«МР 1.2.0025-11. 1.2. Гигиена, токсикология, санитария. Оценка раздражающего действия методом ультразвуковой допплерографии на сосудах хориоаллантоисной оболочки куриного эмбриона ex vivo. Методические рекомендации» (утв. Роспотребнадзором 28.06.2011) Приказ Минздрава МО от 27.06.2011 N 518 «Об обеспечении лекарственными препаратами для лечения и профилактики ВИЧ-инфекции в 2011 году»

В соответствии с пунктом 2 данный документ вступил в силу с 28 июня 2011 года. Текст документа

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
28 июня 2011 года

Дата введения —
с момента утверждения

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

ОЦЕНКА РАЗДРАЖАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ МЕТОДОМ УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ДОППЛЕРОГРАФИИ НА СОСУДАХ ХОРИОАЛЛАНТОИСНОЙ ОБОЛОЧКИ КУРИНОГО ЭМБРИОНА EX VIVO

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
МР 1.2.0025-11

1. Разработаны: ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве»; ОАО Завод экологической техники и экопитания «ДИОД», Москва; ООО «СП Минимакс», Санкт-Петербург.
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации и введены в действие 28 июня 2011 г.
3. Введены впервые.
4. Область применения

1.1. Методические рекомендации предназначены для токсикологических исследований и испытаний парфюмерно-косметической (ПК) продукции, средств гигиены полости рта, а также сырья для их производства, в том числе полученных с применением нанотехнологий или содержащих наноматериалы. 1.2. Методические рекомендации могут быть использованы для оценки раздражающего действия слизистой оболочки глаза вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой продукции. Данный метод может применяться в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсикологическими методами. 1.3. Методические рекомендации предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями и иными организациями, аккредитованными в установленном порядке.

2. Введение

В батарею токсикологических испытаний для оценки безопасности продукции входит исследование раздражающего действия на слизистую оболочку глаза. Для этой цели традиционно используется тест Драйза на лабораторных животных (Draize et al., 1944), являющийся одним из самых болезненных тестов. Возможной альтернативной заменой тесту Драйза является ХЕТ-КАМ-тест (HET-CAM — hen’s egg test at the chorio-allontoic membrane), в котором проводится визуальная оценка состояния сосудов хориоаллантоисной оболочки (ХАО) куриного эмбриона. Однако визуальная оценка не позволяет точно и объективно интерпретировать результаты исследования. Дополнение стандартного ХЕТ-САМ теста методом высокочастотной допплерографии позволяет определять количественные характеристики изменения скорости кровотока в сосудах ХАО, которые отражают выраженность раздражающего действия. Метод высокочастотной ультразвуковой допплерографии использует эффект изменения частоты сигнала отраженного движущегося объекта на величину, пропорциональную скорости движения отражателя, открытый в 1842 г. Допплером. При отсутствии движения исследуемой среды допплеровского сигнала не существует, так как ультразвуковая волна проходит сквозь ткани без отражения, что делает данный метод исследования движущихся структур наиболее объективным. Данные Методические рекомендации содержат порядок проведения оценки раздражающего действия с применением метода высокочастотной допплерографии на сосудах ХАО куриного эмбриона ex vivo. Преимуществом настоящего метода являются простота, высокая чувствительность, объективная цифровая оценка результатов, повышающая их достоверность, воспроизводимость, а также экономичность, быстрота получения результатов. Кроме того, система отвечает современным этическим требованиям, согласно которым следует ограничивать использование млекопитающих в эксперименте.

3. Принцип метода

Основой данного метода исследования является ХЕТ-КАМ-тест, применяемый для оценки раздражающего действия веществ на сосудах ХАО куриного эмбриона. Во время проведения исследования раствор тестируемого вещества наносят на ХАО. При возникновении раздражающего действия происходит сужение кровеносных сосудов без остановки или с временной остановкой тока крови, тромбоз, кровоизлияния и т.п., что, в свою очередь, вызывает изменение скорости кровотока. Модификация ХЕТ-КАМ-теста с использованием прибора «Минимакс-Допплер-К» позволяет провести количественную оценку скорости кровотока при возникновении раздражающего действия. Ультразвуковой сигнал, отраженный от кровотока, поступает на приемный элемент датчика (частотой 25 МГц), далее этот сигнал усиливается, фильтруется и проходит в компьютерную часть прибора, где обрабатывается по специальной программе (Minimax Doppler v.1.7.) и выдается на экран монитора в виде допплерограмм с цветным спектром. Также автоматически вычисляются количественные параметры скорости кровотока: линейная скорость кровотока Vs (см/сек.), объемная скорость кровотока Qs (мл/сек.), средневзвешенная скорость кровотока по кривой средней скорости Vam (см/сек.). Показатели скорости кровотока (Qs и Vam) коррелируют с линейной скоростью кровотока Vs. Таким образом, для изучения влияния исследуемых веществ достаточно оценки одного из параметров — линейной скорости кровотока (Vs). Изменение линейной скорости кровотока является показателем выраженности местно-раздражающего действия исследуемого вещества на сосуды ХАО.

4. Оборудование, материалы и реактивы

• допплерограф ультразвуковой компьютеризированный для исследования скорости кровотока ММ-Д-К «Минимакс-Допплер-К», оснащенный датчиком с частотой 25 МГц, или с аналогичными характеристиками;
• термостат лабораторный, позволяющий поддерживать температуру 38,0 +/- 0,5° С;
• подставка;
• встряхиватель лабораторный типа Вортекс, ТУ 64-1-1081-73, или с аналогичными характеристиками;
• термометр лабораторный 0 — 55 °С, ГОСТ 8.279-78;
• магнитная мешалка, ТУ 25-11-834-73;
• весы аналитические (предел допустимой погрешности не более 0,01 мг), ГОСТ 24104-2001;
• колбы, цилиндры стеклянные мерные, ГОСТ 1770-74;
• микропробирки пропиленовые конические объемом 0,5 и 1,5 куб. см с крышкой;
• штатив для микропробирок вместимостью 0,5 и 1,5 куб. см;
• наконечники одноразовые для дозаторов переменного объема в штативах;
• дозаторы автоматические переменного объема, ТУ 9452-002-33189998-2002;
• часы сигнальные, ТУ 25-07-57;
• пинцеты медицинские, ГОСТ 21241-89;
• шпатели металлические, ГОСТ 19126-2007;
• фильтровальная бумага, ГОСТ 12026-76;
• вода дистиллированная, ГОСТ 6709-02;
• спирт этиловый (этанол), ГОСТ Р 51652-2000 или ГОСТ 18300-87;
• диметилсульфоксид (99,5%);
• калий гидроксид, ГОСТ 24363-80;
• 0,9%-ный раствор NaCl. 4.1. Характеристика объектов исследования. Исследования проводят на 10-дневных куриных эмбрионах домашних кур породы белый леггорн. До начала эксперимента яйца выдерживают тупым концом вверх при температуре 38,0 +/- 0,5 °С. Для поддержания влажности в термостат помещают емкость с водой объемом 500 куб. см.5. Подготовка исследуемых образцов

5.1. Растворители.
При работе с гидрофильными веществами в качестве растворителя используют физиологический раствор (0,9%-ный NaCl). При работе с гидрофобными веществами в качестве растворителя используют медицинское оливковое масло, диметилсульфоксид или этиловый спирт в конечной концентрации не более 1%. При необходимости допускается использование других растворителей в концентрациях, не вызывающих раздражающего действия, что должно быть подтверждено экспериментально. Растворитель, вносимый в эквивалентных объемах, используется в качестве негативного контроля. 5.2. Контроли.
В качестве негативного контроля используют растворитель, вносимый в эквивалентных объемах. В качестве позитивного контроля используют раствор КОН (2,5%-ный). Раствор КОН готовят непосредственно перед использованием. Для этого навеску 250,0 +/- 0,1 мг помещают в мерную колбу вместимостью 10 куб. см, до половины заполняют физиологическим раствором, перемешивают до полного растворения вещества, доводят объем физиологическим раствором до метки и тщательно перемешивают. Изменение скорости кровотока (Vs) при воздействии на сосуды ХАО контрольного образца КОН составляет 40,0 +/- 2,0%. 5.3. Исследуемые концентрации.
Во избежание ложноположительных или ложноотрицательных результатов образцы исследуют в концентрациях, не вызывающих изменение pH инкубационной среды и/или осмотического давления (+/- 0,1). Экстракты из испытуемых образцов готовят путем настаивания в физиологическом растворе или модельной среде (медицинское оливковое масло, диметилсульфоксид или этиловый спирт в конечной концентрации не более 1%). Соотношения веса образца и объема модельной среды приведены в таблице 1. Навески образцов взвешивают в сухой чистой колбе, куда потом добавляют требуемый объем модельной среды. В другую колбу наливают модельную среду и обе колбы помещают в термостат при 37 °С и инкубируют 1 час.

Таблица 1

УСЛОВИЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЭКСТРАКТОВ

            Вид продукции            Масса     Объем    Степень   Продолжи-                                     образца, модельной разведения тельность                                        г      среды,    образца   экстрак-                                                куб. см             ции, час.                                                                               Шампуни для волос и тела          1,0      4,0       1:5        1                                                                                       Ополаскиватели для волос          1,0      4,0       1:5        1                                                                                       Туалетное мыло                    1,0      4,0       1:5        1                                                                                       Средства для принятия душа и      1,0      4,0       1:5        1          

ванны

Дезодоранты и депилятории 1,0 4,0 1:5 1

Кремы, эмульсии и др. (не 2,5 2,5 1:1 1 спиртосодержащие)

Кремы, эмульсии и др. 1,0 4,0 1:5 1 (спиртосодержащие; с разогревающим эффектом)

Маски питательные, очищающие и 2,5 2,5 1:1 1 др.

Зубные пасты и отбеливающие 1,0 4,0 1:5 1 системы

Детские присыпки (тальк, пудра) 1,0 4,0 1:5 1

Средства моющие, чистящие, 1,0 4,0 1:5 1 полирующие для мытья посуды, предназначенной для контакта с пищевыми продуктами и водой

Зубные эликсиры и ополаскиватели 2,5 2,5 1:1 1

Средства для нанесения на губы 1,0 4,0 1:5 1

Средства для макияжа глаз 1,0 4,0 1:5 1

Средства для интимной гигиены 1,0 4,0 1:5 1

Средства для защиты кожи от 1,0 4,0 1:5 1 воздействия производственных вредных факторов (мази, кремы, пасты и т.д.)

6. Подготовка тест-объекта

Перед началом эксперимента яйцо помещают на фиксирующую подставку тупым концом вверх и вскрывают воздушную камеру. От скорлупы освобождают всю воздушную камеру, после чего поверхность подскорлуповой оболочки смачивают физиологическим раствором и полностью ее удаляют так, чтобы не повредить ХАО. На ХАО наслаивают 400 куб. мм физиологического раствора (для предотвращения высыхания). Яйцо помещают в термостат на 20 мин. для снятия травматического шока. Если происходит повреждение ХАО или возникают кровотечения, то яйцо отбраковывается.

7. Процедура тестирования

Выбрав кровеносный сосуд на поверхности ХАО, датчик располагают так, чтобы он находился под углом 60° к исследуемому сосуду, добиваясь при этом слабых по амплитуде пульсаций без острых пиков (медленно меняющаяся волна) допплерограмм, отображающихся на мониторе прибора. После измерения скорости кровотока в выбранном сосуде на 0 минуте проводится наслаивание экстракта из исследуемого образца в количестве 400 куб. мм. Нулевая минута соответствует интактному состоянию сосудов ХАО эмбриона. Через 80 сек. оценивается изменение скорости кровотока сосудов ХАО под влиянием исследуемого образца.

8. Анализ допплерограмм

Анализируется не менее 10 эмбрионов для испытания одного образца. Компьютерная программа Minimax Doppler v.1.7., разработанная для прибора «Минимакс-Допплер-К», автоматически проводит анализ допплерограмм, вычисляя линейную скорость кровотока (параметр Vs, см/сек.).

9. Статистическая обработка данных

Раздражающее действие на слизистую оболочку глаза (X) соответствует изменению скорости кровотока Vs, выраженному в процентном соотношении относительно нулевой точки измерения, и высчитывается по формуле:

                               (V )  - (V )                                 s n     s o                           X = ------------- х 100,                                   (V )                                     s o

где:
(V ) — линейная скорость кровотока в динамике измерений; s n
(V ) — линейная скорость кровотока на нулевой минуте. s o
Результат испытания представляется в виде:

X +/- сигма, при P = 0,95.

За результат анализа принимают среднее арифметическое 10 и более параллельных измерений.

Среднее квадратичное отклонение (сигма) результатов определений количественного выражения раздражающего действия вычисляется по формуле:

                                     / n   _      2                                    / SUM (X - X )                                   /  i=1       i                         сигма = \/ ---------------,                                         n - 1

где:
X — i-й результат определений, n — число параллельных определений; i
_
X — среднее арифметическое результатов изменения скорости кровотока. Среднее арифметическое результатов изменения скорости кровотока вычисляется по формуле:

                                _   1  n                                X = - SUM X .                                    n i=1  i

Достоверность различий между контрольной группой (группа с растворителем) и опытной (исследуемые экстракты) вычисляется по формуле:

                                    _    _                                    X  - X                                     o    к                            T = ----------------.                                  ______________                                 /    2        2                               \/сигма  + сигма                                      o        к

Все указанные статистические параметры можно также вычислять с помощью компьютерной программы Statistica или иных программных средств.

10. Интерпретация результатов

Вещество, вызывающее раздражающее действие (изменение скорости кровотока) относительно контрольной группы менее чем на 15%, следует отнести к соединениям с невыраженным раздражающим действием и исключить его дальнейшее тестирование по данному эффекту на лабораторных животных. Вещества, вызывающие раздражающее действие (изменение скорости кровотока) относительно контрольной группы более чем на 15%, подлежат дальнейшим испытаниям на млекопитающих.

11. Форма представления результатов

По результатам эксперимента оформляется протокол. В протоколе должна быть отражена следующая информация: — название продукта;
— производитель;
— растворитель;
— разведение;
— полученные результаты.

Библиографический список

1. Лукьянов А.С. «Оценка раздражающего действия веществ по тесту на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона (HET-CAM test) в кн. Альтернативные методы исследований (экспресс-методы) для токсиколого-гигиенической оценки материалов и продуктов»//М., ТОО Экс-принт НВ, 1999 г., с. 103 — 107.
2. Лукьянов А.С., Павлова Т.Н., Халепо А.И., Ткачева Т.А. «Тест HET-CAM как альтернатива окулярному тесту Draize»//1-й съезд токсикологов России 17 — 20.11.98. Тезисы докладов. М., 1998 г., с. 292.
3. «Постановка исследований по выявлению раздражающих свойств химических соединений на конъюнктиву глаза с помощью теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона»//Методические указания 2.2.756-99 (от 20.06.1999). М., 1999.
4. «Методические указания по оценке раздражающего действия фармакологических веществ с помощью теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона (ХЕТ-САМ тест)»//Методические указания. М., 2000 г.
5. Козлов В.А., Артюшенко Н.К., Шалак О.В. и др. «Ультразвуковая допплерография в оценке состояния гемодинамики в тканях шеи, лица и полости рта в норме и при некоторых патологических состояниях»//Медицинская академия последипломного образования, ООО «СП Минимакс». С-Пб., 2000 г.
6. Belyankina E.J., Rodina I.A., Shevchenko T.V., Tikhonov V.P. «Application of ultrasonic dopplerografic metod on the model of chicken embryo vessels in ovo for standartization of natural substances»//The 12th International Congress «Phytopharm 2008», P. 20.
7. «Способ оценки раздражающего действия и активности природных, синтетических субстанций и готовых препаратов на куриных эмбрионах методом ультразвуковой допплерографии»//патент на изобретение N 2383888, 2010 г.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ

ПРИКАЗ
от 27 июня 2011 г. N 518

ОБ ОБЕСПЕЧЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННЫМИ ПРЕПАРАТАМИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ В 2011 ГОДУ

В целях рационального использования лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфицированных больных и профилактики передачи ВИЧ-инфекции от матери к ребенку, закупленных в 2011 г. за счет средств бюджета Московской области в рамках государственных контрактов, заключенных Министерством здравоохранения Московской области, приказываю: 1. Директору ГУП МО «Мособлмедсервис» В.А.Романовой: 1.1. Обеспечить хранение лекарственных препаратов и контроль за их сроками годности. 1.2. Производить отгрузку лекарственных препаратов согласно перечню и номенклатуре Указаний Министерства здравоохранения Московской области: 1.2.1. Для обеспечения амбулаторных больных: в филиал ОАО «Мособлфармация» «Аптечный пункт МОНИКИ» — по заявкам Государственного учреждения здравоохранения Московской области «Московского областного центра по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями» (далее — МОЦ ПБ СПИД ИЗ); в аптечные организации городских округов и муниципальных районов Московской области — по заявкам учреждений здравоохранения городских округов и муниципальных районов Московской области, согласованным с МОЦ ПБ СПИД ИЗ. 1.2.2. Для обеспечения стационарных больных: в стационарные медицинские учреждения, в том числе родильные дома (родильные отделения), государственных и муниципальных учреждений здравоохранения; в отделения стационарных медицинских учреждений, не имеющих больничных аптек, — по текущим заявкам МОЦ ПБ СПИД ИЗ (на основании заявок государственных и муниципальных учреждений здравоохранения, не имеющих в своем составе больничных аптек в МОЦ ПБ СПИД ИЗ), но не более месячной потребности. 1.3. Ежемесячно представлять в МОЦ ПБ СПИД ИЗ и Министерство здравоохранения Московской области отчеты о поставках, отгрузках и остатках лекарственных препаратов для лечения и профилактики ВИЧ-инфекции (с указанием сроков годности) с приложением соответствующих документов. 1.4. Своевременно предоставлять данные о лекарственных препаратах с истекающим сроком годности (остаточный срок годности менее 90 дней) в Министерство здравоохранения Московской области и МОЦ ПБ СПИД ИЗ. 2. Генеральному директору ОАО «Мособлфармация», руководителям аптечных организаций Московской области: 2.1. Обеспечить отпуск лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфицированных больных по рецептам из филиала ОАО «Мособлфармация» «Аптечный пункт МОНИКИ» и аптечных организаций в городских округах и муниципальных районах Московской области. 2.2. Обеспечить своевременность передачи сведений о препаратах с истекающим сроком годности (остаточный срок годности менее 90 дней) в государственные и муниципальные учреждения здравоохранения Московской области согласно пункту 2.3. 2.3. Ежемесячно представлять в учреждения здравоохранения, в которых выписываются рецепты на лекарственные препараты, отчеты об отпущенных лекарственных препаратах и их остатках в аптечных организациях (с указанием сроков годности). 3. Главным врачам государственных и муниципальных учреждений здравоохранения Московской области обеспечить: 3.1. Составление заявок на лекарственные препараты для амбулаторного лечения ВИЧ-инфицированных больных, исходя из прогнозируемой текущей потребности. 3.2. Составление заявок на лекарственные препараты для стационарного лечения ВИЧ-инфицированных больных на основании рекомендаций МОЦ ПБ СПИД ИЗ. 3.3. Составление заявок на лекарственные препараты для родильных домов (родильных отделений) с целью пополнения запасов препаратов для профилактики передачи ВИЧ-инфекции от матери к ребенку в этих учреждениях. 3.4. Учет лекарственных препаратов, переданных в стационарные учреждения здравоохранения, в том числе родильные дома (родильные отделения), в установленном настоящим Приказом порядке. 3.5. Контроль сроков годности поставленных препаратов. 3.6. Ежемесячное представление в МОЦ ПБ СПИД ИЗ отчетов об использовании препаратов для амбулаторного лечения, для стационарного лечения ВИЧ-инфицированных больных, препаратов для профилактики передачи ВИЧ-инфекции от матери к ребенку (учет препаратов осуществлять поштучно, с указанием лекарственной формы препарата (таблетки, ампулы и др.). 3.7. Своевременность передачи данных о препаратах с истекающим сроком годности (остаточный срок годности менее 90 дней) в Министерство здравоохранения Московской области и МОЦ ПБ СПИД. 4. Главному врачу МОЦ ПБ СПИД ИЗ А.Ю.Пронину обеспечить: 4.1. Согласование и представление заявок в ГУП МО «Мособлмедсервис» с целью отгрузки необходимых лекарственных препаратов грузополучателям. 4.2. Контроль за рациональным назначением и использованием государственными и муниципальными учреждениями здравоохранения лекарственных препаратов для амбулаторного лечения, для стационарного лечения ВИЧ-инфицированных больных, препаратов для профилактики передачи ВИЧ-инфекции от матери к ребенку. 4.3. Формирование и передачу в Министерство здравоохранения Московской области, на основании сводных ежемесячных данных, подаваемых государственными и муниципальными учреждениями здравоохранения, отчет об использовании и остатках лекарственных препаратов для амбулаторного лечения, для стационарного лечения ВИЧ-инфицированных больных, препаратов для профилактики передачи ВИЧ-инфекции от матери к ребенку. 4.4. Выборочно проводить проверки (не реже 1 раза в квартал) рациональной обоснованности назначения и использования государственными и муниципальными учреждениями здравоохранения лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфицированных больных, препаратов для профилактики передачи ВИЧ-инфекции от матери к ребенку, с последующей передачей отчетов о проведенных проверках в Министерство здравоохранения Московской области. 5. Контроль за исполнением настоящего Приказа возложить на заместителей министра здравоохранения Правительства Московской области Ю.К.Мищенко, Г.В.Тамазян, Г.Г.Шишкареву.

Министр здравоохранения
Правительства Московской области
В.Ю.СЕМЕНОВ