Общая фармакопейная статья «Алюминий. ОФС.1.2.2.2.0001.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том I») Общая фармакопейная статья «Общие реакции на подлинность. ОФС.1.2.2.0001.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том I») Общая фармакопейная статья «Автоматический элементный анализ. ОФС.1.2.1.0024.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том I») Общая фармакопейная статья «Электрофорез в полиакриламидном геле. ОФС.1.2.1.0023.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том I») Общая фармакопейная статья «Капиллярный электрофорез. ОФС.1.2.1.0022.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том I») Общая фармакопейная статья «Электрофорез. ОФС.1.2.1.0021.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том I») Общая фармакопейная статья «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами вып. 1. ОФС.1.1.0014.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том I») Статья. «А ввоз и ныне там» (И.Калиновский) («Фармацевтический вестник», 2015, N 35)
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Алюминий
ОФС.1.2.2.2.0001.15
Вводится впервые
Для определения примеси алюминия в лекарственных средствах используют метод флуориметрии (метод 1) и метод атомно-абсорбционной спектрометрии (метод 2).
Метод 1
Испытуемый раствор. Раствор испытуемого образца, приготовленный, как указано в фармакопейной статье. Эталонный раствор. Используют стандартный раствор алюминий-иона, указанный в фармакопейной статье. Контрольный раствор. Используют растворитель, указанный в фармакопейной статье. Испытуемый раствор помещают в делительную воронку, встряхивают с двумя порциями, по 20 мл каждая, раствора 5 г/л гидроксихинолина в хлороформе, затем с 10 мл этого же раствора. После прибавления каждой порции хлороформные слои отделяют, собирая в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора хлороформом до метки и перемешивают. Эталонный и контрольный растворы обрабатывают аналогично. Измеряют интенсивность флуоресценции испытуемого (I1), эталонного (I2) и контрольного растворов (I3) при длине волны возбуждения 392 нм и длине волны флуоресценции 518 нм. Флуоресценция испытуемого раствора (I1 — I3) не должна превышать флуоресценцию эталонного раствора (I2 — I3).
Стандартные растворы алюминий-иона
Стандартный раствор 200 мкг/мл алюминий-иона. Около 0,352 г (точная навеска) алюминия-калия сульфата додекагидрата, AlK(SO4)2 · 12H2O, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде, прибавляют 10 мл серной кислоты разведенной 9,8%, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Стандартный раствор 2 мкг/мл алюминий-иона. Стандартный раствор (200 мкг/мл алюминий-иона) разводят водой в 100 раз непосредственно перед использованием. Стандартный раствор 100 мкг/мл алюминий-иона. Около 8,947 г (точная навеска) алюминия хлорида гексагидрата, AlCl3 · 6Н2О, помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор разводят водой в 10 раз непосредственно перед использованием. Стандартный раствор 10 мкг/мл алюминий-иона. Около 1,390 г (точная навеска) алюминия нитрата нонагидрата, Al(NO3)3 · 9Н2О, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор разводят водой в 100 раз непосредственно перед использованием.
Примечания.
1. Определение содержания AlK(SO4)2 · 12Н2О в алюминия-калия сульфате. Около 0,45 г (точная навеска) алюминия-калия сульфата растворяют в 20 мл воды и проводят комплексонометрическое титрование алюминия. 1 мл натрия эдетата раствора 0,05 М соответствует 23,72 мг AlK(SO4)2 · 12Н2О. 2. Определение содержания AlCl3 · 6Н2О в алюминия хлориде. Около 0,25 г (точная навеска) алюминия хлорида растворяют в 25 мл воды и проводят комплексонометрическое титрование алюминия. 1 мл натрия эдетата раствора 0,05 М соответствует 12,07 мг AlCl3 · 6Н2О. 3. Определение содержания Al(NO3)3 · 9Н2О в алюминия нитрате. Около 0,35 г (точная навеска) алюминия нитрата растворяют в 20 мл воды и проводят комплексонометрическое титрование алюминия. 1 мл натрия эдетата раствора 0,05 М соответствует 18,76 мг Al(NO3)3 · 9Н2О.
Метод 2
Применяют для субстанций, предназначенных для использования в гемодиализе. Испытуемый раствор. Если не указано в фармакопейной статье, точную навеску испытуемой субстанции, содержащую от 1,2 до 3,8 мкг алюминий-иона, помещают в пластиковую мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл воды и обрабатывают ультразвуком в течение 30 мин. Прибавляют 4 мл азотной кислоты концентрированной, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Эталонные растворы. Алюминиевую проволоку опускают в хлористоводородной кислоты раствор 6 М, нагретый до 80 °С, на несколько минут. Около 0,1 г (точная навеска) обработанной проволоки растворяют в смеси 10 мл хлористоводородной кислоты 25% и 2 мл азотной кислоты концентрированной при температуре около 80 °С в течение примерно 30 мин. Продолжают нагревание, пока объем смеси не уменьшится приблизительно до 4 мл. Охлаждают смесь до комнатной температуры и прибавляют 4 мл воды. Выпаривают при нагревании до объема приблизительно 2 мл. Раствор охлаждают, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Затем 10 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 1,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Далее 1,0, 2,0 и 4,0 мл полученного раствора помещают в отдельные мерные колбы вместимостью 100 мл, доводят объемы растворов разбавленным раствором азотной кислоты (см. Примечание) до метки и перемешивают (0,01, 0,02 и 0,04 мкг/мл алюминий-иона, соответственно). Измеряют поглощение испытуемого и эталонных растворов при спектральной линии излучения алюминия при 309,3 нм на атомно-абсорбционном спектрометре, оснащенном лампой с алюминиевым полым катодом, беспламенной электрической печью, используя разбавленный раствор азотной кислоты в качестве контрольного раствора. Определяют концентрацию алюминия в испытуемом растворе по градуировочному графику, построенному по эталонным растворам, и рассчитывают содержание алюминия в испытуемой субстанции. Примечание. Приготовление разбавленного раствора азотной кислоты. 40 мл азотной кислоты концентрированной помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Общие реакции на подлинность
ОФС.1.2.2.0001.15
Взамен ГФ X
Взамен ст. ГФ XI, вып. 1
Алюминий. Около 15 мг лекарственного средства растворяют в 2 мл воды. К полученному раствору или к 2 мл раствора, приготовленного как указано в фармакопейной статье, прибавляют 0,5 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3% и 0,5 мл реактива тиоацетамида; осадок не образуется. Затем по каплям прибавляют натрия гидроксида раствор 8,5%; образуется гелеобразный белый осадок, растворимый при последующем прибавлении натрия гидроксида раствора 8,5%. Постепенно прибавляют аммония хлорида раствор 10%; снова образуется гелеобразный белый осадок.
Амины ароматические первичные. Около 50 мг лекарственного средства растворяют в 1 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3%, нагревают при необходимости, охлаждают во льду, прибавляют 2 мл натрия нитрита раствора 1%; полученный раствор прибавляют к 1 мл щелочного раствора -нафтола, содержащего 0,5 г натрия ацетата; образуется осадок от желто-оранжевого до оранжево-красного цвета. Примечание. Приготовление щелочного раствора -нафтола, содержащего 0,5 г натрия ацетата. 2 г -нафтола растворяют в 40 мл натрия гидроксида раствора 10% и прибавляют 0,5 г натрия ацетата. После растворения доводят объем раствора водой до 100 мл и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
Аммоний. 1 мл раствора соли аммония (2 — 6 мг аммоний-иона) нагревают с 0,5 мл натрия гидроксида раствора 1.0%; выделяется аммиак, обнаруживаемый по запаху и по посинению влажной красной лакмусовой бумаги.
Ацетаты.
А. 2 мл раствора ацетата (20 — 60 мг ацетат-иона) нагревают с равным количеством серной кислоты концентрированной и 0,5 мл спирта 96%; появляется характерный запах этилацетата. Б. К 2 мл нейтрального раствора ацетата (20 — 60 мг ацетат-иона) прибавляют 0,2 мл железа(III) хлорида раствора 3%; появляется красно-бурое окрашивание, исчезающее при прибавлении разведенных минеральных кислот.
Бензоаты. К 2 мл нейтрального раствора бензоата (10 — 20 мг бензоат-иона) прибавляют 0,2 мл железа(III) хлорида раствора 3%; образуется розовато-желтый осадок, растворимый в эфире.
Бромиды.
А. К 1 мл раствора бромида (2 — 30 мг бромид-иона) прибавляют 1 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3%, 0,5 мл хлорамина раствора 5%, 1 мл хлороформа и взбалтывают; хлороформный слой окрашивается в желто-бурый цвет. Б. К 2 мл раствора бромида (2 — 10 мг бромид-иона) прибавляют 0,5 мл азотной кислоты разведенной 16% и 0,5 мл серебра нитрата раствора 2%; образуется желтоватый творожистый осадок, нерастворимый в азотной кислоте разведенной 16% и трудно растворимый в аммиака растворе 10%.
Висмут.
А. Указанное в фармакопейной статье количество лекарственного средства (около 50 мг висмут-иона) взбалтывают с 3 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3% и фильтруют. К фильтрату прибавляют 1 мл натрия сульфида раствора 2%; образуется коричневато-черный осадок, растворимый при прибавлении равного объема азотной кислоты концентрированной. Б. Указанное в фармакопейной статье количество лекарственного средства (около 50 мг висмут-иона) взбалтывают с 5 мл серной кислоты разведенной 16% и фильтруют. К фильтрату прибавляют две капли калия йодида раствора 10%; образуется черный осадок, растворимый в избытке реактива с образованием раствора желтовато-оранжевого цвета.
Железо(II). К 2 мл раствора соли железа(II) [около 20 мг железо(II)-иона] прибавляют 0,5 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3% и 1 мл калия феррицианида раствора 5%; образуется синий осадок.
Железо(III).
А. К 2 мл раствора соли железа(III) [около 1 мг железо(III)-иона] прибавляют 0,5 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3% и 1 — 2 капли калия ферроцианида раствора 5%; образуется синий осадок. Б. К 2 мл раствора соли железа(III) [около 1 мг железо(III)-иона] прибавляют 0,5 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3% и 1 — 2 капли аммония тиоцианата раствора 5%; появляется красное окрашивание.
Йодиды.
A. К 2 мл раствора йодида (3 — 20 мг йодид-иона) прибавляют 0,2 мл серной кислоты разведенной 16%, 0,2 мл натрия нитрита раствора 10% или железа(III) хлорида раствора 3% и 2 мл хлороформа; при взбалтывании хлороформный слой окрашивается в фиолетовый цвет. Б. К 2 мл раствора йодида (2 — 10 мг йодид-иона) прибавляют 0,5 мл азотной кислоты разведенной 16% и 0,5 мл серебра нитрата раствора 2%; образуется желтый творожистый осадок, нерастворимый в азотной кислоте разведенной 16% и аммиака растворе 10%. B. При нагревании 0,1 г лекарственного средства с 1 мл серной кислоты концентрированной выделяются пары фиолетового цвета.
Калий.
А. К 2 мл раствора соли калия (10 — 20 мг калий-иона) прибавляют 1 мл винной кислоты раствора 20%, 1 мл натрия ацетата раствора 10%, 0,5 мл спирта 96% и встряхивают; постепенно образуется белый кристаллический осадок, растворимый в разведенных минеральных кислотах и растворах гидроксидов щелочных металлов. Б. К 2 мл раствора соли калия (5-10 мг калий-иона), предварительно прокаленной для удаления солей аммония, прибавляют 0,5 мл уксусной кислоты разведенной 30% и 0,5 мл 10% раствора натрия кобальтинитрита; образуется желтый кристаллический осадок. В. Соль калия, внесенная в бесцветное пламя, окрашивает его в фиолетовый цвет или при рассматривании через синее стекло — в пурпурно-красный.
Кальций.
А. К 1 мл раствора соли кальция (2 -20 мг кальций-иона) прибавляют 1 мл аммония оксалата раствора 4%; образуется белый осадок, нерастворимый в уксусной кислоте разведенной 30% и аммиака растворе 10%, растворимый в разведенных минеральных кислотах. Б. Соль кальция, смоченная хлористоводородной кислотой 25% и внесенная в бесцветное пламя, окрашивает его в кирпично-красный цвет.
Карбонаты (гидрокарбонаты).
A. К 0,2 г карбоната (гидрокарбоната) или к 2 мл раствора карбоната (гидрокарбоната) (1:10) прибавляют 0,5 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3%; выделяется газ, при пропускании которого через раствор кальция гидроксида образуется белый осадок. Б. К 2 мл раствора карбоната (1:10) прибавляют 5 капель насыщенного раствора магния сульфата; образуется белый осадок (гидрокарбонат образует осадок только при кипячении смеси). B. Раствор карбоната (1:10) при прибавлении одной капли фенолфталеина раствора 1% окрашивается в красный цвет (отличие от гидрокарбоната).
Магний. К 1 мл раствора соли магния (2-5 мг магний-иона) прибавляют 1 мл аммония хлорида раствора 10%, 1 мл аммиака раствора 10% и 0,5 мл натрия фосфата раствора 5%; образуется белый кристаллический осадок, растворимый в разведенных минеральных кислотах и уксусной кислоте.
Мышьяк.
1. Арсениты.
А. К 0,3 мл раствора соли мышьяка(III) (около 30 мг арсенит-иона) прибавляют 0,5 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3% и две капли натрия сульфида раствора 2%; образуется желтый осадок, нерастворимый в хлористоводородной кислоте концентрированной, растворимый в аммиака растворе 10%. Б. К 0,3 мл раствора соли мышьяка(III) (около 3 мг арсенит-иона) прибавляют 1-2 капли серебра нитрата раствора 2%; образуется желтый осадок, растворимый в азотной кислоте разведенной 16% и аммиака растворе 10%. 2. Арсенаты.
A. К 0,3 мл раствора соли мышьяка(V) (около 30 мг арсенат-иона) прибавляют 0,5 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3%, две капли натрия сульфида раствора 2% и нагревают; образуется желтый осадок, нерастворимый в хлористоводородной кислоте концентрированной, растворимый в аммиака растворе 10%. Б. К 0,3 мл раствора соли мышьяка(V) (около 1 мг арсенат-иона) прибавляют 1-2 капли серебра нитрата раствора 2%; образуется коричневый осадок, растворимый в азотной кислоте разведенной 16% и аммиака растворе 10%. B. К 0,3 мл раствора соли мышьяка(V) (около 1 мг арсенат-иона) прибавляют 1 мл аммония хлорида раствора 10%, 1 мл аммиака раствора 10% и 1 мл магния сульфата раствора 10%; образуется белый кристаллический осадок, растворимый в хлористоводородной кислоте разведенной 8,3% (отличие от арсенитов).
Натрий.
А. К 2 мл раствора натриевой соли (7 — 10 мг натрий-иона) прибавляют 2 мл калия карбоната раствора 15% и нагревают до кипения; осадок не образуется. К раствору прибавляют 4 мл раствора калия пироантимоната и нагревают до кипения. Охлаждают в ледяной воде и при необходимости потирают внутренние стенки пробирки стеклянной папочкой; образуется плотный осадок белого цвета. Б. Соль натрия, смоченная хлористоводородной кислотой 25% и внесенная в бесцветное пламя, окрашивает его в желтый цвет.
Нитраты.
A. К лекарственному средству (около 1 мг нитрат-иона) прибавляют две капли раствора дифениламина; появляется синее окрашивание. Б. К лекарственному средству (2 — 5 мг нитрат-иона) прибавляют по 2 -3 капли воды и серной кислоты концентрированной, 0,05 — 0,10 г металлической меди и нагревают; выделяются пары бурого цвета. B. Нитраты (около 2 мг нитрат-иона) не обесцвечивают раствор калия перманганата 0,1%, подкисленный серной кислотой разведенной 16% (отличие от нитритов).
Нитриты.
A. К лекарственному средству (около 1 мг нитрит-иона) прибавляют две капли раствора дифениламина; появляется синее окрашивание. Б. К лекарственному средству (около 30 мг нитрит-иона) прибавляют 1 мл серной кислоты разведенной 16%; выделяются желто-бурые пары (отличие от нитратов). B. Несколько кристаллов феназона растворяют в фарфоровой чашке в двух каплях хлористоводородной кислоты разведенной 8,3%, прибавляют две капли раствора нитрита (около 1 мг нитрит-иона); появляется зеленое окрашивание (отличие от нитратов).
Ртуть(II).
А. К 2 мл раствора соли ртути(II) [около 50 мг ртуть(II)-иона] прибавляют 0,5 мл натрия гидроксида раствора 10%; образуется желтый осадок. Б. К 1 мл раствора соли ртути(II) [10 — 30 мг ртуть(II)-иона] прибавляют осторожно по каплям калия йодида раствор 10%; образуется красный осадок, растворимый в избытке реактива.
Салицилаты. К 2 мл нейтрального раствора салицилата (2 — 10 мг салицилат-иона) прибавляют 2 капли железа(III) хлорида раствора 3%; появляется сине-фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание, которое сохраняется при прибавлении небольшого количества уксусной кислоты разведенной 30%, но исчезает при прибавлении хлористоводородной кислоты разведенной 8,3%. При этом образуется белый кристаллический осадок.
Сульфаты. К 2 мл раствора сульфата (5 — 50 мг сульфат-иона) прибавляют 0,5 мл бария хлорида раствора 5%; образуется белый осадок, нерастворимый в разведенных минеральных кислотах.
Сульфиты.
А. К 2 мл раствора сульфита (10-30 мг сульфит-иона) прибавляют 2 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3% и встряхивают; постепенно выделяется сернистый газ, обнаруживаемый по характерному резкому запаху. Б. К 2 мл раствора сульфита (2 — 20 мг сульфит-иона) прибавляют 0,5 мл бария хлорида раствора 5%; образуется белый осадок, растворимый в хлористоводородной кислоте разведенной 8,3% (отличие от сульфатов).
Тартраты.
А. К 1 мл раствора тартрата (около 20 мг тартрат-иона) прибавляют кристаллик калия хлорида, 0,5 мл спирта 96%; образуется белый кристаллический осадок, растворимый в разведенных минеральных кислотах и растворах гидроксидов щелочных металлов. Б. 0,25 мл раствора тартрата (около 5 мг тартрат-иона) нагревают с 1 мл серной кислоты концентрированной и несколькими кристаллами резорцина; через 15 — 30 с появляется вишнево-красное окрашивание.
Фосфаты.
А. К 1 мл раствора фосфата (10 — 30 мг фосфат-иона), нейтрализованного до рН около 7,0 прибавляют несколько капель серебра нитрата раствора 2%; образуется желтый осадок, растворимый в азотной кислоте разведенной 16% и аммиака растворе 10%. Б. К 1 мл раствора фосфата (10-30 мг фосфат-иона) прибавляют 1 мл аммония хлорида раствора 10%, 1 мл аммиака раствора 10% и 0,5 мл магния сульфата раствора 10%; образуется белый кристаллический осадок, растворимый в разведенных минеральных кислотах. В. К 1 мл раствора фосфата (10-30 мг фосфат-иона) в азотной кислоте разведенной 16% прибавляют 2 мл аммония молибдата раствора 10% и нагревают; образуется желтый кристаллический осадок, растворимый в аммиака растворе 10%,
Хлориды. К 2 мл раствора хлорида (2 — 10 мг хлорид-иона) прибавляют 0,5 мл азотной кислоты разведенной 16% и 0,5 мл серебра нитрата раствора 2%; образуется белый творожистый осадок, нерастворимый в азотной кислоте разведенной 16% и растворимый в аммиака растворе 10%. Для солей органических оснований испытание растворимости образовавшегося осадка проводят после отфильтровывания и промывания осадка водой.
Цинк.
А. К 2 мл нейтрального раствора соли цинка (5 — 20 мг цинк-иона) прибавляют 0,5 мл натрия сульфида раствора 2%; образуется белый осадок, нерастворимый в уксусной кислоте разведенной 30% и легко растворимый в хлористоводородной кислоте разведенной 8,3%. Б. К 2 мл раствора соли цинка (5 — 20 мг цинк-иона) прибавляют 0,5 мл калия ферроцианида раствора 5%; образуется белый осадок, нерастворимый в хлористоводородной кислоте разведенной 8,3%.
Цитраты.
А. К 1 мл нейтрального раствора цитрата (2 — 10 мг цитрат-иона) прибавляют 1 мл кальция хлорида раствора 20%; раствор остается прозрачным; при кипячении образуется белый осадок, растворимый в хлористоводородной кислоте разведенной 8,3%. Б. К лекарственному средству (1 — 2 мг цитрат-иона) прибавляют 0,5 мл уксусного ангидрида и нагревают; через 20 — 40 с появляется красное окрашивание.
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Автоматический элементный анализ
ОФС.1.2.1.0024.15
Вводится впервые
Метод автоматического элементного анализа основан на высокотемпературном (от 1100 до 1800 °С) окислительном разложении исследуемых веществ с последующим хроматографическим определением компонентов образовавшейся газовой смеси. Метод автоматического элементного анализа может быть использован для определения содержания активного вещества в фармацевтических субстанциях, в состав молекул которых входят углерод (С), водород (Н), азот (N) или сера (S), на основании данных элементного анализа на любой из этих элементов. Применение метода элементного анализа для определения других элементов должно быть описано в фармакопейной статье, Метод может быть использован и для целей идентификации действующего вещества на основе установления его брутто-формулы. Для определения содержания элементов С, Н, N и S в субстанциях проводят высокотемпературное окислительное разложение в потоке гелия, либо его смеси с кислородом в присутствии катализатора окисления. Последующее восстановление оксидов азота до молекулярного азота в присутствии катализатора восстановления и определение образующихся продуктов (СО2, Н2О, N2, SO2), соответствующих определяемым элементам, проводят методом газовой хроматографии. Метод элементного анализа может быть применен и для определения содержания активного вещества в лекарственных препаратах, но только на основании определения азота, входящего в состав молекулы фармацевтической субстанции, при условии отсутствия азота в молекулах вспомогательных веществ. Вследствие присутствия наполнителей при окислительном разложении лекарственных препаратов образуется большое количество углерода диоксида (СО2), мешающего определению азота. В связи с этим газохроматографическое определение азота проводится после предварительного поглощения углерода диоксида (вместе с серы диоксидом) и воды. В качестве катализатора окисления обычно используют меди(II) оксид (CuO) с добавкой ванадия (V) оксида (V2O5) или посеребренного кобальта(II, III) оксида (Co3О4). В качестве катализатора восстановления используют электролитическую медь. Применение других катализаторов должно быть указано в фармакопейной статье. Для поглощения диоксидов углерода и серы (СО2 и SO2) используют ловушки с натронной известью, воды — с ангидроном или освобождаются от воды в соединительных трубках, стенки которых селективно проницаемы для воды. Метод применим для анализа как твердых, так и жидких лекарственных средств.
Оборудование
Определение проводят на приборе «автоматический элементный анализатор», основными составными частями которого являются: ультрамикровесы, узел ввода пробы — автодозатор капсулированных (запечатанных в контейнеры из оловянной фольги) проб анализируемых образцов, окислительный и восстановительный реакторы, помещенные в электропечь, ловушки (поглотители), хроматографическая колонка, детектор по теплопроводности и система для обработки данных и управления прибором.
Методика
При анализе твердых лекарственных средств их предварительно тщательно растирают в агатовой ступке. В качестве стандартных образцов используют ацетанилид, цистеин, метионин с установленным содержанием элементов — стандартные образцы для микроанализа. Точные навески (от 0,5 до 1,5 мг стандартного образца или субстанции или от 1,0 до 5,0 мг препарата), взятые на ультрамикровесах с точностью до 0,001 мг, помещают в предварительно взвешенные пустые оловянные контейнеры. Запечатывают контейнеры с помощью специального устройства, взвешивают капсулированные образцы и помещают в кассету автодозатора. При увеличении объемов катализаторов окисления и восстановления навеска может быть увеличена в 5-10 раз, при этом точность взвешивания может составлять 0,01 мг. Проводят контрольный опыт, для чего с помощью автодозатора в реактор вбрасывают пустые оловянные контейнеры (количество проб не больше трех); при этом регистрируется содержание определяемого элемента для каждой из них. Затем последовательно сжигают по 3-4 навески капсулированных образцов (стандартного и испытуемого). По полученным значениям площадей пиков стандартных образцов с учетом значения контрольного опыта автоматически строится градуировочный график и рассчитывается поправочный коэффициент K к площади пика определяемого элемента по формуле:
,
где: у — содержание определяемого элемента в стандартном образце, %; So — площадь пика на хроматограмме стандартного образца; Sк — площадь пика на хроматограмме контрольного опыта; ао — навеска стандартного образца, мг.
Содержание определяемого элемента в испытуемом образце лекарственного средства (субстанции, препарате) в процентах (Xэ) автоматически рассчитывается по формуле;
,
где: S — площадь пика на хроматограмме испытуемого образца; а — навеска порошка лекарственного средства (для субстанции в пересчете на сухое иди безводное вещество), мг.
Содержание лекарственного вещества в субстанции в процентах (X) вычисляют по формуле:
,
где: М.м. — молекулярная масса лекарственного вещества; А.м. — атомная масса определяемого элемента; n — число атомов определяемого элемента в молекуле лекарственного вещества.
Содержание лекарственного вещества в одной дозе препарата в миллиграммах (X) вычисляют по формуле:
где G — средняя масса одной дозы препарата, мг.
Примечания.
1. Навеску анализируемого лекарственного средства выбирают такой, чтобы количество определяемого элемента, образовавшееся в результате сжигания навески испытуемого образца, было близко к количеству, образующемуся при сжигании навески стандартного образца. 2. Используемые реактивы:
Ацетанилид, цистеин, метионин — стандартные образцы для элементного анализа. Меди(II) оксид (CuO). (М.м. 79,545). Кусочки проволоки длиной 1-3 мм, толщиной около 1 мм, серого цвета. Поставляется фирмой-производителем элементного анализатора. Кобальта(II,III) оксид (Со3О4) посеребрянный. Гранулы черного цвета диаметром около 1 мм. Поставляется фирмой-производителем элементного анализатора. Ангидрон. Mg (ClO4)2. (М.м. 223,20). Магния перхлорат. Белая пористая масса, очень энергично поглощающая влагу (до 60% от своей массы) с образованием кристаллогидрата Mg (ClO4)2·6H2O; растворяется в воде с выделением теплоты, при поглощении воды не расплывается. Применяется для глубокой осушки газов от воды. Может быть обезвожен нагреванием в вакууме до 200-250 °С и повторно использован. Натронная известь. Смесь натрия гидроксида NaOH и гашеной извести Сa(OH)2. Натровая известь. Натристая известь. Белая пористая масса. Поглощает воду (влагу) и углерода диоксид из воздуха, переходя в смесь карбонатов натрия и кальция.
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Электрофорез в полиакриламидном геле
ОФС.1.2.1.0023.15
Вводится впервые
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод молекулярной биологии и биохимии — электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), используемый для разделения белков и нуклеиновых кислот, который основан на движении заряженных биологических макромолекул в постоянном электрическом поле. Разделение в полиакриламидном геле происходит за счет различий заряда разделяемых молекул и отличий молекулярных масс, а также в зависимости от конфигурации молекул. Изменяя концентрацию полимера, можно получать гели с широким диапазоном размеров пор, позволяющих проводить разделение белков и пептидов с молекулярными массами от 2 до 300 тыс. кДа, Можно также изменять электрический заряд макромолекул (путем вариации рН буферного раствора) и их конформацию за счет введения в буферный раствор денатурирующих агентов или детергентов. Протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла, поэтому следует обеспечивать теплоотвод и стабильность температурного режима с целью исключения изменений вязкости, проводимости и скорости потока и, следовательно, искажения зон анализируемых компонентов. Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые молекулы, но не взаимодействуют с ними, причем скорость миграции наиболее подвижных макромолекул пробы должна быть несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда фронт красителя достигает противоположной границы геля, электрофорез прекращают. Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и выдерживают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты фиксируются в том самом месте, где закончилась их миграция. После фиксации или одновременно с ней проводят окрашивание зон путем выдерживания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют. Вместо окрашивания или наряду с ним могут использоваться радиоактивные метки и приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков.
Характеристики полиакриламидных гелей
Гель полиакриламида имеет ряд преимуществ, определяющих его широкое использование. Он прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры, нерастворим в большинстве растворителей, и, наконец, в нем практически отсутствуют адсорбция и электроосмос. Разделяющие свойства полиакриламидных гелей (ПААГ) определяются трехмерной сетью волокон и пор, которая сформирована за счет бифункциональных бисакриламидных связей между смежными полиакридамидными цепями. Полимеризация катализируется системой, производящей свободные радикалы, составленной из аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина. С увеличением концентрации акриламида в геле эффективный размер пор уменьшается. Эффективный размер пор геля определяет его разделяющие свойства, то есть сопротивление геля к перемещению макромолекул. Существуют пределы концентраций акриламида, которые могут использоваться. При высоких концентрациях акриламида гели становятся более ломкими и трудны в обращении. С уменьшением размера пор геля уменьшается скорость перемещения белка через гель. Регулируя размер пор геля путем изменения концентрации акриламида, можно оптимизировать разрешающую способность метода для конкретного анализируемого образца. Таким образом, физическое состояние ПААГ характеризуется по составу акриламида и бисакриламида. Обычно используются гели, в которых общая концентрация мономера и сшивающего агента находится в диапазоне от 3 до 30%, а количество сшивающего агента обычно составляет от одной десятой до одной двадцатой от количества мономера. При этом содержание сшивающего агента тем меньше, чем выше общая концентрация геля.
Электрофорез белков в полиакриламидных гелях с натрия додецилсульфатом
Электрофорез в полиакриламидных гелях с использованием натрия додецилсульфата (SDS) — наиболее распространенный способ электрофореза, используемый для оценки подлинности и чистоты белковых продуктов. Денатурированные под воздействием высокой температуры полипептиды, связываясь с анионным детергентом SDS, становятся отрицательно заряженными и приобретают конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы независимо от типа белка. Поскольку количество связанного SDS почти всегда пропорционально молекулярной массе полипептида и не зависит от последовательности аминокислот в полипептиде, SDS-полипептидные комплексы мигрируют через полиакриламидные гели с подвижностью, прямо пропорциональной молекулярной массе полипептида. Молекулярная масса белка может быть оценена но его относительной подвижности на прокалиброванном геле, и обнаружение отдельной полосы в таком геле является критерием чистоты. Однако, наличие у полипептида радикалов типа N- или О-связанных гликозидов оказывает существенное влияние на оценку молекулярной массы белка, поскольку SDS не связывается с углеводной частью молекулы так же, как с полипептидной. Таким образом, пропорциональность отношения «заряд к массе» не выдерживается и электрофоретическая подвижность белков, подвергшихся посттрансляционным модификациям, не является истинным отражением молекулярной массы полипептидной цепи.
Восстанавливающие условия
Трехмерная структура белков часто поддерживается за счет дисульфидных связей. Цель анализа SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях состоит в том, чтобы разрушить эту структуру путем расщепления дисульфидных связей. Денатурация и дезагрегация белков заключается в обработке их 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом (DTT), в результате которой происходит разрыв S-S связей, разворачивание полипептидной цепи и последующее связывание с SDS. В этих условиях молекулярная масса полипептидных субъединиц может быть рассчитана методом линейной регрессии при использовании подходящих стандартов молекулярных масс.
Невосстанавливающие условия
Без обработки восстанавливающими агентами типа 2-меркаптоэтанола или DTT дисульфидные ковалентные связи остаются неповрежденными и разделения на полипептидные субъединицы не происходит. Невосстановленные белки не могут полностью насыщаться SDS и, следовательно, не могут связывать детергент в постоянном массовом отношении. Это делает определение молекулярных масс этих молекул методом SDS-ПААГ менее стандартизованным, чем исследование полностью денатурированных полипептидов. Однако, выявление одной полосы в таком геле (т.е. отсутствие любых компонентов, отличных от основного компонента) является показателем чистоты белка. Электрофорез белков в полиакриламидных гелях с натрия додецилсульфатом (SDS-PAGE), как правило, проводится в неоднородной буферной системе, которая описывается ниже.
Электрофорез в геле с неоднородной буферной системой (диск-электрофорез)
Метод диск-электрофореза, благодаря своей высокой разрешающей способности, рекомендуется для характеристики смесей белков и для обнаружения примесей, которые могут иметь подвижность, близкую к подвижности главного компонента. Метод подразумевает использование прерывистой системы, состоящей из двух отличных гелей: разделяющего (нижнего) геля и концентрирующего (верхнего) геля. Эти два геля имеют различную пористость (верхний — крупнопористый, нижний — мелкопористый). Кроме степени пористости, эти два геля резко различаются по рН и молярности буферов, в которых они полимеризуются. Пористость, длина и тип буфера для нижнего геля определяются точно такими же соображениями, что и для простого непрерывного электрофореза. Отличительной особенностью данного вида электрофореза является обязательное использование в составе электродного буферного раствора подвижных ионов, мигрирующих в том же направлении, что и белки; например, применение иона Cl- для щелочных буферных растворов или иона K+ — для кислых. В этом буферном растворе подвижность иона, мигрирующего в том же направлении, что и белок, должна сильно зависеть от рН. Для этого удобно использовать цвиттерионы: например, простые аминокислоты (глицин и р-аланин). Их изоэлектрические точки лежат в нейтральной области рН (для глицина рI = 5,97). Под действием электрического поля ионы глицина, входящие в состав электродного буферного раствора, следуют за белками в концентрирующий гель. Область перемещающихся границ быстро формируется под действием высоко подвижных хлорид-ионов во фронте и относительно медленных замыкающих ионов глицина. Хлорид-ион из-за его небольшого размера мигрирует быстрее, чем любой из белков, присутствующих в образце. Величина рН образца и концентрирующих слоев выбирается так, чтобы быть приблизительно на 3 единицы ниже, чем верхнее значение рКа глицина. Поэтому, на пересечении этих слоев только около 0,1% глициновых молекул имеют отрицательный заряд. Таким образом, быстродвижущиеся хлорид-ионы постепенно замещаются ионами глицина, которые при рН 6,8 в концентрирующем геле нейтрализуются и перестают участвовать в проведении тока. Сопротивление верхней части концентрирующего геля резко возрастает, а вместе с ним возрастает и напряженность поля. Локализованные зоны высоковольтового градиента между передним и задним ионными фронтами вызывают относительно высокую скорость миграции белков в концентрирующем геле, которая не ограничивается благодаря крупнопористой структуре этого геля. На границе концентрирующего и разделяющего гелей белки достигают высокоплотных слоев геля и замедляются из-за уменьшающегося размера пор разделяющего геля. Более высокое значение рН, с которым фронт электродного буферного раствора встречается в разделяющем геле, также заставляет глицинат мигрировать быстрее, и напряженность поля падает, что также снижает скорость движения белков. Таким образом, происходит концентрирование пробы и все компоненты образца, независимо от первоначальной высоты столбика пробы в лунке, входят в нижний гель практически одновременно в виде узкой зоны с высокой концентрацией белка. В мелкопористом разделяющем геле начинается процесс медленной миграции белков и их фракционирования в зависимости от молекулярных масс, а то обстоятельство, что процесс разделения начинается с узкой исходной зоны, обеспечивает высокую разрешающую способность системы в целом.
Оборудование
Прибор для электрофореза состоит из:
1) источника постоянного тока с регулируемым напряжением и со стабилизатором напряжения; 2) камеры для электрофореза, служащей для размещения пластинки или трубки геля и поддержания постоянных условий проведения анализа. Камера обычно имеет прямоугольную форму, изготовлена из стекла или твердой пластмассы с двумя изолированными буферными резервуарами (анодным и катодным), содержащими раствор электролита. В каждый резервуар погружен электрод (например, платиновый), подключенный к соответствующему полюсу источника тока. Должен поддерживаться одинаковый уровень электролитов в резервуарах, чтобы предотвратить поток жидкости и гидростатическое давление на гель. Камера для электрофореза оснащена крышкой, которая предотвращает испарение растворителей и обеспечивает равномерно насыщенную влагой атмосферу во время всего процесса. Предпочтительно использование предохранителя для отключения электропитания, когда крышка камеры снята. Если мощность тока, приложенного к электрофоретической пластинке, превышает 10 Вт, то рекомендуется применять охлаждение камеры; 3) устройства для заливки геля, представляющего собой стеклянную трубку, стеклянную пластину или пару прямоугольных пластин (ячейку), служащих для формирования поддерживающей среды, в которой непосредственно проводится процесс электрофоретического разделения. Пластины могут быть расположены в камере вертикально или горизонтально (вариант горизонтального электрофореза обычно применяется для агарозных гелей) и должны быть погружены или иметь контакт посредством фитилей с катодным и анодным изолированными буферными резервуарами, содержащими раствор электролита. Преимуществом пластин для проведения процесса является возможность сравнения образцов в одной общей ячейке геля, что более информативно по сравнению с набором гелей из ряда трубок. Преимущество горизонтальных пластин по сравнению с вертикальными заключается в отсутствии проблемы герметизации швов, а недостаток — в большой поверхности контакта с воздухом и, соответственно, риске испарения жидкости. Сборку прибора и его очистку после использования проводят в соответствии с инструкцией производителя. Перед заливкой геля основание и боковые стороны ячейки закрывают подходящими прокладками, толщина которых определяет толщину рабочего геля (при этом после полимеризации геля прокладку в основании убирают). Ячейку заполняют раствором мономера с поперечно-сшивающим агентом и катализатором. Растворы должны быть дегазированы перед полимеризацией и гели должны использоваться свежеприготовленными. Заливку растворов проводят таким образом, чтобы исключить попадание внутрь ячейки пузырьков воздуха. Гребенку, имеющую зубцы соответствующего размера (в зависимости от объемов наносимого образца), устанавливают в верхнюю часть ячейки на разделяющий гель и оставляют там до окончания полимеризации геля. Формирование геля обычно занимает не менее 30 мин и может считаться законченным, когда между гелем и водным слоем появляется четкая граница. После удаления гребенки из геля, прошедшего полимеризацию, остается ряд лунок. Заполняют нижний и верхний резервуары камеры предписанным электродным буферным раствором. Готовят испытуемый и стандартный растворы, содержащие краситель и сахарозу или другой плотный и вязкий растворитель. Наносят образцы шприцем или микропипеткой в основания лунок, сразу включают электрический ток и начинают электрофорез, соблюдая предписанные условия (температуру и величину напряжения). После окончания процесса (когда краситель достигает нижней границы пластины) ток выключают, пластину удаляют из камеры, зоны фиксируют, окрашивают и при необходимости пластину высушивают.
Подготовка полиакриламидного геля для вертикального электрофореза с SDS в неоднородной буферной системе
Сначала готовят и заливают в подготовленную ячейку нижний разделяющий гель, а затем сверху наслаивают концентрирующий гель.
Приготовление разделяющего геля
В конической колбе готовят рассчитанное в зависимости от объема ячейки количество раствора для разделяющего геля, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в Таблице 1. Смешивают компоненты в указанном порядке, В тех случаях, где требуется, перед добавлением раствора аммония персульфата и тетраметилэтилендиамина (TEMED) раствор фильтруют, и, если необходимо, дегазируют раствор через мембрану из ацетата целлюлозы (с диаметром пор 0,45 мкм) под вакуумом при перемешивании. Добавляют соответствующие количества раствора аммония персульфата и TEMED как указано в табл. 1, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки. Оставляют достаточное место для концентрирующего геля (длина зубцов гребенки плюс 1 см). Используя суженную стеклянную пипетку, тщательно наслаивают на гель сверху воду или изобутанол. Оставляют гель в вертикальном положении при комнатной температуре до завершения полимеризации.
Приготовление концентрирующего геля
После окончания полимеризации воду или изобутанол сливают и промывают верхнюю часть геля несколько раз водой, чтобы удалить остатки неполимеризованного акриламида и изобутанола, если он использовался. Сливают с верхней части геля так много жидкости, как только возможно и затем удаляют любую оставшуюся влагу фильтровальной бумагой. В конической колбе готовят соответствующее количество раствора, содержащего требуемую концентрацию акриламида, используя значения, приведенные в табл. 2. Смешивают компоненты в том же порядке и с использованием тех же приемов фильтрации и дегазирования, что и для разделяющего геля. После добавления соответствующих количеств раствора аммония персульфата и TEMED, как указано в табл. 2, перемешивают и немедленно заливают в промежуток между двумя стеклянными пластинами ячейки непосредственно на поверхность полимеризованного разделяющего геля. Немедленно, но с осторожностью, вставляют чистую тетрафторполиэтиленовую гребенку в раствор концентрирующего геля так, чтобы избежать попадания в гель воздушных пузырей. Добавляют избыточное количество раствора концентрирующего геля так, чтобы полностью заполнить пространство между зубцами гребенки.
Таблица 1
Приготовление разделяющего геля
Компоненты раствора
Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема 5 мл
10 мл
15 мл
20 мл
25 мл
30 мл
40 мл
50 мл
1
2
3
4
5
6
7
8
9
4% акриламида
Вода очищенная
2,6
5,3
7,9
10,6
13,2
15,9
21,2
26,6
Раствор акриламида <1>
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
8,0
10,0
1,5М Трис (рН 8,8) <2>
1,3
2,5
3,8
5,0
6,3
7,5
10,0
12,5
100 г/л SDS <3>
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
100 г/л APS <4>
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
TEMED <5>
0,004
0,008
0,012
0,016
0,02
0,024
0,032
0,04
8% акриламида
Вода очищенная
2,3
4,6
6,9
9,3
11,5
13,9
18,5
23,2
Раствор акриламида <1>
1,3
2,7
4,0
5,3
6,7
8,0
10,7
13,3
1,5М Трис (рН 8,8) <2>
1,3
2,5
3,8
5,0
6,3
7,5
10,0
12,5
100 г/л SDS <3>
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
100 г/л APS <4>
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
TEMED <5>
0,003
0,006
0,009
0,012
0,015
0,018
0,024
0,03
10% акриламида
Вода очищенная
1,9
4,0
5,9
7,9
9,9
11,9
15,9
19,8
Раствор акриламида <1>
1,7
3,3
5,0
6,7
8,3
10,0
13,3
16,7
1,5М Трис (рН 8,8) <2>
1,3
2,5
3,8
5,0
6,3
7,5
10,0
12,5
100 г/л SDS <3>
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
100 г/л APS <4>
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
TEMED <5>
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,016
0,02
12% акриламида
Вода очищенная
1,6
3,3
4,9
6,6
8,2
9,9
13,2
16,5
Раствор акриламида <1>
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
16,0
20,0
1,5М Трис (рН 8,8) <2>
1,3
2,5
3,8
5,0
6,3
7,5
10,0
12,5
100 г/л SDS <3>
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
100 г/л APS <4>
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
TEMED <5>
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,016
0,02
14% акриламида
Вода очищенная
1,4
2,7
3,9
5,3
6,6
8,0
10,6
13,8
Раствор акриламида <1>
2,3
4,6
7,0
9,3
11,6
13,9
18,6
23,2
1,5М Трис (рН 8,8) <2>
1,3
2,5
3,8
5,0
6,3
7,5
10,0
12,5
100 г/л SDS <3>
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
100 г/л APS <4>
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
TEMED <5>
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,016
0,02
15% акриламида
Вода очищенная
1,1
2,3
3,4
4,6
5,7
6,9
9,2
11,5
Раствор акриламида <1>
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
20,0
25,0
1,5М Трис (рН 8,8) <2>
1,3
2,5
3,8
5,0
6,3
7,5
10,0
12,5
100 г/л SDS <3>
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
100 г/л APS <4>
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,4
0,5
TEMED <5>
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,016
0,02
Таблица 2
Приготовление концентрирующего геля
Компоненты раствора
Объем компонента (мл) на ячейку заданного объема 1 мл
2 мл
3 мл
4 мл
5 мл
6 мл
8 мл
10 мл
Вода очищенная
0,68
1,4
2,1
2,7
3,4
4,1
5,5
6,8
Раствор акриламида <1>
0,17
0,33
0,5
0,67
0,83
1,0
1,3
1,7
1,0М Трис (рН 6,8) <6>
0,13
0,25
0,38
0,5
0,63
0,75
1,0
1,25
100 г/л SDS <3>
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,08
0,1
100 г/л APS <4>
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,08
0,1
TEMED <5>
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,008
0,01
<1> Раствор акриламида: 30% раствор акриламида/бисакриламида (29:1). <2> 1,5М Трис (рН 8,8): 1,5 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 8,8. <3> 100 г/л SDS: раствор натрия додецилсульфата 100 г/л. <4> 100 г/л APS: раствор аммония персульфата 100 г/л. Аммония персульфат является источником свободных радикалов, которые управляют полимеризацией акриламида и бисакриламида. Таким образом, раствор аммония персульфата должен добавляться медленно. <5> TEMED: тетраметилэтилендиамин.
<6> 1,0М Трис (рН 6,8): 1 М буферный раствор трис-гидрохлорида, рН 6,8.
Гель со вставленной гребенкой оставляют в вертикальном положении при комнатной температуре до окончания полимеризации. Если в фармакопейной статье нет других указаний, то определение молекулярных масс проводят при нагрузке на лунку 10 мкг общего белка, а определение чистоты — при нагрузке 40 мкг при окрашивании Кумасси бриллиантовым R250, а при окрашивании нитратом серебра достаточно 2-5 мкг белка на лунку. Толщина гребенки выбирается точно в соответствии с толщиной используемых прокладок, а размер зубцов — в соответствии с предполагаемым объемом образцов. Необходимый и достаточный объем формируемой лунки определяется как произведение длины, ширины и высоты (в микрометрах) одного зубца гребенки:
V = L · D · H.
Объем наносимого образца вычисляют следующим образом:
Vx = k · X / C,
где: k — коэффициент разбавления пробы буферным раствором для образца; X — требуемое для нанесения на гель количество белка в зависимости от целей анализа, в мкг; С — концентрация общего белка, определяемая по методу Лоури, в мкг/мл.
Установка геля в прибор для электрофореза и процесс разделения
После окончания полимеризации аккуратно удаляют гребенку, немедленно ополаскивают лунку водой, чтобы удалить любые остатки неполимеризованного акриламида. Если необходимо, выправляют зубцы концентрирующего геля при помощи тупой подкожной иглы, насаженной на шприц. Устанавливают гель в прибор для электрофореза согласно инструкциям изготовителя оборудования. Добавляют электродный буферный раствор в верхнюю и нижнюю буферные емкости. Обычно, если нет других указаний в фармакопейной статье, в качестве электродного буферного раствора используется трис-глициновый буферный раствор с рН 8,3-8,4. Удаляют любые пузыри, которые могут появиться у основания геля между стеклянными пластинами. Не следует включать электрический ток до внесения образцов, так как это уничтожит неоднородность буферных систем. Готовят испытуемый раствор и раствор сравнения в рекомендованном буферном растворе для образцов в соотношении, указанном в фармакопейной статье или нормативной документации. Обычно для обеспечения полной денатурации образец в смеси с буферным раствором подвергают дополнительно температурной обработке, режим которой должен быть указан в фармакопейной статье или нормативной документации. Наносят соответствующие объемы каждого из растворов в лунки концентрирующего геля. Начинают электрофорез, используя условия, рекомендуемые изготовителем оборудования. Изготовители оборудования для SDS-ПААГ могут обеспечивать применение гелей различной площади и толщины. Соответственно продолжительность электрофореза и сила тока (или напряжение) могут быть изменены, как описано изготовителем прибора, чтобы достичь оптимального разделения, что проверяют по скорости перемещения фронта индикатора в разделяющем геле. Когда индикатор достигает основания геля, электрофорез останавливают. Удаляют ячейку с гелем из прибора и отделяют стеклянные пластины. Удаляют прокладки, отрезают и удаляют концентрирующий гель и немедленно проводят процедуру окрашивания. Для того, чтобы можно было выявить присутствие в исследуемом образце агрегатов и других компонентов, не входящих в гель, концентрирующий гель рекомендуется обрезать не полностью, оставляя 2-3 мм. Так называемые, «готовые к использованию» коммерческие гели и наборы реактивов к ним могут быть применены при условии, что они дают результаты, отвечающие валидационным критериям, приведенным ниже в разделе «Оценка пригодности системы».
Обнаружение белков в гелях
Окрашивание Кумасси бриллиантовым R250 — наиболее распространенный метод окрашивания белков с пределом обнаружения порядка от 1 до 10 мкг белка в полосе. Окрашивание нитратом серебра — более чувствительный метод окрашивания белков в гелях, позволяющий выявлять до 1 нг белка. Для селективного окрашивания гликозилированных белков или липопротеидов иногда применяют другие красители или их смеси, о чем должно быть сделано дополнительное указание в фармакопейной статье или нормативной документации. Все процедуры окрашивания геля проводят, как правило, при комнатной температуре и при слабом перемешивании в любом удобном контейнере. При окрашивании геля следует использовать одноразовые перчатки, иначе на геле могут быть прокрашены отпечатки пальцев.
Окраска раствором Кумасси
Погружают гель в большой избыток красящего раствора Кумасси раствора и выдерживают, по крайней мере, 1 ч. Поскольку кислотно-спиртовой состав окрашивающего раствора не позволяет полностью фиксировать белки на геле, это может приводить к потерям некоторых низкомолекулярных белков во время окрашивания и обесцвечивания тонких гелей. Полная фиксация возможна при выдерживании геля в 10% растворе трихлоруксусной кислоты в течение 1 ч перед погружением в окрашивающий Кумасси раствор. Для ускорения процедуры окрашивания допускается подогрев геля в окрашивающем растворе в микроволновой печи. Режим подогрева должен быть описан в фармакопейной статье или нормативной документации. Затем окрашивающий раствор удаляют и гель промывают водой. Обесцвечивают гель избытком обесцвечивающего раствора. Заменяют порции обесцвечивающего раствора несколько раз до тех пор, пока окрашенные полосы белка не станут ясно различимы на прозрачном фоне. Чем более полно обесцвечен гель, тем меньшие количества белка могут быть обнаружены этим методом. Обесцвечивание может быть ускорено при добавлении в обесцвечивающий раствор нескольких граммов анионобменной смолы или маленького кусочка пористого материала. После обесцвечивания гель промывают водой и либо высушивают, либо оставляют в воде для хранения при температуре от 2 до 8 °С.
Окраска раствором нитрата серебра
Погружают гель в большой избыток фиксирующего раствора и выдерживают в течение 1 ч. Фиксирующий раствор сливают, добавляют новую порцию того же раствора и инкубируют, по крайней мере 1 ч или оставляют на ночь. Сливают фиксирующий раствор и промывают гель в большом избытке воды в течение 1 ч. После этого пропитывают гель в течение 15 мин в 1% растворе глутарового альдегида. Промывают гель дважды по 15 мин большим количеством воды. Выдерживают гель в темноте в свежеприготовленном 2% растворе серебра нитрата в течение 15 мин. Промывают гель три раза по 5 мин в большом количестве воды. Погружают гель приблизительно на 1 мин в проявляющий раствор, пока не будет достигнуто удовлетворительное окрашивание. Окрашивание прекращают в момент проявления полосы в треке с минимальным количеством препарата (например, 0,001 мкг). Останавливают развитие окраски погружением в стоп-раствор на 15 мин. Ополаскивают гель водой. Целесообразно использовать готовые наборы реактивов для окрашивания гелей серебра нитратом.
Высушивание проявленных SDS-полиакриламидных гелей
В зависимости от используемого метода окрашивания подготовку геля к высушиванию проводят различными способами: — при окраске Кумасси после процедуры обесцвечивания гель выдерживают в смеси 10,0 г глицерина и 92 мл воды очищенной не менее 2 ч (возможна инкубация «на ночь»); — при окраске нитратом серебра гель после заключительной процедуры ополаскивания выдерживают в течение 5 мин в смеси 2,0 г глицерина и 98 мл воды очищенной. Погружают два листа пористой целлюлозной пленки в воду и выдерживают в течение 5-10 мин. Растягивают один из листов на рамке для высушивания. Аккуратно помещают пропитанный в глицериновом растворе гель на натянутую целлюлозную пленку. Удаляют все случайно попавшие воздушные пузыри, и заливают вокруг граней геля несколько миллилитров воды. Помещают второй лист пленки сверху и снова удаляют все воздушные пузыри. Заканчивают сборку рамки для сушки геля и помещают ее в сушильный шкаф или оставляют при комнатной температуре до полного высыхания.
Определение молекулярных масс белков
Молекулярные массы белков определяют по сравнению их подвижностей с подвижностью нескольких белков-маркеров известной молекулярной массы. Готовые смеси белков с точно известными молекулярными массами (маркеры) для калибрования гелей предлагаются производителями материалов и оборудования для электрофореза в различных диапазонах молекулярных масс. Концентрированные исходные растворы полипептидов известной молекулярной массы готовят в соответствующем буферном растворе для образцов и наносят на гель одновременно с образцом испытуемого белка. Сразу после того, как электрофорез завершен, следует отметить положение полосы красителя бромфенолового синего, которая соответствует электрофоретическому ионному фронту. Это может быть сделано при помощи меток-надрезов в геле или путем прокола геля в зоне окрашенного фронта иглой, предварительно обмакнутой в черную тушь или другой подходящий контрастный краситель. После окрашивания геля измеряют расстояния пробега для каждой полосы белка (маркеров и испытуемого образца) от вершины разделяющего геля. Вычисляют отношение расстояния пробега каждого белка к расстоянию пробега фронта красителя. Нормализованные расстояния пробега, вычисленные таким образом, называются относительными подвижностями белков (относительно фронта красителя) и обозначаются как Rf.
,
где: R — расстояние пробега белка;
RS — расстояние пробега красителя.
Строят график зависимости логарифма относительных молекулярных масс стандартов белка (Mr) от значения Rf. Неизвестные молекулярные массы могут быть оценены методом линейной регрессии или интерполяцией кривых зависимости logMr от Rf в том случае, если значения, полученные для испытуемых образцов, находятся в линейной части графика.
Количественное определение примесей
В тех случаях, когда в фармакопейной статье указан предел примесей, то перед анализом должен быть приготовлен раствор сравнения, соответствующий этому уровню примеси, путем разбавления испытуемого раствора. Например, в случае 5% предела, раствор сравнения должен быть приготовлен разведением испытуемого раствора в соотношении 1:20. При этом примесь (полоса, отличная от главной полосы) на электрофореграмме с испытуемым препаратом не должны быть интенсивнее, чем полоса, полученная с раствором сравнения. При наличии нескольких полос примесей должно быть предусмотрено требованию к содержанию каждой из них и к содержанию суммы примесей. Приемлемым условием определения примесей может считаться метод количественной нормализации с использованием денситометрического интегрирования. В этом случае предварительно должна быть показана линейность отклика прибора.
ОЦЕНКА ПРИГОДНОСТИ СИСТЕМЫ
Результаты анализа считаются достоверными только в том случае, если: — белки маркера молекулярных масс распределены приблизительно на 80% длины геля и охватывают весь требуемый диапазон разделения (например, диапазон молекулярных масс продукта и его димера или продукта и родственных примесей); — зависимость логарифма молекулярной массы белков-маркеров и Rf — линейна в необходимом диапазоне. Дополнительные требования приемлемости результатов анализа должны быть описаны в фармакопейной статье или нормативной документации.
Примечания.
1) Приготовление 30% раствора акриламида/бисакриламида. В мерный стакан вместимостью 250 мл помещают 29,2 г акриламида и 0,8 г N,N’-метиленбисакриламида, растворяют в воде очищенной при перемешивании, доводят объем раствора водой до 100 мл и вновь перемешивают (при необходимости раствор фильтруют, как указано в фармакопейной статье или нормативной документации). Раствор хранят во флаконе из темного стекла при температуре 4-6 °С не более 1 мес. 2) Приготовление раствора натрия додецилсульфата. В мерный стакан вместимостью 250 мл помещают 10,0 г натрия додецилсульфата, растворяют в воде очищенной при аккуратном перемешивании, избегая вспенивания, доводят объем раствора до 100 мл и вновь перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре. 3) Приготовление раствора аммония персульфата. Растворяют 100,0 мг аммония персульфата в 1,0 мл воды очищенной. Раствор используют свежеприготовленным. 4) Приготовление 1,5М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 8,8). В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 90,8 г трис(гидроксиметил)аминометана и растворяют в 400 мл воды. Доводят рН раствора до 8,8 с помощью 1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем доводят объем раствора тем же растворителем до 500 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4-6 °С не более 1 мес. 5) Приготовление 1,0 М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8). В мерный стакан вместимостью 500 мл помещают 60,6 г трис(гидроксиметил)аминометана и растворяют в 400 мл воды. Доводят рН раствора до 6,8 с помощью 1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем доводят объем раствора тем же растворителем до 500 мл и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4-6 °С не более 1 мес. 6) Приготовление электродного буферного раствора (10х) (рН 8,3). В мерный стакан, вместимостью 1000 мл помещают 30,0 г трис(гидроксиметил)аминометана, 144,0 г глицина и 10,0 г натрия додецилсульфата, растворяют в воде и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. Фильтруют и измеряют рН раствора, который должен быть 8,3 — 8,4. Доводить рН раствора кислотой или щелочью до необходимого значения не допускается. Раствор хранят при комнатной температуре не более 3 мес. Непосредственно перед анализом 1 часть приготовленного раствора смешивают с 9 частями воды очищенной. 7) Приготовление буферного раствора для образцов (4х) для электрофореза в восстанавливающих условиях с 2-меркаптоэтанолом. В химическом стакане смешивают 4,7 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата, 0,4 мл 2-меркаптоэтанояа и 2 мг бромфенолового синего. Раствор хранят при температуре 4-6 °С не более 1 мес. 8) Приготовление буферного раствора для образцов (4х) для электрофореза в восстанавливающих условиях с дитиотреитолом. В химическом стакане тщательно перемешивают 5,0 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% раствора натрия додецилсульфата, 0,06 г 1,4-дитиотреитола и 2 мг бромфенолового синего. Раствор используют свежеприготовленным. 9) Приготовление буферного раствора для образцов (4х) для электрофореза в невосстанавливающих условиях. В химическом стакане тщательно смешивают 5,1 мл воды очищенной, 0,5 мл 1М буферного раствора трис-гидрохлорида (рН 6,8), 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 30% раствора натрия додецилсульфата и 2 мг бромфенолового синего. Раствор хранят при температуре 4-6 °С не более 3 мес. 10) Приготовление красящего раствора Кумасси. Раствор готовят по одному из способов приготовления (N 1 или N 2): Раствор N 1. Растворяют 0,3 г Кумасси бриллиантового R250 в смеси 100 мл спирта метилового или этилового и 100 мл воды очищенной. Перемешивают до полного растворения (в течение 1 ч). Добавляют 25 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до 250 мл и перемешивают. Хранят окрашивающий раствор в темной бутыли при комнатной температуре. Раствор хранят при температуре 18-25 °С в течение 2 мес. Раствор N 2. 1,0 г Кумасси ярко-голубого R-250 помещают в химический стакан, доводят до объема 250,0 мл этиловым спиртом, перемешивают не менее 3,5 часов до полного растворения красителя, добавляют 100,0 мл кислоты ледяной уксусной и доводят объем деионизованной водой до 1000,0 мл. Раствор хранят при температуре 18-25 °С в течение 2 мес. 11) Приготовление обесцвечивающего раствора. К 400 мл спирта метилового или этилового добавляют 100 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора до 1000 мл и перемешивают. 12) Приготовление фиксирующего раствора. К 250 мл спирта метилового или этилового добавляют 0,27 мл 37% раствора формальдегида, доводят объем раствора водой очищенной до 500 мл и перемешивают. 13) Приготовление 1% раствора глутарового альдегида. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 4 мл 25% глутарового альдегида или 2 мл 50% глутарового альдегида, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. 14) Приготовление раствора серебра нитрата. Смешивают 2,75 мл 25% раствора аммиака и 40 мл 1 М раствора натрия гидроксида, прибавляют по каплям при постоянном перемешивании 8 мл 20% раствора серебра нитрата, доводят объем раствора водой очищенной до 200 мл и перемешивают. 15) Приготовление 20% раствора серебра нитрата. Растворяют в воде очищенной 2,0 г (точная навеска) серебра нитрата, доводят объем раствора водой до 10 мл и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным. 16) Приготовление проявляющего раствора. Смешивают 2,5 мл 2,0% раствора лимонной кислоты и 0,27 мл 37% раствора формальдегида, доводят объем раствора водой очищенной до 500 мл и перемешивают. 17) Приготовление стоп-раствора, К 50 мл воды прибавляют 10 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до 100 мл и перемешивают.
В случае использования других реактивов и растворов они должны быть описаны в фармакопейной статье или нормативной документации.
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Капиллярный электрофорез
ОФС.1.2.1.0022.15
Вводится впервые
Капиллярный электрофорез — это физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц в растворе электролита под влиянием приложенного электрического поля. Скорость миграции частиц определяется их электрофоретической подвижностью и электроосмотической подвижностью буферного раствора. Электрофоретическая подвижность вещества () зависит от его характеристик (электрического заряда, размеров и формы) и от характеристик буферной среды, в которой происходит разделение (типа и ионной силы электролита, рН, вязкости и добавок):
, (1)
где: q — эффективный заряд частицы;
- вязкость раствора электролита; r — стоксовский радиус частицы.
Электрофоретическую скорость () для вещества сферической формы определяют по формуле:
, (2)
где: Е — сила электрического поля;
V — приложенное напряжение;
L — общая длина капилляра.
Когда к капилляру, заполненному буферным раствором, приложено электрическое поле, внутри капилляра образуется поток растворителя, называемый электроосмотическим потоком. Скорость и направление электроосмотического потока зависят от электроосмотической подвижности (), определяемой знаком и плотностью заряда на внутренней стенке капилляра, а также характеристиками буфера:
, (3)
где: — диэлектрическая константа буфера; , — дзета-потенциал поверхности капилляра.
Электроосмотическую скорость () рассчитывают по формуле:
, (4)
Электрофоретическая и электроосмотическая подвижность ионов могут быть направлены в одну и ту же или в противоположные стороны в зависимости от заряда частиц; таким образом, скорость движения растворенного вещества будет определяться уравнением:
, (5)
Если электроосмотическая скорость выше электрофоретической, можно одновременно разделить как положительно, так и отрицательно заряженные ионы. Время, затраченное ионом для миграции от конца, в котором вводится образец, до места детекции (l — эффективная длина капилляра), определяют по формуле:
. (6)
Как правило, капилляры из плавленого кварца без покрытия при рН выше 3 несут на внутренней поверхности отрицательный заряд из-за диссоциации силанольных групп. При этом электроосмотический поток направлен от анода к катоду. В некоторых случаях необходимо уменьшить или изменить направление электроосмотического потока. Для этого различным образом модифицируют внутреннюю стенку капилляра или изменяют рН буферного раствора. После введения образца в капилляр каждый анализируемый ион движется внутри фонового электролита в виде отдельной зоны в соответствии со своей электрофоретической подвижностью. Степень размывания каждой зоны растворенного соединения определяется совокупностью различных причин. В идеальном случае единственной причиной размывания зон является продольная молекулярная диффузия растворенного вещества вдоль капилляра. В этом, идеальном, случае эффективность разделения полосы, характеризуемая числом теоретических тарелок (N), выражается формулой:
, (7)
где D — молекулярный коэффициент диффузии растворенного вещества в буферном растворе.
На практике на размывание полос значительное влияние оказывают тепловое рассеяние, адсорбция образца на стенке капилляра, различная проводимость между образцом и буфером, длительность ввода пробы, размеры детектирующей ячейки и различия уровней жидкости в емкостях с буферными растворами. Разделение между двумя полосами, называемое разрешением (Rs), определяют по формуле (8): , (8)
где: и — электрофоретические подвижности каждого из двух разделенных ионов;
- их средняя электрофоретическая подвижность.
Среднюю электрофоретическую подвижность определяют по формуле:
, (9)
Оборудование
Система для капиллярного электрофореза состоит из высоковольтного источника напряжения; двух флаконов с буферными растворами и погруженными в них электродами; капилляра, заполненного соответствующим раствором и погруженного обоими концами во флаконы с буферными растворами; системы ввода образца; детектора, способного в режиме реального времени регистрировать вещества, проходящие мимо оптического окна капилляра; системы термостатирования; регистрирующего прибора или подключенного компьютера. Для введения пробы могут использоваться три способа: гидростатический — за счет разного уровня буферных растворов, гидродинамический — с помощью прилагаемого давления или вакуума и электрокинетический — благодаря прилагаемому напряжению. В последнем случае степень ввода в капилляр каждого компонента пробы зависит от соответствующей электрофоретической подвижности. Электрокинетическая система ввода для многокомпонентной смеси с разной электрофоретической подвижностью ведет к изменению соотношения концентраций ее составляющих и в данном случае может адекватно применяться лишь для качественного анализа. При условии определения в многокомпонентной смеси одного или двух соединений этот метод может использоваться и для количественного анализа. Кроме того, такой способ введения может позволить увеличить чувствительность анализа. Детектирование осуществляется с помощью абсорбционной спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях, флуориметрии, кондуктометрии, амперометрии или масс-спектрометрии. Для обнаружения не поглощающих в ультрафиолетовой области и не флуоресцирующих соединений используется непрямое детектирование. В этом случае в ведущий электролит вводится вещество, поглощающее ультрафиолетовое излучение и образующее выраженное фоновое поглощение. При этом зона определяемого вещества визуализируется в виде обратного пика. С использованием специального программного обеспечения электрофореграмме придают стандартный вид. Применяемый раствор электролита фильтруют для того, чтобы удалить крупные частицы (размером более 0,45 мкм), и дегазируют для предотвращения образования пузырьков воздуха, которые могут быть помехой для детектирующей системы или могут нарушить электропроводность в капилляре во время проведения анализа. Для хорошей воспроизводимости времени миграции анализируемых компонентов проб для каждого определения должна быть разработана определенная процедура промывки капилляра. Основными формами проведения капиллярного электрофореза являются: капиллярный зонный электрофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматография, капиллярный гель-электрофорез, капиллярное изоэлектрическое фокусирование и капиллярный изотахофорез.
Капиллярный зонный электрофорез
Аналиты разделяются в капилляре, содержащем только буферный раствор. Разделение происходит за счет того, что различные компоненты образца движутся с разными скоростями, образуя так называемые зоны. Скорость движения каждой зоны зависит от электрофоретической подвижности растворенного вещества и от электроосмотического потока в капилляре. Для уменьшения адсорбции веществ на поверхности плавленого кварца могут использоваться капилляры с модифицированной внутренней поверхностью. Использование капиллярного зонного электрофореза позволяет выполнить разделение как малых (молекулярная масса < 2 кДа), так и больших молекул (2 кДа < молекулярная масса < 100 кДа). При этом может быть обеспечено разделение молекул, имеющих лишь незначительные отличия в соотношениях заряда к массе. Этот способ позволяет также разделять хиральные соединения, для чего в буферный раствор вводятся хиральные селекторы. Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению, однако увеличение используемого напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, приводящее к возникновению градиентов температуры и, как следствие, вязкости буфера внутри капилляра. Этот эффект вызывает уширение полос и уменьшение разрешения. Температура изменяет вязкость буфера и электропроводность и, следовательно, влияет на скорость миграции. В некоторых случаях возрастание температуры в капилляре может вызвать конформационные изменения белков, изменяя времена их миграции и эффективность разделения. Длина и внутренний диаметр капилляра влияют на время анализа, эффективность разделения и нагрузочную емкость. Увеличение как эффективной, так и общей длины капилляра может уменьшить электрическое поле, что увеличивает время миграции. При заданном буфере и электрическом поле от внутреннего диаметра капилляра зависят тепловое рассеивание и, следовательно, уширение полос образца. Для предотвращения адсорбции компонентов анализируемой пробы на стенке капилляра применяются различные подходы: экстремальные значения рН, адсорбция положительно заряженных буферных добавок, покрытие внутренней стенки капилляра различными полимерами (нейтральными, гидрофильными, катионными или анионными). Ведущий электролит для капиллярного электрофореза должен иметь оптимальное значение ионной силы, увеличение которой приводит к возрастанию силы тока, уменьшению электроосмотического потока и, соответственно, снижению скорости движения пробы. Буферные системы для капиллярного электрофореза должны иметь оптимальную буферную емкость в выбранном диапазоне рН и низкую электропроводность для уменьшения возникающего тока. Для симметричной формы регистрируемого пика необходимо, чтобы скорость движения ионов буфера примерно соответствовала скорости движения аналита. Увеличение концентрации буфера (при заданном рН) уменьшает электроосмотический поток и скорость движения пробы. Значение рН буферного раствора влияет на разделение, изменяя заряд анализируемого соединения и добавок, а также электроосмотический поток. При разделении белков и пептидов изменение рН буфера от более низкого, чем изоэлектрическая точка, к более высокому изменяет суммарный заряд растворенного вещества от отрицательного к положительному. Увеличение рН буфера обычно увеличивает электроосмотический поток. Среда для растворения пробы важна для достижения концентрирования образца. Органические модификаторы (метанол, ацетонитрил и др.) добавляют к водному буферному раствору для увеличения растворимости пробы, а также для изменения степени ионизации компонентов образца. Добавление этих органических модификаторов обычно вызывает уменьшение электроосмотического потока. Для разделения оптических изомеров к буферному раствору добавляют хиральные модификаторы: циклодекстрины, краун-эфиры, полисахариды и белки. Другими факторами, контролирующими разрешение в хиральном разделении, являются концентрация хирального модификатора, состав и рН буфера, а также температура. Использование органических компонентов, таких, как метанол или мочевина, может также влиять на достигаемое разрешение.
Мицеллярная электрокинетическая хроматография
В мицеллярной электрокинетической хроматографии разделение осуществляется в растворе электролита, содержащего поверхностно-активное вещество в концентрации выше критической концентрации мицеллообразования. Молекулы растворенного вещества распределяются между буферным раствором и псевдостационарной фазой, состоящей из мицелл. Этот метод может использоваться для разделения как заряженных, так и нейтральных молекул. В качестве анионного поверхностно-активного вещества наиболее часто используется додецилсульфат натрия, в качестве катионного — соли цетилтриметиламмония. При нейтральных и щелочных значениях рН возникает сильный электроосмотический поток, который движет ионы разделяющего буфера в сторону катода. При использовании в качестве поверхностно-активного вещества додецилсульфата натрия электрофоретическое движение анионных мицелл направлено в противоположную сторону — к аноду. В результате суммарная скорость движения мицелл снижена по сравнению с основным потоком раствора электролита. В случае нейтральных веществ скорость движения компонента, не имеющего электрофоретической подвижности, зависит только от его коэффициента распределения между мицеллой и водной средой. На электрофореграмме сначала появляется пик маркера электроосмотического потока, затем пики аналитов, и в конце — пик маркера мицелл. Время между первым и последним пиком называется окном разделения. На движение заряженных веществ влияют как их коэффициенты распределения между мицеллой и водным буферным раствором, так и их собственная электрофоретическая подвижность. Движение аналитов и разрешение может быть описано термином «фактор удерживания (k)», представляющим собой отношение молярных долей аналита в мицелле и в подвижной фазе. Для нейтрального вещества k вычисляют по формуле:
, (10)
где: tR — время миграции аналита;
t0 — время миграции неудерживаемого вещества; tmc — время миграции мицеллы;
K — коэффициент распределения аналита;
VS — объем мицеллярной фазы;
VM — объем подвижной фазы.
Разрешение для двух близко движущихся аналитов (RS) рассчитывают по формуле:
, (11)
где: N — число теоретических тарелок для одного из аналитов; a — селективность разделения;
ka и kb — коэффициенты удерживания обоих аналитов соответственно.
Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению, однако следует учитывать, что увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, приводящее к возникновению градиентов температуры и вязкости буферного раствора. Этот эффект вызывает уширение полос и уменьшение разрешения. Как и в капиллярном зонном электрофорезе, при мицеллярной электрокинетической хроматографии длина и внутренний диаметр капилляра влияют на время анализа и эффективность разделения. Увеличение длины капилляра уменьшает электрическое поле, увеличивает время миграции и повышает эффективность разделения. Уменьшение внутреннего диаметра повышает рассеяние тепла и увеличивает разрешение. Величина рН среды влияет на электроосмотический поток в немодифицированных капиллярах. Уменьшение рН снижает электроосмотический поток и вследствие этого увеличивает разрешение нейтральных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии за счет увеличения времени анализа. Для улучшения разделения гидрофобных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии используют органические модификаторы (метанол, пропанол, ацетонитрил и др.). При этом необходимо учитывать, что добавление органического модификатора влияет на критическую концентрацию мицеллообразования. Для разделения с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии энантиомеров в мицеллярную систему включают хиральные селекторы: ковалентно связанные с поверхностно-активным веществом (соли N-додеканоил-L-аминокислот, соли желчных кислот и др.) или вводимые в состав электролита (циклодекстрины). Для улучшения селективности разделения в мицеллярной электрокинетической хроматографии применяют также вещества, способные изменить взаимодействие аналита с мицеллой путем адсорбции на последней. Этими добавками могут быть второе поверхностно-активное вещество (ионное или неионное), ведущее к образованию смешанных мицелл, катионы металлов, которые распределяются в мицелле и образуют координационные комплексы с аналитом, а также ион-парные соединения, которые взаимодействуют с заряженными компонентами пробы и задерживают их, например, тетрабутиламмония бромид.
Капиллярный гель-электрофорез
В капиллярном гель-электрофорезе разделение происходит внутри капилляра, заполненного гелем, действующим в качестве молекулярного сита. При равном отношении заряда к массе более мелкие компоненты движутся в капилляре быстрее, чем более крупные. Капиллярный гель-электрофорез может быть использован для разделения биологических макромолекул по их молекулярной массе. Электроосмотический поток при этом полностью устраняется путем модификации внутренней стенки капилляра. В капиллярном гель-электрофорезе используются два типа гелей: химически модифицированные и динамически модифицированные. Химически модифицированные гели, как, например, поперечно-сшитый полиакриламид, поливинилпирролидон, готовятся внутри капилляра посредством полимеризации мономеров. Они обычно связаны с кварцевой стенкой капилляра и не могут быть удалены без его разрушения. При использовании таких гелей для анализа белков в редуцирующих условиях буферный раствор содержит обычно додецилсульфат натрия и образцы перед вводом денатурируют нагреванием в смеси додецилсульфата натрия с 2-меркаптоэтанолом или дитиотрейтолом. При анализе в нередуцирующих условиях 2-меркаптоэтанол и дитиотрейтол не используют. Разделение в поперечно сшитых гелях оптимизируют модификацией буферного раствора (как указано в разделе «Капиллярный зонный электрофорез») и контролем пористости геля во время его приготовления. Пористость этих гелей регулируют изменением концентрации акриламида, а также его соотношения со сшивающим реагентом. Уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности аналитов. Из-за неподвижности таких гелей допустимо только электрокинетическое введение пробы. Динамически модифицированные гели являются гидрофильными полимерами, как, например, линейный полиакриламид, производные целлюлозы, декстран и т. п., которые могут быть растворены в водных разделительных буферных растворах с образованием разделяющей среды, действующей как молекулярное сито. После приготовления они могут быть введены в капилляр под давлением. Замена геля перед каждой инжекцией улучшает воспроизводимость разделения. Пористость гелей увеличивается при использовании полимеров с большей молекулярной массой или уменьшении концентрации полимера. Для выбранного буферного раствора уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности компонентов раствора. Так как растворение этих полимеров в буферном растворе дает растворы с низкой вязкостью, может быть использован гидродинамический или электрокинетический ввод пробы.
Капиллярное изоэлектрическое фокусирование
В изоэлектрическом фокусировании заряженные молекулы движутся под воздействием электрического поля в рН-градиенте, созданном амфолитами с широким диапазоном значений рI, растворенными в буфере разделения. Тремя основными этапами изоэлектрического фокусирования являются введение пробы, фокусирование и мобилизация. Этап введения пробы осуществляют в один прием, когда образец смешивается с амфолитами и вводится в капилляр под давлением или под вакуумом, или в несколько приемов, когда в капилляр последовательно вводится ведущий буферный раствор, амфолиты, образец, смешанный с амфолитами, снова амфолиты и, наконец, заключающий буферный раствор. Объем образца должен быть достаточно малым, чтобы не изменять рН-градиент. На этапе фокусирования амфолиты движутся после приложения напряжения к катоду или аноду согласно их суммарному заряду, создавая, таким образом, рН-градиент от более низкого рН (у анода) к более высокому рН (у катода). Движение каждого аналита продолжается до тех пор, пока он не достигнет рН, соответствующего его изоэлектрической точке (pI). На этапе мобилизации полосы разделенных компонентов приводятся в движение в сторону детектора благодаря электроосмотическому потоку путем приложения давления после стадии фокусирования или с помощью добавления солей к флакону у катода или анода. Достигнутое разделение, выражаемое как , зависит от градиента рНdpH/dx, количества амфолитов, имеющих различные значения pI молекулярного коэффициента диффузии (D), интенсивности электрического поля (E) и вариации электрофоретической подвижности аналита в зависимости от :
. (12)
Основными параметрами, которые следует учитывать при разработке разделения, являются: — Напряжение. В капиллярном изоэлектрическом фокусировании используется очень высокое электрическое поле — от 300 до 1000 В/см на этапе фокусирования. — Капилляр. Электроосмотический поток должен быть уменьшен или полностью подавлен. Для уменьшения электроосмотического потока используют капилляры с модифицированной внутренней поверхностью. — Растворы. Анодный флакон заполняется буферным раствором с рН ниже, чем pI наиболее кислого амфолита, а катодный флакон заполняется раствором с рН выше, чем pI наиболее щелочного амфолита. Обычно для анода используется фосфорная кислота, а для катода — натрия гидроксид. Добавление в раствор амфолита полимера, такого как метилцеллюлоза, ведет к подавлению конвекции и электроосмотического потока при увеличении вязкости. Широкие диапазоны рН используются для оценки изоэлектрической точки, в то время как более узкие диапазоны применяются для улучшения точности. Осаждение белков в их изоэлектрической точке во время этапа фокусирования предотвращают в случае необходимости с помощью таких буферных добавок, как глицерин, поверхностно-активные вещества, мочевина или цвиттерионные буферные соли.
Капиллярный изотахофорез
Изотахофорез — это метод разделения, который проводится в режиме поддержания постоянства тока (все разделенные зоны движутся с одной скоростью). При этом должно обеспечиваться постоянное отношение между концентрацией и подвижностью ионов в каждой зоне. В капиллярном изотахофорезе применяются два буферных раствора, между которыми находятся зоны аналита. Например, для анализа анионов буфер должен быть выбран таким образом, чтобы ведущий электролит содержал анион с фактической подвижностью, превышающей характерную для разделяемых веществ. Аналогично ион завершающего электролита должен иметь меньшую подвижность, чем подвижность разделяемых веществ. В результате разделения ведущий анион движется первым, за ним движется анион с очередной высокой подвижностью и т. д. В капиллярном изотахофорезе индивидуальные анионы мигрируют в дискретных зонах, но все движутся с той же скоростью, что и ведущий анион. Концентрации анализируемых веществ одинаковы в каждой зоне; таким образом, длина каждой зоны пропорциональна количеству отдельного компонента. Зоны менее сконцентрированные, чем ведущий электролит, сужаются, зоны более сконцентрированные — расширяются. Принцип изотахофореза используется для предварительного концентрирования образца перед разделением его компонентов с помощью других методик капиллярного электрофореза.
Обработка результатов
Качественный анализ. К качественным результатам относится определение идентичности компонента пробы внутреннему или внешнему стандартному веществу по времени появления соответствующего пика. Полуколичественный анализ. Полуколичественным результатом считается определение концентрации компонента пробы по площади или высоте пика при соотношении сигнал/фон от 2:1 до 3:1. Отношение сигнал/шум (S/N) рассчитывают по формуле:
, (13)
где: Н — высота пика целевого компонента на электрофореграмме раствора сравнения, измеренная от максимума пика до базовой линии сигнала; h — уровень шума на электрофореграмме, полученной после ввода холостой пробы.
Количественный анализ. Количественным результатом является определение концентрации искомого компонента пробы по площади пика при соотношении сигнал/шум больше, чем 3:1. При количественном анализе образца для компенсации различий во временах миграции от анализа к анализу и для устранения различий в сигналах компонентов образца, обладающих различными временами миграции, площади пиков должны быть нормированы на соответствующие времена миграции. При использовании внутреннего стандарта необходимо убедиться, что ни один пик исследуемого вещества не маскируется пиком внутреннего стандарта. Абсолютное содержание компонентов рассчитывают по отношению площадей анализируемого пика и пика стандарта. Процентное содержание одного или более компонентов анализируемого образца рассчитывают путем определения процентной доли скорректированных площадей пиков от общей площади всех пиков, за исключением пиков, вызванных растворителями или другими добавленными реактивами (процедура нормализации). В качестве параметров пригодности системы используются: кажущееся число теоретических тарелок (N), разрешение (Rs), фактор емкости (k’) (только для мицеллярной электрокинетической хроматографии) и фактор симметричности (As). Кажущееся число теоретических тарелок (N) может быть рассчитано эмпирически по формуле:
, (14)
где: tr — время миграции или расстояние вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика соответствующего компонента; w0,5 — ширина пика на половине высоты.
Разрешение (Rs) между пиками схожей величины двух компонентов вычисляют по формуле:
, (15)
tr,b > tr,a,
где: tr,b и tr,a — времена миграции или расстояния вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляров, опущенных из максимумов двух соседних пиков; w0,5,a и w0,5,b — ширина пиков на половине высоты. Фактор симметричности пика рассчитывают по формуле:
, (16)
где: w0,05 — ширина пика на 1/20 от его высоты; d — расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передним краем пика на 1/20 от высоты пика.
В качестве параметров пригодности используются также испытания на воспроизводимость площади (стандартное отклонение площади или отношения площади к времени миграции) и воспроизводимость времени миграции (стандартное отклонение времени миграции).
Перечень условий, подлежащих указанию
В фармакопейной статье указывают использование определенного капилляра, буферного раствора, метода предварительной подготовки капилляра, пробоподготовки и условий миграции.
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Электрофорез
ОФС.1.2.1.0021.15
Взамен ст. ГФ XI, вып. 1
Электрофорез — метод анализа, основанный на способности заряженных частиц, растворенных или диспергированных в электролите, перемещаться под действием внешнего электрического поля. Различие физико-химических свойств заряженных частиц (размер, форма, величина заряда), а также влияние факторов электролитической среды (напряженность электрического поля, природа среды, вязкость электролита, рН, температура среды, а также продолжительность электрофореза) обусловливают различие скоростей перемещения частиц и, следовательно, обеспечивают их разделение. При электрофорезе на твердых носителях на подвижность и эффективность разделения дополнительное влияние оказывают: адсорбция, неоднородность вещества носителя и его ионообменные свойства, размер пор, электроосмос и капиллярный эффект. Электрофоретическая подвижность является величиной, характерной для данного вещества. Различают абсолютную и относительную электрофоретическую подвижность. Абсолютная электрофоретическая подвижность, формирующаяся под влиянием внешнего электрического поля, измеряется в сантиметрах в секунду. Относительная электрофоретическая подвижность представляет собой отношение подвижности исследуемого вещества к подвижности другого вещества, принятого за стандарт. Все электрофоретические методы могут быть разделены на две основные категории: электрофорез в свободном растворе, называемый также электрофорезом с подвижной границей или фронтальным электрофорезом; и электрофорез на поддерживающих средах, называемый также зональным электрофорезом.
Фронтальный электрофорез
В данном методе воздействию электрического тока подвергается раствор электролита и анализируемые компоненты, помещенные непосредственно в раствор. Этот метод является способом прямого определения электрофоретической подвижности веществ в отсутствие влияния эффектов носителя (адсорбции, электроосмоса, неоднородности среды), однако метод непригоден для выделения чистых компонентов анализируемой смеси из-за низкого разрешения. Метод может применяться для веществ с относительно высокой молекулярной массой, обладающих низкой диффузионной способностью.
Зональный электрофорез
В этом методе используется неподвижный носитель, по поверхности или через объем которого осуществляется миграция ионов, причем стабилизация электролита на плотной матрице позволяет предотвратить конвекцию и смешивание зон после разделения компонентов. В зависимости от среды и способа проведения зональный электрофорез имеет несколько вариантов. Природа поддерживающей плотной среды (бумага, силикагель, пленки из ацетата целлюлозы, гели на основе крахмала, агарозы, полиамидов или смешанные гели) вносит множество дополнительных факторов, изменяющих подвижность. Если среда не является электрически нейтральной, то в ней на подвижность анализируемых компонентов дополнительное влияние оказывает электроосмотический поток. Например, в капиллярном электрофорезе электроосмотический поток возникает из-за образования двойного слоя между раствором и внутренней стенкой капилляра. Внутренняя стенка плавленого кварца отрицательно заряжена за счет присутствия диссоциированных силанольных групп. Этот отрицательно заряженный слой притягивает положительные ионы из раствора, в результате чего образуется положительно заряженное кольцо жидкости, движущееся в направлении отрицательно заряженного катода. Электроосмотический поток сильно зависит от рН, Он присутствует только при значениях рН более 4, Чем выше значение рН, тем более четко выражен эффект. Электроосмотический поток может быть уменьшен в результате химической модификации или покрытия внутренней стенки капилляра положительно заряженными амфолитами. Профиль электроосмотического потока очень плоский по сравнению с гидродинамическим потоком, профиль которого параболический. В результате электроосмотический поток не вызывает размывания пиков. Разогрев среды, вследствие эффекта Джоуля, может вызывать некоторое испарение жидкости из поддерживающей среды, которое, вследствие капиллярных взаимодействий, вызывает перемещение раствора от краев пластинки к центру. Следовательно, скорость перемещения зависит от 4 главных факторов: подвижности заряженной частицы, электроосмотического потока, скорости испарения и напряженности поля. Для достижения воспроизводимых результатов необходимо установить и контролировать определенные условия электрофореза (напряжение, температура и т.д.) и использовать реактивы установленной квалификации. Многообразие методов электрофореза связано с большим количеством разных способов стабилизации электрофоретической среды (градиенты плотности с добавлением глицерина, гликолей, сахарозы, полиаминополикарбоновых кислот), носителей различной природы и разнообразия способов их использования (электрофорез в крахмальном блоке, в тонком слое, на колонке, в пленке или в пластине геля, в трубках или на бумаге).
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ
НА ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКУЮ ПОДВИЖНОСТЬ
Влияние заряда, размера частицы, вязкости электролита и градиента напряжения. Электрофоретическая подвижность заряженной частицы непосредственно связана с величиной заряда и обратно пропорциональна размеру частицы, непосредственно связанному, в свою очередь, с ее молекулярной массой. Поскольку пептиды и другие биологически активные вещества, которые могут быть проанализированы методом электрофореза, обычно не имеют идеальной сферической формы и не подчиняются закону Стокса, то их электрофоретическая подвижность (u0) лучше всего описывается уравнением:
,
где: — скорость частицы;
Е — градиент напряжения, наложенный на электролит; А — коэффициент формы, обычно в диапазоне от 4 до 6, который показывает обратную зависимость подвижности от квадрата радиуса. В терминах молекулярной массы это подразумевает обратную зависимость подвижности от 2/3 единицы молекулярной массы; Q — заряд частицы;
r — радиус частицы;
- вязкость электролита.
Влияние величины pH. Электрофоретическая подвижность зависит от величины рН раствора, влияющей на степень ионизации вещества. В качестве примера на рисунке приведена зависимость подвижности глицина от величины рН.
Рисунок. Зависимость подвижности глицина от величины рН
Значения рKа 2,2 и 9,9 совпадают с точками перегиба графика. Так как соответствующие функциональные группы на 50% ионизированы при тех значениях, где рН = pKa, то электрофоретическая подвижность в этих точках составляет половину от величины, наблюдаемой для полностью ионизированного катиона и аниона, существующего при очень низком и очень высоком значении рН, соответственно. Цвиттер-ион, который существует в промежуточном диапазоне значений рН, электрически нейтрален и имеет нулевую подвижность. Влияние ионной силы и температуры. Электрофоретическая подвижность уменьшается с увеличением ионной силы применяемого электролита. Ионная сила определяется как:
,
где: Сi — концентрация иона, моль/л;
Zi — валентность иона.
Для буферных растворов, в которых и анион, и катион являются одновалентными, ионная сила равна молярности. Ионная сила электролитов, используемых для электрофореза, обычно выбирается в пределах от 0,01 до 0,10, что зависит от состава образца, так как буферная емкость должна быть достаточно большой, чтобы поддерживалось постоянное значение рН по области расположения зон компонентов. Температура влияет на подвижность косвенно, так как вязкость применяемого электролита является величиной, зависимой от температуры. Вязкость воды уменьшается приблизительно на 3% при изменении температуры на 1 °С в диапазоне температур от 0 до 5 °С и, с меньшей скоростью, в диапазоне комнатных температур. Поэтому подвижность увеличивается с увеличением температуры электролита.
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами вып. 1 ОФС.1.1.0014.15
Взамен ГФ X
Взамен ст. ГФ XI
В данной общей фармакопейной статье изложены основные методы планирования и статистической обработки результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами. В данной статье используются следующие основные условные обозначения: а — свободный член линейной регрессии;
b — угловой коэффициент линейной регрессии [тангенс угла наклона линии зависимости величины ответа тест-объекта от логарифма дозы (дозозависимости) <>];
<> В разделе 4.5 a, b, c и d — число положительных и отрицательных ответов на 2 сравниваемых испытуемых препарата, применяемых для вычисления значения критерия Пирсона.
d, — разность некоторых величин;
e — основание натурального логарифма;
f — число степеней свободы;
k — число препаратов в испытании (включая стандартный образец), умноженное на количество доз в испытании; n — число ответов в группе;
p — уровень значимости;
s2 — дисперсия;
s — среднее квадратическое отклонение;
s1, s2, и s3 — малая, средняя и большая доза стандартного образца ; t — критерий Стьюдента (приложение, табл. II); u1, u2, и u3 — малая, средняя и большая доза испытуемого препарата ; х, у — ответ тест-объекта <>;
<> В разделе 2 символом «х» обозначен логарифм дозы.
и и — средний ответ на стандартный образец и испытуемый препарат;
- значение критерия Пирсона; AU — ожидаемая активность испытуемого препарата; B — сумма ответов за 2 дня для каждого животного (двойной перекрест); С — статистика, применяемая для вычисления доверительного интервала, а также сумма столбцов в методе случайных блоков и латинском квадрате; DI и DII — сумма ответов в первый и второй день двойного перекреста; Е — сумма квадратов показателя «Регрессия»; F — значение критерия Фишера (отношение большей дисперсии к меньшей, см. приложение, табл. III); I — десятичный логарифм соотношения доз; К — поправочный коэффициент для дисперсионного анализа; L — разность логарифмов верхней и нижней доверительной границы биологической активности; LS и LU — линейные контрасты стандартного образца и испытуемого препарата; МU — десятичный логарифм биологической активности испытуемого препарата;
- величина, на которую найденная биологическая активность испытуемого препарата отличается от его ожидаемой биологической активности (в логарифмическом виде); N — общее число ответов в опыте; Р — доверительная вероятность <>;
<
> В разделе 4.2.1 «Р» — значение пробита, а в разделе 4.5 «Р» — статистика, вычисляемая по формуле Фишера.
Q1, Qn — контрольные критерии выявления грубых ошибок; QS и QU — квадратический контраст для стандартного образца и испытуемого препарата в дисперсионном анализе; R — сумма блоков в методе случайных блоков или сумма строк в методе латинского квадрата; RU — биологическая активность испытуемого препарата (10Mu);
- стандартный образец; S — суммарный ответ на стандартный образец; S1, S2 и S3 — суммарные ответы на малую, среднюю и большую дозу стандартного образца ;
- испытуемый препарат; U — суммарный ответ на испытуемый препарат; U1, U2 и U3 — суммарные ответы на малую, среднюю и большую дозу испытуемого препарата ; W — весовой коэффициент для пробит-метода (приложение, табл. VI), а также весовой коэффициент для объединения независимых биологических испытаний (раздел 5).
- ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА БИОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
Во многих случаях физических и химических анализов достаточно для полной характеристики свойств лекарственных средств. Однако физические и химические показатели не всегда в полной мере отражают терапевтическое действие лекарственного средства. В подобных случаях необходимо определение его биологической активности при помощи непосредственного биологического исследования. Часто показатель, характеризующий биологическую активность лекарственного средства, учитывают в количественной форме: например концентрация глюкозы в крови при определении биологической активности инсулина, время свертывания крови при действии гепарина и т.д. В этом случае конечным результатом испытания следует считать среднее значение у (ответа тест-объекта), а точнее — его доверительный интервал.
Пример 1. При внутрибрюшинном введении 7 мышам раствора гексенала в дозе 100 мг/кг получены следующие величины продолжительности наркоза yi (в минутах): 35; 83; 53; 60; 71; 62; 39. Расчет проводят по следующим формулам при Р = 95%:
средний ответ мин.,
где n — число животных в опыте;
дисперсия ответа ;
среднее квадратичное отклонение s = 16,97; число степеней свободы f = n -1 = 6;
критическое значение критерия Стьюдента: t(0,05; 0,6) = 2,45 (см. табл. II приложения);
полуширина доверительного интервала ;
; ymin = 41,9 мин.; ymax = 73,3 мин.
Одной из важнейших задач биологических испытаний биологически активных веществ является сравнение испытуемого лекарственного средства со стандартным образцом <>, для чего испытание проводят одновременно на двух или более группах животных или других тест-объектах. При составлении этих групп следует обеспечивать однородность тест-объектов (по полу, возрасту, массе тела, условиям содержания и т.д.) внутри групп, а также распределение тест-объектов по группам при помощи методов рандомизации. Кроме того, следует стремиться к тому, чтобы число тест-объектов во всех группах было одинаково. Это является условием применимости ряда процедур статистического анализа и всегда упрощает вычисление.
<> В дальнейшем для удобства лекарственное средство с неизвестной биологической активностью будет называться «испытуемый препарат».
Если по какой-либо причине (ошибка в эксперименте, гибель животного, не связанная с испытанием) в некоторых из групп выпал один или несколько результатов, можно уравнять численность групп одним из следующих способов: а) исключить из больших групп по одному результату, но обязательно с применением рандомизации; б) прибавить к каждой из меньших групп один результат, равный среднему из оставшихся в этой группе результатов, но в дальнейших расчетах число степеней свободы, относящихся к данной группе, должно считаться на единицу меньшим. Выбор способа выравнивания численности в группах зависит, главным образом, от числа групп, в которых образовались пробелы. Эти процедуры можно применять и при различии в численности групп на 2-3 или большее число единиц, но это всегда менее желательно, так как снижает точность и надежность окончательных выводов по результатам испытания. Сравнение стандартного образца и испытуемого препарата (ИП), то есть проверка того, одинаковы ли их биологические активности, производится при помощи критерия Стьюдента:
, где f = ni — 1;
,
при f = n1 + n2 — 2 = 16 и P = 95%.
Пример 2. Опыт, описанный в примере 1, был повторен на другой группе из 7 мышей, но за 15 мин. до введения гексенала вводили (также внутрибрюшинно) акрихин в дозе 150 мг/кг. Длительность наркоза Yi оказалась (в минутах): 75; 78; 114; 110; 93; 100; 87. Требуется выяснить, влияет ли предварительное введение акрихина на действие гексенала. Расчет по вышеуказанным формулам дает: yi = 93,9 мин.; = 226,48, s1 = 15,05, f1 = 6, fобщ. = 12, tнабл. = 4,23, tкритич. (0,05;12) = 2,18. Из этого можно заключить, что вероятность того, что акрихин влияет на действие гексенала, превышает 95%. Примечание. Если превышает критическое значение критерия Фишера (приложение, табл. III), то для вычисления наблюдаемого значения критерия Стьюдента следует применять формулу:
при .
Вычисленное значение tнабл. сравнивают с tкритич., как указано выше (число степеней свободы f округляют до целого числа). Критическое значение критерия Стьюдента можно также найти в приложении (табл. II). При сравнении биологических активностей вероятность различия 95% может считаться приемлемой. Но, если, например, решается вопрос об отсутствии вредных побочных действий, то требования к вероятности значительно возрастают. При подозрении особо опасного побочного действия «степень риска» (1 — P) = p (эту величину называют уровнем значимости) следует снижать до значений 10-4 или даже меньших; соответствующие критические значения t (p, f) можно найти в специальных математико-статистических таблицах или с помощью компьютерных программ. Если выбран определенный уровень значимости p, то при t > t (p) или t > t (P) различие считается значимым. В этом случае вычисляют доверительный интервал разности сравниваемых показателей. Чувствительность указанного метода сравнения двух ИП значительно возрастает, если можно организовать испытание их на ряде достаточно однородных (сопряженных) пар тест-объектов. Сопряженную пару могут составить, например, животные из одного помета, одинакового пола и близкой массы тела или, если это допускается методикой испытания, 2 повторных определения на одном животном с достаточным разрывом во времени, обеспечивающим восстановление исходного состояния после первого опыта. При использовании n сопряженных пар y1, , y2, …yn, составляют ряд разностей , , и вычисляют величину:
,
где ,
.
Полученную величину t сравнивают с табличным значением t (p, f) для принятого уровня значимости p и числа степеней свободы f= n — 1.
Пример 3. Пусть тест-объекты N 1, 2,… 7 из примера 1 были сопряжены с тест-объектами N 3, 1, 5, 2, 6, 4, 7 из примера 2 (в каждой паре были мыши из одного помета примерно с одинаковой массой тела). Тогда получается: d = 254/7 = 36,3, sd = 27,27, t =3,52, в то время как t (Р = 95%, f = 6) = 2,45 и t (Р = 99%, f = 6) = 3,71; t(Р = 99,9%, f = 6) = 5,96.
2. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ РАСЧЕТОВ
В подавляющем большинстве случаев в интервале обычно применяемых доз фармакологический эффект (когда он выражается количественно), связан линейно с логарифмом дозы. Эту связь отражает уравнение линейной регрессии:
y = a + bx,
где: a — свободный член линейной регрессии; b — угловой коэффициент линейной регрессии; х — логарифм дозы.
Определение биологической активности проводят путем сравнения линий дозозависимости стандартного образца и испытуемого препарата. В процессе статистической обработки результатов биологического испытания для того, чтобы проверить правильность проведенного опыта и вычислить его дисперсию, проводят дисперсионный анализ, с помощью которого определяют следующие компоненты или источники дисперсии (показатели): — линейность (при использовании не менее трех доз стандартного образца и испытуемого препарата) <>;
<> Для «лианеризации» дозозависимости ответы тест-объектов (y) можно подвергать различным преобразованиям (логарифмировать, извлекать квадратный корень, возводить в квадрат и др.).
- параллельность;
- дозозависимость;
- блоки или строки (при необходимости);
- столбцы (при необходимости);
- дни x параллельность (при необходимости);
- другие вспомогательные показатели. Затем вычисляют биологическую активность испытуемого препарата относительно стандартного образца (ее среднее значение и доверительные границы). Объединение результатов двух и более биологических испытаний одного и того же препарата проводят согласно разделу 5 «Объединение результатов независимых определений биологической активности». Ниже, в качестве примеров, приведены рекомендуемые алгоритмы вычисления биологической активности испытуемых препаратов в зависимости от типа ответа тест-объектов и наиболее распространенных видов постановок. Для расчетов можно использовать электронные таблицы <>. Возможно применение специального валидированного статистического (в т.ч. биометрического) программного обеспечения, в котором могут быть реализованы общие методы анализа, а также другие методы определения специфической фармакологической активности, например, четырехпараметрический метод анализа S-образных кривых для иммунологических лекарственных средств (3.9).
<
> При этом за счет разницы в точности вычислений полученные результаты могут незначительно отличаться от приведенных в статье.3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ, ОСНОВАННЫЕ НА КОЛИЧЕСТВЕННОМ ОТВЕТЕ
3.1. Обработка результатов двухдозовой рандомизированной постановки (на примере биологической активности гонадотропина хорионического)
Если в качестве тест-объекта используют крыс-самок, то в качестве ответа животного принимают отношение массы матки в мг к массе тела в г. В случае использования самцов, ответ животного представляет собой отношение массы добавочных половых желез в мг к массе тела в г. Схема расчетов при этом абсолютно одинакова. В табл. 1 даны ответы крыс-самок на введение двух доз стандартного образца и двух доз испытуемого препарата.
Таблица 1
Ответы y
Группа 1
Группа 2
Группа 3
Группа 4
s1
s2
u1
u2
0,398
2,233
0,533
3,447
0,443
2,129
0,663
3,123
0,483
2,872
0,434
3,354
0,623
2,732
0,710
1,769
0,462
3,043
0,637
4,382
0,619
2,717
0,470
3,525
0,436
2,939
0,650
3,331
0,495
1,785
0,600
3,995
0,568
3,474
0,820
2,977
0,593
3,120
0,512
2,556
Таблица 2
Суммы ответов и контрасты
Стандартный образец
Испытуемый препарат
Сумма
Малая доза
S1 = 5,12
U1 = 6,03
Большая доза
S2 = 27,04
U2 = 32,46
Сумма
S = 32,16
U = 38,49
Линейный контраст
LS =S2 — S1 = 21,92
LU=U2 — U1 = 26,43
Для того чтобы проверить правильность проведенного опыта и вычислить его дисперсию, проводят дисперсионный анализ полученных данных. При этом рассчитывают значения дисперсий для 6 источников дисперсии (см. табл. 3). Для этого на основании данных, представленных в табл. 1 и 2, а также поправочного коэффициента, вычисляют суммы квадратов источников дисперсии.
Поправочный коэффициент ;
;
;
;
;
;
Отклонение = итог — обработки = 67,23 — 59,94 = 7,29.
Таблица 3
Сводная таблица дисперсионного анализа (двухдозовая рандомизированная постановка)
Источник дисперсии (показатель)
Число степеней свободы (f)
Сумма квадратов
Средний квадрат,
Наблюдаемое значение критерия Фишера Fнабл. Критическое значение критерия Фишера Fкритич. Препараты
1
0,99
0,99
Регрессия
1
58,44
58,44
292,2
> 7,40 (Р = 99%)
Параллельность
1
0,51
0,51
2,55
< 4,11 (Р = 95%)
Обработки
k — 1 = 4 — 1 = 3 = fоб.
59,94
19,98
Отклонение
N — 1 — fоб. — m = 39 — 3 = 36
7,29
0,20
Итог
N — 1 — m = 39
67,23
n = 10 (число ответов в группе);
N = 40 (общее число ответов в опыте);
m = 0 (число утраченных и замененных значений).
Значимость различий дисперсий проверяют с помощью критерия Фишера. Обязательным является выполнение требований для показателей «Регрессия» и «Параллельность». Эти требования заключаются в том, что для «Регрессии» наблюдаемое значение критерия Фишера должно быть больше критического (Р = 99%), а для «Параллельности» — меньше критического (Р = 95%). Для того чтобы найти Fнабл. средние квадраты показателей делят на средний квадрат показателя «Отклонение». Полученные результаты сравнивают с табличными критическими значениями критерия Фишера (приложение, табл. III). Число степеней свободы f1 = 1, а f2 = 36. Дисперсионный анализ показал правильность результатов опыта: статистическую значимость дозозависимости («Регрессия») и параллельность 2 линий регрессии («Параллельность»).
Вычисление биологической активности и ее доверительных границ. Соотношение доз равно 2, следовательно I = lg 2,0 = 0,3010; t = 2,03 при f = 36 и P = 95%;
;
;
;
;
АU = 1000 ЕД/фл.;
;
Биологическая активность RU = 103,039 = 1093,96 ЕД/фл.; С = E/(Е — s2t2) = 58,44/(58,44 — 0,20 · 2,032) = 1,014.
Логарифмические доверительные границы биологической активности испытуемого препарата вычисляют по формуле:
.
Логарифмические доверительные границы биологической активности испытуемого препарата составляют 0,0036 и 0,0755. Нижняя и верхняя доверительная граница составляет и , т.е. 1008,3 и 1189,9 ЕД/фл. соответственно.
3.2. Обработка результатов трехдозовой рандомизированной постановки (на примере биологической активности гонадотропина хорионического)
Если в качестве тест-объекта используют крыс-самок, то в качестве ответа животного принимают отношение массы матки в мг к массе тела в г. В случае использования самцов, ответ животного представляет собой отношение массы добавочных половых желез в мг к массе тела в г. Схема расчетов при этом абсолютно одинакова. В табл. 4 даны ответы крыс-самок на введение трех доз стандартного образца и трех доз испытуемого препарата.
Таблица 4
Ответы y
Группа 1
Группа 2
Группа 3
Группа 4
Группа 5
Группа 6
s1
s2
s3
u1
u2
u3
0,398
1,583
2,233
0,533
1,655
3,447
0,443
0,780
2,129
0,663
0,935
3,123
0,483
2,380
2,872
0,434
1,973
3,354
0,623
0,984
2,732
0,71
2,199
1,769
0,462
1,265
3,043
0,637
0,886
4,382
0,619
1,568
2,717
0,47
1,097
3,525
0,436
1,167
2,939
0,65
2,447
3,331
0,495
1,743
1,785
0,600
1,941
3,995
0,568
1,375
3,474
0,820
1,151
2,977
0,593
1,375
3,120
0,512
2,804
2,556
Таблица 5
Суммы ответов и контрасты
Стандартный образец
Испытуемый препарат
Сумма
Малая доза
S1 = 5,12
U1 = 6,03
Средняя доза
S2 = 14,22
U2 = 17,09
Большая доза
S3 = 27,04
U3 = 32,46
Сумма
S = 46,38
U = 55,58
Линейный контраст
LS = S3 — S1 = 21,92
LU = U3 — U1 = 26,43
Квадратический контраст
Qs = S1 — 2S2 + S3 = 3,72
QU = U1 — 2U2 + U3 = 4,31
Для того чтобы проверить правильность проведенного опыта и вычислить его дисперсию, проводят дисперсионный анализ полученных данных. При этом рассчитывают значения дисперсий для 8 источников дисперсии (см. сводную табл. 6). Для этого на основании данных, представленных в табл. 4 и 5, а также поправочного коэффициента, вычисляют суммы квадратов источников дисперсии.
Поправочный коэффициент ;
;
;
;
;
;
;
;
Отклонение = итог — обработки = 74,04 — 60,9 = 13,14.
Таблица 6
Сводная таблица дисперсионного анализа
(трехдозовая рандомизированная постановка)
Источник дисперсии (показатель)
Число степеней свободы (f)
Сумма квадратов
Средний квадрат,
Наблюдаемое значение критерия Фишера Fнабл. Критическое значение критерия Фишера Fкритич. Препараты
1
1,41
1,41
Регрессия
1
58,44
58,44
243,5
>7,13(Р = 99%)
Параллельность
1
0,51
0,51
2,13
<4,02 (Р = 95%)
Квадратичность
1
0,54
0,54
2,25
<4,02 (Р = 95%)
Разность квадратичностей
1
0,0002
0,0002
0,0008
<4,02 (Р = 95%)
Обработки
k — 1 = 6 — 1 = 5 = fобщ.
60,9
12,18
Отклонение
N — l — fоб..- m = 59 — 5 = 54
13,14
0,24
Итог
N — l — m = 59
74,04
n = 10 (число ответов в группе);
N = 60 (общее число ответов в опыте);
m = 0 (число утраченных и замененных значений).
Значимость различий дисперсий проверяют с помощью критерия Фишера. Обязательным является выполнение требований для показателей «Регрессия», «Параллельность», «Квадратичность» и «Разность квадратичностей». Для «Регрессии» наблюдаемое значение критерия Фишера должно быть больше критического (Р = 99%), а для остальных показателей — меньше критического (Р = 95%). Для того чтобы найти Fнабл. средние квадраты показателей делят на средний квадрат показателя «Отклонение», Полученные результаты сравнивают с табличными критическими значениями критерия Фишера (приложение, табл. III). Число степеней свободы f1 = 1, а f2 = 54. Дисперсионный анализ показал правильность результатов опыта: статистическую значимость дозозависимости («Регрессия»), параллельность и линейность двух линий регрессии («Параллельность», «Квадратичность» и «Разность квадратичностей»).
Вычисление биологической активности и ее доверительных границ. Соотношение доз равно 2, следовательно I = lg 2,0 = 0,3010; t = 1,958788 + 2,429953/f + 2,189891/f2 + 4,630189/f3 + 1,398179/f9 = 2.00, при f =54 и Р = 95%;
;
;
;
;
Ожидаемая активность АU = 1000 ЕД/фл.;
;
Биологическая активность RU = 103,075 = 1188,50 ЕД/фл.; С = E/(Е — s2t2) = 58,44/(58,44 — 0,24 · 2,002) = 1,017.
Логарифмические доверительные границы биологической активности испытуемого препарата вычисляют по формуле:
.
Логарифмические доверительные границы биологической активности испытуемого препарата составляют 0,0114 и 0,1411. Нижняя и верхняя доверительная граница составляет и , т.е. 1026,6 и 1383,9 ЕД/фл. соответственно.
3.3. Обработка результатов двухдозовой постановки методом случайных блоков (на примере биологической активности окситоцина на петушке)
При использовании петушка в качестве тест-объекта ответом является величина падения артериального давления (мм) после введения двух доз стандартного образца окситоцина и двух доз испытуемого препарата. Порядок введения доз приведен в табл. 10.
Таблица 7
Ответы y
s1
s2
u1
u2
Блоки (R)
12
20
14
20
66
15
23
16
22
76
15
20
14
23
72
15
20
14
24
73
Таблица 8
Суммы ответов и контрасты
Стандартный образец
Испытуемый препарат
Сумма
Малая доза
S1 = 57
U1 = 58
Большая доза
S2 = 83
U2 = 89
Сумма
S = 140
U = 147
Линейный контраст
LS = 26
LU = 31
Для того чтобы проверить правильность проведенного опыта и вычислить его дисперсию, проводят дисперсионный анализ полученных данных. При этом рассчитывают значения дисперсий для 7 источников дисперсии (см. сводную табл. 9). Для этого на основании данных, представленных в табл. 7 и 8, а также поправочного коэффициента, вычисляют суммы квадратов источников дисперсии.
Поправочный коэффициент ;
;
;
;
;
;
Отклонение = Итог — обработки — блоки = 232,94 — 207,69 — 13,19 = 12,06.
Таблица 9
Сводная таблица дисперсионного анализа
(метод случайных блоков)
Источник дисперсии (показатель)
Число степеней свободы (f)
Сумма квадратов
Средний квадрат,
Наблюдаемое значение критерия Фишера Fнабл. Критическое значение критерия Фишера Fкритич. Препараты
1
3,065
3.065
Регрессия
1
203,06
203,06
151,54
>10,56 (Р = 99%)
Параллельность
1
1,565
1,565
1,17
<5,12 (Р = 95%)
Обработки
k — 1 = 4 — 1 = 3 = fоб.
207,69
69,23
Блоки
n — 1 = 3 = fб.
13,19
4,40
3,28
<6,99 (Р = 99%)
Отклонение
N — l — fоб..- fб. — m = 9
12,06
1,34
Итог
N — l — m = 15
232,94
15,53
n = 4 (число ответов на дозу);
N = 16 (общее число ответов в опыте);
m = 0 (число утраченных и замененных значений).
Значимость различий дисперсий проверяют с помощью критерия Фишера. Обязательным является выполнение требований для показателей «Регрессия», «Параллельность» и «Блоки». Для «Регрессии» наблюдаемое значение критерия Фишера должно быть больше критического (Р = 99%), а для «Параллельности» и «Блоков» — меньше критического (Р = 95% и Р = 99% соответственно). Для того чтобы найти Fнабд., средние квадраты показателей делят на средний квадрат показателя «Отклонение». Полученные результаты сравнивают с табличными критическими значениями критерия Фишера (приложение, табл. III). Число степеней свободы f1 = 1 или 3, а f2 = 9. Дисперсионный анализ показал правильность результатов опыта: статистическую значимость дозозависимости («Регрессия»), параллельность двух линий регрессии («Параллельность») и отсутствие статистически значимых различий между блоками («Блоки»).
Вычисление биологической активности и ее доверительных границ. Соотношение доз равно 2, следовательно I = Ig 2,0 = 0,3010; t = 1,958788 + 2,429953/f + 2,189891/f2 + 4,630189/f3 + 1,398179/f9 = 2,262, при f = 9 и Р = 95%;
;
;
;
;
Ожидаемая активность АU = 5 ЕД/мл;
;
Биологическая активность RU = 100,736 = 5,45 ЕД/мл.;
Логарифмические доверительные границы биологической активности испытуемого препарата вычисляют по формуле:
.
Логарифмические доверительные границы биологической активности испытуемого препарата составляют -0,0185 и 0,0950. Нижняя и верхняя доверительная граница составляет и , т.е. 4,79 и 6,22 ЕД/мл соответственно.
3.4. Обработка результатов двухдозовой постановки методом латинского квадрата (на примере биологической активности окситоцина на изолированном органе)
При использовании в качестве тест-объекта изолированного рога матки крысы, ответом является величина его изотонического сокращения в ответ на введение двух доз стандартного образца окситоцина и двух доз испытуемого препарата. Эти сокращения регистрируют в виде амплитуды перемещения писчика механического рычага или пера электронного самописца (см или мм). Порядок введения доз приведен в табл. 10.
Таблица 10
Схема двухдозового латинского квадрата
1.
s1
s2
u1
u2
2.
u2
s1
s2
u1
3.
u1
u2
s1
s2
4.
s2
u1
u2
s1
Таблица 11
Ответы y (см)
Строка
Столбцы
Сумма строк, R
R2
1.
6,50
12,45
9,75
12,5
R1 = 41,20
1697,44
2.
12,20
5,35
12,70
6,10
R2 = 36,35
1321,32
3.
6,40
12,30
5,25
12,85
R3 = 36,80
1354,24
4.
12,80
5,70
11,55
4,30
R4 = 34,35
1179,92
Сумма столбцов (C)
37,90
35,80
39,25
35,75
C2
1436,41
1281,64
1540,56
1278,063
Таблица 12
Суммы ответов и контрасты
Стандартный образец
Испытуемый препарат
Сумма
Малая доза
S1 = 21,40
U1 = 27,95
Большая доза
S2 = 50,80
U2 = 48,55
Сумма
S = 72,20
U = 76,5
Линейный контраст
LS = 29,40
LU = 20,6
Для того чтобы проверить правильность проведенного опыта и вычислить его дисперсию, проводят дисперсионный анализ полученных данных. При этом рассчитывают значения дисперсий для 8 источников дисперсии (см. сводную табл. 13). Для этого на основании данных, представленных в табл. 11 и 12, а также поправочного коэффициента вычисляют суммы квадратов источников дисперсии.
Поправочный коэффициент ;
;
;
;
;
;
Отклонение = итог — обработки — строки — столбцы = = 175,705 — 162,246 — 6,25 — 2,19 = 5,02.
Таблица 13
Сводная таблица дисперсионного анализа
(латинский квадрат)
Источник дисперсии (показатель)
Число степеней свободы (f)
Сумма квадратов
Средний квадрат,
Наблюдаемое значение критерия Фишера Fнабл. Критическое значение критерия Фишера Fкритич. Препараты
1
1,156
1,156
Регрессия
1
156,25
156,25
186,75
>13,75 (Р = 99%)
Параллельность
1
4,84
4,84
5,78
<5,99 (Р = 95%)
Обработки
k — 1 = 4 — 1 = 3 = fоб.
162,246
54,082
Строки
n — 1 = 3 = fстр.
6,25
2,083
2,49
<9,78 (Р = 99%)
Столбцы
n — 1 = 3 = fст.
2,19
0,73
0,872
<9,78 (Р = 99%)
Отклонение
N — l — fоб..- fстр. — fст. — m = 6
5,02
0,837
Итог
N — l — fоб..- fстр. — fст. — m = 6
175,705
11,71
n = 4 (число ответов на дозу);
N = 16 (общее число ответов в опыте);
m — 0 (число утраченных и замененных значений).
Значимость различий дисперсий проверяют с помощью критерия Фишера. Обязательным является выполнение требований для показателей «Регрессия», «Параллельность», «Строки» и «Столбцы». Для «Регрессии» наблюдаемое значение критерия Фишера должно быть больше критического (Р = 99%), а для показателей «Параллельность» (Р — 95%), «Строки» (Р = 99%) «Столбцы» (Р = 99%) — меньше критического. Показатель «Регрессия» характеризует дозозависимость, «Параллельность» — параллельность двух линий регрессии, а «Строки» и «Столбцы» — сбалансированность ответов изолированного органа на протяжении всего опыта. Для того чтобы найти Fнабл. средние квадраты показателей делят на средний квадрат показателя «Отклонение», Полученные результаты сравнивают с табличными критическими значениями критерия Фишера (приложения, табл. III). Число степеней свободы f1 = 1 или 3, а f2 = 6. Дисперсионный анализ показал правильность результатов опыта: статистическую значимость дозозависимости («Регрессия»), параллельность двух линий регрессии («Параллельность») и отсутствие статистически значимых различий между строками и столбцами (см. «Одноименные показатели»). Вычисление биологической активности и ее доверительных границ Соотношение доз равно 2, следовательно I = Ig 2,0 = 0,3010; t = 1,958788 + 2,429953/f + 2,189891/f2 + 4,630189/f3 + 1,398179/f9 = 2,446, при f = 6 и Р = 95%;
;
;
;
;
Ожидаемая активность АU = 5 ЕД/мл;
;
Биологическая активность RU = 100,725 = 5,31 ЕД/мл;
Логарифмические доверительные границы биологической активности испытуемого препарата вычисляют по формуле:
.
Логарифмические доверительные границы биологической активности испытуемого препарата составляют -0,0281 и 0,0816. Нижняя и верхняя доверительная граница составляет и т.е. 4,69 и 6,03 ЕД/мл соответственно.
3.5. Обработка результатов трехдозовой постановки методом латинского квадрата (на примере биологической активности антибиотиков методом диффузии в агар в чашках Петри)
Биологическую активность антибиотиков определяют по зонам угнетения роста микроорганизмов. В каждую чашку Петри вносят по 3 раствора стандартного образца и 3 раствора испытуемого препарата. В качестве ответа принимают диаметр зоны угнетения в мм. Последовательность внесения растворов в лунки или цилиндры приведена в табл. 14.
Таблица 14
Схема трехдозового латинского квадрата
N чашки
Доза
1
s1
s2
s3
u1
u2
u3
2
u3
s1
s2
s3
u1
u2
3
u2
u3
s1
s2
s3
u1
4
u1
u2
u3
s1
s2
s3
5
s3
u1
u2
u3
s1
s2
6
s2
s3
u1
u2
u3
s1
Таблица 15
Ответы y
Строка
Столбцы
Сумма строк (R)
R2
1
16,4
17,6
18,2
16.2
17,2
18.4
R1 = 104,0
10816,00
2
17,8
16,4
17,4
18,2
16,0
17.2
R2 = 103,0
10609,00
3
17,0
18,4
16,6
17,2
18,8
15,4
R3 = 103,4
10691,56
4
16,4
16,6
18,0
16,0
17,6
18,0
R4 = 102,6
10526,76
5
18,2
16,0
17,4
18,6
16,2
17,4
R5 = 103,8
10774,44
6
17,4
18,4
16,2
17,4
18,0
16,0
R6 = 103,4
10691,56
Сумма столбцов (C)
103,2
103,4
103,8
103,6
103,8
102,4
C2
10650,24
10691,56
10774,44
10732,96
10774,44
10485,76
Таблица 16
Суммы ответов и контрасты
Стандартный образец
Испытуемый препарат
Сумма
Малая доза
S1 = 97,6
U1 = 96,2
Средняя доза
S2 = 104,6
U2 = 102,8
Большая доза
S3 = 109,8
U3 = 109,2
Сумма
S = 312,0
U = 308,2
Линейный контраст
LS = 12,2
LU = 13,0
LS + LU = 25,2
Квадратический контраст
Qs = -1,8
QU = -0,2
QS + QU = -2,0
Для того чтобы проверить правильность проведенного опыта и вычислить его дисперсию, проводят дисперсионный анализ полученных данных. При этом рассчитывают значения дисперсий для 10 источников дисперсии (см. сводную табл. 17). Для этого на основании данных, представленных в табл. 15 и 16, а также поправочного коэффициента, вычисляют суммы квадратов источников дисперсии.
Поправочный коэффициент ;
;
;
;
;
;
;
;
;
Отклонение = итог — обработки — строки — столбцы = 29,2922 — 26,9789 — 0,2189 -0,2322 = 1,8622.
Таблица 17
Сводная таблица дисперсионного анализа
(трехдозовый латинский квадрат)
Источник дисперсии (показатель)
Число степеней свободы (f)
Сумма квадратов
Средний квадрат,
Наблюдаемое значение критерия Фишера Fнабл. Критическое значение критерия Фишера Fкритич. Препараты
1
0,401
0,401
4,307
Регрессия
1
26,46
26,46
284,18
>8,1
(Р = 99%)
Параллельность
1
0,027
0,027
0,290
<4,35
(Р = 95%)
Квадратичность
1
0,055
0,055
0,591
<4,35
(Р = 95%)
Разность квадратичностей
1
0,0361
0,0361
0,3877
<4,35
(Р = 95%)
Обработки
k — 1 = 6 — 1 = 5 = fоб.
26,9789
5,39578
Строки
n — 1 = 5 = fстр.
0,2189
0,04378
0,4702
<4,1
(Р = 99%)
Столбцы
n — 1 = 5 = fст.
0,2322
0,04644
0,4988
<4,1
(Р = 99%)
Отклонение
N — l — fоб..- fстр. — fст. — m = 20
1,8622
0,09311 = s2
Итог
N — l — m = 35
29,2922
0,83692
n = 6 (число ответов на дозу);
N = 36 (общее число ответов в опыте);
m = 0 (число утраченных и замененных значений).
Значимость различий дисперсий проверяют с помощью критерия Фишера. Обязательным является выполнение требований для показателей «Регрессия», «Параллельность», «Квадратичность», «Разность квадратичностей», «Строки» и «Столбцы». Для «Регрессии» наблюдаемое значение критерия Фишера должно быть больше критического (Р = 99%), а для показателей «Параллельность» (Р — 95%), «Строки» (Р = 99%) и «Столбцы» (Р = 99%) ~ меньше критического. Показатель «Регрессия» характеризует дозозависимость, «Параллельность» — параллельность двух линий регрессии, «Квадратичность» и «Разность квадратичностей» — линейность дозозависимости, а «Строки» и «Столбцы» — сбалансированность ответов на протяжении всего опыта. Для того чтобы найти Fнабл.. средние квадраты показателей делят на средний квадрат показателя «Отклонение». Полученные результаты сравнивают с табличными критическими значениями критерия Фишера (приложение, табл. III). Число степеней свободы f1 = 1 или 5, f2 — 20. Дисперсионный анализ показал правильность результатов опыта: статистическую значимость дозозависимости («Регрессия»), параллельность двух линий регрессии («Параллельность»), линейность дозозависимости («Квадратичность» и «Разность квадратичностей») и отсутствие статистически значимых различий между строками и столбцами (см. «Одноименные показатели»).
Вычисление биологической активности и ее доверительных границ. Соотношение доз равно 1,5 следовательно I = Ig 1,5 = 0,1761; t = 2,5638 + 5,49059/f + 2,72654/f2 + 31,2446/f3 + 21,6745/f10 = 2,849, при f =20 и Р = 99%;
;
;
;
;
Ожидаемая активность AU =1000 МЕ/мг;
;
Биологическая активность МЕ/мг;
.
Логарифмические доверительные границы биологической активности испытуемого препарата вычисляют по формуле:
.
.
Логарифмические доверительные границы биологической активности испытуемого препарата составляют -0,08610 и 0,01325. Нижняя и верхняя доверительная граница составляет и , т.е. 1030,97 МЕ/мг соответственно.
3.6. Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом А и В)
Биологическую активность инсулина определяют по его гипогликемическому действию.
Таблица 18
Схема двойного перекреста
ГРУППА 1
ГРУППА 2
ГРУППА 3
ГРУППА 4
I ПОСТАНОВКА (день 1)
s1
s2
u1
u2
II ПОСТАНОВКА (день 2)
u2
u1
s2
s1
В качестве ответа животного (y) принимают: — для кролика — сумму двух концентраций глюкозы в крови через 1 ч и 2,5 ч после инъекции инсулина или среднюю величину, на которую снижается концентрация глюкозы в крови через 1 и 2,5 ч после введения инсулина, выраженную в процентах по отношению к исходной (так называемый средний процент снижения); — для мыши — концентрацию глюкозы в крови через 40 мин после инъекции. В обоих случаях схема расчетов одинакова. В данном подразделе приведен пример обработки результатов двойного перекреста на мышах.
Таблица 19
Ответы y (концентрация глюкозы (мг %) в крови животных через 40 мин после инъекции инсулина)
Группа 1
Группа 2
Группа 3
Группа 4
y
Сумма за 2 дня (В)
y
Сумма за 2 дня (В)
y
Сумма за 2 дня (В)
y
Сумма за 2 дня (В)
s1
u2
s2
u1
u1
s2
u2
s1
125
84
209
81
78
159
120
82
202
89
84
173
76
61
137
87
90
177
89
72
161
78
106
184
91
65
156
78
113
191
104
87
191
72
74
146
76
81
157
74
105
179
129
61
190
66
132
198
90
71
161
80
85
165
87
76
163
54
87
141
112
60
172
72
69
141
102
73
175
60
88
148
102
74
176
71
121
192
80
53
133
87
99
186
64
48
112
79
128
207
123
86
209
67
100
167
120
67
187
73
101
174
126
80
206
73
95
168
82
57
139
98
78
176
91
42
133
72
97
169
68
40
108
86
71
157
90
73
163
79
119
198
83
75
158
65
57
122
107
86
193
74
113
187
Таблица 20
Суммы ответов и контрасты
Стандартный образец
Испытуемый препарат
Сумма
День 1
Малая доза
S1I = 1089
U1I = 1248
Большая доза
S2I = 944
U2I = 871
Сумма
SI = 2033
UI = 2119
DI = 4152
День 2
Малая доза
S1II = 1194
U1II = 1096
Большая доза
S2II = 871
U2II = 783
Сумма
SII = 2065
UII = 1879
DII = 3944
Сумма ответов за 2 дня
S = 4098
U = 3998
Линейные контрасты
День 1
LSI = -145
LUI = -377
LI = -522
День 2
LSII = -323
LUII = -313
LII = -636
Сумма
LS = -468
LU = -690
Для того чтобы проверить правильность проведенного опыта и вычислить его дисперсию, проводят дисперсионный анализ полученных данных. При этом рассчитывают значения дисперсий для 11 показателей (см. сводную табл. 21). Для этого на основании данных, представленных в табл. 19 и 20, а также поправочного коэффициента, вычисляют суммы квадратов источников дисперсии.
Поправочный коэффициент ;
;
;
;
;
;
;
;
;
;
Отклонение (1) = блоки — параллельность — (дни х препараты) — (дни х регрессию) = 13547,91; Отклонение (2) = итог — блоки — препараты — регрессия — дни — (дни х параллельность) = 8398,75.
Таблица 21
Сводная таблица дисперсионного анализа
(двойной перекрест)
Источник дисперсии (показатель)
Число степеней свободы (f)
Сумма квадратов
Средний квадрат,
Наблюдаемое значение критерия Фишера Fнабл. Критическое значение критерия Фишера Fкритич. Параллельность
1
513,37
513,37
1,67
<4,06 (Р = 95%)
Дни препараты
1
770,68
770,68
2,50
<4,06 (Р = 95%)
Дни регрессию
1
135,37
135,37
0,44
<4,06 (Р = 95%)
Отклонение (1)
13547,91
307,91
Блоки
2n — 1 = 47
14967,33
318,45
Препараты
1
104,16
104,16
0,55
<4,06 (Р = 95%)
Регрессия
1
13968,38
13968,38
73,18
>7,24 (Р = 99%)
Дни
1
450,66
450,66
2,36
<4,06 (Р = 95%)
Дни параллельность
1
610,05
610,05
3,20
<4,06 (Р = 95%)
Отклонение (2) (дисперсия опыта)
8398,75
190,88
Итог
N — 1 — m = 95
38499,33
N = 96 (общее число ответов в опыте);
n = 24 (число ответов в группе);
m = 0 (число утраченных и замененных значений).
Значимость различий дисперсий проверяют с помощью критерия Фишера. Обязательным является выполнение требований для показателей «Регрессия» и «Дни параллельность», «Регрессия» характеризует дозозависимость, а «Дни параллельность» ~ показатель групповой устойчивости, характеризующий согласованность углов наклона линий дозозависимости в первый и второй день. Для «Регрессии» наблюдаемое значение критерия Фишера должно быть больше критического (Р = 99%), а для показателя «Дни параллельность» — меньше критического (Р — 95%). Для того чтобы найти Fнабл., средние квадраты показателей «Параллельность», «Дни препараты» и «Дни регрессию» делят на средний квадрат показателя «Отклонение (1)», а все остальные — на средний квадрат «Отклонения (2)». Полученные результаты сравнивают с табличными критическими значениями критерия Фишера (приложение, табл. III). Число степеней свободы f1 = 1, а f2 = 44.
Вычисление биологической активности и ее доверительных границ. Соотношение доз равно 2,667, следовательно I = lg 2,667 = 0,4260; t = 1,958788 + 2,429953/f + 2,189891/f2 + 4,630189/f3 + 1,398179/f9 = 2,02 (f = 44 и Р = 95%);
;
;
;
;
АU = 100 ЕД/мл;
;
Биологическая активность RU = 102,0369 = 108,87 ЕД/мл;
Логарифмические доверительные границы биологической активности испытуемого препарата вычисляют по формуле:
.
Логарифмические доверительные границы биологической активности испытуемого препарата составляют 1,9351 и 2,1431. Таким образом, биологическая активность испытуемого препарата равна 108,9 ЕД/мл. Ее доверительные границы составляют 101,9351 — 102,1431 т.е. 86,1 — 139,0 ЕД/мл.
3.7. Статистическая обработка результатов испытания на гистамин
При определении содержания гистамина в лекарственных препаратах в качестве тест-объекта применяют изолированную подвздошную кишку морской свинки, а в качестве ответа — величину ее изотонического сокращения в ответ на введение стандартного образца и испытуемого препарата. Эти сокращения регистрируют в виде амплитуды перемещения писчика механического рычага или пера электронного самописца (см или мм).
Таблица 22
Учет результатов (первичные данные)
Стандартный образец (гистамина дигидрохлорид) Испытуемый препарат (ИП) или его разведение Разведение 3
Разведение 1
Концентрация гистамина дигидрохлорида, г/мл 5,00 ·10-6
1,25 ·10-6
Логарифм концентрации гистамина дигидрохлорида -5,301
-5,903
Высота пика, мм
25,5
30,0
27,5
28,5
24,5
14,0
11,0
10,0
11,5
8,5
17,5
19,5
19,0
12,0
16,0
Среднее значение, см
27,2
11,0
16,8 (y)
- Для каждого разведения стандартного образца и ИП получают не менее 4 пиков, измеряют их высоту (см. табл. 22).
- Вычисляют параметры уравнения линейной регрессии (систематическую погрешность и коэффициент регрессии) для зависимости ответа изолированного органа (высоты пика) от логарифма концентрации стандартного образца: a = 169,8381, b = 26,9076, где: а — свободный член линейной регрессии (отрезок между началом координат и точкой пересечения линии регрессии с осью ординат); b — угловой коэффициент линейной регрессии (тангенс угла наклона линии регрессии).
- Вычисляют, какой концентрации гистамина в пересчете на стандартный образец соответствует средний ответ на введение ИП:
у = а + bх
16,8 = 169,8381 + 26,9076x
логарифм концентрации гистамина в ИП в пересчете на стандартный образец).
10x = 10-5,688 = 2,05 · 10-6 (г/мл) гистамина в ИП в пересчете на стандартный образец. 4) Коэффициент пересчета с гистамина дигидрохлорида на гистамин-основание равен 0,6038, следовательно: 0,6038 · 2,05 · 10-6 = 1,2378 · 10-6 (г/мл) гистамина-основания в ИП. ИП считают прошедшим испытание, если содержание гистамина-основания в неразведенном ИП не превышает максимально допустимое нормативным документом.
3.8. Обработка результатов испытания на пролонгированное (удлиненное) действие лекарственных препаратов инсулина и его апологов
Пролонгированное действие препаратов инсулина определяют путем сравнения их гипогликемического действия с действием раствора стандартного образца инсулина после подкожной инъекции. В качестве тест-объекта используют кроликов, а в качестве ответа — концентрацию глюкозы в крови через 1,0; 1,5; 3,5 и 6,0 ч после введения в % от исходного уровня.
Таблица 23
Ответы (концентрация глюкозы в крови кроликов в мг %)
Стандартный образец
N п/п
Время, ч
0
1,5
3
4,5
6
1
119
30
33
66
115
2
84
19
43
75
90
3
85
32
37
55
87
4
73
43
40
49
81
5
91
24
71
83
95
6
82
48
48
57
75
7
91
21
36
48
92
8
95
44
47
65
111
9
93
25
20
65
95
Сумма
Среднее, мг %
90,33
31,78
41,67
62,56
93,44
319,78
Среднее, %
100,00
35,18
46,13
69,26
103.44
n = 9
Среднее снижение, %
64,82
53,87
30,74
-3,44
Испытуемый препарат
N п/п
Время, ч
0
1,5
3
4,5
6
1
89
41
48
54
74
2
102
36
41
43
68
3
83
36
45
57
72
4
82
47
20
34
61
5
94
62
56
93
34
6
79
40
41
52
48
7
97
19
34
42
79
8
110
47
44
89
73
9
62
35
36
40
44
Сумма
Среднее, мг %
88,67
40,33
40,56
56,00
61,44
287,00
Среднее, %
100,00
45,48
45,74
63,16
69.29
n = 9
Среднее снижение, %
54,52
54,26
36,84
30,71
Для каждого кролика в каждой временной точке рассчитывают индивидуальную относительную концентрацию глюкозы в крови в процентах от исходного уровня данного животного.
Таблица 24
Концентрация глюкозы в крови животных (%) от исходного уровня
Стандартный образец
Время, ч
N п/п
0
1,5
3
4,5
6
1
100,00
25,21
27,73
55,46
96,64
2
100,00
22,62
51,19
89,29
107,14
3
100,00
37,65
43,53
64,71
102,35
4
100,00
58,9
54,79
67,12
110,96
5
100,00
26,37
78,02
91,21
104,4
6
100,00
58,54
58,54
69,51
91,46
7
100,00
23,08
39,56
52,75
101,1
8
100,00
46,32
49,47
68,42
116,84
9
100,00
26,88
21,51
69,89
102,15
Среднее
100,00
36,17
47,15
69,82
103,67
n
9
9
9
9
f
8
8
8
8
s
14,915
16,838
13,085
7,486
t
2,306
2,306
2,306
2,306
x, Р = 95%
11,46
12,94
10,06
5,75
Испытуемый препарат
Время, ч
N п/п
0
1,5
3
4,5
6
1
100,00
46,07
53,93
60,67
83,15
2
100,00
35,29
40,2
42,16
66,67
3
100,00
43,37
54,22
68,67
86,75
4
100,00
57,32
24,39
41,46
74,39
5
100,00
65,96
59,57
98,94
36,17
6
100,00
50,63
51,9
65,82
60,76
7
100,00
19,59
35,05
43,3
81,44
8
100,00
42,73
40
80,91
66,36
9
100,00
56,45
58,06
64,52
70,97
Среднее
100,00
46,38
46,37
62,94
69,63
n
9
9
9
9
f
8
8
8
8
s
13,628
11,99
19,192
15,238
t
2,306
2,306
2,306
2,306
x, Р = 95%
10,48
9,22
14,75
1.1,71
Так как в течение 6 ч средняя относительная концентрация глюкозы в крови кроликов, получивших раствор стандартного образца, достигла 103,7%, то в качестве контрольной точки принимают время, когда она достигла 100% (между 4,5 и 6 ч).
- Расчет контрольной временной точки: 1.1. У группы кроликов, получивших стандартный образец, вычисляют изменение средней относительной концентрации глюкозы в крови на завершающем этапе опыта. Для этого вычисляют разность между средними значениями относительной концентрации глюкозы в крови группы животных, получивших раствор стандартного образца, через 6 и 4,5 ч после введения:
103,67 — 69,82 = 33,85 (%).
1.2. Разность между средним исходным уровнем и средней концентрацией глюкозы через 4,5 ч после введения:
100,00 — 69,82 = 30,18 (%).
1.3. Составляют следующую пропорцию:
1,50 ч 33,85%
(ч) прошло от 4,5 ч до контрольной точки.
1.4. Контрольная временная точка равна: 4,50 + 1,34 = 5,84 (ч).
2. Для каждого животного рассчитывают относительную концентрацию глюкозы в крови в контрольной временной точке. Например, для кролика N 1 в первой группе: 2.1. 96,64 — 55,46 = 41,18 (%) за 1,5 ч с 4,5 до 6 ч. Следовательно, за время, прошедшее от 4,5 до 5,84 ч концентрация глюкозы в крови данного животного возросла на:
(%)
2.2. Поэтому, концентрация глюкозы в крови кролика N 1 в контрольной временной точке составила 55,46 + 36,79 = 92,25 (%). Такие же расчеты проводят и для остальных животных. Полученные результаты переносят в следующую табл. 25.
Таблица 25
Результаты определения пролонгированного действия
Стандартный образец ()
Испытуемый препарат
0
4,5 ч
6 ч
Контрольная точка
5,84 ч
0
4,5
6 ч
Контрольная точка
5,84 ч
100,00
55,46
96,64
92,25
100,00
60,67
83,15
80,75
100,00
89,29
107,14
105,24
100,00
42,16
66,67
64,06
100.00
64,71
102,35
98,34
100,00
68,67
86,75
84,82
100,00
67,12
110,96
106,28
100,00
41,46
74,39
70,88
100,00
91,21
104,4
102,99
100,00
98,94
36,17
42,87
100,00
69,51
91,46
89,12
100,00
65,82
60,76
61,3
100.00
52,75
101,1
95,94
100,00
43,3
81,44
77,37
100.00
68,42
116,84
111,68
100,00
80,91
66,36
67,91
100,00
69,89
102,15
98,71
100,00
64,52
70,97
70,28
100,00
69,82
103,67
100,06 100,00
s2 = 51,446
100,00
62,94
69,63
68,92
s2 = 153,895
Для того чтобы проверить равенство дисперсий в двух группах, делят большую дисперсию на меньшую: , что меньше критического значения критерия Фишера для f1 = f2 = 8 и Р = 95%, равного 3,44 (приложение, табл. III). Это значит, что различие двух дисперсий статистически недостоверно. Поэтому проводят сравнение двух средних значений относительной концентрации глюкозы в крови двух групп животных с помощью критерия Стьюдента по формуле:
, где f = ni — 1;
tкритич. = 1,958788 + 2,429953/f + 2,189891/f2 + 4,630189/f3 + 1,398179/f9 2,120, при f = n1 + n2 — 2 = 16 и P = 95%.
Это говорит о том, что в контрольное время (5,84 ч) средняя относительная концентрация глюкозы в крови кроликов, получивших испытуемый препарат, была достоверно ниже, чем таковая в крови животных, получивших раствор стандартного образца, что свидетельствует о наличии пролонгированного действия испытуемого препарата.
Результаты опыта в графическом виде приведены на рисунке.
Рисунок. Гипогликемические кривые кроликов в % от исходного уровня (определение пролонгированного действия).
Примечание. Если превышает критическое значение критерия Фишера, то для вычисления наблюдаемого значения критерия Стьюдента следует применять формулу:
при .
Вычисленное значение tнабл. сравнивают с tкритич., как указано выше (число степеней свободы f округляют до целого числа). Критическое значение критерия Стьюдента можно также найти в приложениях (табл. II).
3.9. Четырехпараметрический метод анализа S-образных кривых дозозависимости
Данный метод применяют для определения биологической активности иммунобиологических препаратов. Кривая дозозависимости как стандартного образца, так и испытуемого препарата характеризуется 4 параметрами: — верхнее плато ();
— нижнее плато ();
— коэффициент наклона ();
— расстояние между кривыми по оси x (y). Зависимость ответа u от натурального логарифма дозы x выражают следующей формулой:
.
Кривые стандартного образца и испытуемого препарата можно сравнивать при одинаковом наклоне, а также одинаковом уровне верхнего и нижнего плато. Таким образом, кривые должны различаться только по параметру y, который является показателем активности испытуемого препарата. Равенство трех остальных параметров доказывают при валидации методики для рутинных испытаний. Повторная проверка равенства данных параметров необходима только при изменении условий испытания. Четырехпараметрический метод реализован в специальном биометрическом программном обеспечении (например, CombiStats, PLA). В случае отсутствия такого программного обеспечения, можно выбрать линейные участки кривых и сравнить их с помощью метода трехдозовой рандомизированной постановки (3.2).
4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ, ОСНОВАННЫЕ
НА АЛЬТЕРНАТИВНОМ ОТВЕТЕ
При испытаниях некоторых лекарственных средств результат их действия учитывают ее в количественной, а в альтернативной форме (наличие или отсутствие эффекта — гибели, судорог и т.д., иногда это называют реакцией «все или ничего»). В ряде случаев может быть получена величина эффективной (пороговой) дозы ED для каждого отдельного испытуемого препарата: фиксируют ту дозу, при которой получается ожидаемый эффект. Тогда оценкой эффективной дозы для данного испытуемого препарата может служить среднее значение по достаточно большой группе животных. При расчетах найденные индивидуальные эффективные дозы ED заменяют их логарифмами х = lgED, ибо распределение этих логарифмов обычно ближе к нормальному, чем распределение самих доз. После того как вычислены значения:
;
,
находят доверительные границы для эффективной дозы:
.
Величину t(p, ) ищут для числа степеней свободы . Вычисление эквивалентной эффективной дозы и ее доверительных границ производят по формулам:
;
;
;
;
,
a t(P,) ищут для числа степеней свободы . Доверительные границы для отношения эквивалентных эффективных доз равны:
.
Если рассматриваемый эффект не является необратимым, то лучше использовать одну группу тест-объектов, применяя к каждому из них сначала 1 испытуемый препарат, а затем после интервала, необходимого для полного восстановления начального состояния, другой. Получив для каждого тест-объекта разность логарифмов пороговых доз , вычисляют:
,
,
причем t(P,) ищут для числа степеней . Такая постановка испытания позволяет уменьшить влияние изменчивости исходных состояний и параметров тест-объектов и приводит к сужению доверительных интервалов. При этом целесообразно разбить группу тест-объектов на 2 примерно равные подгруппы с тем, чтобы одна из них получала сначала стандартный образец, а затем испытуемый препарат, а другая подгруппа — наоборот. Этим обеспечивается лучшая рандомизация.
Примечание.
Нумерация пунктов дана в соответствии с официальным текстом документа.
4.1.1. Обработка результатов оценки активности испытуемого препарата по сравнению со стандартным образцом на кошках
Из полученных в опыте данных вычисляют величину смертельной дозы испытуемого препарата для каждого животного в миллилитрах на 1 кг массы тела (Y). Находят величину средней смертельной дозы для стандартного образца и испытуемого препарата ( и соответственно), а также их стандартные отклонения ss и su, вычисленные по следующим формулам:
, где ;
;
.
Результаты опытов удовлетворяют требованиям метода, если отношение стандартного отклонения среднего результата Sy к средней смертельной дозе Y не превышает 5,7%. В противном случае необходимо увеличить число опытов. Испытуемый препарат считают прошедшим испытание, если отношение средних смертельных доз стандартного образца и испытуемого препарата составляет 90-110%, а их разность не превышает величины Sd · t. Стандартное отклонение разности рассчитывают по формуле:
.
Критическое значение критерия Стьюдента t для числа степеней свободы при Р = 95% вычисляют как в предыдущих разделах или находят в табл. II приложения.
Таблица 26
Определение биологической активности сердечных гликозидов на кошках по сравнению со стандартным образцом (пример 5)
N п/п
Стандартный образец
Испытуемый препарат
, мл/кг
, мл/кг
1
15,0
3,5
4,00
16,0
2,5
6,25
2
16,3
2,2
0,49
17,1
1,4
1,96 1
3
18,2
0,3
1,44
20,0
1,5
2,25
4
17,8
0,7
0,64
19,5
1,0
1,00
5
17,0
1,5
0,00
20,0
1,5
2,25
6
17,7
0,8
0,49
18,4
0,1
0,01
- 17,0 (мл/кг) ;
- 18,5 (мл/кг) ;
;
;
Отношение стандартного отклонения среднего результата к средней смертельной дозе для стандартного образца и испытуемого препарата соответственно:
;
.
Из полученных данных видно, что значения этих отношений меньше 5,7%. Следовательно, число проведенных опытов достаточно. Активность испытуемого препарата составляет:
.
Среднее отклонение разности равно:
.
Величина t при и Р = 95% равна 2,23.
Следовательно:
sd · t = 0,8 · 2,23 = 1,78 мл/кг.
Так как разность средних смертельных доз составляет 1,5 мл/кг и меньше величины sd · t, равной 1,78, а активность испытуемого препарата составляет 91%, испытуемый препарат следует считать удовлетворяющим по своей активности предъявляемым требованиям.
4.2. Оценка биологической активности
испытуемого препарата при косвенном определении эффективных доз (оценка ED50)
Чаще всего прямое определение эффективной (пороговой) дозы для отдельного животного невозможно, и тогда количественной характеристикой активности испытуемого препарата в каждом опыте служит доля (процент) тест-объектов, давших положительный ответ. Зависимость этой доли от дозы имеет всегда вид S-образной несимметричной кривой, которая при замене доз их логарифмами обычно становится более или менее симметричной. В качестве показателя, характеризующего биологическую активность испытуемого препарата в целом, чаще всего принимается та доза, которая вызывает эффект у 50% тест-объектов; ее называют 50%-й эффективной дозой и обозначают ED50 (в частности, для токсинов употребляется 50-процентная летальная доза ED50). Для нахождения ED50 следует поставить опыты с несколькими (не менее 3) группами тест-объектов (как правило, не менее 6 в каждой группе) при разных дозах. Интервал используемых доз должен обеспечивать достаточно широкий диапазон положительных ответов (примерно от 20 до 80%). После получения процентов pi, положительных ответов для каждой из доз Di, они заменяются так называемыми пробитами yi согласно табл. V приложения. Смысл этой замены состоит в том, что зависимость между пробитами yi, и логарифмами доз хi = lgDi обычно близка к линейной. Эта близость соблюдается тем лучше, чем ближе значение рi к 50%, поэтому для каждой из групп вводится весовой коэффициент wi зависящий от рi; значения wi приведены в табл. VI приложения.
4.2.1. Определение средней смертельной дозы (ED50)
ED50 — доза, при которой погибает половина животных. В опыт взяли 4 группы белых мышей по 6 животных в каждой <>.
<> Равное число животных в группах и равный интервал доз желателен, но не обязателен.
Таблица 27
Учет результатов опыта (яд гюрзы)
Доза, мг/кг (D)
Число погибших животных в группе
Число животных в группе
% погибших животных в группе
Пробит (Р)
Весовой коэффициент (W)
2,50
0
6
0
3,27
1,54
3,75
3
6
50
5,00
5,00
5,00
5
6
83,3
5,962
3,576
6,25
6
6
100
6,73
1.54
11,656
Пробиты и соответствующие им весовые коэффициенты см. табл. V, VI и VII в приложении.
Таблица 28
DW
PW
D2W
PWD
3,850
5,036
9,625
12,590
18,750
25,000
70,313
93,750
17,880
21,320
89,400
106,601
9,625
10,364
60,156
64,776
50,105
61,720
229,494
277,717
Вычисляют LD50:
;
n = 12 (общее число животных в группах, в которых наблюдался эффект от 6,66 до 93,33%). В данном случае, в этот теоретический интервал попадают группы, получившие 3,75 и 5,00 мг/кг.
Число степеней свободы ;
(P = 95%; = 11);
;
;
;
;
;
Нижняя доверительная граница (P = 95%) = LD50 — st = 3,962 — 0,464 · 2,201 = 2,941; Верхняя, доверительная граница (P = 95%) = LD50 + st = 3,962 — 0,464 · 2,201 = 4,983.
4.3. Сравнение ЛД50 двух испытуемых препаратов
Испытуемый препарат 1
Испытуемый препарат 2
LD50 = 3,962 (мг/кг)
LD50 = 2,632 (мг/кг)
Доверительные границы
2,941 — 4,983 мг/кг
Доверительные границы
2,034 — 3,230 мг/кг
n = 12, = 11, P = 95%
n = 24, = 23, P = 95%
s = 0,464
s = 0,289
tкритич. = 2,0346 ( = 34, Р = 95%)
Разность (мг/кг);
Стандартное отклонение этой разности ;
t = 2,0346 при и P = 95%, следовательно, нижняя доверительная граница разности равна d — tsd = 1,330 — 2,0346 · 0,547 = 0,217, а верхняя доверительная граница равна d + tsd = 2,443 (мг/кг). Из того, что tнабл. > tкритичю и доверительные границы d являются положительными величинами, следует, что LD50 испытуемого препарата 1 и испытуемого препарата 2 статистически значимо различаются (Р = 95%).
4.4. Качественное сравнение испытуемых препаратов
Когда какой-либо испытуемый препарат изучают (например, по зависимости доза-эффект) при наличии другого испытуемого препарата с аналогичным действием, может возникнуть необходимость сравнения их эффективности при сопоставимых дозах (обычно при ED50 для каждого). Может потребоваться доказательство эффективности испытуемого препарата по сравнению с плацебо. Составляют следующую таблицу:
Таблица 32
Схема качественного сравнения двух препаратов
Препарат
+
Сумма
Испытуемый препарат 1
а
b
а + b
Испытуемый препарат 2
с
d
с + d
Сумма
а + с
b + d
n
«+» и «-» — тест-объекты, давшие соответственно положительный и отрицательный ответ при действии испытуемого препарата, а a, b, с и d — их число. Число степеней свободы равно 1, поэтому критические значения критерия Пирсона ; ; являются константами. Наблюдаемое значение критерия вычисляют по следующей формуле:
.
Пример 6. Для проверки эффективности вакцины против туберкулеза телятам сначала делали либо предохранительную прививку, либо прививку контрольных средств, а затем заражали микобактериями туберкулеза. С вакцинацией заболели 6 из 20 животных, а без вакцинации — 16 из 19.
Таблица 33
Проверка эффективности вакцины против туберкулеза
—
+
Сумма
С вакцинацией
14
6
20
Без вакцинации
3
16
19
Сумма
17
22
39
.
Это значение превышает критическое значение = 6,63 (P = 95%; = 1), поэтому вакцину следует признать эффективной. Если значение а, b, с или d меньше 3, применение критерия Пирсона не рекомендуется. В таких случаях используют формулу Фишера:
.
При P < 0,01 нулевая гипотеза отвергается, а при P 0,05 - принимается.
5. ОБЪЕДИНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ НЕЗАВИСИМЫХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
При необходимости объединения результатов n определений биологической активности одного и того же испытуемого препарата, применяют следующие способы.
Взвешенное среднее
Если при всех объединяемых биологических испытаниях исходят из одинакового значения ожидаемой активности испытуемого препарата, для каждого опыта рассчитывают весовой коэффициент:
,
где L — разность логарифмов верхней и нижней доверительной границы биологической активности.
Средневзвешенная логарифмическая биологическая активность равна:
Среднее значение объединенной биологической активности = . Стандартное отклонение средней биологической активности обратно пропорционально сумме весовых коэффициентов объединяемых биологических испытаний:
.
Доверительные границы объединенной активности составляют , где t = t(P, ), и при этом число степеней свободы для данного значения критерия Стьюдента равно сумме степеней свободы показателей «Отклонение» объединяемых биологических испытаний (Р = 95%). Однородность полученных результатов проверяют с помощью критерия Пирсона (P = 95%):
,
, где , и P = 95%.
Критические значения критерия Пирсона можно также найти в приложении (табл. IV). Наблюдаемое значение критерия Пирсона должно быть меньше критического <>.
<> В противном случае при определенных условиях можно применять так называемое полувзвешенное среднее (см. руководство к соответствующей статистической компьютерной программе).
Невзвешенное среднее
В случаях, когда расчет взвешенного среднего невозможен, например, при различном значении ожидаемой активности Аи в объединяемых опытах, используют невзвешенное среднее с доверительными границами, основанными на дисперсии между опытами <>.
<> Должно быть не менее 6 опытов.
,
.
Доверительные границы равны при и Р = 95%.
Приложение
Таблица I
Критические значения контрольного критерия Q (Р, n)
n
Q
Р = 90%
Р = 95%
Р = 99%
3
0,89
0,94
0,99
4
0,68
0,77
0,89
5
0,56
0,64
0,76
6
0,48
0,56
0,70
7
0,43
0,51
0,64
8
0,40
0,48
0,58
9
0,38
0,46
0,55
Таблица II
Критические значения критерия Стьюдента
Доверительная вероятность
Доверительная вероятность
Р = 95%
Р = 99%
Р = 99,9%
Р = 95%
Р = 99%
Р = 99,9%
1
12,71
63,60
21
2,08
2,83
3,82
2
4,30
9,93
31,60
22
2,07
2,82
3,79
3
3,18
5,84
12,94
23
2,07
2,81
3,77
4
2,78
4,60
8,61
24
2,06
2,80
3,75
5
2,57
4,03
6,86
25
2,06
2,79
3,73
6
2,45
3,71
5,96
26
2,06
2,78
3,71
7
2,37
3,50
5,41
27
2,05
2,77
3,69
8
2,31
3,36
5,04
28
2,05
2,76
3,67
9
2,26
3,25
4,78
29
2,04
2,76
3,66
10
2,23
3,17
4,59
30
2,04
2,75
3,65
11
2,20
3,11
4,44
40
2,02
2,70
3,55
12
2,18
3,06
4,32
50
2,01
2,68
3,50
13
2,16
3,01
4,22
60
2,00
2,66
3,46
14
2,15
2,98
4,14
80
1,99
2,64
3,42
15
2,13
2,95
4,07
10
1,98
2,63
3,39
16
2,12
2,92
4,02
12
1,98
2,62
3,37
17
2,11
2,90
3,97
20
1,97
2,60
3,34
18
2,10
2,88
3,92
50
1,96
2,59
3,31
19
2,09
2,86
3,88
1,96
2,58
3,29
20
2,09
2,85
3,85
р = 0,05
р = 0,01
р = 0,001
р = 0,05
р = 0,01
р = 0,001
Уровень значимости
Уровень значимости
при P = 95%;
при P = 99%.
Таблица III
Критические значения критерия Фишера
—
число степеней свободы для меньшей дисперсии
- число степеней свободы для большей дисперсии 1 2 3 4 5 6 7 8 20
3
10,13
34,12
9,55 30,81
9,28
29,46
9,12
28,71
9,01
28,24
8,94
27,91
8,88
27,67
8,84
27,49
8,66
26,69
8,53
26,12
6
5,99
13,74
5,14
10,92
4,76
9,78
4,53
9,15
4,39
8,75
4,28
8,47
4,21
8,26
4,15
8,10
3,87
7,39
3,67
6,88
9
5,12
10,56
4,26
8,02
3,86
6,99
3,63
6,42
3,48
6,06
3,87
5,80
3,29
5,62
3,23
5,47
2,93
4,80
2,71
4,31
12
4,75
9,33
3,89
6,93
3,49
5,95
3,26
5,41
3,11
5,06
3,00
4,82
2,91
4,64
2,85
4,50
2,54
3,86
2,30
3,36
15
4,54
8,68
3,68
6,36
3,29
5,42
3,06
4,89
2,90
4,56
2,79
4,32
2,71
4,14
2,64
4,00
2,33
3,37
2,07
2,87
20
4,35
8,10
3,49
5,85
3,10
4,94
2,87
4,43
2,71
4,10
2,60
3,87
2,51
3,70
2,45
3,56
2,12
2,94
1,84
2,42
30
4,17
7,56
3,32
5,39
2,92
4,51
2,69
4,02
2,53
3,70
2,42
3,47
2,33
3,30
2,27
3,17
1,93
2,55
1,62
2,01
60
4,00
7,08
3,15
4,98
2,76
4,13
2,53
3,65
2,37
3,34
2,25
3,12
2,17
2,95
2,10
2,82
1,75
2,20
1,39
1,60
3,84
6,63
3,00
4,61
2,60
3,78
2,37
3,32
2,21
3,02
2,10
2,80
2,01
2,64
1,94
2,51
1,57
1,88
1,00
1,00
Примечание.
В официальном тексте документа первые цифры каждой строки таблицы III выделены жирным шрифтом, вторые — обычным.
F для Р = 95% напечатаны жирным шрифтом, a F для Р = 99% — обычным.
Таблица IV
Критические значения критерия Пирсона
Р = 95%
Р = 99%
Р = 95%
Р = 99%
Р = 95%
Р = 99%
1
3,84
6,63
18
28,9
34,8
35
49,8
57,3
2
5,99
9,21
19
30,1
36,2
36
51,0
58,6
3
7,81
11,3
20
31,4
37,6
37
52,2
59,9
4
9,49
13,3
21
32,7
38,9
38
53,4
61,2
5
11,1
15,1
22
33,9
40,3
39
54,6
62,4
0
12,6
16,8
23
35,2
41,6
40
55,8
63,7
7
14,1
18,5
24
36,4
43,0
41
56,9
65,0
8
15,5
20,1
25
37,7
44,3
42
58,1
66,2
9
16,9
21,7
26
38,9
45,6
43
59,3
67,5
10
18,3
23,2
27
40,1
47,0
44
60,5
68,7
11
19,7
24,7
28
41,3
48,3
45
61,7
70,0
12
21,0
26,2
29
42,6
49,6
46
62,8
71,2
13
22,4
27,7
30
43,8
50,9
47
64,0
72,4
14
23,7
29,1
31
45,0
52,2
48
65,2
73,7
15
25,0
30,6
32
46,2
53,5
49
66,3
74,9
16
26,3
32,0
33
47,4
54,8
50
67,5
76,2
17
27,6
33,4
34
48,6
56,1
при и P = 95%;
при и P = 99%
Для справедливы следующие приближения:
при Р = 95%;
при Р = 99%;
Таблица V
Перевод процентов в пробиты
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
—
2,67
2,95
3,12
3,25
3,36
3,45
3,52
3,59
3,66
10
3,72
3,77
3,82
3,87
3,92
3,96
4,01
4,05
4,08
4,12
20
4,16
4,19
4,23
4,26
4,29
4,33
4,36
4,39
4,42
4,45
30
4,48
4,50
4,53
4,56
4,59
4,61
4,64
4,67
4,69
4,72
40
4,75
4,77
4,80
4,82
4,85
4,87
4,90
4,92
4,95
4,97
50
5,00
5,03
5,05
5,08
5,10
5,13
5,15
5,18
5,20
5,23
60
5,25
5,28
5,31
5,33
5,36
5,39
5,41
5,44
5,47
5,50
70
5,52
5,55
5,58
5,61
5,64
5,67
5,71
5,74
5,77
5,81
80
5,84
5,88
5,92
5,95
5,99
6,04
6,08
6,13
6,18
6,23
90
6,28
6,34
6,41
6,48
6,55
6,64
6,75
6,88
7,05
733
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
99
7,33
7,37
7,41
7,46
7,51
7,58
7,65
7,75
7,88
8,09
Таблица VI
Перевод пробитов в весовые коэффициенты
Пробиты
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
3
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,3
2,6
2,9
3,2
4
3,5
3,7
3,9
4,1
4,3
4,5
4,6
4,7
4,8
4,9
5
5,0
4,9
4,8
4,7
4,6
4,5
4,3
4,1
3,9
3,7
6
3,5
3,2
2,9
2,6
2,3
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
Таблица VII
«Рабочие» пробиты для эффектов, равных 0 и 100%
Число животных в группе (n)
0%
100%
2
3,85
6,15
3
3,62
6,38
4
3,47
6,53
5
3,36
6,64
6
3,27
6,73
7
3,20
6,80
8
3,13
6,87
9
3,09
6,91
10
3,04
6,96
11
3,00
7,00
12
2,97
7,03
13
2,93
7,07
14
2,90
7,10
15
2,87
7,13
16
2,85
7,15
17
2,82
7,18
18
2,80
7,20
19
2,78
7,22
20
2,76
7,24
«Фармацевтический вестник», 2015, N 35
А ВВОЗ И НЫНЕ ТАМ
Импортеров незарегистрированных в России лекарств не слишком обнадежили послабления в правилах ввоза
Возможность не предоставлять при декларировании на таможне оригинал разрешения от Минздрава на ввоз лекарственных препаратов — капля в море чрезмерно зарегулированных отношений между теми, кто в них нуждается, и чиновниками.
Бумажка с печатью
В октябре вступил в силу долгожданный некоторыми участниками фармрынка Приказ Федеральной таможенной службы (ФТС) России N 1219 от 22.06.2015, согласно которому для ввоза не зарегистрированных в стране лекарственных препаратов и биологических материалов не требуется при таможенном декларировании предоставлять разрешительные документы Минздрава. Если раньше бумажку с печатью необходимо было получать на руки и прикладывать к кипе других документов, требуемых таможней, теперь импортеру достаточно будет указать в декларации номер разрешения — и таможенники сами найдут нужный документ в информационной системе. Вздох облегчения должны издать в первую очередь организации, занимающиеся клиническими исследованиями не зарегистрированных в России лекарственных средств, а также пациентские организации и благотворительные фонды, оказывающие медицинскую помощь россиянам с редкими или особо тяжелыми заболеваниями. Однако они, хотя и допускают, что это нововведение, возможно, облегчит им жизнь, не слишком уповают на оперативность чиновников от здравоохранения. Как рассказала «ФВ» исполнительный директор Ассоциации организаций по клиническим исследованиям Светлана Завидова, сложности с прежней системой декларирования ввозимых из-за рубежа препаратов у организации были и, скорее всего, останутся. «Конечно, сложно при прохождении нескольких таможенных постов предоставлять оригинал разрешения от Минздрава. Однако и сейчас нет уверенности в том, что номера этих документов будут оперативно попадать в Единую автоматизированную информационную систему (ЕАИС) ФТС. По крайней мере, полгода назад с этим были проблемы, и таможня называла их единственной причиной нерасторопность чиновников Минздрава», — говорит она. Источник в ФТС подтвердил «ФВ», что за полгода мало что изменилось в отношениях таможни с Минздравом. «Чтобы система работала в оперативном режиме, необходимо актуализировать карту межведомственного взаимодействия, и тогда информация от Минздрава будет попадать к нам тотчас», — поясняет он.
В обе стороны
Между тем Светлана Завидова указывает, что для «клиников» и пациентских организаций важно также, чтобы межведомственное взаимодействие работало в обе стороны. «Когда исследование затягивается или открываются новые центры, и возникает потребность в импорте дополнительных партий препарата, мы вынуждены предоставлять в Минздрав информацию о том, что уже ввезено и в каких объемах. Приходится обращаться в ФТС за этими бумагами, заверять их печатями. При этом в таможне недоумевают: зачем, если вся информация есть в системе?!» — сетует она. В ФТС соглашаются, что сейчас Товарная номенклатура внешнеэкономической деятельности (ТН ВЭД) Таможенного союза работает в одностороннем порядке: «Действительно, по запросу Минздрава мы предоставляем сведения о ввезенных препаратах в бумажном варианте. Их можно занести в ЕАИС, но для этого должна быть разработана другая карта межведомственного взаимодействия, где Минздрав будет потребителем информации, а ФТС — поставщиком. Инициатива должна исходить от Минздрава. Что касается приказа N 1219, на наш взгляд, он облегчит жизнь участникам ВЭД. Следует заметить, что ФТС осуществляет планомерный переход на электронный документооборот и готова работать с импортерами исключительно в безбумажной форме. Дальше — вопрос в заинтересованности в такой работе других ведомств. Но перед ними правительство также поставило задачу по переходу на электронный документооборот». Директор благотворительного фонда помощи детям с заболеваниями в области онкологии и онкогематологии «Жизнь» Карина Михайлова считает разлаженность в информационном обмене между Минздравом и ФТС не самой большой проблемой. «Нам совсем не сложно отвезти нужные чиновникам бумажки. А вот сам процесс получения разрешений на импорт лекарств, на наш взгляд, слишком громоздкий. Ведь чтобы легально ввезти в страну препарат, в котором остро нуждается наш пациент, необходимо собирать консилиум врачей по каждому конкретному случаю. И это в тот момент, когда фактор времени чрезвычайно важен для жизни больного», — делится она.
И.КАЛИНОВСКИЙ
Подписано в печать
29.10.2015
