Приказ Минздрава МО от 06.11.2015 N 1641 «Об утверждении перечня лекарственных препаратов и медицинских изделий, необходимых для обеспечения отдельных категорий граждан, а также назначаемые по решению врачебных комиссий медицинских организаций» Общая фармакопейная статья «Оценка специфической безопасности производственных штаммов и посевных вирусов кори, паротита и краснухи. ОФС.1.7.2.0010.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II») Общая фармакопейная статья «Определение специфической активности пробиотиков. ОФС.1.7.2.0009.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II») Общая фармакопейная статья «Определение концентрации микробных клеток. ОФС.1.7.2.0008.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II») Общая фармакопейная статья «Определение содержания анатоксинов/токсинов в реакции флокуляции. ОФС.1.7.2.0007.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II») Общая фармакопейная статья «Испытание вирусных вакцин на присутствие посторонних агентов. ОФС.1.7.2.0006.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II») Общая фармакопейная статья «Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин. ОФС.1.7.2.0005.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II») Общая фармакопейная статья «Иммуногенность адсорбированного столбнячного анатоксина. ОФС.1.7.2.0004.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II») Общая фармакопейная статья «Иммуногенность адсорбированного дифтерийного анатоксина. ОФС.1.7.2.0003.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II») Распоряжение Минздрава МО от 18.06.2015 N 10-Р (ред. от 23.09.2015) «О формировании заявки и размещении государственного заказа на поставку лекарственных препаратов, медицинских изделий и специализированных продуктов лечебного питания для детей-инвалидов для обеспечения в 2016 году отдельных категорий граждан, имеющих право на получение государственной социальной помощи» (вместе с «Порядком формирования заявки на лекарственные препараты, медицинские изделия, специализированные продукты лечебного питания для детей-инвалидов, необходимые для обеспечения отдельных категорий граждан, имеющих право на получение государственной социальной помощи»)

В соответствии с пунктом 3 данный документ вступил в силу с 1 января 2016 года. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ

ПРИКАЗ
от 6 ноября 2015 г. N 1641

ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ПЕРЕЧНЯ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ, НЕОБХОДИМЫХ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ КАТЕГОРИЙ ГРАЖДАН, А ТАКЖЕ НАЗНАЧАЕМЫЕ ПО РЕШЕНИЮ ВРАЧЕБНЫХ КОМИССИЙ МЕДИЦИНСКИХ ОРГАНИЗАЦИЙ

Во исполнение постановления Правительства Московской области от 29.12.2007 N 1064/48 «Об организации за счет средств бюджета Московской области лекарственного обеспечения отдельных категорий граждан, имеющих место жительства в Московской области» (в ред. постановлений Правительства Московской области от 11.03.2009 N 196/10, от 10.03.2019 N 130/9) и совместного приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации и Министерства труда и социальной защиты Российской Федерации от 08.07.2015 N 427н/443н «О признании утратившими силу некоторых приказов Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» приказываю: 1. Утвердить прилагаемый перечень лекарственных препаратов и медицинских изделий, необходимых для обеспечения отдельных категорий граждан, а также назначаемых по решению врачебных комиссий медицинских организаций. 2. Признать утратившим силу приказ Министерства здравоохранения Московской области от 02.06.2015 N 779-А «Об утверждении перечня лекарственных препаратов и медицинских изделий, необходимых для обеспечения отдельных категорий граждан, а также назначаемых по решению врачебных комиссий медицинских организаций». 3. Данный приказ вступает в силу с 01.01.2016. 4. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на заместителя министра здравоохранения Московской области В.В.Гребенникову.

Министр здравоохранения
Московской области
H.B.СУСЛОНОВА

Приложение
к приказу Министерства
здравоохранения Московской области
от 6 ноября 2015 г. N 1641

ПЕРЕЧЕНЬ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ И МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ, НЕОБХОДИМЫХ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ КАТЕГОРИЙ ГРАЖДАН, А ТАКЖЕ НАЗНАЧАЕМЫХ ПО РЕШЕНИЮ ВРАЧЕБНЫХ КОМИССИЙ МЕДИЦИНСКИХ ОРГАНИЗАЦИЙ

NN п/п
Международное непатентованное наименование Назначение по решению ВК
1
абакавир

2
абакавир + ламивудин

3
абакавир + ламивудин + зидовудин

4
абатацепт

5
абиратерон

6
агалсидаза альфа
вк
7
агалсидаза бета
вк
8
агомелатин
вк
9
адалимумаб
вк
10
адеметионин
вк
11
азапентацен

12
азатиоприн

13
азацитидин

14
азитромицин

15
алгелдрат + магния гидроксид

16
алендроновая кислота

17
аллопуринол

18
алфузозин

19
альфакальцидол

20
алюминия фосфат

21
амантадин

22
амброксол

23
амикацин

24
аминосалициловая кислота

25
аминофиллин

26
амиодарон

27
амисульприд

28
амитриптилин

29
амлодипин

30
амлодипин + валсартан
вк
31
амлодипин + валсартан + гидрохлоротиазид вк
32
амоксициллин

33
амоксициллин + клавулановая кислота

34
ампициллин

35
анастрозол

36
антиингибиторный коагулянтный комплекс
вк
37
антитромбин III
вк
38
арипипразол

39
аскорбиновая кислота

40
аскорбиновая кислота + железа сульфат

41
асунапревир
вк
42
атазанавир

43
атенолол

44
аторвастатин
вк
45
ацетазоламид

46
ацетилсалициловая кислота

47
ацетилсалициловая кислота + магния гидроксид

48
ацетилцистеин

49
баклофен

50
бевацизумаб
вк
51
беклометазон

52
беклометазон + формотерол

53
белимумаб
вк
54
бендамустин
вк
55
бензобарбитал

56
бетагистин

57
бетаксолол

58
бетаметазон

59
бетаметазон + гентамицин + клотримазол

60
бикалутамид
вк
61
бисакодил

62
бисопролол

63
бисопролол + гидрохлоротиазид

64
бифидобактерин бифидум

65
бозентан
вк
66
ботулинический токсин типа А
вк
67
ботулинический токсин типа — гемагглютинин комплекс вк
68
бринзоламид

69
бромдигидрохлорфенилбензодиазепин

70
бромокриптин

71
будесонид

72
будесонид + формотерол

73
валганцикловир
вк
74
валсартан

75
вальпроевая кислота

76
вандетаниб
вк
77
варфарин

78
верапамил

79
вилдаглипин + метформин

80
вилдаглиптин
вк
81
винорелбин
вк
82
винпоцетин

83
вориконазол
вк
84
габапентин

85
галантамин

86
галоперидол

87
галсульфаза
вк
88
гамма-амино-бетафенилмасляной кислоты гидрохлорид

89
гемцитабин

90
гепарин натрия

91
гефитиниб
вк
92
гидрокортизон

93
гидроксикарбамид
вк
94
гидроксихлорохин

95
гидрохлоротиазид

96
гидрохлоротиазид + каптоприл

97
гидрохлоротиазид + эналаприл

98
гидрохлоротиазид + эпросартан

99
гилромеллоза

100
глибенкламид

101
глибенкламид + метформин

102
гликвидон

103
гликлазид

104
глимепирид

105
глимепирид + метформин

106
глипизид

107
глицирризиновая кислота + фосфолипиды

108
гозерелин
вк
109
голимумаб
вк
110
гопантеновая кислота

111
дабигатранаэтексилат

112
дазатиниб
вк
113
дакарбазин
вк
114
даклатасвир
вк
115
далтепарин натрия

116
даназол
вк
117
дапаглифлозин

118
дарбэпоэтин альфа
вк
119
дарунавир

120
дасабувир + омбитасвир + паритапревир + ритонавир

121
дегареликс
вк
122
дезлоратадин

123
дезоксирибонуклеат натрия

124
дексаметазон + неомицина сульфат + полимиксин В

125
дексаметазон + фрамицетин сульфат + грамицидин С

126
декспантенол

127
деносумаб
вк
128
десмопрессин

129
детское питание

130
деферазирокс

131
диазепам

132
дигоксин

133
диданозин

134
диклофенак

135
дилтиазем

136
дипиридамол

137
диэтиламинопропионил-этоксикарбониламино-фенотиазин вк
138
доксазозин

139
доксициклин

140
доксорубицин

141
домперидон

142
дорзоламид

143
доцетаксел
вк
144
дротаверин

145
железа (III) гидроксид декстран

146
железа (III) гидроксид полимальтозат

147
железа (III) гидроксида сахарозный комплекс вк
148
железа сульфат + аскорбиновая кислота

149
зафирлукаст
вк
150
зидовудин

151
зидовудин + ламивудин

152
золедроновая кислота
вк
153
зуклопентиксол
вк
154
ибандроновая кислота

155
ибупрофен

156
ивабрадин

157
иглы

158
идарубицин

159
идурсульфаза
вк
160
изониазид

161
изониазид + пиридоксин

162
изосорбида динитрат

163
изосорбида мононитрат

164
илопрост
вк
165
иматиниб
вк
166
имидазолилэтанамид пентандиовой кислоты

167
имипенем + циластатин

168
иммуноглобулин человека нормальный
вк
169
индапамид

170
индапамид + периндоприл

171
индапамид + эналаприл

172
индинавир

173
индометацин

174
инозин + никотинамид + рибофлавин + янтарная кислота

175
инсулин аспарт

176
инсулин аспарт двухфазный

177
инсулин гларгин

178
инсулин глулизин

179
инсулин двухфазный [человеческий генно-инженерный]

180
инсулин деглудек
вк
181
инсулин детемир

182
инсулин лизпро

183
инсулин лизпро двухфазный

184
инсулин растворимый [человеческий генно-инженерный]

185
инсулин-изофан [человеческий генно-инженерный]

186
интерферон альфа-2а
вк
187
интерферон альфа-2b
вк
188
инфликсимаб
вк
189
ипратропия бромид

190
ипратропия бромид + фенотерол

191
ирбесартан
вк
192
иринотекан

193
ифосфамид

194
йод + калия йодид + глицерол

195
кабазитаксел
вк
196
каберголин

197
кагоцел

198
калия и магния аспарагинат

199
кальцитонин
вк
200
кальцитриол

201
кальция фолинат

202
канаглифлозин
вк
203
канамицин

204
кандесартан

205
капецитабин
вк
206
каптоприл

207
каптоприл + гидрохлоротиазид

208
карбамазепин

209
карбидопа + леводопа

210
карбоплатин

211
карведилол

212
кветиапин

213
кетоаналоги аминокислот

214
кетопрофен

215
кеторолак

216
кладрибин
вк
217
кларитромицин

218
клиндамицин

219
клодроновая кислота

220
клозапин

221
кломипрамин

222
клоназепам

223
клопидогрел
вк
224
кодеин + морфин + носкапин + папаверина гидрохлорид + тебаин вк
225
колекальциферол

226
колекальциферол + кальция карбонат

227
колистиметат натрия

228
кортизон

229
ко-тримоксазол

230
кромоглициевая кислота
вк
231
ксилометазолин

232
лакосамид

233
лактобактерии ацидофильные + грибки кефирные

234
лактулоза

235
лактулоза + симетикон

236
ламивудин

237
ламотриджин

238
ланреотид
вк
239
лапатиниб
вк
240
лаппаконитина гидробромид

241
ларонидаза
вк
242
латанопрост

243
леветирацетам

244
леводопа + бенсеразид

245
леводопа + энтакапон + [карбидопа]

246
левокарнитин

247
левомепромазин

248
левотироксин натрия

249
левофлоксацин
вк
250
лейпррелин

251
леналидомид
вк
252
ленограстим

253
летрозол

254
лефлуномид

255
лизаты бактерий смесь

256
лизиноприл

257
линаглиптин
вк
258
линезолид

259
лираглутид
вк
260
лития карбонат

261
лозартан

262
лозартан + гидрохлоротиазид

263
ломефлоксацин
вк
264
ломустин

265
лоперамид

266
лопинавир + ритонавир

267
лоразепам

268
лоратадин

269
лорноксикам

270
макрогол

271
мапротилин

272
маравирок

273
мебгидролин

274
мебеверин

275
мегестрол

276
медроксипрогестерон

277
мелоксикам

278
мелфалан

279
мельдоний
вк
280
мемантин

281
менадиона натрия бисульфит

282
меркаптопурин

283
меропенем

284
месалазин

285
месна

286
метазид

287
метилдопа

288
метилпреднизолон

289
метилфенилтиометил-диметиламинометил-гидроксиброминдол карбоновой кислоты этиловый эфир

290
метилэтилпиридинол

291
метоксиполиэтиленгликоль-эпоэтин бета
вк
292
метопролол

293
метотрексат

294
метронидазол

295
метформин

296
метформин + ситаглиптин

297
миглустат
вк
298
микофенолата мофетил

299
микофеноловая кислота

300
митоксантрон

301
митомицин

302
моксонидин

303
мометазон

304
монтелукаст
вк
305
морфин
вк
306
надропарин кальция

307
натализумаб
вк
308
натамицин

309
небиволол

310
невирапин

311
недокромил натрия

312
неостигмина метилсульфат

313
нилотиниб
вк
314
нимодипин

315
нитроглицерин

316
нифедипин

317
нифуроксазид

318
оксазепам

319
оксалиплатин
вк
320
оксациллин

321
окскарбазепин

322
октреотид
вк
323
оланзапин

324
омализумаб
вк
325
омепразол

326
ондансетрон

327
орнитин

328
осельтамивир
вк
329
офлоксацин

330
пазопаниб
вк
331
паклитаксел
вк
332
палиперидон
вк
333
палиперидона пальмитат

334
панкреатин

335
парацетамол

336
парикальцитол
вк
337
пароксетин

338
пасиреотид
вк
339
пеметрексед
вк
340
пеницилламин

341
пентоксифиллин

342
перампанел
вк
343
периндоприл

344
перициазин

345
перфеназин

346
пилокарпин + тимолол

347
пимекролимус
вк
348
пипофезин

349
пиразинамид

350
пирацетам

351
пирибедил

352
пиридоксин

353
пиридостигмина бромид

354
пиритинол

355
пиритион цинк

356
пирлиндол

357
повидон-йод

358
полиметилсилоксана полигидрат

359
прамипексол
вк
360
прегабалин
вк
361
преднизолон

362
прокарбазин

363
пропафенон

364
пропилтиоурацил

365
пропионилфенил-этоксиэтилпиперидин

366
протионамид

367
пэгинтерферон альфа-2b
вк
368
пэгинтерферон альфа-2а
вк
369
рабепразол
вк
370
разагилин

371
ралтегравир

372
ралтитрексид
вк
373
рамиприл

374
ранитидин

375
расходные материалы для инсулиновых помп

376
репаглинид

377
рибавирин

378
ривароксабан
вк
379
ривастигмин

380
рисперидон
вк
381
ритонавир

382
ритуксимаб
вк
383
рифабутин

384
рифампицин

385
розувастатин

386
ромиплостим
вк
387
ропимирол

388
руксолитиниб
вк
389
саквинавир

390
саксаглиптин
вк
391
салметерол + флутиказон

392
сальбутамол

393
севеламер

394
сеннозиды А и В

395
сертиндол

396
сертралин

397
силденафил
вк
398
симвастатин
вк
399
симетикон

400
сиролимус
вк
401
ситаглиптин
вк
402
смектит диоктаэдрический

403
соматропин
вк
404
сорафениб
вк
405
соталол

406
спиронолактон

407
ставудин

408
стронция ранелат
вк
409
сулодексид

410
сульпирид

411
сульфасалазин

412
сунитиниб
вк
413
такролимус
вк
414
тамоксифен

415
тамсулозин

416
таурин

417
телбивудин

418
телмисартан

419
темозоломид
вк
420
тенофовир

421
тенофовир + эмтрицитабин
вк
422
теофиллин

423
терипаратид
вк
424
тест-полоски к глюкометрам

425
тиамфеникола глицинат ацетилцистеинат

426
трастузумаб + пертузумаб
вк
427
третиноин
вк
428
тригексифенидил

429
тримеперидин

430
триметазидин

431
трипторелин
вк
432
трифлуоперазин

433
троксерутин

434
трописетрон

435
умифеновир

436
урсодезоксихолевая кислота

437
устекинумаб
вк
438
фамотидин

439
фелодипин

440
фенитоин

441
фенобарбитал

442
фенотерол

443
фенспирид

444
фентанил

445
филграстим
вк
446
финголимод
вк
447
флувоксамин

448
флудрокортизон

449
флуконазол

450
флуоксетин

451
флупентиксол

452
флутамид

453
флутиказон

454
флуфеназин
вк
455
фозиноприл

456
фолиевая кислота

457
формотерол

458
фосампренавир

459
фосфолипиды + глицирризиновая кислота

460
фторурацил

461
фулвестрант
вк
462
фуросемид

463
хинаприл

464
хлорамбуцил

465
хлоропирамин

466
хлорохин

467
хлорпромазин

468
хлорпротиксен

469
холина альфосцерат
вк
470
холина салицилат

471
церебролизин
вк
472
цертолизумаба пэгол
вк
473
цетиризин

474
цетуксимаб
вк
475
цефтазидим

476
циклоспорин

477
циклофосфамид

478
цинакалцет
вк
479
цинка сульфат

480
ципротерон

481
ципрофлоксацин

482
цисплатин

483
цитарабин

484
эверолимус
вк
485
эзомепразол
вк
486
эксеместан

487
эксенатид

488
экулизумаб
вк
489
элтромбопаг
вк
490
эналаприл

491
эноксапарин натрия
вк
492
энтекавир

493
энтерол

494
энфувиртид

495
эпирубицин

496
эпоэтин альфа

497
эпоэтин бета

498
эпоэтин бета [метоксиполиэтиленгликоль]

499
эпросартан

500
эптаког альфа (активированный)
вк
501
эрлотиниб
вк
502
эсциталопрам

503
этамбутол

504
этамзилат

505
этанерцепт
вк
506
этанол

507
этилметилгидроксипиридина сукцинат

508
этопозид

509
этосуксимид

510
этравирин

511
эфавиренз

---

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

---

Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Оценка специфической безопасности производственных штаммов и посевных вирусов кори, паротита и краснухи ОФС.1.7.2.0010.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод оценки специфической безопасности (остаточной нейровирулентности) производственных штаммов и посевных вирусов кори, паротита и краснухи, используемых для изготовления живых вирусных вакцин. Метод основан на изучении специфической безопасности (остаточной нейровирулентности) указанных производственных штаммов вирусов путем интрацеребрального заражения восприимчивых к указанным вирусам обезьян. Этот метод может быть также применен при оценке специфической безопасности (остаточной нейровирулентности) новых вакцинных штаммов вирусов кори, паротита и краснухи. Исследованию на остаточную нейровирулентность подвергают каждую новую серию производственных штаммов и посевных вирусов кори, паротита и краснухи. В процессе хранения производственный штамм должен контролироваться на генетическую стабильность 1 раз в 5 лет.

Животные. Испытания на нейровирулентность следует проводить на обезьянах макака резус, макака мулата или яванская макака. При отсутствии обезьян вида макака исследование материалов, содержащих вирусы кори и паротита, можно провести на зеленых мартышках. На каждое испытание берут не менее 10 здоровых серонегативных обезьян. В качестве контроля используют дополнительно 4 серонегативные обезьяны, двум из которых интрацеребрально вводят по 0,5 мл жидкости, собранной с незараженных культур клеток. Две другие обезьяны контрольной группы предназначены для оценки контагиозности производственного штамма (посевного вируса) и должны содержаться в непосредственной близости от опытных животных в течение всего периода наблюдения. Производственный штамм (посевной вирус) считают не контагиозным, если сыворотки крови контрольных обезьян, содержащихся в непосредственной близости от опытных животных в течение всего периода наблюдения, не содержат специфических антител.

Введение исследуемого материала. Вируссодержащий материал (жидкий полуфабрикат со стабилизатором) вводят каждой обезьяне по 0,5 мл в зрительные бугры обоих полушарий. Доза вируса кори и паротита для интрацеребрального введения составляет не менее десяти минимальных прививочных доз человека, для вируса краснухи — не менее одной минимальной прививочной дозы человека. Материал вводят обезьянам под глубоким наркозом, который достигается путем внутримышечного введения препарата для наркоза в соответствии с инструкцией по его применению. Перед введением исследуемого материала шерсть на голове у обезьян тщательно сбривают, и операционное поле дважды обрабатывают 70% спиртом и 10% настойкой йода. В момент заражения кожу головы натягивают назад и фиксируют рукой с целью последующего образования «биологического шва». Для заражения используют иглу длиной 2,3-2,5 см и диаметром 0,6 мм. Вируссодержащую жидкость вводят в трепанационное отверстие, сделанное сверлом диаметром 1,5 мм, отступая 0,5 см назад от коронарного шва и на 1,0-1,5 см латеральнее саггитального шва на глубину 2,0-2,5 см, в зависимости от размеров черепа животного. Иглу вводят несколько вперед и медиально по направлению к глазу. Рекомендуемая методика интрацеребральной инокуляции позволяет получить стандартные по топографии и глубине инокуляционные каналы, уменьшить вероятность повреждения стенок желудочков мозга и предупредить развитие посттравматических реакций, затрудняющих достоверную оценку степени нейровирулентности исследуемых материалов. При этом методе инокуляции постинъекционные рубцы располагаются симметрично с обеих сторон в области пре- и постцентральных извилин коры головного мозга, в подкорковых ганглиях (в головке хвостатого ядра, внутренней капсуле) и передних ядрах таламуса.

Серологические исследования. Непосредственно перед началом испытания необходимо убедиться с помощью адекватных серологических методов, что в сыворотке крови всех обезьян отсутствуют антитела к вирусу кори (паротита или краснухи соответственно). В соответствии с рекомендациями ВОЗ материал считается успешно прошедшим испытание, если антитела вырабатываются не менее, чем у 80% вакцинированных обезьян. При этом надо иметь в виду, что у вакцинированных зеленых мартышек антитела к исследуемым вирусам могут вырабатываться у меньшего количества животных (менее 80%), что делает нецелесообразным исследование у зеленых мартышек наличия антител к вирусу кори и паротита после заражения. В этом случае оценка результатов основывается только на анализе гистологических и клинических данных.

Клинические наблюдения. Наблюдение за обезьянами, используемыми в тесте оценки остаточной нейровирулентности, проводят ежедневно в течение 17-21 сут. при исследовании материалов, содержащих вирус кори или краснухи, и в течение 25-28 сут. при исследовании материалов, содержащих вирус паротита. Наблюдение за контрольными животными проводят дополнительно еще в течение 10 сут. Животных, погибших в течение первых 48 ч после заражения, заменяют. В период наблюдения регистрируют общие клинические симптомы и признаки поражения центральной нервной системы. Клинически значимыми симптомами считают: изменение поведенческих характеристик животных (вялость, беспокойство), нарушение аппетита, повышение температуры тела (нормальная температура обезьян °С), различные неврологические нарушения (парезы, параличи, наличие нистагма и косоглазия).

Морфологические исследования. По истечении срока наблюдения животных под глубоким наркозом обескровливают, производят аутопсию и гистологическое исследование головного и спинного мозга. Из головного мозга каждого животного при испытании вирусов кори и краснухи должно быть исследовано 15 блоков (табл. 1); при контроле вируса паротита — 18 блоков (передние, задние и нижние рога боковых желудочков исследуются в обоих полушариях головного мозга).

Оценка степени нейровирулентности производственного штамма и посевного вируса паротита

При инфицировании ЦНС обезьян вирусом паротита «мишенью» является желудочковая система головного мозга. Для достоверной оценки параметров развивающегося патологического процесса необходимо максимально обследовать все отделы желудочковой системы. Срезы головного мозга производятся на определенных анатомических уровнях, которые вместе с соответствующими отделами желудочковой системы представлены в табл. 1. При вырезке кусочков головного мозга в протоколе обязательно фиксируют наличие инокуляционных каналов, их величину и топографию по отношению к стенкам боковых и третьего желудочков. Оценке подлежат следующие отделы желудочковой системы: 1) передние рога боковых желудочков;
2) центральные части боковых желудочков; 3) нижние рога боковых желудочков;
4) задние рога боковых желудочков;
5) третий желудочек;
6) сильвиев водопровод;
7) четвертый желудочек.
Парные образования — боковые желудочки — оцениваются отдельно в правом и левом полушарии. Основным проявлением паротитного процесса в ЦНС обезьян является патоморфологическая триада: хориоплексит, эпендимит и перивентрикулярный энцефалит. Степень выраженности и распространенности этих изменений являются основными морфометрическими параметрами, отражающими нейровирулентные свойства штаммов вируса паротита. Для оценки интенсивности патоморфологических изменений в желудочковой системе обезьян используют четырехбальную шкалу: 1 балл (минимальные изменения). Один-два небольших лимфогистиоцитарных инфильтрата в строме сосудистого сплетения; слабая диффузная лимфоидная инфильтрация стромы сосудистого сплетения, единичные мелкие васкулиты в субэпендимарной зоне (СЭЗ). 2 балла (умеренные изменения). Три и более умеренно выраженных очаговых лимфогистиоцитарных инфильтратов в строме сосудистого сплетения; несколько васкулитов и/или умеренная диффузная инфильтрация стромы сосудистого сплетения и СЭЗ, умеренные дистрофические изменения и очаговая пролиферация эпендимного эпителия. 3 балла (выраженные изменения). Три и более выраженных инфильтратов в строме сосудистого сплетения, множественные васкулиты в СЭЗ; интенсивная диффузная инфильтрация вентрикулярной стенки на значительном протяжении; частичная дегенерация эпендимной выстилки наряду с интенсивной пролиферацией эпендимного эпителия и образованием папилломатозных выростов; субэпендимарный отек; адгезия воспаленного сосудистого сплетения к стенкам желудочка. 4 балла. Интенсивная воспалительная инфильтрация СЭЗ и стромы сосудистых сплетений; тяжелая дегенерация и десквамация эпендимного эпителия; некроз петель плексусов; адгезия сосудистого сплетения к вентрикулярным стенкам вплоть до полной обтурации полости желудочка; поражение нейронов вне зоны инокуляционной травмы вне зависимости от степени поражения желудочковой системы.

Оценка степени нейровирулентности производственного штамма и посевного вируса кори (краснухи)

Степень выраженности морфологических изменений в месте введения вируссодержащего материала, а также наличие и распространенность энцефалита, являются основными морфометрическими параметрами, отражающими нейровирулентные свойства вакцинного штамма вируса кори (краснухи). Основные патоморфологические изменения возникают в месте инокуляции и сопровождаются развитием воспалительной реакции, очаговой демиелинизации, пролиферации глии и дистрофических изменений нервных клеток. При наличии инокуляционного повреждения желудочковой системы вакцинный вирус кори (краснухи) вызывает развитие преимущественно перивентрикулярного очагового энцефалита. При вырезке кусочков головного мозга в протоколе обязательно фиксируют наличие инокуляционных каналов, их величину и топографию по отношению к стенкам боковых и третьего желудочков. Для оценки интенсивности патоморфологических изменений в ЦНС обезьян используют четырехбалльную шкалу: 1 балл (минимальные изменения). Один-два лимфогистиоцитарных инфильтрата умеренной выраженности и/или слабая диффузная лимфоидная инфильтрация в строме сосудистого сплетения; обратимые дистрофические изменения единичных нервных клеток в перитравматической зоне, слабая диффузно-очаговая пролиферация глиальных и гистиоцитарных элементов по ходу сосудов и проводников, единичные васкулиты и/или слабая лимфоидно-клеточная инфильтрация в перитравматической зоне. 2 балла (умеренные изменения). Умеренная диффузная или диффузно-очаговая инфильтрация стромы сосудистого сплетения, умеренные дистрофические изменения и умеренная очаговая пролиферация эпендимного эпителия; умеренная диффузно-очаговая пролиферация глиальных и гистиоцитарных элементов вокруг сосудов и по ходу проводящих путей и/или умеренные дистрофические изменения большей части нейронов в перитравматической зоне. 3 балла (выраженные изменения). Выраженные инфильтраты в строме сосудистого сплетения; частичная дегенерация эпендимной выстилки наряду с участками интенсивной пролиферации эпендимного эпителия; множественные васкулиты с участками интенсивной диффузной или очаговой глиально-гистиоцитарной пролиферации и/или выраженные дистрофические изменения и деструкция нервных клеток в перитравматической зоне. 4 балла. Множественные васкулиты с участками интенсивной диффузной или очаговой глиально-гистиоцитарной пролиферации в паренхиме мозга и/или выраженные дистрофические изменения и деструкция нервных клеток за пределами перитравматической зоны.

Критерии пригодности серий производственного штамма и посевного вируса паротита, кори, краснухи по результатам оценки остаточной нейровирулентности в тесте на обезьянах

Контроль считается недействительным и должен быть повторен, если: 1) более 20% обезьян погибает от неспецифических причин, установленных патологоанатомическим вскрытием; 2) менее чем у 80% зараженных обезьян имеется микроскопическое подтверждение инокуляционной травмы в таламической области; 3) в случае развития однотипных поражений в ЦНС обезьян опытной и контрольной групп. При оценке результатов теста на остаточную нейровирулентность производственные штаммы и посевные вирусы кори, паротита и краснухи, считают не нейровирулентными, если: 1) у вакцинированных обезьян отсутствуют клинические симптомы поражения центральной нервной системы в течение всего периода наблюдения; 2) при гистологическом исследовании головного мозга обезьян отсутствуют изменения на 4 балла, а изменения на 3 балла отмечаются не более, чем у одного животного. Результаты оценки степени нейровирулентности заносятся в протоколы (табл. 2 — образец протокола для вирусов кори и краснухи; табл. 3 — для вируса паротита).

Приложение

Таблица 1

Срезы головного мозга и соответствующие отделы ЦНС, подлежащие гистологическому исследованию

N п/п
Анатомический уровень среза
Отделы ЦНС, подлежащие исследованию
Условные обозначения
1
Фронтальный срез впереди передней спайки Лобная зона коры (верхняя лобная извилина) Л
Передние рога боковых желудочков и отделы подкорковых ганглиев: головка хвостатого ядра, передняя ножка внутренней капсулы, чечевицеобразное ядро А
2
Фронтальный срез на уровне сосцевидных тел Двигательная зона коры (прецентральная извилина) Д
Центральные части боковых желудочков, третий желудочек, хвостатое ядро, таламус, внутренняя капсула, чечевицеобразное ядро Г
3
Фронтальный срез через ножки мозга и мост Теменная зона коры (постцентральная извилина) Т
Центральные части боковых желудочков и третий желудочек, тело хвостатого ядра, ядра таламуса, задняя ножка внутренней капсулы V
Гиппокамп; нижние рога боковых желудочков Нр
4
Фронтальный срез через борозду птичьей шпоры Затылочная зона коры
3
Задние рога боковых желудочков
Зр
5
Поперечный разрез среднего мозга через пластинку четверохолмия Сильвиев водопровод, черное вещество, ядра среднего мозга xxxx
6
Поперечный разрез моста на уровне выхода тройничного нерва Оральная часть четвертого желудочка, собственные ядра Варолиева моста и расположенные в нем участки проводящих путей xxx
7
Поперечный разрез ствола на границе между мостом и продолговатым мозгом Центральная часть четвертого желудочка, ядра и участки проводящих путей, расположенные в дне ромбовидной ямки xx
8
Поперечный срез продолговатого мозга
Каудальная часть четвертого желудочка, ядра олив, ретикулярная формация, ядра черепно-мозговых нервов, участки проводящих путей x
9
Поперечный срез спинного мозга на уровне шейного утолщения Шейный отдел спинного мозга: ядра серого вещества и проводящие пути белого вещества Ш.о.
10
Поперечный срез спинного мозга на уровне поясничного утолщения Поясничный отдел спинного мозга
П.о.

Таблица 2

Протокол
«Оценка интенсивности патоморфологических изменений в ЦНС обезьян, зараженных вирусом кори (краснухи)»

Вид обезьян
Дата инокуляции
Исследуемый вирус
Титр при инокуляции
Дата забоя обезьян
Номера обезьян
Интенсивность патоморфологических изменений в баллах Условные обозначения отделов ЦНС обезьян, подлежащих гистологическому исследованию
Отделы головного мозга
Отделы спинного мозга
Л
А
Д
Г
Т
V
HP
ЗР
3
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Ш.о
П.о.
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Примечание: «Л», «А» и т.д. — обозначения отделов ЦНС представлены в табл. 1.

Таблица 3

Протокол
«Оценка интенсивности патоморфологических изменений в ЦНС обезьян, зараженных вирусом паротита»

Вид обезьян
Дата инокуляции
Исследуемый вирус
Титр при инокуляции
Дата забоя обезьян
Номера обезьян
Интенсивность патоморфологических изменений в баллах Условные обозначения отделов ЦНС обезьян, подлежащих гистологическому исследованию
Отделы головного мозга
Отделы спинного мозга
Л
А
ПР
Д
Г
Т
V
HP
ЗР
3
x
x
x
x
x
x
x
x
Ш.о
П.о.
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Примечание: «Л», «А» и т.д. — обозначения отделов ЦНС представлены в табл. 1.

---

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

---

Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Определение специфической активности пробиотиков ОФС.1.7.2.0009.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы испытания специфической активности пробиотических производственных штаммов и пробиотиков на их основе, которая определяется количеством жизнеспособных бактерий и активностью кислотообразования или их антагонистической активностью по отношению к тест-штаммам. Таким образом, описанные в настоящей статье микробиологические методы позволяют определить следующие показатели специфической активности испытуемого препарата или штамма: — количество жизнеспособных бактерий в 1 дозе1 иммунобиологического лекарственного препарата (ИЛП) (раздел 1); — активность кислотообразования (раздел 2); — антагонистическая активность (раздел 3).

ОБЩАЯ ЧАСТЬ

Требования к специфической активности испытуемого препарата касаются определения количества живых бактерий в 1 дозе лекарственного средства, кислотообразующей активности штаммов-продуцентов, входящих в лакто- и бифидосодержащие пробиотики для медицинского применения, и определения уровня антагонистической активности испытуемого препарата. Контроль испытуемого препарата по показателю «Количество жизнеспособных бактерий в одной дозе лекарственного средства» является обязательным при отработке новых технологий производства лекарственного средства, предварительном и сертификационном контроле, оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности. Определение количества живых микроорганизмов в испытуемой дозе проводят методом серийных разведений, при необходимости, с последующим высевом на питательные среды (Человеческая доза — доза испытуемого препарата, указанная на этикетке или в инструкции по медицинскому применению (листке-вкладыше)). При проведении контроля поликомпонентных или комбинированных пробиотиков необходимо учитывать количество и соотношение всех видов или штаммов, входящих в состав препарата. Показатель «Активность кислотообразования» является обязательным при контроле штаммов-продуцентов, входящих в состав лакто- и бифидосодержащих пробиотиков, при предварительном и сертификационном контроле, при оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности. Показатель «Антагонистическая активность» является обязательным при контроле колисодержащих и споровых пробиотиков для медицинского применения и производственных штаммов. Уровень антагонистической активности ИЛП в отношении штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов определяют методом отсроченного антагонизма на плотной среде по зонам задержки роста тест-штаммов. Производственные штаммы контролируются не реже 1 раза в год.

Питательные среды, используемые в испытаниях

Для выращивания микроорганизмов, входящих в пробиотики для медицинского применения, используют адекватную для данного вида бактерий и для данной методики питательную среду (если нет других указаний в нормативной документации): — для лактобактерий — МРС-2, МРС-4, МРС-5, МРС-1; для ацидофильных лактобактерий — стерильное обезжиренное молоко; — для бифидобактерий — полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, среду Блаурокка с натрия азидом, МРС-5; — для кишечной палочки — среду Эндо, мясопептонный агар (МПА), среду Гаузе N 2 агаризованную; — для энтерококков — МПА, среду N 1;
— для бактерии рода Bacillus — среду Гаузе N 2 агаризованную, МПА, полусинтетическую среду с дрожжевым диализатом. Питательные среды для проведения испытаний готовят в соответствии с приведенными ниже указаниями. Также могут использоваться эквивалентные коммерчески доступные среды при условии, что они выдерживают испытания на ростовые свойства. Необходимое значение pH питательных сред устанавливают при температуре () °С.

Среда МРС-1

В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:

• марганец сернокислый 0,05 г
• цистеин солянокислый или L-цистин 0,10 г
• магний сернокислый 0,200 г
• калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный 2,00 г
• аммония цитрат 2,00 г
• натрия ацетат (натрий уксуснокислый) 5,00 г
• печеночный экстракт а) (1:1) 100,0 мл
• дрожжевой аутолизат б) с содержанием
• аминного азота () % 50,0 мл
• пептон сухой ферментативный 10,00 г
• гидролизат обезжиренного молока в) 500,0 мл
• полисорбат 80 1,00 мл
• глюкоза 20,00 г

Доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл; pH среды (). Питательную среду разливают в пробирки по 10, 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре () °С в течение () мин. Срок хранения готовой стерильной среды 2 мес. при температуре от 2 до 8 °С или не более 1 мес. при температуре от 18 до 25 °С. Примечание.
а) Приготовление печеночного экстракта с содержанием аминного азота () %.

• Печень говяжья 1,0 кг
• Вода очищенная 1000 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре () °С в течение () мин. (процесс стерилизации валидируется). Приготовление: 1,0 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3x3x3) см, заливают 1 л воды очищенной и кипятят в течение 1,5-2 ч. Остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань «миткаль»), количество отвара доводят водой очищенной до 1 л, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре °С в течение мин. Срок хранения печеночного экстракта при температуре от 2 до 8 °С не более 6 мес. или не более 3 мес. при комнатной температуре.

б) Приготовление дрожжевого аутолизата с содержанием аминного азота ()%.

• Дрожжи хлебопекарные 1000 г
• Вода питьевая 4000 мл
• Хлороформ 40 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре () С в течение () мин.

в) Приготовление гидролизата обезжиренного молока по Богданову.

• Молоко коровье пастеризованное, нежирное () 1000 мл
• Панкреатин 1,0 г
• Хлороформ 5,0 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре () °С в течение () мин.

Среда МРС-2

• Марганец сернокислый 0,05 г
• Цистеин солянокислый или L-цистин 0,10 г
• Магний сернокислый 0,20 г
• Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный 2,00 г
• Аммония цитрат 2,00 г
• Натрия ацетат 5,00 г
• Печеночный экстракт (1:1) 100,0 мл
• Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота () % 50,0 мл
• Пептон сухой ферментативный 10,00 г
• Гидролизат обезжиренного молока 500,0 мл
• Полисорбат 80 1,00 мл
• Глюкоза 20,00 г
• Агар микробиологический 1,00 г
• Вода очищенная до 1000 мл

Значение pH готовой среды (). Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре () °С в течение () мин. Срок хранения питательной среды 2 мес. при температуре от 2 до 8 °С или не более 1 мес. при температуре от 18 до 25 °С.

Среда МРС-4

В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:

• Марганец сернокислый 0,05 г
• Цистеин солянокислый или L-цистин 0,10 г
• Магний сернокислый 0,200 г
• Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный 2,00 г
• Аммония цитрат 2,00 г
• Натрия ацетат 5,00 г
• Печеночный экстракт (1:1) 100,0 мл
• Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота () % 50,0 мл
• Пептон сухой ферментативный 10,00 г
• Гидролизат обезжиренного молока 500,0 мл
• Полисорбат 80 1,00 мл
• Глюкоза 20,00 г
• Агар микробиологический 19,0 г

Доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл (). Питательную среду стерилизуют в автоклаве при температуре () °С в течение () мин. Срок хранения питательной среды 6 мес. при температуре от 2 до 8 °С в стерильных герметичных флаконах или не более 3 мес. при температуре от 18 до 25 °С.

Среда МРС-5

• Марганец сернокислый 0,05 г
• Цистеин солянокислый или L-цистин 0,10 г
• Магний сернокислый 0,200 г
• Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный 2,00 г
• Печеночный экстракт (1:1) 100,0 мл
• Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота () % 50,0 мл
• Пептон сухой ферментативный 10,00 г
• Гидролизат обезжиренного молока 500,0 мл
• Полисорбат 80 1,00 мл
• Глюкоза 20,00 г
• Агар микробиологический 15,0 г
• Вода очищенная до 1000 мл

Питательную среду (pH 7,0) стерилизуют в автоклаве при температуре () °С в течение () мин. Срок хранения питательной среды 6 мес. при температуре от 2 до 8 °С в стерильных герметичных контейнерах (флаконах) или не более 3 мес. при температуре от 18 до 25 °С.

Примечание.
Приготовление обезжиренного стерильного молока pH (); показатель кислотности не более 18 °Т:

• Молоко сухое обезжиренное 80 г
• Вода очищенная до 1000 мл

Разливают в пробирки по 10, 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре () °С в течение () мин. (процесс стерилизации валидируется). Срок хранения обезжиренного стерильного молока 2 мес. при температуре от 2 до 8 °С или не более 1 мес. при температуре от 18 до 25 °С.

Модифицированная печеночная среда Блаурокка

• Печеночная вода (1:2) с содержанием аминного азота () мг % 1000 мл
• Пептон сухой 10 г
• Натрия хлорид 5 г
• Лактоза 10 г
• Цистеин 0,1 г
• Агар микробиологический 0,75 г

Устанавливают требуемое значение pH () с помощью 20% раствора натрия гидроксида. Питательные среды разливают в пробирки по 10, 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре () °С в течение () мин. (процесс стерилизации валидируется). Срок хранения питательной среды 2 мес. при температуре от 2 до 8 °С или не более 1 мес. при температуре от 18 до 25 °С. После 14 сут. хранения перед использованием для снижения содержания растворенного кислорода среду следует однократно регенерировать путем нагревания пробирок на водяной бане при температуре 70-80 °С в течение 10-15 мин.

Примечание.
Приготовление печеночной воды с содержанием аминного азота () мг %.

• Печень говяжья 0,5 кг
• Вода очищенная 1000 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре () °С в течение () мин. (процесс стерилизации валидируется). 0,5 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3x3x3) см, заливают 1 л воды очищенной и кипятят в течение 1,5-2 ч. Остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань «миткаль»), количество отвара доводят водой очищенной до 1 л, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре () °С в течение () мин. Срок хранения — не более 6 мес. при температуре от 2 до 8 °С или не более 3 мес. при температуре от 18 до 25 °С.

Среда Блаурокка с азидом натрия

• Среда Блаурокка 1000 мл
• Натрия азид 0,1 г

Среду перемешивают, разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре () °С в течение () мин. Срок хранения питательной среды 1 мес. при температуре от 2 до 8 °С.

Среда Гаузе N 2 агаризованная

• Бульон Хоттингера1) с содержание аминного азота 700 мг % 30 мл
• Пептон сухой 5 г
• Натрия хлорид 5 г
• Глюкоза 10 г
• Агар микробиологический 30 г
• Вода очищенная до 1000 мл

Примечание.
Приготовление бульона Хоттингера (содержание аминного азота 700 мг %).

• Гидролизат Хоттингера 24,0 г
• Натрия хлорид 5,0 г
• Вода очищенная до 1000 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре () °С в течение () мин. Срок хранения питательной среды в течение 6 мес. при температуре от 2 до 8 °С в стерильных герметичных контейнерах (флаконах).

Полусинтетическая среда с дрожжевым диализатом агаризованная

• Марганец хлористый 4-водный или марганец сернокислый 0,01 г
• Железо(III) сернокислое 7-водное 0,01 г
• Магний сернокислый 7-водный или магния хлорид 6-водный 0,1 г
• Кальция хлорид 0,08 г
• Пептон сухой 0,5 г
• Дрожжевой диализат с содержанием азота аминного 150 мг % 5,0 мл
• Глюкоза 10,0 г
• Агар микробиологический 20-30 г
• Вода очищенная до 1000 мл

Стерилизация в автоклаве при температуре () °С в течение () мин. Срок хранения питательной среды 6 мес. при температуре от 2 до 8 °С в стерильных герметичных контейнерах (флаконах).

Мясопептонный агар (МПА)

• Пептон 10,0 г
• Натрия хлорид 5,0 г
• Мясная вода 300-500 мл
• Агар микробиологический 13-20 г

В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г натрия хлорида, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают pH 7,2-7,4 и добавляют измельченный агар в количестве, зависящем от его качества и назначения среды. После добавления агара среду кипятят на слабом огне при постоянном перемешивании до полного растворения агара. Разливают в пробирки и флаконы, стерилизуют при температуре 120 °С в течение () мин. После стерилизации среда, остывая, уплотняется. Срок хранения готовой среды () 6 мес. при температуре от 2 до 8 °С или не более 1 мес. при температуре от 18 до 25 °С.

Мясопептонный бульон (МПБ)

• Пептон 10,0 г
• Натрия хлорид 5,0 г
• Мясная вода 1000 мл

В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г натрия хлорида, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают pH 7,2-7,4 и разливают в пробирки и флаконы. Стерилизуют при температуре 120 °С в течение () мин. Срок хранения питательной среды 6 мес. при температуре от 2 до 8 °С или не более 1 мес. при температуре от 18 до 25 °С.

Примечание.
Приготовление мясной воды (1:2).

• Мясо-говядина (фарш) 500 г
• Вода очищенная 1000 мл

Стерилизация при температуре 121 °С в течение 20 мин. Срок хранения 2 мес. при температуре от 2 до 8 °С и не более 1 мес. при температуре от 18 до 25 °С.

Перед испытанием, в случае использования плотной питательной среды, по 10-15 или 20-25 мл расплавленной агаризованной питательной среды (при температуре около 45 °С) разливают в стерильные чашки Петри диаметром 9 или 12 см (соответственно), оставляют на горизонтальной поверхности и дают среде застыть. Поверхность агаризованных сред перед посевом подсушивают для удаления конденсационной воды и проверки стерильности. Чашки Петри с питательными средами помещают закрытыми и перевернутыми вверх дном в термостат при температуре () °С на 48 ч. Агар Эндо подсушивают 40 мин. в ламинарном шкафу с открытыми крышками.

Раздел 1. Определение количества жизнеспособных бактерий в 1 дозе ИЛП

В настоящем разделе изложены общие принципы определения количества живых бактерий в пробиотиках для медицинского применения методом десятикратных разведений с высевом на плотные питательные среды (метод Коха) и глубинного чашечного метода или в жидкие и полужидкие среды (метод предельных разведений). Результаты количественного определения микроорганизмов выражаются в колониеобразующих единицах (КОЕ).

Отбор и подготовка образцов для анализа

От каждой испытуемой серии препарата пробиотика методом случайной выборки отбирают по 3 испытуемых образца. Испытания проводят, соблюдая правила асептики. Каждый образец в отдельности разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида и перемешивают пипеткой 8-10 раз. Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации): 1. Лиофилизаты (флаконы) — каждый образец в отдельности ресуспензируют стерильным 0,9% раствором натрия хлорида (из расчета 1 мл на 1 дозу) и перемешивают пипеткой 8-10 раз, получая исходное разведение. 2. Порошки — содержимое пакета (саше) асептически пересыпают в стерильную колбу вместимостью 250 мл, добавляют 100 мл 0,9% раствора натрия хлорида и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин., получая разведение 1:100 (10-2). 3. Таблетки — каждый образец в отдельности предварительно растирают в стерильной ступке стерильным пестиком до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз, получая исходное разведение. 4. Капсулы — каждый образец в отдельности вносят в стерильные пробирки, добавляют 10 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Пробирки с капсулами помещают на водяную баню при температуре () °С. Через 10-30 мин. содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение 1:10 (10-1). 5. Суппозиторий-каждый образец в отдельности помещают в стерильные пробирки и добавляют предварительно нагретый до температуры () °С стерильный 0,9% раствор натрия хлорида до общего объема 10 мл в зависимости от величины средней массы суппозитория испытуемой серии (например, при массе 1,1 г добавляют 8,9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, а при массе 2 г — 8 мл физиологического раствора). Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре () °С. Через 10-30 мин. содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение 1:10 (10-1).

Методика испытания.
Испытание проводят методом последовательных десятикратных разведений, соблюдая правила асептики. Для этого 1 мл микробной суспензии испытуемого образца (исходное разведение, разведения 10-1 или 10-2) вносят пипеткой в пробирку, содержащую 9 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Затем новой пипеткой 10-15 раз перемешивают, получая следующее разведение (10-2 или 10-3), и затем 1 мл суспензии переносят в следующее разведение. Титрование проводят до разведений, из которых будет произведен высев на питательные среды. Для каждого разведения используют отдельную пипетку. В случае, если образец содержит 1 дозу, 0,5 мл микробной суспензии испытуемого образца (исходное разведение) пипеткой вносят в пробирку, содержащую 4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Затем новой пипеткой 10-15 раз перемешивают, получая следующее разведение (10-1) и 1 мл суспензии переносят в пробирку с 9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, получая разведение 10-2. Титрование проводят до разведений, из которых будет произведен высев на питательные среды. Для каждого разведения используют отдельную пипетку. В зависимости от биологических свойств бактерий, входящих в состав испытуемого образца, используют соответствующую методику испытания.

1. Высев на плотные питательные среды

1.1. Метод Коха

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в 1 дозе исследуемого препарата) по 0,1 мл микробной суспензии высевают на чашки Петри с питательной средой (по 2 чашки на каждое разведение). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского или с помощью стеклянных бус до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации. Посевы инкубируют при температуре () °С в течение 24-96 ч в адекватных, в зависимости от вида микроорганизма, условиях (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных). При инкубировании в анаэробных или микроаэрофильных условиях чашки Петри с посевами помещают в анаэростат и создают необходимую газовую атмосферу. Данный метод может быть использован при определении количества живых бактерий каждого вида в поликомпонентных пробиотиках при условии, что бактерии, входящие в состав препарата, образуют визуально различимые по форме и другим признакам колонии.

1.2. Глубинный чашечный метод

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в исследуемом препарате) по 1,0 мл микробной суспензии стерильной пипеткой вместимостью 1,0 мл вносят в чашки Петри диаметром 90 мм (по 2 чашки на каждое разведение). Добавляют 20-25 мл расплавленной и охлажденной до температуры °С агаризованной питательной среды, закрывают и быстро осторожно перемешивают вращательно-поступательными движениями, не отрывая дна чашки от поверхности стола и не допуская попадания среды на крышку чашки. После застывания агара чашки Петри переворачивают вверх дном и инкубируют в адекватных условиях при температуре () °С в течение необходимого для данного микроорганизма времени.

Учет результатов.
По окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе испытуемого образца. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний. Пример расчета содержания живых микробных клеток в 1 дозе испытуемого образца: — из разведения 10-7 выросло 42 и 45 колоний; среднее арифметическое равно (42 + 45) : 2 = 43,5; — из разведения 10-6 выросло 410 и 450 колоний; среднее арифметическое равно (410 + 450) : 2 = 430; — количество живых бактерий в 1 дозе равно: (43,5 · 107 + 430 · 106) : 2 10 = 4325000000 = 4,3 · 109. Умножают среднюю арифметическую числа колоний на степень разведения и в том случае, если высев на чашку Петри сделан в объеме 0,1 мл, умножают на коэффициент 10 для пересчета на 1,0 мл.

2. Метод предельных разведений с последующим высевом на жидкие и полужидкие питательные среды

2.1. Пробирочный метод наиболее вероятных чисел (определение количества живых ацидофильных лактобактерий)

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии от каждого разведения в 2 пробирки с 9 мл стерильного обезжиренного молока. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение 10-6 препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению 10-6 в молоке. Для контроля среды добавляют 4 незасеянные пробирки с молоком. Засеянные и контрольные пробирки инкубируют при температуре () С в течение 3-4 сут. По окончании инкубации определяют количество пробирок со свернувшимся молоком. Из сгустка с культурой готовят мазки и окрашивают по Граму. Если в мазках видны характерные бактерии и отсутствует посторонняя микрофлора, то данное разведение учитывают, как содержащее микроорганизмы данного вида. В случае сквашивания молока в контрольных пробирках и при обнаружении посторонней микрофлоры в мазках, контроль проводят на новой партии среды.

Учет результатов.
При подсчете количества живых особей используют таблицу Мак-Креди (табл. 1). Сначала составляют числовую характеристику. Она состоит из 3 цифр: на первое место (слева) ставят цифру, равную числу пробирок со свернувшимся молоком, взятых в том последнем разведении, где молоко свернулось во всех пробирках (например, 2 пробирки разведения 10-6). Следующие две цифры обозначают число пробирок со свернувшимся молоком в 2 последующих разведениях (например, в 1 пробирке разведения 10-7 и в 1 пробирке разведения 10-8). Числовая характеристика результата будет 211. По таблице Мак-Креди находят вероятное число, соответствующее полученной цифровой характеристике (в нашем случае 13), умножают его на разведение, которому соответствует первая цифра числовой характеристики (в данном примере — 10-6). Тогда количество живых особей микроорганизмов в 1 дозе составляет 13 · 106 = 1,3 · 107.

Таблица 1

Таблица Мак-Креди, используемая при подсчете количества живых ацидофильных лактобактерий

Числовая характеристика
Наиболее вероятное число микроорганизмов при посеве в 2 параллельные пробирки 200
2,5
201
5,0
202
—
210
6,0
211
13,0
212
20,0
220
25,0
221
70,0

2.2. Пробирочный метод учета колоний в полужидкой среде

Из разведений препарата 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение 10-6 препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению 10-6 в питательной полужидкой среде. Посевы инкубируют при температуре () °С в зависимости от вида микроорганизма в течение 1-6 сут. По окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост типичных колоний для данного вида микроорганизмов.

Учет результатов.
В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в полужидкой питательной среде должно наблюдаться 10-кратное уменьшение количества колоний микроорганизмов. Количество живых бактерий в дозе испытуемого препарата вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке (объем вносимого материала в 1,0 мл дает коэффициент умножения 1, который не влияет на конечный результат при вычислении).

3. Определение количества живых бактерий в поликомпонентных пробиотиках

3.1. Комбинированный метод
(определение количества бифидо- и колибактерий)

Для определения количества живых бактерий в составе препарата пробиотика из соответствующих последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в 0,9% растворе натрия хлорида (с 10-1 по 10-9) проводят высевы на среду Блаурокка с натрия азидом (учет бифидобактерий) и на среду Эндо (учет колибактерий). Для определения количества бифидобактерий по 1 мл микробной суспензии из разведений 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 высевают в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды Блаурокка с азидом натрия (отмечая разведение, из которого сделан посев). При этом учитывают, что разведение 10-6 препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению 10-6 в среде Блаурокка с азидом натрия. Посевы в среде Блаурокка с азидом натрия инкубируют при температуре () °С в течение 4-5 сут. Для определения количества кишечных палочек делают посев по 0,1 мл микробной суспензии из разведений испытуемого образца 10-5, 10-6 на чашки Петри со средой Эндо (по 2 чашки от каждого разведения). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды Эндо шпателем Дригальского до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре () °С в течение 18-24 ч.

Учет результатов.
В среде Блаурокка с натрия азидом по окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост колоний в виде «гвоздиков». Количество живых бактерий в дозе вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке. На среде Эндо по окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе препарата. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний. Пример для расчета аналогичен описанному в подразделе 1.

Раздел 2. Активность кислотообразования

Кислотообразующую активность штаммов-продуцентов, входящих в состав лакто- и бифидосодержащих пробиотиков для медицинского применения определяют по титруемой кислотности при культивировании бактерий в адекватной питательной среде. Испытание количественного определения кислотообразующей активности проводят методом кислотно-основного титрования. Для выращивания бифидобактерий используют полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, для лактобактерий — МРС-1 или стерильное обезжиренное молоко, если нет других указаний в нормативной документации.

Реактивы, используемые в испытании:
— титрованный 0,1 М раствор натрия гидроксида; — индикатор — 1% раствор фенолфталеин.

Особенности отбора и подготовки образцов для анализа

От каждой испытуемой серии лекарственного средства, независимо от ее объема, методом случайной выборки отбирают по 2 образца. В случае, если испытуемый образец (т.е. таблетка/капсула/суппозиторий) содержит 1 дозу, то в 1 образец объединяют 3 таблетки/капсулы/суппозитория. Испытания проводят, соблюдая правила асептики. Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации): 1. Лиофилизаты — испытуемый образец (каждый образец в отдельности) разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу препарата и перемешивают пипеткой 8-10 раз. По 2,5 мл полученной суспензии каждого образца вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 25 мл питательной среды. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре () °С и инкубируют в течение 48-72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма). 2. Таблетки — каждый образец в отдельности предварительно растирают (асептически) в ступке до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз. По 2,5 мл полученной суспензии каждого образца вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 25 мл питательной среды. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре () °С и инкубируют в течение 48-72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма). 3. Порошки — содержимое саше асептично пересыпают в пробирку, вместимостью 50 мл, содержащую 25 мл питательной среды, и перемешивают. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре () °С и инкубируют в течение 48-72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма). 4. Капсулы — каждый образец в отдельности вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре () °С. Через 20-30 мин. полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре () °С и инкубируют в течение 48-72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма). 5. Суппозитории — каждый образец в отдельности вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды, адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре () °С. Через 20-30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре () °С и инкубируют в течение 48-72 ч (сроки инкубации определяются видом микроорганизма). Примечание.
После окончания инкубации суспензию в пробирках освобождают от липофильной суппозиторной основы одним из следующих способов: — сразу после окончания инкубирования при температуре посевов () °С стерильной пипеткой удаляют растопленный верхний слой жира; — пробирки охлаждают при температуре от 2 до 8 °С в течение ()мин., затем застывшую суппозиторную основу снимают асептически пастеркой с загнутым концом или бактериологической петлей.

Методика испытания.
Уровень кислотообразования определяют в каждом из 2 образцов. После окончания инкубации содержимое пробирки перемешивают отдельной пипеткой 8-10 раз. Каждую пробу в объеме 10 мл вносят в отдельную коническую колбу или стакан вместимостью 100 мл. Штаммы-продуценты, выращенные в стерильном обезжиренном молоке, образуют сгусток. Образовавшийся сгусток разбивают путем тщательного перемешивания (10-12 раз) пипеткой вместимостью 10 мл. После этого 10 мл микробной суспензии переносят из пробирки с культуральной средой в коническую колбу вместимостью 100 мл, содержащую 20 мл воды очищенной. Колбу интенсивно встряхивают для равномерного перемешивания содержимого, затем прибавляют 2-3 капли 1% раствора фенолфталеина. Полученную суспензию титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до появления стойкого слабо-розового окрашивания и достижения pH () (контролируют потенциометрически), при этом учитывают количество миллилитров 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование.

Учет результатов.
Кислотность выражают в градусах Тернера (°Т) и вычисляют по формуле:

°Т = А · К · 10,

где: А — количество миллилитров 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование 10 мл исследуемой микробной суспензии; К — поправка к титру 0,1 М раствора натрия гидроксида; 10 — объем микробной суспензии, мл.
Пример расчета: на титрование 10 мл микробной суспензии пошло 10,6 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, где К = 1,03, тогда: Т = 10,6 · 1,03 · 10 = 109,18 °Т Вычисляют средний показатель из 2 параллельных проб от каждого образца (пробирки) и средний показатель из 2 образцов (пробирок) при условии, если показатель активности кислотообразования каждого из них был не ниже регламентированного.

Раздел 3. Антагонистическая активность

Антагонистическую активность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов оценивают как у штаммов-продуцентов, так и у препаратов пробиотиков, полученных на их основе. Определение антагонистической активности штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, проводят с помощью метода отсроченного антагонизма. При проведении испытания применяют питательную среду, адекватную для данного вида бактерий (если нет других указаний в нормативной документации): — для лактобактерий и бифидобактерий — среду МРС-5; — для кишечной палочки и споровых пробиотиков — среду Гаузе N 2.

Тест-штаммы микроорганизмов

Тест-штаммы микроорганизмов, используемые в испытании, приведены в табл. 2. Их получают в лиофилизированном виде (в ампулах) из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» (если нет других указаний в нормативной документации) с сертификатом соответствия (паспортом на штамм).

Таблица 2

Тест-штаммы микроорганизмов, используемых в испытаниях по отсроченному антагонизму

Тест-штамм микроорганизма
Номер штамма
Staphylococcus aureus
АТСС 6538 (FDA 209P)
Escherichia coli
О157
Shigella flexneri
170, 337
Shigella sonnei
5063
Proteus mirabilis
Н-237 или 56/10
Proteus vulgaris
177 или 401
Candida albicans
ATCC10231

Восстановление лиофилизированных тест-штаммов микроорганизмов. Ампулы с тест-культурами микроорганизмов вскрывают в асептических условиях в соответствии с инструкцией производителя. Для восстановления жизнеспособности культуры необходимо не менее двух пересевов на адекватной питательной среде (соответствующей потребностям используемого микроорганизма) с инкубацией в стандартных условиях. Для получения изолированных колоний второй пересев культуры тест-штамма проводят на адекватной плотной питательной среде при инкубации в стандартных условиях. Температура инкубации посевов бактерий () °С, грибов — () °С, если нет других указаний в нормативной документации. По окончании инкубации изучают морфологию выросших колоний, микроскопируют мазки, окрашенные по Граму, изучают биохимические свойства с использованием тест-систем, разрешенных к использованию. Тест-штамм микроорганизма должен обладать типичными морфологическими, тинкториальными, культуральными, биохимическими свойствами в соответствии с представленным сертификатом коллекции. Тест-штаммы микроорганизмов в лиофилизированном виде хранятся при температуре () °С в течение 24 мес. Допускается не более 5 пассажей от исходной культуры.

Приготовление тест-штаммов микроорганизмов для испытания. Для испытания используют культуры, выращенные в течение () ч, второго или третьего пассажа, которые инкубируют на адекватной плотной питательной среде в адекватных условиях. Выросшую чистую культуру смывают 0,9% раствором натрия хлорида с поверхности плотной питательной среды. Полученную суспензию собирают в стерильную посуду (флакон, пробирку и т.д.). Доводят концентрацию микробных клеток в полученной суспензии в соответствии со стандартным образцом мутности 5 ОЕ в соответствии с ОФС «Определение концентрации микробных клеток».

Отбор и подготовка образцов для анализа. Методом случайной выборки отбирают образцы от каждой серии препарата. Посевы проводятся в стерильных условиях. Пробиотические производственные штаммы-продуценты (лиофилизаты) восстанавливают до первоначально высушенного объема (но не менее 107 микробных клеток/мл), добавляя в лиофилизат стерильный 0,9% раствор натрия хлорида. Особенности подготовки испытуемого образца препарата пробиотиков в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации): 1. Лиофилизаты — разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз. 2. Таблетки — предварительно растирают в ступке (асептически) до гомогенного состояния дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8-10 раз. 3. Порошки — содержимое пакета (саше) высыпают в пробирку, содержащую 25 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида, и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин. 4. Капсулы — содержимое капсулы вносят в пробирку, добавляют 1 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида и перемешивают до гомогенного состояния. 5. Суппозитории — вносят в пробирку, добавляют до общего объема 10 мл стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, предварительно нагретый до температуры () °С. Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре () °С. Через 10-30 мин. содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния и освобождают от жировой основы (как описано выше в разделе 2).

Методика испытания.
Полученную суспензию испытуемого образца перемешивают и высевают бактериологической петлей диаметром () мм на 6 чашек Петри с питательной средой, проводя по 2 параллельных штриха длиной, равной диаметру чашки. После инкубирования в течение 48-96 ч при температуре () °С в адекватных (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных) условиях в зависимости от вида микроорганизма к выросшей культуре испытуемого образца подсевают культуры тест-штаммов (в соответствии с требованиями нормативной документации). Подсев тест-штаммов производят петлей диаметром () мм в направлении, перпендикулярном зоне роста изучаемого микроорганизма, и не касаясь его. Чашки Петри перевернутые вверх дном инкубируют при температуре () °С в течение 18-20 ч (если нет других указаний в нормативной документации). Контролем роста тест-штаммов служит их параллельный посев на чашки с той же питательной средой без испытуемой культуры.

Учет результатов.
Учитывают величину зоны отсутствия роста тест-штамма, выраженную в мм. Чем больше величина угнетения роста тест-культур, тем выше антагонистическая активность испытуемого штамма. Если нет других указаний в нормативной документации, антагонистическую активность штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, считают высокой, если: — зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 20 мм — для штаммов-продуцентов, входящих в лактосодержащие пробиотики; — зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 15 мм — для штаммов-продуцентов, входящих в коли-, бифидосодержащие пробиотики; — зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 10 мм — для штаммов-продуцентов, входящих в споросодержащие пробиотики.

---

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

---

Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Определение концентрации микробных клеток ОФС.1.7.2.0008.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на микробиологические исследования, при которых необходимо использование взвесей микроорганизмов, содержащих определенное количество микробных клеток. Концентрация микробных клеток выражается числом клеток определяемых микроорганизмов (включая нежизнеспособные и поврежденные) на единицу объема суспензии. При определении концентрации микробных клеток устанавливается процентное содержание жизнеспособных клеток, определяемое числом живых клеток на единицу объема суспензии (число колониеобразующих единиц в мл — КОЕ/мл). Процедура подсчета концентрации микробных клеток в лабораторных условиях может выполняться вручную или с помощью автоматических устройств. Различают методы прямого визуального подсчета, определение количества колоний после высева микроорганизмов на питательные среды, а также учет микробных клеток под микроскопом после их окрашивания определенными красителями. Кроме того, могут применяться коммерческие водорастворимые системы, содержащие стандартизованное количество микробных клеток. Современные коммерческие системы просты в использовании и позволяют снизить случайную погрешность при определении концентрации микробных клеток, связанную с человеческим фактором.

Методы прямого подсчета

Методы прямого подсчета дают возможность наиболее полно учесть численность микроорганизмов. Их эффективность гораздо выше, чем метода посева на питательные среды, так как многие микроорганизмы требовательны к условиям культивирования и качеству питательной среды. Кроме того, методы прямого подсчета дают возможность получить дополнительную информацию о размерах и морфологии исследуемых клеток.

Подсчет в счетной камере

Наиболее распространенным методом определения общего числа клеток в 1 мл суспензии является их подсчет под микроскопом с использованием счетной камеры. Существует несколько видов счетных камер, принципиальное устройство которых одинаково: Тома-Цейсса, Бюркера, Горяева, камера подсчета с сеткой Нейбауэра. Счетная камера Горяева представляет собой специальное предметное стекло с нанесенными на него поперечными прорезями, образующими три поперечно расположенные плоские площадки. Средняя площадка продольной прорезью разделена еще на две площадки, каждая из которых имеет выгравированную на ней сетку с квадратами определенной площади. По обе стороны средней площадки в камере Горяева расположены две других на 0,1 мм выше средней. Плоскости этих площадок служат для притирания покровного стекла до появления так называемых Ньютоновских колец. После притирания покровного стекла создается камера, закрытая с двух боковых сторон, а с двух других имеющая капиллярные пространства, через которые с помощью пастеровской пипетки камеру заполняют разведением взвеси микроорганизма (рис. 1).

Рисунок 1. Счетная камера Горяева

Подсчет клеток проводят под микроскопом, который настраивают таким образом, чтобы была видна нанесенная на камеру сетка и клетки микроорганизма, равномерно распределенные на ней. Считают число клеток в 5 горизонтальных и 15 диагональных больших квадратах, после чего определяют число клеток (x) в 1 мл исследуемой взвеси по формуле:

,

где: a — число клеток в 20 квадратах;
N = 225 — число больших квадратов в камере Горяева;

• коэффициент, равный величине, обратной объему камеры Горяева (v = 0,9 мм3 = 0,9 · 10-3 мл); b — разведение исходной взвеси микроорганизма.

При подсчете с использованием камеры Горяева необходимо соблюдать следующие основные правила: — использовать только стандартные покровные стекла; — проводить подсчет только чистых культур; — избегать недостаточного заполнения и переполнения камеры; — избегать наличия пузырьков воздуха в камере; — учитывать все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата; — подсчет клеток производить с объективом 8x (10x), реже 40x. С иммерсионным объективом работать нельзя.

Подсчет клеток на мембранных фильтрах

Этот метод рекомендуется использовать для определения количества микроорганизмов во взвесях с низкой концентрацией клеток. Определенный объем исследуемой суспензии фильтруют через мембранный фильтр с нанесенной сеткой. Размер пор фильтра 0,22 или 0,45 мкм. Затем микроорганизмы на фильтре окрашивают карболовым эритрозином и подсчитывают в 20 полях зрения с помощью микроскопа, оснащенного окулярным микрометром. Расчет общего количества микроорганизмов (x) в 1 мл производят по формуле:

,

где: S — фильтрующая площадь (мм2);
106 — переводной коэффициент квадратных миллиметров в квадратные микрометры; N — среднее количество бактерий в одном квадрате; s — площадь квадрата окулярного микрометра, мкм2; V — объем профильтрованной жидкости, мл.

При подсчете клеток на мембранных фильтрах с помощью люминесцентного микроскопа используют нелюминесцирующие фильтры. После концентрирования клеток на их поверхности проводят флюорохромирование акридиновым оранжевым и подсчитывают. Этот метод позволяет подсчитать общее количество микроорганизмов и определить среди них количество жизнеспособных клеток, так как при окрашивании акридиновыми красителями жизнеспособные клетки имеют зеленую, а нежизнеспособные — красную окраску.

Методы непрямого определения концентрации клеток микроорганизмов

К непрямым методам определения концентрации клеток микроорганизмов относятся визуальные методы, методы, основанные на светопоглощении (турбидиметрия), светорассеянии (нефелометрия), электропроводности микробных взвесей (кондуктометрия) и др. Рост микроорганизмов в питательной среде обычно приводит к изменению ее мутности. Мутность — это способность оптически неоднородной среды рассеивать проходящий свет. Мутность взвесей микроорганизмов является оптическим эквивалентом концентрации содержащихся в них микробных клеток. Мутность зависит как от свойств микроорганизмов (размер, показатель преломления), так и от их количества в единице объема. Мутность микробных взвесей определяют путем сравнения со стандартными образцами мутности.

Турбидиметрия и нефелометрия

Мутность микробной взвеси может быть определена путем измерения оптической плотности при определенной длине волны. Интенсивность пучка света, проходящего через пробу, уменьшается за счет рассеивания (нефелометрия) или поглощения света (турбидиметрия). Светорассеяние и светопоглощение зависят не только от количества клеток в суспензии, но также от их размеров и формы. Для более концентрированных взвесей обычно применяют турбидиметрический метод. Для очень разбавленных суспензий используют метод нефелометрии вследствие его большей чувствительности. Действие нефелометра основано на сравнении интенсивности света, рассеянного испытуемой средой, с интенсивностью рассеяния эталона. При испытании пробу ярко освещают, а затем измеряют интенсивность прошедшего излучения или излучения, рассеянного под определенным углом. Для определения количества клеток в среде используют калибровочный график, отображающий зависимость между величиной светорассеяния и числом клеток в единице объема взвеси. Для построения калибровочного графика измеряют величину светорассеяния в ряде проб с известным содержанием клеток. Калибровочные графики индивидуальны для каждого микроорганизма. Для измерения оптической плотности взвесей микроорганизмов возможно использование автоматических систем-анализаторов.

Визуальный метод

Для определения концентрации микроорганизмов может быть использован метод, основанный на визуальном сравнении мутности исследуемой взвеси со стандартным образцом мутности. Визуальные методы оптической стандартизации микробных взвесей основаны на принципе установления равенства показателей мутности двух сред — исследуемой взвеси и стандартного образца мутности. Для этого исследуемую взвесь и стандартный образец сравнивают между собой в проходящем или отраженном свете с помощью специальной сравнительной таблицы. Если при одинаковом освещении видимость просвечивающихся через пробирки с исследуемой взвесью и стандартным образцом линий элементов сравнительной таблицы одинакова, то считают, что мутность исследуемой взвеси равна мутности стандартного образца. Зная показатель мутности стандартного образца и его числовой микробный эквивалент, рассчитывают концентрацию микробных клеток в исследуемой взвеси.

Международный стандартный образец мутности Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)

Международный стандартный образец мутности ВОЗ (International Reference Preparation of Opacity (IRP), World Health Organization), равный 10 ME мутности (международным единицам мутности) — это утвержденный ВОЗ первичный эталон мутности для стандартизации бактериальных взвесей визуальным методом, который выпускается под эгидой ВОЗ (International Laboratory for Biological Standard, National Institute for Biological Standards and Control, London, England).

Стандартный образец мутности

Стандартные образцы мутности (СО мутности), равные 10 ME, 5 ME и 20 ME мутности соответственно, предназначены для стандартизации бактериальных взвесей визуальным методом и обеспечения единства определения концентрации микробных клеток в бактериальных взвесях при микробиологических исследованиях. CO мутности аттестованы с использованием 5-го Международного стандартного образца мутности ВОЗ (N 76/522), одна международная единица которого соответствует мутности взвеси коклюшных бактерий, содержащей 1,1 · 109 клеток в 1 мл. Мутность экземпляра СО, равная 10 ME, ориентировочно соответствует следующим концентрациям других микробных клеток в 1 мл (коэффициент k): 11 · 109 клеток/мл для бактерий коклюшной группы; 0,93 · 109 клеток/мл для бактерий кишечной группы; 1,7 · 109 клеток/мл для бруцеллезных бактерий; 2,2 · 109 клеток/мл для холерного вибриона; 5,0 · 109 клеток/мл для туляремийных бактерий (франциселл). Для экземпляра CO 5 ME концентрация микробных клеток в 2 раза меньше, чем для CO 10 ME. Для экземпляра CO 20 ME концентрация микробных клеток в 2 раза больше, чем для CO 10 ME. В случае, если исследуемый микроорганизм не указан в тексте выше, допускается использование значения концентрации для микроба, наиболее близкого по размеру к исследуемому. Определение общей концентрации (ОК) микробных клеток с использованием CO мутности. Исходную взвесь микроорганизмов разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида до тех пор, пока ее мутность не будет равна мутности стандартного образца, что определяют в соответствии с инструкцией по применению CO мутности по специальной сравнительной таблице. Исследуемую микробную взвесь перемешивают встряхиванием или пипетированием в стерильной емкости до гомогенного состояния и переносят в пробирку, входящую в комплект с CO мутности, в объеме 6-7 мл, что соответствует объему жидкости в пробирке с СО. Для проведения испытания с использованием CO работают только с пробирками, поставляемыми в комплекте с CO мутности. Перед началом измерения стандартный образец встряхивают в течение 10-15 секунд до полного исчезновения осадка. Если после встряхивания в пробирке с CO мутности остается видимый глазом осадок, экземпляр изымают из обращения. Совмещают пробирки с CO мутности и исследуемой взвесью микроорганизмов в вертикальном положении на уровне глаз, плотно прикладывают пробирки к сравнительной таблице и освещают источником рассеянного света таким образом, чтобы пробирки не экранировали друг друга от источника света. Источником света могут служить: люминесцентная лампа мощностью от 20 до 40 Вт, лампа накаливания матовая или с матовым фильтром (плафоном) мощностью от 40 до 60 Вт, рассеянный дневной свет. Проводить испытания при прямом солнечном свете не допускается. В случае одинаковой четкости просматриваемых элементов сравнительной таблицы через пробирку с CO и пробирку с исследуемой микробной взвесью, мутность их считают одинаковой и равной мутности, указанной на этикетке СО. Погрешность визуального определения мутности с помощью CO мутности составляет около 10%. Не допускается оставлять экземпляры CO мутности под действием бактерицидного облучателя, а также замораживание. Расчет OK микробных клеток проводят по формуле:

,

где: V0 — объем исходной взвеси, мл;
Vi — объем стерильного 0,9% раствора натрия хлорида, использованного для разведения исходной взвеси, мл; k — коэффициент: концентрация исследуемых микробных клеток в мл, соответствующая 10 ME, КОЕ/мл.

Пример определения общей концентрации (OK) микробных клеток в вакцине туляремийной живой сухой

Определение проводят, используя не менее чем три образца. К 0,5 мл ресуспендированной вакцины (V0 = 0,5 мл) прибавляют порциями стерильный 0,9% раствор натрия хлорида для доведения исследуемой взвеси до мутности, соответствующей 10 ME (Vi = 1,0 + 0,2 + 0,3 = 1,5 мл). Концентрация туляремийных бактерий во взвеси (коэффициент к), соответствующей 10 ME, составляет 5,0 · 109 КОЕ/мл.

КОЕ/мл

Итоговое значение общей концентрации микробных клеток рассчитывают как среднее арифметическое значений OK по трем образцам.

Стандарт мутности Мак-Фарланда (McFarland)

Другим примером стандартизации по стандарту мутности микробной взвеси является использование стандарта Мак-Фарланда (McF). Согласно инструкции по применению, изготавливают 1% растворы бария хлорида и серной кислоты. Для приготовления стандарта мутности и взвеси микроорганизмов, подлежащей исследованию, подбирают пробирки одного диаметра. В пробирки изготавливаемого стандарта разливают 1% раствор серной кислоты в объеме, указанном в табл. 1 и добавляют 1% раствор бария хлорида для получения общего объема 10 мл. Пробирки с изготовленным стандартом герметично закрывают. Жидкость в стандарте Мак-Фарланда и исследуемой пробирке должна быть гомогенно мутной. Внимание! Бария хлорид и серная кислота — ядовитые вещества. Количественную характеристику исследуемой микробной взвеси определяют сравнением с ближайшими по мутности пробирками тем же способом, как при использовании CO мутности с учетом данных, приведенных в табл. 1. Методика не предназначена для определения общей концентрации микробных клеток в бактерийных взвесях при производстве и контроле иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП).

Таблица 1

Количественная оценка бактериальных взвесей по шкале Мак-Фарланда

Номер по шкале Мак-Фарланда
Объем, мл
Приблизительное количество
КОЕ/мл
Соответствующая микробная взвесь,
КОЕ/мл
1% H2SO4
1% BaCl2
0,5
9,95
0,05
1 · 108
1,5 · 108
1
9,9
0,1
3 · 108
3 · 108
2
9,8
0,2
6 · 108
6 · 108
3
9,7
0,3
9 · 108
9 · 108
4
9,6
0,4
12 · 108
12 · 108
5
9,5
0,5
15 · 108
15 · 108
6
9,4
0,6
18 · 108
18 · 108
7
9,3
0,7
21 · 108
21 · 108
8
9,2
0,8
24 · 108
24 · 108
9
9,1
0,9
27 · 108
27 · 108
10
9,0
1,0
30 · 108
30 · 108

Кондуктометрические методы

Кондуктометрические методы основаны на зависимости сопротивления или проводимости среды от концентрации клеток. При росте и размножении в соответствующей жидкой питательной среде микроорганизмы продуцируют высокозаряженные ионные метаболиты, что приводит к изменению электрохимических свойств питательной среды. Эти изменения полного сопротивления, измеряемые проводимостью или емкостным сопротивлением, регистрируются электродами, находящимися в контакте с культуральной средой. Время определения обратно пропорционально концентрации микробных клеток в суспензии. Для дрожжевых и плесневых грибов, которые вызывают только незначительные изменения электропроводности, обычно применяют косвенные методы измерения проводимости с использованием источника калия гидроксида, однако прямые измерения также могут быть применены. Одним из таких методов является подсчет числа клеток в электронном счетчике Култера. Суспендированные в электролите клетки проходят через апертуру малого диаметра, расположенную между двумя электродами. Когда клетки проходят через апертуру («электрочувствительную зону»), каждая из них вытесняет определенное количество электролита, вызывая возрастание сопротивления. В результате происходит небольшое изменение величины электрического тока в усилителе, который преобразует колебания силы тока в импульсы напряжения, которые находятся в прямой зависимости от размера прошедшей через апертуру клетки. К преимуществам данного метода относится возможность подсчета общего количества клеток и распределения клеток популяции по размерам.

Методы определения жизнеспособных клеток микроорганизмов

Метод мембранной фильтрации

С помощью мембранной фильтрации может быть определено как общее количество клеток, так и количество жизнеспособных микроорганизмов. В последнем случае после проведения фильтрации мембранный фильтр помещают на соответствующую плотную питательную среду. После инкубации в адекватных для исследуемого микроорганизма условиях подсчитывают видимые колонии. Метод мембранной фильтрации аналогичен методу подсчета клеток на чашках, но является более чувствительным, поскольку через фильтр можно пропускать большие объемы исследуемого материала.

Метод посева на питательные среды
(чашечный метод)

Сущность метода заключается в посеве определенного объема из серии десятикратных разведений суспензии исследуемых микроорганизмов на плотную питательную среду, инкубации и подсчете образовавшихся колоний, учитывая, что каждая колония — результат размножения одной жизнеспособной клетки микроорганизма. Посев осуществляют одним из чашечных методов, указанных в разделе «Микробиологическая чистота», а именно: глубинным, поверхностным, двуслойным или модифицированным агаровым методом. При этом из каждого разведения производят посев на набор чашек с плотной питательной средой (так называемый, метод параллельных высевов). При учете результатов определяют среднее количество колоний, выросших при посеве каждого разведения. Для получения достоверных результатов отбирают чашки, где число колоний бактерий находится в пределах от 30 до 300, а колоний грибов — от 10 до 100. Если чашки из двух последовательных разведений попадают в эту область, количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл рассчитывают как их среднее значение. Рассчитывают среднее количество КОЕ (N) в 1 мл по формуле:

где: c — сумма подсчитанных колоний на всех чашках; n1 — количество чашек первого разведения; n2 — количество чашек второго разведения; d — коэффициент первого разведения;
0,1 — коэффициент, учитывающий кратность первого и второго разведения.

Пример: В двух последовательных разведениях 10-6 и 10-7 были получены результаты: 168; 215 и 14; 25 колоний соответственно. Количество микроорганизмов в исходной суспензии равно:

КОЕ/мл.

Окраска селективными красителями

Данное исследование основано на витальном (или прижизненном) окрашивании микроорганизмов, что позволяет различать живые и погибшие клетки (живые клетки не окрашиваются, мертвые или поврежденные клетки окрашиваются). Наиболее часто используемые красители — трипановый синий, эритрозин B или нигрозин. Оптимальное значение pH 7,5. Концентрация красителя и время окрашивания валидируются. Окрашивание клеточной суспензии, например раствором трипанового синего проводят, осторожно смешивая краситель с суспензией микробных клеток. Выдерживают в течение 2 мин. при комнатной температуре. Далее перемешивают и помещают в счетную камеру. Подсчет проводят незамедлительно. Необходимо, чтобы время контакта клеток с красителем при окрашивании составляло не более 4 мин., так как увеличение времени экспозиции с красителем значительно увеличивает количество окрашенных клеток. Процентное содержание жизнеспособных клеток (X) определяют как отношение числа неокрашенных (живых) клеток к общему числу клеток под оптическим микроскопом. При этом учитывают как все неокрашенные (живые), так и все окрашенные (мертвые) клетки. Жизнеспособность (X) в процентах (%) определяется по формуле:

;

где: n — число неокрашенных жизнеспособных клеток; N — общее число клеток.

---

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

---

Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Определение содержания анатоксинов/токсинов в реакции флокуляции ОФС.1.7.2.0007.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на реакцию флокуляции, которая предназначена для определения содержания анатоксинов или токсинов в растворах. Реакция флокуляции по Рамону (Ramon assay) основана на способности некоторых антигенов при соединении со специфическими антителами образовывать нерастворимый комплекс «антиген-антитело», который визуально выявляется в виде помутнения среды и образования хлопьев (флокулята). Характерной особенностью реакции флокуляции является феномен инициальной флокуляции, т.е. способность формирования флокулята в первую очередь в тех растворах, где содержание антигена и антител (токсина/анатоксина-антитоксина) эквивалентны. Для проведения испытания используют специфический антитоксин, калиброванный, в зависимости от использованного иммунохимического метода, в Международных единицах (ME) или Lf-эквивалентах (Lf-eq.). Предпочтительнее использовать антитоксины, калиброванные в единицах Lf-eq. против соответствующих международных референс-препаратов анатоксинов для флокуляционных тестов. За 1 Lf принимают количество анатоксина, которое вступает в реакцию флокуляции с 1 ME или 1 Lf-eq. антитоксина в наиболее короткий промежуток времени. Содержание токсина/анатоксина в растворе, определенное в реакции флокуляции, выражают в Lf/мл.

ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

Специфический антитоксин в концентрации 100 ME или Lf-eq. в 1 мл вносят в возрастающих объемах (количествах МЕ/мл) в ряд пробирок, содержащих равные объемы испытуемого раствора токсина/анатоксина. Содержимое каждой пробирки доводят до равного объема 0,9% раствором натрия хлорида. Смеси перемешивают, избегая образования пены. Пробирки со смесями инкубируют на водяной бане при температуре 45-50 °С, периодически оценивая состояние растворов. Результат реакции оценивают в проходящем свете, при необходимости применяют лупу. Отмечают пробирки, в которых раньше других произошла флокуляция, и время наступления флокуляции (Kf). Пробирка, в которой раньше других наблюдается появление хлопьев (инициальная флокуляция), содержит эквивалентные или близкие к эквивалентным количества антигена и антител. Для расчета содержания антигена учитывают концентрацию антитоксина в этой пробирке. Если инициальная флокуляция наблюдается одновременно в 2 пробирках, для расчета берут среднее значение показателей концентрации антитоксина, содержащегося в этих пробирках. Если перед проведением реакции флокуляции испытуемый раствор был разведен, то для расчета содержания анатоксина в растворе полученный результат умножают на степень разведения. Показатель (Kf) является полезным индикатором качества антигена. Если при данных значениях температуры и концентраций анатоксина и антитоксина значение Kf при повторных испытаниях увеличивается по сравнению с наблюдавшимся ранее, это может свидетельствовать о разрушении антигена и снижении его иммуногенной активности. Определение содержания анатоксина в испытуемом образце представлено в табл.

Таблица

Определение содержания анатоксина в испытуемом образце

Испытуемый раствор
N пробирки
1
2
3
4
5
Объем раствора испытуемого анатоксина, мл 1
1
1
1
1
Объем внесенного раствора соответствующего антитоксина, мл 0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
Активность внесенного антитоксина, МЕ/мл 35
40
45
50
55
Объем внесенного 0,9% раствора натрия хлорида, мл 0,65
0,60
0,55
0,50
0,45

В данном примере раньше других наблюдалась флокуляция в пробирке N 3, следовательно, в этой пробирке содержание анатоксина близко или эквивалентно количеству внесенного антитоксина. В данном случае — 45 Lf/мл. Если испытуемый раствор был разведен в 10 раз, содержание анатоксина в нем равно 450 (45 · 10) Lf/мл. Если инициальная флокуляция произошла в пробирке N 1 или N 5, результаты не учитывают, а тест повторяют, изменив количество вносимого антитоксина или разведение испытуемого раствора токсина/анатоксина. Для выполнения повторной реакции объемы вносимого в пробирки антитоксина следует выбирать с учетом того, чтобы крайняя пробирка (N 1 или N 5), в которой наблюдалась инициальная флокуляция, оказалась в середине ряда. Для получения более точных результатов повторяют тест, выполняя реакцию флокуляции с объемами вносимого антитоксина, близкими по значению к эквивалентной концентрации, используя меньшие различия во вносимых объемах. Например: если инициальная флокуляция произошла в пробирке N 3, следует для уточнения эквивалентной концентрации повторить реакцию, внося в пробирки ряда антитоксин в объемах 0,41; 0,43; 0,45; 0,47; 0,49 мл. Для подтверждения полученных результатов тест повторяют при тех же условиях. Результаты считаются приемлемыми, если в повторных тестах наблюдаются различия не более чем на 1 разведение антитоксина. За окончательное значение принимают среднее арифметическое повторных измерений.

Реакция флокуляции для растворов с низкой концентрацией анатоксинов/токсинов

Для растворов анатоксинов или токсинов с низкой концентрацией (менее 5 Lf/мл) предпочтительнее использовать метод смешанной флокуляции, поскольку Lf смеси анатоксинов равен сумме их Lf (при условии их гомогенности). Метод заключается в сравнении значений Lf раствора анатоксина с предварительно установленной концентрацией с Lf этого же анатоксина в смеси с испытуемым анатоксином низкой концентрации. Если токсины/анатоксины не гомогенны, может возникать ложная картина с 2 флокуляционными максимумами. Например: анатоксин с известным содержанием разводят 0,9% раствором натрия хлорида в соотношении 1:1. Тот же анатоксин смешивают с раствором испытуемого анатоксина низкой концентрации в равных соотношениях. Каждую из смесей разливают по 1 мл в ряд пробирок. В пробирки обоих рядов вносят в возрастающих объемах антитоксин с концентрацией 100 МЕ/мл и 0,9% раствор натрия хлорида для доведения общего объема в каждой из пробирок до постоянной величины. Инкубируют пробирки на водяной бане при температуре 45-50 °С, периодически оценивая состояние раствора. Отмечают пробирки с инициальной флокуляцией в каждом ряду. Разница значений показателей инициальной флокуляции обоих рядов указывает на содержание анатоксина в испытуемом растворе.

---

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

---

Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Испытание вирусных вакцин на присутствие посторонних агентов ОФС.1.7.2.0006.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы обнаружения посторонних агентов в вирусных вакцинах для медицинского применения. Для производства вирусных вакцин допускается использовать только субстраты, одобренные национальными регулирующими органами. Если для приготовления иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) используются ткани животных или эмбрионы птиц, а также приготовленные на их основе клеточные культуры, то животные и эмбрионы должны поступать из изолированных, постоянно контролируемых хозяйств, свободных от специфической патогенной флоры (SPF), если в нормативной документации нет других указаний. На присутствие посторонних агентов должны быть испытаны: — контрольные клеточные культуры (клетки, отобранные из производственного пула клеточных культур до внесения вакцинного штамма); — объединенный вирусный сбор вакцинного и посевного вирусов для живых и инактивированных вакцин; — объединенный вирусный сбор (полуфабрикат вакцины до добавления вспомогательных веществ) каждой серии живых вирусных вакцин. Учитывая специфические особенности производства ИЛП, в нормативную документацию на них могут быть введены дополнительные требования.

1. Испытание контрольной клеточной культуры

1.1. Исследование в клеточных культурах

Испытанию подвергается не менее 500 мл незараженной клеточной суспензии в концентрации, используемой для посева клеточных культур-продуцентов вакцины. Отобранную в качестве контрольной клеточную суспензию разливают во флаконы, клетки оставляют незараженными и инкубируют в тех же условиях, что и клетки, используемые для производства вакцины. За контрольной клеточной культурой наблюдают до времени последнего сбора вирусов с культур-продуцентов вакцины, но не менее 14 сут. В конце периода наблюдения все флаконы с контрольными клеточными культурами исследуют с помощью светового микроскопа на наличие цитопатических изменений. Во время культивирования контрольных клеток не должно выявляться признаков специфической дегенерации. По истечении срока наблюдения (после изучения монослоя под микроскопом) не менее 25% контрольных клеточных культур проверяют на наличие феномена гемадсорбции с 0,25% эритроцитами морской свинки, кур и человека I(0) группы, если нет других указаний в нормативной документации. Материал инкубируют в течение 30 мин. сначала при температуре от 2 до 8 °С, а затем при температуре от 20 до 25 °С. Взвесь эритроцитов сливают, клеточный монослой трижды отмывают раствором Хенкса или 0,9% раствором натрия хлорида и просматривают под микроскопом на наличие гемадсорбции. Из оставшихся флаконов с контрольными культурами отбирают по 10 мл культуральной жидкости. Если на протяжении срока инкубации контрольных культур производят сливы вируссодержащей жидкости из производственных культур, то в те же сроки берут пробы культуральной жидкости из флаконов с контрольными культурами и сохраняют их при температуре не выше минус 20 °С. В конце наблюдения пробы культуральной жидкости из контрольных клеточных культур объединяют и вносят по 10 мл в 3 клеточные культуры: гомологичную, приготовленную из другой партии производственного субстрата (например, фибробласты куриных или перепелиных эмбрионов), человека или обезьяны (например, диплоидные клеточные культуры человека или клетки Vero) и наиболее чувствительную для выявления вирусов — возможных контаминантов используемого субстрата (для птичьего субстрата — почки эмбриона кур). От каждой вновь испытуемой клеточной культуры оставляют по одному интактному (незараженному) контрольному флакону. Все культуры выдерживают при температуре () °С в течение 14 сут. По окончании срока наблюдения все контрольные культуры проверяют на наличие цитопатических изменений и феномена гемадсорбции, как указано выше. Пробы считают прошедшими испытание, если в опытных и контрольных культурах отсутствуют цитопатические изменения и гемадсорбция. Если при исследовании контрольных клеточных культур в одном из испытаний обнаружены цитопатические изменения или феномен гемадсорбции, то вирусный сбор, полученный в производственных культурах, не должен быть использован для приготовления вакцины.

1.2. Обнаружение группо-специфического (ГС) антигена вирусов лейкозно-саркоматозного комплекса птиц (Cofal-test)

Если для производства и контроля вакцин используют субстраты, приготовленные на основе эмбрионов кур или других птиц (например, перепелов), то для обнаружения группоспецифического антигена лейкозо-саркоматозного комплекса птиц (ГС-антиген) проводят реакцию связывания комплемента (РСК) (Cofal-test) по общепринятой методике. Испытуемый антиген готовят из той же партии контрольных клеточных культур, используемых при производстве вирусных вакцин. Клетки засевают в три флакона (по 150-160 тыс. клеток на мл) и инкубируют при температуре () °С в смеси равных объемов питательных сред Игла и 199 с добавлением 5% телячьей сыворотки. Через 5-7 сут. после образования монослоя клетки субкультивируют не менее двух раз в течение 14 сут. По окончании инкубации культуральную жидкость из флаконов сливают, добавляют 4,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида, затем клетки разрушают трехкратным замораживанием и оттаиванием и используют в РСК. В качестве положительного контроля антигена возможно использование 10% суспензии опухоли вируса саркомы Рауса в 0,9% растворе натрия хлорида. При обнаружении в испытуемой культуре ГС-антигена вакцину бракуют. Обнаружение ГС-антигена (после приготовления как указано выше) возможно также в ИФА и ПЦР в соответствии с инструкциями по применению тест-систем после валидации методик.

2. Исследование вируссодержащего материала

Испытанию подлежит объединенный вирусный сбор, полученный в процессе приготовления вакцинного штамма и посевного вируса. При необходимости для определенных вирусных вакцин испытанию также подлежит объединенный вирусный сбор, полученный в процессе приготовления полуфабриката вакцины до добавления вспомогательных веществ, что должно быть указано в нормативной документации. Контроль проводят в клеточных культурах, на животных и куриных эмбрионах (если в нормативной документации нет других указаний). Если образцы исследуют в течение первых 24 ч, то до проведения контроля их сохраняют при температуре от 2 до 8 °С. При проведении контроля в более поздние сроки образцы замораживают и хранят при температуре не выше минус 20 °С. Размораживание материала в процессе контроля разрешается проводить не более одного раза.

2.1. Исследование в клеточных культурах

Если испытуемый материал вызывает в культуре цитопатогенное или гемадсорбирующее действие, используют предварительную нейтрализацию вируса иммунной сывороткой. Для получения иммунной сыворотки используют животных, ткани которых не применяют при приготовлении клеточных культур-продуцентов вакцины. Антиген для иммунизации животных готовят в клеточных культурах, не используемых для проведения контроля. Сыворотка не должна оказывать ингибирующего/токсического действия на ход анализа. Испытуемый материал (не менее 50 мл вируссодержащей жидкости, если в нормативной документации нет других указаний) смешивают с иммунной сывороткой, взятой в количестве, достаточном для полной нейтрализации содержащегося в пробе вируса. Смесь инкубируют при заданной температуре в течение времени (обычно 1-2 ч), необходимого для нейтрализации вакцинного штамма вируса (если нет других указаний в нормативной документации), затем вносят во флаконы с тремя указанными выше видами клеточных культур. Для каждого вида культуры клеток оставляют один контрольный флакон с незараженной клеточной культурой. Культуры клеток выдерживают при температуре () °С 14 сут. со сменой среды на 4-6 сут. (если это необходимо). По истечении 14 сут. опытные и контрольные клеточные культуры просматривают под микроскопом на наличие цитопатических изменений, трижды замораживают и опаивают, после чего производят пассаж на одноименной культуре, внося в нее не менее 25 мл неосветленной культуральной жидкости. Разведение вносимого материала поддерживающей средой не должно превышать четырехкратного. Если для испытания используют перевиваемую клеточную линию, то по истечении указанного срока инкубации возможно проведение субпассажа клеток. После проведения пассажа опытные и контрольные культуры клеток инкубируют при температуре () °С в течение 14 сут. со сменой среды на 4-6 сут., периодически просматривая их под микроскопом на наличие цитопатических изменений. По истечении срока наблюдения культуры проверяют в реакции гемадсорбции, как указано выше. Материал считают прошедшим контроль, если в опытных и контрольных культурах отсутствуют цитопатические изменения и гемадсорбция.

2.2. Испытание на животных

Испытанию подлежит объединенный вирусный сбор, полученный в процессе приготовления вакцинного штамма, посевного вируса и полуфабриката вакцины до добавления вспомогательных веществ, что должно быть указано в нормативной документации. Используют здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Если содержащийся в контролируемом материале вакцинный штамм вируса патогенен для животных, используемых для контроля, его предварительно нейтрализуют иммунной сывороткой, приготовленной, как было указано выше. Испытания на животных проводятся в том случае, если в нормативной документации нет других указаний.

2.2.1. Испытание на взрослых мышах.
Используют от 10 до 20 мышей массой 15-20 г. Каждому животному вводят по 0,03 мл испытуемого материала интрацеребрально и по 0,5 мл — интраперитониально. За животными наблюдают от 21 до 28 сут. Все мыши, которые погибают позже 24 ч после введения материала, или с признаками заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически. Если при макроскопическом исследовании не были выявлены признаки заболевания, из внутренних органов (печень, почки, селезенка, легкие, головной мозг) готовят 10% суспензии на 0,9% растворе натрия хлорида и вводят их интрацеребрально и интраперитонеально не менее чем 5 мышам, в дозах, указанных выше. За животными наблюдают 21 сут. Материал считается прошедшим контроль, если на протяжении периода наблюдения остаются здоровыми не менее 80% инокулированных животных и ни у одного из них не выявляют признаки, указывающие на присутствие в вакцине посторонних агентов.

2.2.2. Испытание на новорожденных мышах. Используют не менее 20 новорожденных мышей не старше 24 ч (два-три помета). Каждому животному вводят по 0,01 мл испытуемого материала интрацеребрально и по 0,1 мл — интраперитонеально. За животными наблюдают 14 сут. Все мыши, которые погибают позже 24 ч наблюдений, или у которых наблюдаются признаки заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически на наличие спонтанной патологии, не связанной с введением препарата. При отсутствии патологии, из внутренних органов (печень, почки, селезенка, легкие, головной мозг) мышей готовят 10% суспензии на 0,9% растворе натрия хлорида и вводят интрацеребрально и интраперитонеально не менее чем 5 новорожденным мышам в дозах, указанных выше. За животными наблюдают 14 сут. Материал считается прошедшим контроль, если на протяжении периода наблюдения остаются здоровыми не менее 80% инокулированных животных и ни у одного из них не выявляются признаки, указывающие на присутствие в вакцине посторонних агентов.

2.2.3. Испытание на морских свинках.
Используют не менее 5 морских свинок массой 300-350 г. Каждому животному вводят по 0,1 мл испытуемого материала интрацеребрально и по 5,0 мл — интраперитонеально. За животными наблюдают 42 дня. Все животные, которые погибают позднее 24 ч после введения материала или с признаками заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически, а внутренние органы (печень, селезенка, легкие, сердце) исследуются микроскопически. Материал считают прошедшим испытание, если не менее 80% инокулированных животных остаются здоровыми к концу периода наблюдения и ни у одного из них не наблюдается признаков вирусной или туберкулезной инфекции, связанной с введением вакцинного препарата.

3. Испытание на куриных эмбрионах

Если содержащийся в контролируемом материале вакцинный штамм вируса патогенен для куриных эмбрионов, его необходимо предварительно нейтрализовать иммунной сывороткой, как было указано выше. Испытуемый материал вводят трем группам эмбрионов (по 10 шт. в каждой группе). Первой группе куриных эмбрионов 9-10 дневного возраста материал вводят по 0,2 мл в аллантоисную полость. Эмбрионы инкубируют при температуре () °С в течение 6-7 сут., затем аллантоисную жидкость исследуют в реакции гемагглютинации со смесью эритроцитов морской свинки, петуха и человека I(0) группы. С этой целью готовят 5-6 последовательных двукратных разведений аллантоисной жидкости от каждого инокулированного эмбриона, добавляют равные объемы 0,5% суспензии эритроцитов (в 0,9% растворе натрия хлорида), инкубируют 30-40 мин. при температуре от 20 до 25 °С и учитывают результаты. Материал считают прошедшим испытание, если в течение срока наблюдения не менее 80% инокулированных эмбрионов остаются живыми и ни в одной пробе аллантоисной жидкости не выявлено гемагглютинирующих агентов. Второй группе куриных эмбрионов 5-6 дневного возраста материал вводят по 0,2 мл в желточный мешок. Эмбрионы инкубируют при температуре () °С в течение 10-12 сут. Материал считается прошедшим испытание, если к концу указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80% инокулированных эмбрионов, а в мазках ткани желточных мешков, окрашенных гематоксилин-эозином по Романовскому-Гимзе, не выявляется элементарных телец. Третьей группе куриных эмбрионов 10-11 дневного возраста материал вводят по 0,2 мл на хорионаллантоисную оболочку, после чего их инкубируют при () °С в течение 6-7 сут. По истечении указанного срока оболочки извлекают и просматривают в проходящем свете на черном фоне на наличие патологических изменений. Материал считается прошедшим испытание, если к концу указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80% инокулированных эмбрионов и на хорионаллантоисных оболочках всех эмбрионов отсутствуют изменения, видимые невооруженным глазом.

4. Испытание на присутствие микоплазм

Испытание проводят в соответствии с ОФС «Испытание на присутствие микоплазм». Контролю подлежат: культуральная жидкость контрольных клеточных культур, объединенный вирусный сбор, полученный в процессе приготовления вакцинного штамма, посевного вируса и полуфабриката вакцины до добавления вспомогательных веществ, живых и инактивированных вирусных вакцин. При наличии роста микоплазм хотя бы в одной пробирке материал бракуют.

5. Испытание на присутствие микобактерий туберкулеза

Испытание на присутствие микобактерий туберкулеза проводят высевом на питательные среды или методом ПЦР в соответствии с инструкцией по применению после валидации методики. Если субстратом производства вакцины является культура клеток птиц, испытание на отсутствие микобактерий должно проводиться бактериологически на адекватной питательной среде. Испытанию подлежат сливы с контрольных (не зараженных вирусом) флаконов с культурой клеток. Исследование проводят путем высева культуральной жидкости на среду Левенштейна-Йенсена. Перед посевом 20 мл исследуемого материала центрифугируют (при необходимости) в течение 15 мин. при 4000 об/мин., надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида и высевают по 0,2 мл в 5 пробирок со скошенной средой Левенштейна-Йенсена. Учет производят через 45 сут. инкубации при температуре () °С. Колонии микобактерий должны отсутствовать. Методы выявления контаминирующих агентов в ИЛП должны быть наиболее современными и информативными, применяться с учетом сложности технологического процесса приготовления этих препаратов и в соответствии с требованиями, изложенными в нормативной документации.

---

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

---

Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин ОФС.1.7.2.0005.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения иммуногенности коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин путем сравнения с иммуногенностью референс-препарата коклюшной вакцины, откалиброванного в международных единицах (ME) по соответствующему международному стандартному образцу. Определение проводят на модели экспериментального менингоэнцефалита при внутримозговом введении иммунизированным мышам заражающей дозы тест-штамма Bordetella pertussis 18323 по методу Kendrick.

Материалы

Животные. Здоровые мыши с массой тела () г чувствительной линии или аутбредные мыши, способные давать адекватный иммунный ответ. Используют мышей одного пола или самцов и самок, равномерно распределенных по группам. В 1 опыте различия массы тела отдельных животных не должны превышать 2 г. Перед проведением испытания за животными проводят наблюдение в течение 3 сут. При гибели более 10% мышей данную партию не используют. Референс-препараты:
— стандартный образец иммуногенности коклюшной вакцины, калиброванный в ME по соответствующему международному стандартному образцу; — стандартный образец мутности 10 ME, калиброванный в международных оптических единицах (ME). Тест-штамм. В. pertussis 18323, хранят в лиофилизированном состоянии. Продолжительность хранения высушенного штамма не должна превышать 10 лет; биологические свойства лиофилизированного тест-штамма проверяют ежегодно. Среды. Используют среды Борде-Жангу, казеиново-угольный агар (КУА), их модификации или другие среды, адаптированные к коклюшному микробу. Среда Борде-Жангу.
В 1500 мл воды очищенной последовательно растворяют ингредиенты: — калий фосфорнокислый двузамещенный — 2,25 г; — калий фосфорнокислый однозамещенный — 0,75 г; — калий хлористый — 1,5 г;
— магний сернокислый — 0,075 г;
— натрий хлористый — 7,5 г.
Полученный солевой раствор до внесения следующих ингредиентов должен иметь pH 7,4-7,5. Затем в солевой раствор вносят:
— фильтрат картофельного отвара — 500 мл, — агар зарубежных фирм «Дифко» (США) или «Мерк» (Германия) — 60 г. Среду кипятят до полного растворения агара, устанавливают pH 7,1-7,2, разливают по () мл в стерильные флаконы вместимостью 500 мл и стерилизуют при температуре 110 °С в течение 30 мин. Среду Борде-Жангу хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 3 мес.

Фильтрат картофельного отвара.
В 1 л воды очищенной вносят 0,5 кг очищенного мелко нарезанного картофеля и нагревают до кипения. В момент закипания добавляют 40 мл глицерина и кипятят в закрытой посуде до полного разваривания картофеля в течение 1,0-1,5 ч. Доводят объем водой очищенной до первоначального уровня и процеживают через двухслойную марлевую салфетку. Картофельный отвар используют свежеприготовленным. Для получения среды Борде-Жангу с 30% крови содержимое флакона нагревают до температуры 50-55 °С, вносят 60 мл дефибринированной крови человека, перемешивают и разливают в чашки Петри. Срок хранения среды с кровью — 10 сут. при температуре от 2 до 8 °С. Примечание.
Дефибринированную кровь получают на участках заготовки крови, где ее контролируют на отсутствие возбудителей инфекций, которые передаются при гемотрансфузиях, в соответствии с утвержденными уполномоченными органами РФ «Инструкцией по заготовке и консервированию донорской крови» и «Инструкцией по проведению донорского прерывистого плазмафереза». Срок хранения крови не более 2 сут.

Среда КУА (казеиново-угольный агар).
На 1 л среды добавляют:
— гидролизат казеина — () мл (берется из расчета, чтобы в готовой среде содержание аминного азота составляло от 150 до 160 мг %); — дрожжевой диализат — () мл;
— калий фосфорнокислый однозамещенный — 0,5 г; — магний хлористый 6-водный — 0,4 г;
— крахмал растворимый — 1,5 г;
— кальций хлористый — 0,01 г или 1% раствор — 1 мл; — железо сернокислое 7-водное — 0,01 г или 0,5% раствор — 2 мл; — медь сернокислая 5-водная — 0,005 г или 0,2% раствор — 2 мл; — цистеин — 0,03 г или 1,5% раствор — 2 мл; — агар микробиологический — 30,0 г;
— уголь активированный — 2 г.
Содержание хлоридов в среде должно составлять ()%, аминного азота ( мг %); pH среды доводят до 7,0-7,1 с помощью 20% раствора натрия гидроксида. Среду разливают в матрацы по () мл, пробирки по () мл и флаконы вместимостью 500 мл по () мл, стерилизуют 30 мин при температуре 110 °С и хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 1 мес. Для получения среды с 10% крови содержимое флакона растапливают, охлаждают до температуры 50-55 °С, вносят 20 мл дефибринированной крови человека и перемешивают. Срок хранения среды с кровью 10 сут. при температуре от 2 до 8 °С. Гидролизат казеина:
— казеин (сухой) — 2000 г;
— хлористоводородная кислота концентрированная — 1000 мл; — вода очищенная — 500 мл.
Степень расщепления белка — не менее 93%. Аминный азот 850-1000 мг %, общий азот 910-1080 мг %, натрия хлорид 4-6%. Среду стерилизуют 30 мин при температуре 110 °С. Среду используют свежеприготовленной (при добавлении 0,5% хлороформа срок хранения 1 год при температуре от 2 до 8 °С). Дрожжевой диализат:
— дрожжи хлебопекарные — 1000 г;
— вода очищенная — 1000 мл;
— хлороформ — 4 мл.
Аминный азот — не менее 0,54 мг/мл. Срок хранения 3 мес. при температуре от 2 до 8 °С. 1% раствор гидролизата казеина.
Гидролизат казеина — 10 мл (аминный азот 8,5-10,0 мг/мл), натрий хлористый — 6,0 г (до концентрации хлоридов 0,6%), вода очищенная — до 1000 мл. С помощью 20% раствора натрия гидроксида pH доводят до (). Среду стерилизуют 15 мин при температуре 121 °С. Срок хранения 6 мес. Каждую серию гидролизата казеина проверяют на безвредность путем внутримозгового введения 5 мышам по 0,03 мл. Животные должны оставаться живыми и здоровыми в течение 3 сут.

Метод исследования иммуногенной активности коклюшной вакцины

Мышей распределяют в группы по 18-20 животных в каждой: по 2 группы для испытуемого и референс-препаратов. Одновременно для контроля вирулентности заражающего штамма B. pertussis 18323 (определение LD50 культуры) из этой же партии животных формируют 4 группы по 10 мышей в каждой. Необходимо соблюдать принцип случайного распределения животных по группам, случайными должны быть и расположение клеток на полках, и порядок введения разрешающей дозы.

Иммунизация мышей.
Готовят по 3 пятикратных разведения испытуемого и референс-препаратов. В качестве растворителя используют 0,9% раствор натрия хлорида, pH (). В интервале используемых разведений каждого образца должна содержаться средняя эффективная доза ED50. В ампулу с референс-препаратом вносят стерильный растворитель из такого расчета, чтобы в 1 мл содержалась 1 ME (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 1).

Таблица 1

Пример разведения референс-препарата

Разведение
Объем вносимого разведения I референс-препарата, мл Объем вносимого растворителя, мл
Разведения референс-препарата
(в 0,5 мл)
Иммунизирующая доза — 0,5 мл
Количество исходного референс-препарата, мл Количество ME
I
15
0
1:60
0,0167
0,5
II
2,5
10,0
1:300
0,0033
0,1
III
0,5
12,0
1:1500
0,00066
0,02

Образец испытуемой вакцины разводят в 14 раз (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 2). Если полученное в опыте значение ED50 испытуемой вакцины будет больше значений использованных доз, необходимо изменить разведение I (например, 1:10). Последующие 2 разведения делают по вышеприведенной схеме. Приготовленные разведения вакцины и референс-препарата хранят при температуре от 2 до 8 °С и используют в течение не более 4 ч.

Таблица 2

Пример разведения испытуемой вакцины

Разведение
Объем вносимого
I разведения вакцины, мл
Объем вносимого растворителя, мл
Кратность разведений исходной вакцины
(в 0,5 мл)
Иммунизирующая доза в объеме 0,5 мл
Количество исходной вакцины, мл
Количество ME (предполагаемое содержание) I
14
0
1:28
0,0357
0,5
II
2,5
10,0
1:140
0,0071
0,1
III
0,5
12,0
1:700
0,00142
0,02

Каждой мыши в каждой группе внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл одного из разведений испытуемой вакцины или референс-препарата. К моменту введения заражающей дозы не менее 94% иммунизированных мышей должно остаться в живых и без признаков заболевания. Если гибель животных превышает указанную величину, то опыт не подлежит учету.

Приготовление заражающей суспензии тест-штамма B. pertussis 18323. Бактериальную суспензию B. pertussis 18323, используемую для заражения, готовят из 20-24-часовой культуры второго-третьего пассажа, выращенной на среде Борде-Жангу, с кровью человека или КУА с кровью человека или на других, адаптированных к коклюшному микробу средах. Выросшую культуру контролируют путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. Микробные клетки B. pertussis 18323 должны быть морфологически однородны. Посторонняя микрофлора должна отсутствовать. Готовят бактериальную суспензию микробных клеток с концентрацией, соответствующей 10 ME по стандартному образцу мутности (разведение 1А). Все дальнейшие разведения микробной суспензии делают в 1% растворе гидролизата казеина, содержащего 0,6% раствор натрия хлорида, pH (). Полученную суспензию разводят последовательно так, чтобы получить заражающую дозу, содержащую 100000 микробных клеток (рабочая суспензия) в объеме 0,03 мл (100-1000 LD50). Из рабочей суспензии готовят разведения 1/10, 1/50, 1/250 и 1/1250 для определения LD50 тест-штамма и проверки жизнеспособности микробов в суспензии (табл. 3).

Таблица 3

Пример разведения тест-штамма B. pertussis 18323

Номер пробирки
Кратность разведения
Объем переносимой суспензии из предыдущей пробирки в последующую, мл Объем внесенного растворителя, мл
Полученная суспензия содержит
в 0,03 мл (эквивалентно)
Назначение
1
1A:3
1
2
100 млн

2
11:10
0,5
4,5
10 млн

3
12:10
0,5
4,5
1 млн

4
13:10
2
18
100000
Разливают в 3 пробирки для заражения — рабочая суспензия 5
14:10
0,5
4,5
10000
Для определения LD50 штамма
6
15:5
1,0
4,0
2000
7
16:5
1.0
4,0
400
8
17:5
1,0
4,0
80

Из пробирки 8 сразу после приготовления разведения делают посев по 0,1 мл на 3 чашки Петри со средой Борде-Жангу или КУА с кровью с целью подсчета количества содержащихся в ней живых клеток, выраженного в колониеобразующих единицах (КОЕ). Культуру помещают в термостат с температурой () °С на 3-4 сут. Для определения количества КОЕ в 30 мкл проводят подсчет выросших колоний на 3 чашках, и полученное значение делят на 10. В 0,03 мл разведения из пробирки 8 должно быть не более 50 КОЕ. При разведении и в процессе заражения суспензию хранят в холодной водяной бане (вода со льдом). Продолжительность работы с микробной суспензией не должна превышать 2,5 ч с момента приготовления смыва культуры. Если в испытании используют высокочувствительную к коклюшным антигенам линию мышей, то заражающую дозу тест-штамма 18323 следует уменьшить до содержания 100-1000 LD50 в объеме 0,03 мл.

Заражение иммунизированных животных.
Мышам, иммунизированным испытуемой вакциной и референс-препаратом, через 14-17 сут. интрацеребрально вводят по 0,03 мл рабочей суспензии живой культуры тест-штамма B. pertussis 18323 (пробирка 4) путем прокола лобной кости в точке, расположенной в 2 мм от средней линии и на 2 мм выше глаза. Для заражения используют туберкулиновые шприцы с ценой деления 0,01 мл, используя иглу N 27, имеющую короткий срез и муфту; длина свободного конца иглы от края муфты до среза должна составлять от 3 до 4 мм. Для определения величины LD50 разведения заражающей дозы (пробирки 5, 6, 7, 8) вводят контрольным мышам соответствующих групп интрацеребрально по 0,03 мл. Мышей, погибших в течение 3 сут. после заражения, исключают из опыта (неспецифическая гибель); в каждой клетке оставляют по 16 мышей. За зараженными животными наблюдают 14 сут. с ежедневной регистрацией их гибели. В день учета результатов (14-е сут.) в число погибших включают также всех парализованных мышей. Вычисление величины LD50 (табл. 4) культуры тест-штамма производят по формуле Кербера:

,

где: DN — максимальная из испытуемых доз;

• логарифм кратности разведения (отношение большей дозы к следующей за ней меньшей дозе); Li — отношение числа животных, погибших при введении данной дозы культуры, к общему числу животных, которым эта доза была введена;
• сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.

Таблица 4

Пример расчета величины LD50 культуры
тест-штамма B. pertussis 18323

Доза культуры (число микробных клеток) 0,03 мл Число зараженных животных
Число погибших (парализованных) из общего числа зараженных животных Значения Li
LD50
Кол-во колоний в заражающей дозе 80 клеток 104
10
9/10
0,9
648
23
2 · 103
10
7/10
0,7
4 · 102
10
4/10
0,4
80
10
2/10
0,2

lg LD50 = lg · 104 — lg 5 · (2,2 — 0,5) = 4,0 — 0,699 · 1,7 = 2,8117 LD50 = 648 микробных клеток.
В заражающей дозе (105 микробных клеток) содержится 648 = 154 LD50.

Оценка иммуногенной активности испытуемой вакцины

Расчет иммуногенной активности испытуемого препарата проводят по методу Вильсона и Вустера с использованием таблиц Национального института здоровья США (для n = 16) или статистическим методом с помощью программы Probit-analysis. Для проведения расчета в таблице Вильсона-Вустера (табл. 5) по вертикальной оси отмечают величину, равную сумме выживших мышей от всех 3 доз препарата (А), по горизонтальной оси — разницу между числом мышей, выживших от наибольшей и наименьшей доз, взятых в опыт (В). В месте пересечения прямых, проведенных от соответствующих величин А и В, находят ED50 (верхняя цифра) и ее стандартные отклонения, выраженные в процентах (нижние цифры). Найденное значение соответствует ED50 для средней иммунизирующей дозы, равной 100 мл. Для определения величины ED50 в опыте, найденную в таблице величину ED50 делят на 100 и умножают на значение средней иммунизирующей дозы в данном опыте. Результаты опыта считают достоверными, если стандартное отклонение средней иммунизирующей дозы не ниже 64% и не выше 157% от найденного значения ED50. Примеры расчета количества ME в 1 мл по методу Вильсона и Вустера приведены в табл. 6.

Таблица 5

Таблица Вильсона-Вустера

Таблица 6

Пример расчета иммуногенной активности вакцины

Препарат
Доза препарата в 0,5 мл
Количество выживших мышей/ общее число зараженных в группе Величины А/В и ED50 по таблице
ED50 (стандартные отклонения в опыте)
Разведение
Количество исходного препарата, мл
Количество ME в иммунизирующей дозе
Референс-препарат
1:60
0,0167
0,5
14/16
27/11
71,3
72-139
0,0023
(0,00327 — 0,00169)
1:300
0,0033
0,1
10/16
1:1500
0,00066
0,02
3/16
Вакцина
1:28
0,0357

13/16
23/11
111,75
72-139
0,0079
(0,011 — 0,0057)
1:140
0,0071

8/16
1:700
0,00142

2/16

Средняя иммунизирующая доза референс-препарата, выраженная в мл (0,0033 мл), содержит 0,1 ME (табл. 6). При определении ED50 референс-препарата используют значение средней иммунизирующей дозы, выраженное в ME.

ME,

ME,

ME,

мл,

мл,

мл.

Количество ME в 1 мл вакцины определяют по формуле:

,

МЕ/мл.

Доверительный интервал значения иммуногенности (МЕ/мл) препарата рассчитывают по формулам:

;

Rмакс = R · K,

где: R — количество ME в 1 мл препарата; Rмин — нижний предел доверительного интервала; Rмакс — верхний предел доверительного интервала; K — доверительный коэффициент.

,

где: S1 = (lg ED50)макс. — lg ED50 для более иммуногенного препарата при избранном уровне существенности различия — 95 или 99%; S2 = lg ED50 — (lg ED50)мин. для менее иммуногенного препарата. Для примера:

.
K = 1,6
Отсюда:

; т.е. МЕ

Rмакс = R · K; т.е. 9,0 ME · 1,6 = 14,4 ME

Таким образом, в 1 мл вакцины содержится 9,0 ME с доверительным интервалом от 5,6 до 14,4 ME. Если в первом опыте активность препарата не соответствует установленным требованиям, опыт повторяют. В этом случае при вычислении количества ME в 1,0 мл препарата учитывают результаты всех достоверных опытов (не более 3). Используют расчет средней геометрической (Xгеом.) величины значения по формуле:

,

где: ПX — произведение усредняемых величин; n — число определений.

Критерии достоверности теста:
— ED50 референс-препарата и испытуемой вакцины лежит в интервале между наибольшей и наименьшей иммунизирующими дозами; — LD50 не превышает 1000 микробных клеток; — заражающая доза микробных клеток содержит не менее 100 и не более 1000 LD50; — в 0,03 мл разведения из пробирки 8 содержится не более 50 КОЕ.

---

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

---

Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Иммуногенность адсорбированного столбнячного анатоксина ОФС.1.7.2.0004.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения специфической (иммуногенной) активности адсорбированного столбнячного анатоксина, входящего в состав моно- и комбинированных вакцин. Специфическую активность столбнячного анатоксина определяют по его способности защищать иммунизированных животных от заражения столбнячным токсином и выражают в количестве Международных единиц (ME) активности, содержащихся в 1 мл или 1 прививочной дозе (0,5 мл). Активность столбнячного анатоксина в МЕ/мл рассчитывают путем сопоставления его количества и количества соответствующего референс-препарата, калиброванного в ME, необходимых для защиты 50% животных от летального заражения столбнячным токсином (LD50). Для определения специфической активности используют метод множественных разведений. При стабильно воспроизводимых показателях активности адсорбированного столбнячного анатоксина и стандартной технологии производства возможно использование метода с одним разведением.

Метод множественных разведений

Разными дозами испытуемого препарата иммунизируют не менее 3 групп мышей по 12-16 животных в группе. Не менее 3 аналогичных групп животных иммунизируют разными дозами референс-препарата, калиброванного в ME. Разведения вакцины и референс-препаратов выбирают таким образом, чтобы наименьшая доза защищала от заражения не более 20%, а наибольшая доза — не менее 80% иммунизированных животных. Следует избегать разведений испытуемых образцов, при которых наблюдается гибель или выживаемость 100% иммунизированных животных. Через 28 сут животным вводят по 50 LD50 столбнячного токсина. Наблюдение проводят в течение 4 сут, регистрируя число выживших животных, и рассчитывают величины ED50 (статистически определяемая доза вакцины или референс-препарата, защищающая от гибели 50% иммунизированных животных в течение 4 сут) для вакцины (в мл) и референс-препарата (в ME). На основании полученных результатов определяют количество ME в 1 мл вакцины.

Материалы и животные:
— референс-препарат (стандартный образец активности адсорбированного столбнячного анатоксина, калиброванный в ME по соответствующему международному стандартному образцу); — испытуемый образец;
— столбнячный токсин с предварительно установленной дозой LD50 (статистически определяемая доза токсина, вызывающая гибель 50% животных в течение 4 сут); — белые мыши с массой тела 16-18 г.
Примечания.
1. Приготовление разведений референс-препарата. Референс-препарат разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида, pH (), и готовят не менее 3 последовательных разведений с двойным шагом (например: 0,5, 1,0 и 2 МЕ/0,5 мл). 2. Приготовление разведений испытуемого образца вакцины. Разведения испытуемого образца готовят, соблюдая те же условия, что и при приготовлении разведений референс-препарата.

Иммунизация животных.
Разведения референс-препарата и испытуемого образца анатоксина вводят по 0,5 мл мышам в соответствующих группах однократно под кожу в область внутренней поверхности верхней трети бедра.

Введение столбнячного токсина.
По истечении 28 сут всем иммунизированным животным вводят под кожу внутренней поверхности верхней трети бедра по () LD50 столбнячного токсина в объеме 0,5 мл. Опыт сопровождают контролем величины LD50 столбнячного токсина. Для этого неиммунизированным мышам из той же партии, разделенным на 3 группы (не менее 4 мышей в каждой группе), вводят столбнячный токсин в дозах 0,5, 1 и 2 LD50. За иммунизированными животными и животными контрольной группы наблюдают 4 сут, регистрируя число выживших мышей без явлений столбняка. На основании полученных результатов производят расчет иммуногенной активности столбнячного анатоксина с помощью статистических программ, включающих Probit analysis, или по формуле Кербера, определяя величины ED50 для референс-препарата и испытуемой вакцины. Также рассчитывают количество LD50 токсина, введенного иммунизированным животным. Формула Кербера:
— для испытуемого образца и референс-препарата:

,

• для токсина:

,

где: DN — величина максимальной из испытуемых доз;

• логарифм кратности разведения (отношение большей дозы к следующей за ней меньшей дозе); Li — отношение количества выживших мышей без явлений столбняка (для LD50 — павших) к общему числу животных, получивших данную дозу;
• сумма значений Li, найденных для всех испытуемых доз.

Испытание считается проведенным правильно, если: — вычисленное значение ED50 для испытуемого образца анатоксина и референс-препарата лежит между значениями наибольшей и наименьшей дозы препаратов, введенных животным; — пределы доверительного интервала (Р = 0,95) не менее 50% и не более 200% от величины вычисленной активности; — разрешающая доза столбнячного токсина приблизительно равна 50 LD50.

Метод с одним разведением

Если при испытании не менее 10 серий вакцины подтверждена стабильность и соответствие требованиям нормативной документации показателя иммуногенности столбнячного анатоксина, возможно использование метода с одним разведением. Принцип метода заключается в сравнении активности единичных разведений вакцины и референс-препарата, калиброванного в ME. По данным тестов с 3 разведениями выбирают дозу референс-препарата, обеспечивающую выживаемость 10-20% иммунизированных животных при заражении разрешающей дозой токсина. Разведение вакцины готовят с таким расчетом, чтобы получить подтверждение того, что ее активность значительно выше минимально требуемой. Животных делят на 2 группы (не менее 12 животных в каждой), одну из которых иммунизируют вакциной, а другую — референс-препаратом. Препараты вводят подкожно в объеме 0,5 мл. Через 28 сут всем иммунизированным животным вводят разрешающую дозу столбнячного токсина () LD50 в объеме 0,5 мл. Опыт сопровождают контролем величины LD50 столбнячного токсина. За животными наблюдают 4 сут, регистрируя число выживших животных без явлений столбняка в каждой группе. Результаты выражают как отношение числа выживших без явлений столбняка мышей в каждой группе к общему числу животных, получивших данную дозу вакцины или референс-препарата. В опытной группе количество выживших животных должно быть достоверно выше, чем в контроле. Достоверность различия определяют с помощью точного критерия Фишера (одностороннего, P < 0,05). При значении различия считаются недостоверными (табл.).

Таблица

Расчет значения доверительного интервала (P)

Группа
Количество испытуемых животных
Выжило
Пало
Всего
Опыт
a
b
T
Контроль
c
d
R
Всего
n+
n-
N

Вычисление P проводят по формуле:

,

где: ! — знак факториала (означает произведение всех натуральных чисел от 1 до числа, стоящего перед знаком «!» включительно).

Если показатель иммуногенности столбнячного анатоксина при испытании методом с одним разведением не соответствует требованиям нормативной документации, испытание повторяют методом множественных разведений.

---

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

---

Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Иммуногенность адсорбированного дифтерийного анатоксина ОФС.1.7.2.0003.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения специфической (иммуногенной) активности адсорбированного дифтерийного анатоксина, входящего в состав комбинированных вакцин. Специфическую активность дифтерийного анатоксина определяют по его способности защищать иммунизированных животных от заражения дифтерийным токсином и выражают в количестве Международных единиц (ME) активности, содержащихся в 1 мл или в прививочной дозе (0,5 мл). Специфическую активность дифтерийного анатоксина в МЕ/мл рассчитывают путем сопоставления его количества и количества соответствующего референс-препарата, калиброванного в ME, необходимых для защиты 50% животных от летального заражения дифтерийным токсином (LD50). Для определения специфической активности используют метод множественных разведений. При стабильно воспроизводимых показателях специфической активности адсорбированного дифтерийного анатоксина и стандартной технологии производства возможно использование метода с одним разведением.

Метод множественных разведений

Разными дозами вакцины иммунизируют не менее 3 групп по 10 морских свинок в каждой группе. Не менее 3 аналогичных групп животных иммунизируют разными дозами референс-препарата, калиброванного в ME. Разведения вакцины и референс-препарата выбирают таким образом, чтобы наименьшая доза защищала от заражения не более 20%, а наибольшая доза — не менее 80% иммунизированных животных. Следует избегать разведений испытуемых образцов, при которых наблюдается гибель или выживаемость 100% иммунизированных животных. Через 28-30 сут иммунизированным животным вводят по 100 LD50 дифтерийного токсина. Наблюдение проводят в течение 5 сут, регистрируя число выживших животных в каждой группе, и рассчитывают для вакцины и референс-препарата величины ED50 (статистически определяемая доза вакцины или референс-препарата, защищающая от гибели 50% иммунизированных животных в течение 4 сут). На основании полученных результатов определяют количество ME в 1 мл вакцины.

Материалы и животные:
— референс-препарат (стандартный образец активности адсорбированного дифтерийного анатоксина, калиброванный в ME по соответствующему международному стандартному образцу); — испытуемая вакцина;
— дифтерийный токсин с предварительно установленной дозой LD50 (статистически определяемая доза токсина, вызывающая гибель 50% животных в течение 4 сут); — морские свинки массой 250-350 г обоего пола. Примечания.
1. Приготовление разведений референс-препарата. Референс-препарат разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида () и готовят не менее 3 последовательных разведений с двойным шагом (например: 1, 2 и 4 МЕ/мл). 2. Приготовление разведений вакцины. Разведения вакцины готовят, соблюдая те же условия, что и при приготовлении разведений референс-препарата.

Иммунизация животных.
Разведения референс-препарата и вакцины вводят морским свинкам по 1 мл подкожно в бок.

Введение дифтерийного токсина.
По истечении 28 сут всем иммунизированным животным вводят подкожно в область грудины 1 мл дифтерийного токсина, содержащего 100 LD50. Опыт сопровождают контролем величины LD50 дифтерийного токсина. Для этого неиммунизированным морским свинкам из той же партии, разделенным на 3 группы (не менее 5 свинок в каждой группе), вводят дифтерийный токсин в дозах 0,5, 1 и 2 LD50. За иммунизированными животными и животными контрольной группы наблюдают 4 сут, регистрируя число выживших в каждой группе. На основании полученных результатов производят расчет иммуногенной активности дифтерийного анатоксина с помощью статистических программ, включающих Probit analysis, или по формуле Кербера, определяя величины ED50 для референс-препарата (в ME) и испытуемой вакцины (в мл). Формула Кербера:

,

где: DN — величина максимальной из испытанных доз;

• логарифм кратности разведения (отношение большей дозы к следующей за ней меньшей дозе); Li — отношение количества выживших животных к общему числу животных, получивших данную дозу;
• сумма значений Li, найденных для всех испытуемых доз. LD50 токсина рассчитывают по той же формуле, в которой Li — отношение количества павших к общему числу животных, получивших данную дозу токсина.

Испытание считается проведенным правильно, если: — вычисленные значения ED50 для вакцины и референс-препарата находятся между значениями наибольшей и наименьшей дозы препаратов, введенных животным; — пределы доверительного интервала (Р = 0,95) не менее 50% и не более 200% от величины вычисленной активности; — разрешающая доза введенного дифтерийного токсина приблизительно равна 100 LD50.

Метод с одним разведением

Если при испытании не менее 10 серий вакцины подтверждена стабильность и соответствие требованиям нормативной документации показателя иммуногенности дифтерийного анатоксина, возможно использование метода с одним разведением. Принцип метода заключается в сравнении активности единичных разведений вакцины и референс-препарата, калиброванного в ME. По результатам ранее проведенных испытаний с 3 разведениями выбирают дозу референс-препарата, обеспечивающую выживаемость 10-20% иммунизированных животных при заражении разрешающей дозой токсина. Разведение вакцины осуществляют с таким расчетом, чтобы получить подтверждение того, что ее активность значительно выше минимально требуемой. Животных делят на 2 группы (не менее 12 животных в каждой), одну из которых иммунизируют вакциной, а другую — референс-препаратом. Препараты вводят подкожно в объеме 1 мл. Через 28 сут всем иммунизированным животным вводят разрешающую дозу дифтерийного токсина, равную 100 LD50, в объеме 1 мл. Опыт сопровождают контролем величины LD50 дифтерийного токсина. За животными наблюдают 4 сут, регистрируя число выживших в каждой группе. Результаты выражают как отношение числа выживших к общему числу морских свинок в группе, иммунизированных вакциной или референс-препаратом. В опытной группе количество выживших животных должно быть достоверно выше, чем в контроле. Достоверность различия определяют с помощью точного критерия Фишера (одностороннего, P < 0,05). При значении различия считаются недостоверными (табл.).

Таблица

Расчет значения доверительного интервала (P)

Группа
Количество испытуемых животных
Выжило
Пало
Всего
Опыт
a
b
T
Контроль
c
d
R
Всего
n+
n
N

Вычисление P проводят по формуле:

,

где: ! — знак факториала (означает произведение всех натуральных чисел от 1 до числа, стоящего перед знаком «!» включительно).

Если показатель иммуногенности дифтерийного анатоксина при испытании методом с одним разведением не соответствует требованиям нормативной документации, испытание повторяют методом множественных разведений.

---

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ

РАСПОРЯЖЕНИЕ
от 18 июня 2015 г. N 10-Р

О ФОРМИРОВАНИИ ЗАЯВКИ И РАЗМЕЩЕНИИ ГОСУДАРСТВЕННОГО ЗАКАЗА НА ПОСТАВКУ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ, МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ И СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ ПРОДУКТОВ ЛЕЧЕБНОГО ПИТАНИЯ ДЛЯ ДЕТЕЙ-ИНВАЛИДОВ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ В 2016 ГОДУ ОТДЕЛЬНЫХ КАТЕГОРИЙ ГРАЖДАН, ИМЕЮЩИХ ПРАВО НА ПОЛУЧЕНИЕ ГОСУДАРСТВЕННОЙ СОЦИАЛЬНОЙ ПОМОЩИ

Список изменяющих документов
(в ред. Приказа Минздрава МО от 23.09.2015 N 1342)

В соответствии с постановлениями Правительства Московской области от 01.02.2008 N 55/2 «О порядке реализации в Московской области полномочий Российской Федерации в области оказания государственной социальной помощи в виде набора социальных услуг, переданных для осуществления органам государственной власти субъектов Российской Федерации» (с последующими изменениями), от 29.12.2007 N 1064/48 «Об организации за счет средств бюджета Московской области лекарственного обеспечения отдельных категорий граждан, имеющих место жительства в Московской области» (с последующими изменениями), в целях своевременной подготовки и размещения государственного заказа на поставку лекарственных препаратов и медицинских изделий, специализированных продуктов лечебного питания для детей-инвалидов на 2016 год: 1. Утвердить порядок формирования заявки на лекарственные препараты, медицинские изделия, специализированные продукты лечебного питания для детей-инвалидов, необходимые для обеспечения отдельных категорий граждан, имеющих право на получение государственной социальной помощи (далее — Порядок) (приложение). 2. Начальникам Управлений координации деятельности медицинских и фармацевтических организаций NN 1-15 Министерства здравоохранения Московской области (далее — Министерства): 2.1. Сформировать с учетом потребности отдельных категорий граждан заявки на неспецифические лекарственные препараты и медицинские изделия для организации проведения закупок лекарственных препаратов по международным непатентованным наименованиям (далее — МНН) на 2016 год в соответствии с Порядком, утвержденным пунктом 1 настоящего распоряжения. 2.2. Представить в Управление организации лекарственной помощи согласованные и утвержденные сводные заявки на лекарственные препараты (по МНН), медицинские изделия, специализированные продукты лечебного питания для детей-инвалидов (на электронном и бумажном носителе) с обоснованием. Срок: 01.07.2015.
3. Главным внештатным специалистам Министерства здравоохранения Московской области согласно пункту 2 Порядка, утвержденного пунктом 1 настоящего распоряжения: 3.1. Сформировать заявки на специфические лекарственные препараты, медицинские изделия, специализированные продукты лечебного питания для детей-инвалидов на основании данных, представленных Управлениями координации деятельности медицинских и фармацевтических организаций NN 1-15 Министерства, для организации проведения закупок лекарственных препаратов (по МНН) и медицинских изделий. 3.2. Представить в Управление организации лекарственной помощи Министерства на бумажном и электронном носителях утвержденную сводную заявку на специфические лекарственные препараты (по МНН), медицинские изделия, специализированные продукты лечебного питания для детей-инвалидов с обоснованием. Срок: 06.07.2015.
4. Управлению организации лекарственной помощи Министерства: 4.1. Направить в Управления координации деятельности медицинских и фармацевтических организаций NN 1-15 Министерства в электронном виде перечень лекарственных препаратов (по МНН), медицинских изделий, специализированных продуктов лечебного питания для детей-инвалидов, подготовленный на основании проведенного анализа выполнения годовой потребности в лекарственных препаратах и медицинских изделий за 2014-2015 годы. Срок: 23.06.2015.
4.2. Сформировать сводную заявку по Московской области на лекарственные препараты (по МНН), медицинские изделия, специализированные продукты лечебного питания для детей-инвалидов на основании предложений по перечню и количеству лекарственных препаратов, медицинских изделий, специализированных продуктов лечебного питания для детей-инвалидов, представленных Управлениями координации деятельности медицинских и фармацевтических организаций NN 1-15 Министерства (далее — сводная заявка). Срок: 14.07.2015.
4.3. Направить сводную заявку в Комиссию Министерства по рассмотрению вопросов обеспечения лекарственными препаратами и медицинскими изделиями отдельных категорий граждан, имеющих право на получение государственной социальной помощи, проживающих на территории Московской области (далее — Комиссия). Срок: 17.07.2015.
4.4. Информировать о результатах работы Комиссии Управления координации деятельности медицинских и фармацевтических организаций NN 1-15 Министерства и главных внештатных специалистов Министерства. Срок: 18.07.2015.
4.5. Подготовить техническое задание и сформировать начальную максимальную цену на лекарственные препараты, медицинские изделия и специализированные продукты лечебного питания для детей-инвалидов в соответствии с утвержденной сводной заявкой на 2016 год. Срок 29.08.2015.
5. Комиссии рассмотреть и утвердить сводную заявку, представить в Управление организации лекарственной помощи Министерства перечень лекарственных препаратов (по МНН), медицинских изделий, специализированных продуктов лечебного питания для детей-инвалидов с согласованными объемами закупок (с учетом предусмотренных финансовых средств). Срок: 22.07.2015.
6. Планово-экономическому управлению Министерства представить в Управление организации лекарственной помощи Министерства информацию о планируемых объемах финансовых средств на закупку лекарственных препаратов, медицинских изделий, специализированных продуктов лечебного питания для детей-инвалидов в рамках прогнозных показателей бюджета на 2016 год. Срок: 22.06.2015.
7. ГКУ МО «Дирекция единого заказчика Министерства здравоохранения Московской области» подготовить необходимую документацию и провести процедуру закупок лекарственных препаратов, медицинских изделий, специализированных продуктов лечебного питания для детей-инвалидов на 2016 год в соответствии с действующим законодательством. Срок: 25.12.2015.
8. Возложить персональную ответственность за формирование заявки на специфические лекарственные препараты, медицинские изделия, специализированные продукты лечебного питания для детей-инвалидов на профильных главных специалистов Министерства. 9. Контроль за исполнением настоящего распоряжения оставляю за собой.

Министр здравоохранения
Московской области
H.B.СУСЛОНОВА

Приложение
к распоряжению Министерства
здравоохранения Московской области
от 18 июня 2015 г. N 10-Р

ПОРЯДОК
ФОРМИРОВАНИЯ ЗАЯВКИ НА ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ, МЕДИЦИНСКИЕ ИЗДЕЛИЯ, СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ ПРОДУКТЫ ЛЕЧЕБНОГО ПИТАНИЯ ДЛЯ ДЕТЕЙ-ИНВАЛИДОВ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ КАТЕГОРИЙ ГРАЖДАН, ИМЕЮЩИХ ПРАВО НА ПОЛУЧЕНИЕ ГОСУДАРСТВЕННОЙ СОЦИАЛЬНОЙ ПОМОЩИ

Список изменяющих документов
(в ред. Приказа Минздрава МО от 23.09.2015 N 1342)

1. Порядок предоставления заявки на неспецифические лекарственные препараты и медицинские изделия. Формировать заявки на неспецифические лекарственные препараты по МНН, медицинские изделия необходимо с учетом персонифицированного регистра лиц, имеющих право на получение государственной социальной помощи, при амбулаторном лечении которых лекарственные препараты и медицинские изделия отпускаются по рецептам врачей бесплатно. 1.1. Руководитель медицинской организации при получении потребности на необходимые лекарственные препараты и медицинские изделия обобщает и анализирует ее, формирует сводную потребность по медицинской организации на планируемый период. Заверенная подписью руководителя и печатью медицинской организации сводная потребность представляется в Управления координации деятельности медицинских и фармацевтических организаций NN 1-15 Министерства. 1.2. Управления координации деятельности медицинских и фармацевтических организаций NN 1-15 Министерства совместно со специалистами по основным нозологиям анализируют поступившую от всех медицинских организаций, осуществляющих лекарственное обеспечение отдельных категорий граждан, потребность и формируют сводную заявку по Управлениям. 1.3. С целью возможности применения компьютерной обработки данных формирование заявки необходимо осуществлять в предоставленном Министерством файле с перечнями лекарственных препаратов и медицинских изделий, не внося изменений в указанные перечни. 1.4. В случае необходимости внесения изменений и дополнений в предоставленные перечни Управлениям координации деятельности медицинских и фармацевтических организаций NN 1-15 Министерства следует сформировать и представить в Управление организации лекарственной помощи отдельные перечни для дальнейшего согласования. 1.5. Сформированная сводная заявка на лекарственные препараты и медицинские изделия (с обоснованием) представляется на бумажном и электронном носителях в Управление организации лекарственной помощи Министерства.
2. Порядок предоставления заявки на специфические лекарственные препараты, медицинские изделия и специализированные продукты лечебного питания для детей-инвалидов. 2.1. При формировании главными внештатными специалистами Министерства заявок на специфические лекарственные препараты (по МНН), медицинские изделия и специализированные продукты лечебного питания для детей-инвалидов, подготовленных на основании данных, представленных Управлениями координации деятельности медицинских и фармацевтических организаций NN 1-15 Министерства, а также на основании персонифицированных регистров пациентов, необходимо учесть потребность на все специфические лекарственные препараты, которые при амбулаторном лечении отпускаются по рецептам врачей бесплатно. 2.2. Сводные заявки по Московской области для проведения процедур закупок дорогостоящих специфических лекарственных препаратов, медицинских изделий и специализированных продуктов лечебного питания для детей-инвалидов главным внештатным специалистам Министерства необходимо формировать согласно стандартам медицинской помощи, а также на основании персонифицированного регистра лиц, имеющих право на получение государственной социальной помощи, в соответствии с Федеральным законом от 17.07.1999 N 178-ФЗ «О государственной социальной помощи» и Законом Московской области от 23.03.2006 N 36/2006-ОЗ «О социальной поддержке отдельных категорий граждан в Московской области». 2.3. Главным внештатным специалистам Министерства не позднее 7 дней с момента получения заявок на лекарственные препараты от Управлений координации деятельности медицинских и фармацевтических организаций NN 1-15 Министерства рассмотреть, согласовать заявки и представить экспертное заключение об объемах и структуре сводной заявки на бумажном и электронном носителях в Управление организации лекарственной помощи Министерства: главному внештатному специалисту-эндокринологу Древалю А.В. — для лечения эндокринологических заболеваний у взрослых; главному внештатному специалисту-эндокринологу Ивановой И.Е. — для лечения эндокринологических заболеваний у детей; главному внештатному специалисту-пульмонологу Островскому Е.И. — для лечения пульмонологических заболеваний, в т.ч. муковисцидоза у взрослых и детей; исключен. — Приказ Минздрава МО от 23.09.2015 N 1342; главному внештатному детскому специалисту-онкологу Варфоломеевой С.Р. — для лечения онкологических заболеваний у детей; главному внештатному специалисту-ревматологу Елонакову А.В. — для лечения ревматологических заболеваний у взрослых и детей; главному внештатному специалисту-гематологу Голенкову А.К. — для лечения онкогематологических, гематологических заболеваний, гемабластозы, цитопении, наследственных гемопатий у взрослых и детей; главному внештатному специалисту-гастроэнтерологу Белоусовой Е.А. — для лечения гепатоцеребральной дистрофии, неспецифического язвенного колита и болезни Крона у взрослых и детей; главному внештатному специалисту-терапевту Саниной Н.П. — для лечения терапевтических заболеваний; главному внештатному специалисту-психиатру Козлову А.А. — для лечения взрослых и детей, страдающих психическими расстройствами и расстройствами поведения (в т.ч. шизофренией); главному внештатному специалисту-кардиологу Глезер М.Г. — для лечения болезней, характеризующихся повышенным кровяным давлением у взрослых и детей; главному внештатному специалисту-гепатологу Богомолову П.О. — для лечения гепатитов В и С у взрослых и детей; главному внештатному специалисту-неврологу Котову С.В. — для лечения больных эпилепсией, рассеянным склерозом у взрослых и детей; главному внештатному специалисту по ВИЧ-инфекции и борьбе со СПИД Пронину А.Ю. — для лечения СПИД, ВИЧ-инфицированных взрослых и детей; главному внештатному специалисту-нефрологу Ватазину А.В. — для лечения нефрологических заболеваний у взрослых и детей; главному внештатному специалисту-дерматовенерологу Важбину Л.Б. — для лечения кожно-венерологических заболеваний у взрослых и детей; главному внештатному специалисту по трансплантации органов и тканей Ахметшину Р.Б. — для лечения взрослых и детей, перенесших трансплантацию органов и тканей; главному внештатному специалисту-фтизиатру Смердину С.В. — для лечения туберкулеза у взрослых; главному внештатному специалисту-фтизиатру Горовенко Л.А. — для лечения туберкулеза у детей; главному внештатному специалисту-педиатру Урсовой Н.И. — для лечения детей в возрасте до 3-х лет и до 6-ти лет из многодетных семей; главным специалистам по орфанным заболеваниям — заявку на лекарственные препараты и медицинские изделия для больных, страдающих орфанными заболеваниями, необходимо формировать согласно персонифицированному регистру пациентов, а также на основании данных, полученных от медицинских организаций регионального и федерального уровня. врио главного врача ГБУЗ МО «Московский областной онкологический диспансер» Меркулову А.Ф.; (введен Приказом Минздрава МО от 23.09.2015 N 1342) главному врачу ГБУЗ МО «Люберецкий онкологический диспансер» Лапынину Ю.Г.; (введен Приказом Минздрава МО от 23.09.2015 N 1342) главному врачу ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского» Палееву Ф.Н. (введен Приказом Минздрава МО от 23.09.2015 N 1342) 2.4. Формирование заявок необходимо осуществлять в предоставленном Министерством файле с перечнем лекарственных препаратов, медицинских изделий и специализированных продуктов лечебного питания для детей-инвалидов, дополняя (при необходимости) указанный перечень другими наименованиями препаратов.
3. Порядок предоставления дополнительных заявок на лекарственные препараты, медицинские изделия и специализированные продукты лечебного питания для детей-инвалидов для обеспечения вновь выявленных пациентов, а также пациентов, вернувших право на получение государственной социальной помощи в части лекарственного обеспечения и не включенных в основную заявку на 2016 год. 3.1. В случае необходимости лекарственного обеспечения вновь выявленных пациентов, а также пациентов, вернувших право на получение государственной социальной помощи в части лекарственного обеспечения и не включенных в основную заявку на 2016 год, осуществляются дополнительные закупки лекарственных препаратов, медицинских изделий и специализированных продуктов лечебного питания для детей-инвалидов в соответствии с Федеральным законом от 05.04.2013 N 44-ФЗ «О контрактной системе в сфере закупок товаров, работ, услуг для обеспечения государственных и муниципальных нужд». На период, необходимый для проведения конкурсных процедур (два месяца), лекарственное обеспечение осуществляется (при имеющейся возможности) за счет проторгованных объемов (путем досрочной поставки).

---