дважды в оптической кювете для каждого образца. Первый раз измеряется фон субстрата и кюветы перед внесением в нее субстрата. Второй раз флюоресценция измеряется после внесения субстрата в конус и образования флюоресцирующего продукта в результате ферментативной реакции на поверхности конуса. Вычитание фона кюветы из последнего измерения дает относительную величину флуоресценции - ОВФ (Relative Fluorescence Value) тестируемого образца. Интерпретация значений ОВФ проводится прибором автоматически согласно формуле:

[Результат теста = ОВФ образца / ОВФ стандарта]

Результат теста Интерпретация

< 0,1 Отрицательный

>= 0,1 Положительный

Результат теста со значением меньше порогового указывает на то, что образец не содержит антигена Campylobacter либо содержит его в концентрации ниже порога определения. Результат теста со значением, равным или больше порогового, свидетельствует о том, что образец загрязнен бактериями рода Campylobacter. В этом случае следует провести подтверждение положительного результата по п. 7.3.5. Результаты также считаются недействительными, если (1) значение ОВФ фона выше ожидаемого значения или (2) нет информации о значениях ОВФ стандарта. В первом случае возможно загрязнение субстрата, в связи с чем необходимо провести повторное тестирование образца с новым стрипом. Во втором случае должен быть протестирован новый стандарт из той же партии и результаты теста должны быть пересчитаны по этому стандарту. На принтер выводится информация - тип теста, номер образца, дата и время анализа, номер партии и дата окончания срока годности набора, значения ОВФ, результат и его интерпретация. 7.3.5. Подтверждение положительного результата Подтверждение положительного результата проводят путем высева 0,1 мл хранившегося в холодильнике бульона обогащения, полученного по п. 7.3.2, на поверхность одной из селективных сред (по п. 4.2.2). Инкубацию образцов проводят при температуре (42 +/- 1) град. С в течение 20-24 ч, при отсутствии роста инкубировать еще 24 ч. При наличии характерных колоний необходимо провести идентификацию до 5 подозрительных колоний на принадлежность к бактериям рода Campylobacter по п. 8.1. При получении противоречивых результатов (положительных альтернативным методом, не подтвержденных стандартным методом) для проверки следует использовать дополнительные методы.

8. ОТБОР КОЛОНИЙ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЫДЕЛЕННЫХ КУЛЬТУР

Манипуляции по отбору колоний для исследования и их пересев необходимо проводить в максимально короткие сроки. Кампилобактерии при росте в микроаэрофильных условиях на поверхности селективного агара образуют мелкие округлые колонии или колонии средних размеров, неправильной формы, как бы растекающиеся по ходу штриха, серые или полупрозрачные с сероватым оттенком, гладкие, влажные, блестящие (в жидких и полужидких средах кампилобактерии дают гомогенное помутнение или голубовато-серую пленку). Отбирают 5 типичных или подозрительных на принадлежность к Campylobacter spp. изолированных колоний (если число таких колоний менее пяти, то отбирают все колонии), суспендируя каждую из колоний в 1 мл бульона для бруцелл или любой жидкой среды без антибиотиков и крови. Идентификацию осуществляют в два этапа: для подтверждения принадлежности к роду (I) и определения вида (II) кампилобактерий.

8.1. Определение принадлежности к роду Campylobacter

8.1.1. Окраска по Граму. Бактерии рода Campylobacter - грамотрицательные мелкие, тонкие палочки с одним или более завитками. В мазке имеют вид запятой, буквы S, либо галочки при соединении двух клеток. В стареющих культурах (через 48-72 ч. инкубации на твердой среде) могут обнаруживаться кокковидные клетки. 8.1.2. Подвижность. Определяют при микроскопии раздавленной капли с помощью фазово-контрастного устройства. Не следует разводить образец в дистиллированной воде, т.к. кампилобактерии теряют в ней подвижность, разводить необходимо изотоническим раствором хлорида натрия или любой жидкой средой без антибиотиков и крови. Кампилобактерии, взятые с агара, имеют волнообразную подвижность, из бульона - спиралевидную. До 10% штаммов могут быть неподвижны. Обнаружение в пересевах на твердой селективной среде колоний с типичными культуральными свойствами, в которых обнаруживаются клетки с типичной для кампилобактерии морфологией, обладающие подвижностью, позволяет дать предварительный ответ о наличии бактерий рода Campylobacter в исследуемой пробе на 3-4 сутки от начала исследования (I этап). Для выдачи окончательного ответа необходимо проведение тестов идентификации, которые включают в себя подтверждение принадлежности к роду и определение принадлежности к термотолерантным видам Campylobacter: на способность к росту при температуре (+) 25 град. C, наличие каталазы, оксидазы, способности гидролизовывать гиппурат, утилизировать углеводы и продуцировать сероводород при росте на трехсахарном агаре с солями железа, а также определение чувствительности к налидиксовой кислоте и цефалотину (II этап). Колонии, в которых обнаружены типичные клетки кампилобактерий, пересевают петлей из взвеси в бульоне для бруцелл на поверхность кровяного Колумбийского агара для получения чистой культуры и инкубируют при 42 град. C в течение 24-48 ч. в микроаэрофильной атмосфере.

8.2. Подтверждающие тесты родовой и видовой идентификации

8.2.1. Рост при 25 град. C. Для определения способности к росту при температуре 25 град. C исследуемую культуру засевают петлей в пробирку с бульоном для бруцелл, инкубируют при температуре 25 град. C в микроаэрофильных условиях в течение 3-5 сут. Учет проводят по наличию или отсутствию видимого роста. Термофильные бактерии рода Campylobacter не способны к росту при температуре 25 град. C. 8.2.2. Тест на оксидазу. Постановку реакции можно осуществлять двумя нижеописанными способами: 1. Полоску фильтровальной бумаги смачивают 2-3 каплями оксидазного реагента. На обработанную реактивом полоску платиновой петлей наносят исследуемую культуру. При появлении сиреневой, фиолетовой или глубокой синей окраски в течение 10 с реакцию считают положительной. 2. Используют готовые бумажные диски, пропитанные оксидазным реагентом. Учет результатов реакции проводят согласно инструкции изготовителя. Бактерии рода Campylobacter оксидазоположительны. Не рекомендуется проводить постановку данной реакции с колониями, выращенными на угольном агаре, т.к. они могут не давать характерной окраски (сиреневой, фиолетовой или синей). 8.2.3. Тест на каталазу. В каплю перекиси водорода на чистом предметном стекле вносят петлю исследуемой культуры. Появление пузырьков воздуха свидетельствует о положительной реакции. Бактерии рода Campylobacter каталазоположительны, за исключением редко встречающегося вида C.upsaliensis. 8.2.4. Гидролиз гиппурата. В пробирку с 0,4 мл раствора гиппурата вносят полную петлю исследуемой чистой культуры. Для исследования берут только хорошо изолированные колонии. Для полного смешивания инкубируют на водяной бане при температуре 37 град. C в обычной атмосфере. Через 2 ч. добавляют 0,2 мл нингидринового реактива, перемешивают и дополнительно инкубируют на водяной бане в течение 10 мин. О положительной реакции свидетельствует появление фиолетового или темно-синего окрашивания. К гидролизу гиппурата способны Campylobacter jejuni, представители других видов рода Campylobacter не ферментируют гиппурат. 8.2.5. Утилизация глюкозы, лактозы, сахарозы и продукция сероводорода (H2S). Способность выделенных бактерий утилизировать сахара и продуцировать сероводород изучают по росту на скошенном столбике трехсахарного железосодержащего агара. Обильно засевают чистой культурой исследуемого микроорганизма поверхность скошенной части ТСА с последующим уколом в столбик среды. Инкубирование осуществляют в микроаэробных условиях при температуре 42 град. C в течение 24 ч. и продолжают, если необходимо, до 5 дней. Учет результатов проводят по наличию изменения цвета поверхности скошенной части ТСА и цвета столбика среды в пробирке, формированию газа в среде. При неспособности к утилизации сахаров и продукции H2S цвет поверхности скошенной части ТСА и самого столбика остается неизменным, пузырьки газа и расслоение среды отсутствуют. Появление желтого окрашивания столбика либо поверхности скошенной части ТСА свидетельствует об утилизации одного из сахаров, газообразования - об утилизации глюкозы, а появление черного окрашивания в толще столбика - о формировании H2S. Бактерии рода Campylobacter не утилизируют углеводы. Продуцировать сероводород могут штаммы вида C.coli (11-89% случаев).

8.2.6. Определение чувствительности к налидиксовой кислоте и цефалотину. Двухсуточную агаровую культуру Campylobacter spp. суспендируют в стерильном физиологическом растворе и стандартизуют по оптическому стандарту мутности на 10 ед. Полученную бактериальную взвесь, содержащую 9
10 КОЕ/мл, в количестве 1 мл наносят на поверхность агара Мюллера-Хинтона с добавлением 7% крови барана, равномерно распределяют покачиванием, избыток взвеси отсасывают пастеровской пипеткой. Чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин. На поверхность инокулированной чашки накладывают диски с цефалотином и налидиксовой кислотой. Чашки инкубируют в микроаэробных условиях при температуре 37 град. C в течение 48-72 ч. Рост в контакте с диском расценивается как устойчивость, наличие зоны задержки роста любых размеров - как чувствительность. Бактерии рода Campylobacter устойчивы к цефалотину (за исключением видов С.hyointestinalis и C.upsaliensis) и к налидиксовой кислоте (за исключением C.coli и C.upsaliensis). Среди C.jejuni могут быть штаммы как устойчивые, так и чувствительные к налидиксовой кислоте. 8.2.7. Обобщение результатов идентификации При обобщении результатов идентификации и подтверждении выделенных бактерий к термотолерантным видам Campylobacter spp. пользуются табл. 2.

Таблица 2

СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER

Признак \ Вид C.jejuni C.coli C.lari C.hyointestinalis C.upsaliensis

Рост при 25 град. C - - - V -

Гидролиз гиппурата + - - - -

Продукция H2S - V - + (1) -

Продукция каталазы + + + + -

Продукция оксидазы + + + + +

Устойчивость: S (2) S R R S к налидиксовой кислоте

к цефалотину R R R S S

Обозначения: "+" - штаммы положительны в 90% и более случаев; "-" - штаммы отрицательны в 90% и более случаев; "V" - штаммы положительны от 11 до 89% случаев; "S" - все штаммы чувствительны; "R" - все штаммы устойчивы; (1) - слабое образование H2S в ТСА за срок менее 3 дней; (2)

есть сообщения о штаммах, устойчивых к налидиксовой кислоте.

Если бактерии с указанными характеристиками присутствуют по меньшей мере в одной из изученных колоний, считают, что термотолерантные виды Campylobacter в анализируемом образце обнаружены. Для видовой дифференциации выделенных культур кампилобактерий допускается использовать биохимические тест-системы API CAMPY либо другие аналогичного назначения, имеющие разрешение уполномоченных органов Российской Федерации на их применение. При их использовании следует руководствоваться рекомендациями изготовителя.

8.3. Учет результатов и выдача ответа

8.3.1. Учет результатов и выдача ответа при качественном определении. Результат оценивают по каждой исследованной пробе продукта определенной массы или объема (10, 25 или 50 г (куб. см)) отдельно. Предварительный ответ выдается с учетом идентификационных тестов по п. 8.1. Окончательный - с учетом идентификационных тестов по п. 8.2. Если в результате проведенного исследования бактерии рода Campylobacter обнаружены, то результат выражают следующим образом: "Бактерии рода Campylobacter обнаружены в 10, 25 или 50 г (куб. см) продукта". Если не обнаружены: "Бактерии рода Campylobacter не обнаружены в 10, 25 или 50 г (куб. см) продукта". При необходимости в ответе указывается вид бактерий рода Campylobacter. 8.3.2. Учет результатов и выдача ответа при количественном определении. Результат оценивают по каждой исследованной пробе продукта отдельно. Регистрируют число положительных результатов в колбах и пробирках с посевами трех последовательно убывающих масс (объемов) продукта, в которых подтверждено наличие бактерий рода Campylobacter при пересеве на твердые питательные среды и последующей идентификации. В зависимости от получаемой комбинации положительных и отрицательных результатов для каждого значения массы (объема) продукта составляют трехзначное число (индекс), по которому, используя табл., приведенную в Прилож. 2, находят наиболее вероятное число (НВЧ) кампилобактерий, соответствующее их содержанию в 1 г (куб. см) продукта. Для окончательного определения НВЧ бактерий рода Campylobacter в анализируемом образце учитывают значение первой выбранной для расчета индекса НВЧ массы (объема) продукта с подтвержденным наличием кампилобактерий. Так, в случае если расчет ведется от посева массы (объема) 10 г (куб. см) (х 3) продукта, количество кампилобактерий в 1 г (куб. см) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ, взятого из таблицы соответственно установленному индексу, на 10. В случае, когда в качестве первого значения для расчета выбрана масса (объем) 1 г (куб. см) (х 3), количество кампилобактерий в 1 г (куб. см) образца эквивалентно числу НВЧ по таблице. ПРИМЕР: Кампилобактерии обнаружены в трех повторностях при посеве 1 г (то есть по 10 мл из разведения 1:10), в трех повторностях - при посеве 0,1 г (по 1 мл из разведения 1:10) и в одной - при посеве 0,01 г (по 0,1 мл из разведения 1:10).

Изображение не приводится

Результат по числу секторов с подтвержденным ростом бактерий рода Campylobacter из трех выбранных масс записывается как индекс 3:3:1, что соответствует НВЧ, равному 46 (табл. Прилож. 2). Соответственно, наиболее вероятное число бактерий рода Campylobacter составляет 46 КОЕ в 1 г продукта. Если НВЧ менее чем 0,3 КОЕ и 1 г (куб. см) (индекс 0:0:0) в случае, когда в качестве первого значения для расчета выбрана масса (объем) 1 г (куб. см) (х 3), то результат должен выражаться следующим образом: "Менее 1 КОЕ в 1 г (куб. см)". В случае, когда в качестве первого значения для расчета выбрана масса (объем) 10 г (куб. см) (х 3), то число НВЧ должно быть поделено на 10, и результат должен выражаться как: "Менее 0,1 КОЕ в 1 г (куб. см)". Если НВЧ составляет величину более чем 110 КОЕ/г (куб. см) (индекс 3:3:3), исследование целесообразно повторить, используя более высокие разведения образца, в которых исходная концентрация продукта будет в 10 или 100 раз ниже, чем в первоначально выбранном значении. При необходимости ответа о количестве в пищевом продукте кампилобактерий определенного вида обязательно проведение исследований и учет результатов по п. 8.2.

9. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ

Выявление и определение бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах проводят в соответствии с СанПиН 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами".

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ

ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для микробиологических анализов".
ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов".
ГОСТ Р 50396.0 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям".
ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы бактериологического анализа".
ГОСТ 4288-76 "Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого мяса. Правила приемки и методы испытания".
ГОСТ 9958-81 "Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа".
ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб".
ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа".
ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) "Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований".
СанПиН 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами".
Пособие для врачей ЦНИИ эпидемиологии. Микробиологическая диагностика заболеваний, вызванных микроаэрофильными изогнутыми бактериями. М., 2002. 42 с.
ISO 10272:1995 (E) "Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for detection of thermotolerant Campylobacter" с дополнениями 1996 и 1997 гг. 17 стр.
FDA/CFSAN Bacteriological Analytical Manual. Chapter 7. "Isolation of Campylobacter Species from Food and Water", 2001, 20 p.

Приложение N 1

СХЕМА ПРОЦЕДУРЫ ПОСЕВА ПО НВЧ

Схема не приводится.

Приложение N 2

Таблица

ТАБЛИЦА
ДЛЯ РАСЧЕТА НАИБОЛЕЕ ВЕРОЯТНОГО ЧИСЛА МИКРООРГАНИЗМОВ (ПО ГОСТ Р 51446-99)

     Число секторов с        НВЧ,     Действительное число микроорганизмов     подтвержденным ростом     КОЕ/г       в 1 г (куб. см) с вероятностью        Campylobacter spp. (из  (куб. см)                                          трех выбранных значений                    95%                 99%               массы (объема))                                                                                                                                    1,0      0,1     0,01              от        до        от       до                                                                                      0        0       0       < 0,30    0,00      0,94      0,00     1,40                                                                                    0        0       1       0,30      0,01      0,95      0,00     1,40                                                                                    0        1       0       0,30      0,01      1,00      00       1,60                                                                                    0        1       1       0,61      0,12      1,7       0,05     2,50                                                                                    0        2       0       0,62      0,12      1,70      0,05     2,50                                                                                    0        3       0       0,94      0,35      3,3       0,18     4,60                                                                                    1        0       0       0,36      0,02      1,70      0,05     2,50                                                                                    1        0       1       0,72      0,12      1,70      0,05     2,50                                                                                    1        0       2       1,1       0,4       3,5       0,2      4,6                                                                                     1        1       0       0,74      0,13      2,00      0,06     2,7                                                                                     1        1       1       1,1       0,4       3,5       0,2      4,6                                                                                     1        2       0       1,1       0,4       3,5       0,2      4,6                                                                                     1        2       1       1,5       0,5       3,8       0,2      5,2                                                                                     1        3       0       1,6       0,5       3,8       0,2      5,2                                                                                     2        0       0       0,92      0,15      3,50      0,07     4,60                                                                                    2        0       1       1,4       0,4       3,5       0,2      4,6                                                                                     2        0       2       2,0       0,5       3,8       0,2      5,2                                                                                     2        1       0       1,5       0,4       3,8       0,2      5,2                                                                                     2        1       1       2,0       0,5       3,8       0,2      5,2                                                                                     2        1       1       2,0       0,5       3,8       0,2      5,2                                                                                     2        1       2       2,7       0,9       9,4       0,5      14,2                                                                                    2        2       0       2,1       0,5       4,0       0,2      5,6                                                                                     2        2       1       2,8       0,9       9,4       0,5      14,2                                                                                    2        2       2       3,5       0,9       9,4       0,5      14,2                                                                                    2        3       0       2,9       0,9       9,4       0,5      14,2                                                                                    2        3       1       3,6       0,9       9,4       0,5      14,2                                                                                    3        0       0       2,3       0,5       9,4       0,3      14,2                                                                                    3        0       1       3,8       0,9       10,4      0,5      15,7                                                                                    3        0       2       6,4       1,6       18,1      1,0      25,0                                                                                    3        1       0       4,3       0,9       18,1      0,5      25,0                                                                                    3        1       1       7,5       1,7       19,9      1,1      27,0                                                                                    3        1       2       12        3         36        2        44                                                                                      3        1       3       16        3         38        2        52                                                                                      3        2       0       9,3       1,8       36,0      1,2      43,0                                                                                    3        2       1       15        3         38        2        52                                                                                      3        2       2       21        3         40        2        56                                                                                      3        2       3       29        9         99        5        152                                                                                     3        3       0       24        4         99        5        152                                                                                     3        3       1       46        9         198       5        283                                                                                     3        3       2       110       20        400       10       570                                                                                     3        3       3       > 110

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ

ПРИКАЗ
от 21 июня 2011 г. N 504

О РЕАЛИЗАЦИИ МЕРОПРИЯТИЙ ПОДПРОГРАММЫ "МОДЕРНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ НА 2011-2012 ГОДЫ"

В целях реализации заключенных с органами местного самоуправления Московской области соглашений о реализации мероприятий подпрограммы "Модернизация здравоохранения Московской области на 2011-2012 годы" (далее - Подпрограмма) и в соответствии с постановлениями Правительства Московской области от 19.04.2011 N 352/15 "О внесении изменений в постановление Правительства Московской области от 11.12.2008 N 1106/48 "Об утверждении долгосрочной целевой программы Московской области "Предупреждение и борьба с заболеваниями социального характера в Московской области на 2009-2011 годы" (приложение N 3), от 17.05.2011 N 446/19 "О реализации подпрограммы "Модернизация здравоохранения Московской области на 2011-2012 годы" долгосрочной целевой программы Московской области "Предупреждение и борьба с заболеваниями социального характера в Московской области на 2009-2012 годы", приказываю: 1. Руководителям муниципальных органов управления здравоохранения Московской области, главным врачам ЦРБ, ЦГБ представить, в срок до 01.07.2011, копии технических заданий и локальных смет на проведение капитального ремонта в 2011 году, общая сумма которых не должна превышать установленного лимита по Подпрограмме, согласно утвержденному перечню объектов. 2. Ежемесячно, до 1 числа месяца, следующего за отчетным, представлять информацию по подготовке и реализации мероприятий Подпрограммы, согласно Приложению N 1. 3. Управлению развития материально-технической базы обеспечить сбор и обработку информации.

Примечание.
Нумерация пунктов дана в соответствии с официальным текстом документа.

3. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на Первого заместителя министра здравоохранения Правительства Московской области К.Б.Герцева.

Министр здравоохранения
Правительства Московской области
В.Ю.СЕМЕНОВ

Приложение N 1
к приказу
Министерства здравоохранения
Московской области
от 21 июня 2011 г. N 504

Информация по подготовке и реализации мероприятий подпрограммы "Модернизация здравоохранения Московской области на 2011-2012 годы"
по состоянию на "__" _____________ 2011 г.

   N  Наименование   Адрес    Стоимость  Наличие     Номер реестровой   Сумма     Краткий   Стоимость Кассовое исполнение   Процент     п/п учреждения,    (место   работ по   положи-     записи, размещен-  муници-   перечень  выполнен-   (с начала работ    исполнения       объекта      нахождения утвержден- тельного    ный на официальном пального  выполнен- ных       нарастающим итогом)   = гр. 9 /       здравоохра-   объекта)  ной        заключения  сайте              контракта ных       работ, по         руб.          гр. 7 x         нения                   проектно-  экспертизы, www.zakupki.gov.ru (после    работ, по форме                            x 100                                  сметной    если                           проведе-  форме     КС-3      всего федер- муници-                                          документа- предусмот-                     ния       КС-2      (нараста-       альный пальный                                          ции, руб.  рено                           торгов),            ющим            бюджет бюджет                                                      законода-                      руб.                итогом)                                                                            тельством                                                                                                                                                                                                                             1       2           3          4           5              6              7         8         9      10     11     12        13

Руководитель учреждения
здравоохранения подпись Ф.И.О.

исполнитель (должность)

контактный телефон

"__" __________ 2011 г

Приказ Роспотребнадзора от 27.06.2011 N 621 «О совершенствовании эпиднадзора и мерах профилактики вирусных гепатитов»

Вопрос: Существуют ли нормативы расхода моющих средств для стирки медицинских халатов и нормы выдачи халатов для персонала? («Медтехника и медизделия», 2011, N 5)

СвязанныеСообщения

Добавить комментарий Отменить ответ

Товары

Товары

Свежие записи

Добро пожаловать!

Восстановите ваш пароль

Приказ Роспотребнадзора от 27.06.2011 N 621 «О совершенствовании эпиднадзора и мерах профилактики вирусных гепатитов»

Вопрос: Существуют ли нормативы расхода моющих средств для стирки медицинских халатов и нормы выдачи халатов для персонала? («Медтехника и медизделия», 2011, N 5)

СвязанныеСообщения

Добавить комментарий Отменить ответ

Товары

Товары

Метки

Свежие записи

Добро пожаловать!

Восстановите ваш пароль