«Методика оценки санитарно-гигиенического состояния на предприятиях, выпускающих радиационно стерилизуемую продукцию медицинского назначения» (утв. Заместителем главного государственного санитарного врача СССР от 11.02.1982 N 2534-82)

УТВЕРЖДАЮ
Заместитель Главного государственного
санитарного врача СССР
В.Е.КОВШИЛО
11 февраля 1982 г. N 2534-82

МЕТОДИКА
ОЦЕНКИ САНИТАРНО — ГИГИЕНИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ НА ПРЕДПРИЯТИЯХ, ВЫПУСКАЮЩИХ РАДИАЦИОННО СТЕРИЛИЗУЕМУЮ ПРОДУКЦИЮ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ

1. Общие положения

1.1. Величина стерилизующей дозы излучения зависит от инициальной контаминации продукции, подлежащей радиационной стерилизации. Инициальная контаминация характеризуется количеством микроорганизмов и их резистентностью к ионизирующим излучениям. 1.2. Инициальная контаминация продукции формируется микроорганизмами, обсеменяющими руки, спецодежду персонала, воздух, поверхности производственных помещений и оборудования. 1.3. Предприятие, выпускающее изделия, стерилизуемые радиационным методом, обязано обеспечить регулярный контроль обсемененности микроорганизмами рук, спецодежды персонала, воздуха, поверхностей производственных помещений цехов и участков, на которых осуществляется изготовление элементов изделий и их сборка. 1.4. Контроль обсемененности объектов, перечисленных в п. 1.3., проводят первоначально не реже 1 раза в неделю. После достижения санитарного состояния производства, стабильно характеризующегося приведенными ниже нормами обсемененности этих объектов, контроль проводят не реже 1 раза в месяц. 1.5. Контроль радиорезистентности производственной микрофлоры по методике, изложенной в п. 3, проводится 1 раз в полугодие.

2. Контроль микробной обсемененности объектов, формирующих инициальную контаминацию продукции

2.1. Определение обсемененности рук обслуживающего персонала. 2.1.1. Пробы с кожи рук обслуживающего персонала отбирают во второй половине рабочего дня у 10-30% занятого персонала (в зависимости от количества персонала, работающего в цехе, на участке). 2.1.2. Микробную обсемененность кожи рук определяют методом смыва. 2.1.3. Взятие смывов производят стерильными марлевыми салфетками размером 5х5 см. При использовании салфеток их увлажняют физиологическим раствором с 0,5% твина-80 в чашках Петри из расчета 2 мл раствора на 10 салфеток. 2.1.4. Смывы производят с межпальцевых, подногтевых пространств, с ладоней и с тыльной поверхности руки. Для каждой руки используют отдельную марлевую салфетку. 2.1.5. После взятия смыва салфетки помещают в 10 мл стерильного физиологического раствора с 0,5% твина-80, разлитого в широкогорлые пробирки, обе салфетки (п. 2.1.4.) помещают в одну пробирку с бусами (3-4 штуки на пробирку). 2.1.6. После встряхивания пробирок в течение 10 минут производят посев смывной жидкости в толщу агара Хоттингера с 0,5% глюкозы для определения микробной обсемененности. В зависимости от предполагаемой массивности обсеменения микроорганизмами, засевают 0,5 мл смывной жидкости на поверхность питательного агара, разлитого в чашки Петри и предварительно подсушенного, или 2,0 мл в толщу агара. В последнем случае определенный объем смывной жидкости вносят пипеткой в чашки Петри, затем вливают в них 15-20 мл расплавленного и остуженного до 45-50 град. С питательного агара; круговыми движениями на ровной гладкой поверхности вращают чашки Петри в течение 30-45 сек., перемешивая смывную жидкость и агаризированную среду для равномерного распределения в ней микроорганизмов; оставляют чашки на ровной поверхности до застывания агара, после чего помещают их в термостат и инкубируют при 32 град. в течение 72 часов. 2.1.7. Обсемененность рук не должна превышать 200 микробных клеток на кисть руки. 2.1.8. Для ориентировочного контроля обсемененности кожи рук можно использовать метод отпечатков. 2.1.9. Отпечатки производят на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри или на предметном стекле (см. пп. 2.2.4. — 2.2.5.) путем прикладывания ногтевой фаланги каждого пальца. 2.1.10. При контроле методом отпечатков общая обсемененность не должна превышать 10 колоний на каждую фалангу. 2.2. Определение обсемененности спецодежды персонала. 2.2.1. Пробы отбирают предпочтительно перед сменой спецодежды у 10-30% занятого персонала (в зависимости от количества персонала, работающего в цехе, на участке). 2.2.2. Микробную обсемененность спецодежды определяют методом отпечатков на предметные стекла, залитые питательной средой (агаром Хоттингера с 0,5% глюкозы). 2.2.3. Отпечаток на питательную среду производят путем прикладывания предметного стекла со средой к исследуемой поверхности. Количество микробных клеток определяют по количеству выросших на питательной среде колоний. 2.2.4. Для приготовления пластинок предметные стекла раскладывают стерильным пинцетом в стерильные чашки Петри. Питательную среду растапливают на водяной бане и при помощи пипетки, осторожно приоткрыв чашки, наливают среду на поверхность каждого стекла до его полного покрытия (около 1,5 мл). Чашки с пластинами после застывания среды можно сохранять до 3 суток в холодильнике. 2.2.5. Посевы — отпечатки производят следующим образом: берут пальцами за края предметного стекла, не касаясь питательной среды, и плотно прикладывают питательной средой к исследуемой поверхности на 2-3 сек. После соприкосновения с исследованной поверхностью предметное стекло с питательной средой отпечатком кверху помещают в чашку Петри, закрывают крышкой и ставят в термостат при 32 град. на 72 часа, после чего производят подсчет выросших колоний. Делают пересчет количества выросших колоний на 1 кв. см поверхности. 2.2.6. При изучении микробной обсемененности халатов отпечатки берут с 5 участков (нижние части рукава, верхняя, средняя и нижняя части передней поверхности). Смывы с косынок, масок, шапочек берут с различных мест наружной поверхности (1-2 точки). 2.2.7. Обсемененность спецодежды не должна превышать 10 микробных клеток на 1 кв. см. 2.3. Определение обсемененности воздуха производственных помещений. 2.3.1. Обсемененность воздуха производственных помещений контролируют преимущественно в конце рабочей смены в 3-5 точках помещения на уровне рабочих столов. 2.3.2. Отбор проб воздуха следует проводить аспирационным методом с помощью аппарата Ю.А.Кротова или мембранных фильтров. Для отбора проб с помощью прибора для бактериологического анализа воздуха — модель 818 (аппарат Кротова) предварительно в чашки Петри заливают питательную среду (агар Хоттингера с 0,5% глюкозы). Заливку чашки производят на строго горизонтальной поверхности, наливая в каждую чашку по 15 мл питательной среды. Чашки с агаром подсушивают в термостате. Прибор устанавливают на ровной горизонтальной поверхности и включают в сеть, затем при помощи вентиля устанавливают скорость проходящего через прибор воздуха (25-30 л в минуту). При включенном электродвигателе с прибора снимают крышку и помещают на диск чашку Петри с питательной средой, чашке придают некоторое вращение от руки, крышку закрывают и одновременно производят отметку времени по секундомеру. По истечении 3-10 минут (в зависимости от предполагаемой обсемененности) выключают прибор и открывают крышку, вынимают чашку и помещают ее в термостат при 32 град. на 48 часов. Зная количество пропущенного воздуха и время отбора проб, определяют общий объем воздуха, из которого производят посев. По количеству выросших в чашке Петри колоний определяют количество бактерий в 1 куб. м воздуха. Пример подсчета: пропущено 100 л воздуха (по 25 л в минуту), число выросших колоний 80, в 1 кубическом метре воздуха содержится:

                            80 х 1000                        Х = --------- = 800.                               100

Для отбора проб воздуха с помощью мембранных фильтров используют мембранные фильтры, выпускаемые отечественной промышленностью, N 1 или N 2 (диаметр пор соответственно 0,3 и 0,5 мкм, диаметр фильтра 35 мм). Мембраны предварительно обрабатывают: погружают в дистиллированную воду и прогревают до 60 град., затем воду сливают, фильтры снова заливают дистиллированной водой и кипятит 10 минут. Фильтры до употребления оставляют в воде, в которой их кипятили последний раз. Обработанные мембраны вкладывают в стерильные фильтры Зейтца или устройства других типов. Перед стерилизацией в устройства на сетку помещают кружочки фильтровальной бумаги, равные по диаметру мембранным фильтрам, для предотвращения повреждений последних. Устройства стерилизуют в упаковке из бумаги или ткани в паровых стерилизаторах при давлении водяного насыщенного пара 2,0 кгс/кв. см в течение 20 минут. Заправленные мембранами устройства можно стерилизовать ионизирующим излучением. Заправленные мембранами устройства подсоединяют резиновым шлангом к аспиратору для отбора проб воздуха (модель 822). Воздух пропускают со скоростью 20 л в мин в течение 3-5 мин., в зависимости от предполагаемой обсемененности воздуха, после чего мембраны фильтрующей поверхностью вверх помещают на агар Хоттингера с 0,5% глюкозы в чашках Петри. Инкубируют посевы в термостате при 32 град. в течение 72 час. Зная скорость прохождения воздуха и время его фильтрации, определяют объем воздуха, прошедшего через фильтр, подсчитав количество колоний, выросших на фильтре, рассчитывают обсемененность 1 куб. м воздуха. 2.3.3. Обсемененность воздуха при определении с помощью мембранной фильтрации не должна превышать в производственных помещениях (1.3.), не обеспеченных вентиляцией с помощью ламинарного потока стерильного воздуха, 500 м.к./куб. м, обеспеченных такой вентиляцией — 10 м.к./ куб. м. 2.3.4. При учете обсемененности воздуха с помощью аппарата Кротова поправочный коэффициент к приведенным выше нормам составляет 2,8, т.е. число колоний, выросших на чашках, следует умножить на 2,8. Показатель не должен превышать 200 м.к./куб. м. 2.4. Определение обсемененности поверхностей помещений и оборудования. 2.4.1. Определение обсемененности поверхностей проводят во время рабочей смены. Следует брать не менее 5 проб. 2.4.2. Для определения обсемененности микроорганизмами поверхностей помещений (стены, окна, двери, пол) и оборудования (рабочие столы, приборы, машины и т.д.) могут быть использованы 2 метода: метод отпечатков (прямого оттиска) и метод смыва. Для гладких, ровных поверхностей рекомендуется метод отпечатков, для неровных, труднодоступных — метод смыва. Отбор проб с поверхности методом отпечатков производят в соответствии с рекомендациями, изложенными в пп. 2.2.2.-2.2.5. При отборе проб методом смыва изучаемые поверхности (10х10 см) тщательно в течение 30 сек. протирают увлажненной салфеткой размером 5х5 см. Увлажнение салфеток и дальнейшую после смыва обработку материала проводят согласно пп. 2.1.5. и 2.1.6. соответственно. Если предполагается, что изучаемые поверхности предметов обильно обсеменены микроорганизмами, то перед посевом испытуемую жидкость разводят в 10, 100 раз и т.д. Затем посевы помещают в термостат при температуре 32 град. и выдерживают 72 часа. Через 72 часа подсчитывают количество выросших колоний и рассчитывают плотность обсеменения на 100 кв. см. 2.4.3. Обсемененность поверхностей пола производственных помещений не должна превышать 25 микробных клеток на 1 кв. см (м.к./кв. см), оборудования 5 м.к./кв. см.

3. Методика обнаружения радиорезистентных микроорганизмов на предприятиях медицинской промышленности, выпускающих радиационно стерилизуемую продукцию

Методика включает три этапа работы: выделение на производстве с помощью обычных методов смешанной микрофлоры, облучение смешанной популяции суббактерицидными дозами ионизирующих излучений с целью селекции радиорезистентных микроорганизмов и качественное определение радиорезистентности у микроорганизмов и после радиоселекции. 3.1. Выделение производственной микрофлоры проводится в цехе окончательной сборки и упаковки продукции ватными тампонами, а также из готовой продукции путем смыва. Одним тампоном, увлажненным физиологическим раствором, в который рекомендуется добавить 1% твина-80, протирают поверхность оборудования и рабочих мест площадью 0,2 кв. м. Смывы с изделий производят так же, как и при определении инициальной контаминации. Одновременно используют 5 тампонов и выборку изделий, равную удвоенной выборке, используемой для определения инициальной контаминации. Тампоны встряхивают в течение 10 минут в пробирках с 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Смывную жидкость смешивают и фильтруют через мембранный фильтр (размером пор < 0,3 мкм; диаметр диска предпочтительно 60 мм) 0,1 мл нефильтрованной смывной жидкости высевают в разведениях 1:100-1:10 на плотную питательную среду (МПА, агар Хоттингера, 75% аминного азота, рН 7,0-7,2) для подсчета числа жизнеспособных клеток в испытуемой жидкости. Учет результатов высева проводят через 18-24 ч. после инкубации при 32 град. С. Смыв с изделий смешивают и обрабатывают так же, как и смывную жидкость с тампонов. Фильтры по окончании фильтрации высушивают в боксе на открытом воздухе при комнатной температуре и отключенных бактерицидных лампах в течение 12-18 час. Пригодными для дальнейшей работы считаются фильтры, через которые профильтрована испытуемая жидкость, содержащая в целом не менее 10 (в третьей степени) микроорганизмов (данные о содержании микроорганизмов находят путем пересчета результатов высева, с учетом общего объема профильтрованной жидкости, разведения и объема инокулята). 3.2. Выделение радиорезистентных микроорганизмов из смешанной популяции. Сухие фильтры с микроорганизмами облучают в дозе 10 кГр и помещают на плотную питательную среду (агар Хоттингера, 75% аминного азота, рН 7,0-7,2; МПА). Инкубацию проводят при 32 град. в течение 7 дней. Если на фильтре не вырастают колонии микроорганизмов, то делается вывод о практическом отсутствии в составе производственной микрофлоры высокорадиорезистентных микроорганизмов. 3.3. Качественное определение радиорезистентности микроорганизмов, выделенных из смешанной популяции после облучения. Выросшие на фильтре после облучения колонии пересевают в пробирки со скошенным агаром (пункт 3.2.), инкубируют при 32 град. в течение 18-24 час, а для спорообразующих микроорганизмов после инкубации в термостате дополнительно выдерживают в затемненном помещении при комнатной температуре 7 дней, и готовят по оптическому стандарту мутности на 10 ед. взвеси путем смыва физиологическим раствором микробной массы. 0,1 мл этой взвеси переносят в пробирку с 0,9 мл стерильного 0,8% раствора хлорида натрия и облучают в дозе 35 кГр. После излучения в пробирку с соблюдением правил асептики добавляют 9 мл бульона Хоттингера или МПБ, посевы инкубируют в течение 7 дней. Наличие роста свидетельствует о высокой радиорезистентности данного микроорганизма. Количественно определить радиорезистентность можно по показаниям Д(10) (дозы облучения, при которых численность популяции микроорганизмов уменьшается в 10 раз). Высокорадиорезистентными считаются микроорганизмы, для которых показатели Д(10) равны или превышают 5 кГр. Такие микроорганизмы встречаются в окружающей среде весьма редко (10/в минус четвертой степени/). При их обнаружении с помощью описанной методики следует улучшить соблюдение на производстве санитарно - гигиенического режима, а также при необходимости провести дополнительные санитарно - гигиенические мероприятия. Контроль радиорезистентности производственной микрофлоры по изложенной методике рекомендуется проводить два раза в год. Все выделенные штаммы микроорганизмов с положительным результатом качественного теста на радиорезистентность направляются для количественного определения радиорезистентности этих микроорганизмов в учреждение, в котором проводятся соответствующие исследования - Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР, Институт биофизики Министерства здравоохранения СССР, ВНИИ дезинфекции и стерилизации Минздрава СССР.