«Методика определения биосовместимости полимерных материалов и изделий для эндопротезирования по их влиянию на лимфоидную ткань» (утв. Минздравом СССР 27.11.1985)
УТВЕРЖДЕНА
Начальником Управления
по внедрению новых
лекарственных средств
и медицинской техники
Э.А.БАБАЯНОМ
27 ноября 1985 года
МЕТОДИКА
ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОСОВМЕСТИМОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ И ИЗДЕЛИЙ ДЛЯ ЭНДОПРОТЕЗИРОВАНИЯ ПО ИХ ВЛИЯНИЮ НА ЛИМФОИДНУЮ ТКАНЬ
В связи со все увеличивающимся объемом разработок новых материалов и изделий особое значение приобретает разработка экспресс-методов на биологических тест-объектах и тест-системах. Эти методы можно применять в следующих случаях: а) при отборе оптимальных лабораторных образцов материалов и изделий на первом этапе их разработки; б) при оценке различных технологий переработки материалов в изделие; в) при выборе оптимального способа стерилизации изделия; г) при незначительном изменении рецептуры материала; д) при изменении сферы применения хорошо изученного материала.
- ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
При непосредственном введении материалов во внутреннюю среду организма способность их вызывать состояние сенсибилизации иммунокомпетентных систем во многом определяет степень совместимости материала с организмом (биосовместимость). Современная неинфекционная иммунология располагает методами, позволяющими оценить степень биосовместимости вживляемых материалов по характеру их влияния на органы иммунитета, представляемые в организме лимфоидной тканью. Настоящая Методика предполагает комплекс методов оценки состояния лимфоидной ткани при имплантации синтетических материалов. Эти методы апробированы и адаптированы к задачам токсикологической оценки полимеров медицинского назначения. Комплекс предлагаемых методов предназначается для использования в качестве экспресс-метода оценки биосовместимости при отборе перспективных для медицины полимерных материалов, а также в качестве этапа токсикологического изучения при гигиенической оценке материалов и изделий, длительно контактирующих с внутренними средами организма.
2. ПЕРЕЧЕНЬ МАТЕРИАЛОВ И ИЗДЕЛИЙ, ПОДЛЕЖАЩИХ ОЦЕНКЕ НА БИОСОВМЕСТИМОСТЬ
2.1. Материалы для пластики тканей, изготовления эндопротезов или частей и деталей к ним. 2.2. Клеи медицинского назначения.
2.3. Шовные и перевязочные материалы.
2.4. Материалы для микрокапсулирования лекарственных средств. 2.5. Крове- и плазмозаменители.
3. ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛОВ К ИССЛЕДОВАНИЮ
3.1. Твердые материалы должны иметь форму, удобную для имплантации. Предпочтительна форма в виде бруска, имеющего размеры 6x4x2 мм (грани бруска и углы не должны быть острыми). 3.2. Жидкие, порошкообразные и вспенивающиеся материалы готовятся для имплантации в виде порций по 0,5 куб. см (0,5 мл). 3.3. Тканые и пленочные материалы должны иметь размеры 10×10 кв. мм. 3.4. Все материалы, подлежащие оценке на биосовместимость, должны быть стерильны. Способ стерилизации должен соответствовать ОСТ 42-21-2-85 «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения», отобранному для данного вида изделий.
4. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
4.1. Вид животных: белые крысы — самцы линии Вистор или беспородные. 4.2. Количество групп животных в эксперименте должно быть не менее четырех: а) подопытная; б) контроль интактный; в) контроль ложнооперированный; г) контрольная имплантация традиционного биосовместимого материала. 4.2.1. В качестве традиционного биосовместимого материала при оценке нерассасывающихся имплантатов следует применять тефлон, для рассасывающихся — кетгут, для кровезаменителей — поливинилпирролидон мол. массы 12600, для порошкообразных — порошок тефлона или кетгута, для сплавов — сплав КХС. 4.3. Количество животных в группе — не менее 6 голов. 4.4. Продолжительность эксперимента — 1 месяц. 4.5. Сроки взятия лимфоидных органов — через 2 недели и через 4 недели после имплантации. 4.6. Техника операции: под нембуталовым наркозом (доза 40 мг/кг) на наружной поверхности верхней трети бедра крысы делается разрез кожи длиной около 1 см. Анатомическим глазным пинцетом расчленяется бедренная мышца (вдоль волокон), в которой при помощи того же пинцета формируется карман. Изучаемый материал помещается в этот карман. На мышцу накладывается один шов, на кожу два шва. Применяется хирургический шелк высоких номеров. Одной из контрольных групп животных имплантируется биосовместимый материал, другой — производится ложная операция (те же манипуляции без имплантации материала). 4.6.1. В случае изучения жидких или вспенивающихся материалов имплантация производится инъекционным способом.
5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИМФОИДНОЙ ТКАНИ
5.1. Патоморфологический анализ отпечатков лимфатических узлов. 5.1.1. Взятие материала и приготовление отпечатков. Животные забиваются методом декапитации. При вскрытии извлекается правый (регионарный к месту имплантации) и левый (отдаленный) лимфоузлы, освобождаются от жировой ткани и острым лезвием перерезаются поперек. При помощи пинцета половинка узла прикладывается несколько раз к обезжиренному предметному стеклу поверхностью среза. Отпечатки высушиваются на воздухе при комнатной температуре, затем фиксируются метанолом в течение двух минут (или спиртом-ректификатом в течение 15 мин.) и промываются проточной водой. Окраска отпечатков производится стандартными растворами красителей Май-Грюнвальд (в течение 4 мин.) и азур-эозиновой смесью (10 мл красителя на 100 мл дистиллированной воды); окрашивать в течение 45-60 мин. 5.1.2. Проведение анализа отпечатков и техника оформления получаемых результатов. Отпечатки изучаются под микроскопом с применением иммерсии. В отпечатках производится подсчет иммунокомпетентных клеток: малых лимфоцитов, бластов, зрелых плазматических клеток и ретикулярных клеток, а также количество делящихся клеток (митозов). Подсчет клеток производится в 10 полях зрения, и в дальнейшем принимаются во внимание средние (М) из 10 полей зрения показатели для каждого из видов клеток. Поля зрения берутся в разных частях отпечатков, преимущественно в парокортикальных зонах и у основания мозговых тяжей. Запись протокола подсчета клеток производится по нижеприведенному образцу (табл. 1).
Таблица 1
ОБРАЗЕЦ ЗАПИСИ ПРОТОКОЛА ПОДСЧЕТА ВИДОВ КЛЕТОК
Виды клеток Поля зрения М
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Малые лимфоциты 25 20 36 21 30 20 18 26 27 22 24,5
Бласты 8 7 10 4 5 3 6 7 12 4 6,6
Плазматические — — 1 2 — — 1 — — 1 0,5 клетки
Ретикулярные — 1 — 1 — 2 — 1 — — 0,5 клетки
Митозы — — — — — — 1 — — 1 0,2
Примечание.
Нумерация пунктов дана в соответствии с официальным текстом документа.
5.2.1. Взятие материала и приготовление мазков. Взятие материала. Забой животных и взятие материала производится так же, как в п. 5.1.1. Можно использовать лимфоузлы, из которых готовились отпечатки. Приготовление мазков. На предметное стекло в каплю физиологического раствора помещается лимфоузел. Затем при помощи двух инъекционных игл ткань органа размельчается в этой капле до получения гомогенной взвеси. Из капли обычным образом готовится мазок, который высушивается на воздухе при комнатной температуре. Фиксация мазков. Приготовление фиксатора: готовится 60% раствор ацетона (60 мл ацетона и 40 мл дистиллированной воды), куда добавляется трилон (250 мг на 100 мл 60% раствора ацетона); pH раствора 4,8-5,0 (доводить pH 0,1 раствором HCl). Высушенные мазки фиксируются в ацетоновом фиксаторе в течение 30 с, затем промываются в проточной воде и высушиваются на воздухе. 5.2.2. Выявление сукцинатдегидрогеназы и бета-глицерофосфат-дегидрогеназы. Приготовление фосфатного буфера:
а) приготовить раствор калия фосфорнокислого однозамещенного с мол. весом 136,09 (3,78 г растворяют в 100 мл воды); б) приготовить раствор калия фосфорнокислого двузамещенного (4,56 г растворить в 100 мл воды); в) оба раствора слить для получения pH = 7,0 — 7,4 (30 мл раствора калия однозамещенного и 70 мл раствора калия двузамещенного). Буфер хранить в холодильнике.
Приготовление инкубационной среды для выявления сукцинатдегидрогеназы (СДГ): а) 10 мг трилона Б; б) 540 мг сукцината натрия; в) 10 мг паранитротетразолия фиолетового; г) 40 мл фосфатного буфера. Приготовление инкубационной среды для выявления бета-глицерофосфатдегидрогеназы (бета-ГДГ): а) 10 мг трилона Б; б) 650 мг бета-глицерофосфата; в) 10 мг паранитротетразолия фиолетового; г) 10 мг фосфатного буфера. Примечание: п-нитротетразолий лучше добавить после того, как pH среды будет доведен до рабочего.
Приготовление красителя метилового зеленого: 2,7 г уксуснокислого натрия растворить в 100 мл дистиллированной воды, довести ледяной кислотой до pH 4,8-5,0 (1,5 мл) 500 мг метилового зеленого растворить в 100 мл шуфера из уксуснокислого натрия. Смесь очищают при помощи делительной воронки хлороформом до тех пор, пока хлороформ не станет чистым. Выявление ферментов и окраска мазков. Зафиксированные мазки помещают в одну из инкубационных сред (в зависимости от того, какая дегидрогеназа выявляется) и нагревают до 38-39 град. C, после чего помещают в термостат (37 град. C) на 60 минут. После инкубации мазки промывают в проточной воде и окрашивают метиловым зеленым в течение 60 минут. Затем следует отмывка препаратов. 5.2.3. Проведение анализа мазков и техника оформления полученных результатов. Подсчет гранул ферментов в клетках производится под микроскопом с применением иммерсии. В окрашенном препарате лимфоциты и прочие клетки лимфоидного ряда имеют бледно-зеленую окраску. Гранулы фермента располагаются в ядре и цитоплазме, имеют округлую сферическую форму и темно-фиолетовый (почти черный) цвет. Техника анализа мазка предполагает подсчет количества гранул в 50 клетках, последние считают в разных полях зрения, в разных участках мазка. Активность фермента в клетке выражается средним количеством гранул в одной клетке (общее количество гранул в 50 клетках, деленное на 50). Запись протокола подсчета гранул фермента производится по нижеприведенному образцу («0» обозначает отсутствие фермента в клетке).
Таблица 2
ОБРАЗЕЦ ЗАПИСИ ПРОТОКОЛА ПОДСЧЕТА ГРАНУЛ ФЕРМЕНТА
1 5 6 0 0 10 6 0 1 4
0 3 0 0 8 12 15 4 6 0
4 3 2 0 0 8 9 0 6 0
0 5 5 4 0 0 0 8 10 11
4 1 1 2 4 6 0 5 10 0
Коэффициент активности фермента в этом случае равен 158 / 50 = 3,74. 5.3. Гистохимическое выявление рибонуклеиновой кислоты в ткани селезенки по методу Браше. 5.4. Гистохимическое выявление щелочной фосфатазы в лимфоузлах по методу Гомори. 5.5. Определение весовых коэффициентов тимуса и селезенки. 5.6. Оценка результатов экспериментов.
Для оценки степени совместимости материала главное значение имеют данные цитоморфологического анализа лимфоузлов. Эти данные должны получить подтверждение в результате гистохимического исследования селезенки и анализа весовых коэффициентов лимфоидных органов. Цитохимическое определение сукцинатдегидрогеназы и бета-гли-церофосфатдегидрогеназы проводится факультативно, но обязательно в совокупности с гистохимическим определением щелочной фосфатазы в лимфоузлах. Материал следует считать биологически несовместимым, если через 1 месяц после имплантации материалов не наблюдается нормализации показателей или выраженной тенденции к таковой и отличия их от контроля существенны (статистически достоверны). В случае если показатели состояния лимфоидной ткани подопытных животных отличаются от контроля менее существенно (носят характер тенденции к изменению Р, равном или меньше 0,1), вопрос о биологической совместимости исследуемого материала должен решаться с учетом всей совокупности данных токсикологического эксперимента. 5.6.1. Статистическая обработка данных. Для цифровых показателей, получаемых методами, указанными в п.п. 5.1.; 5.2.3.; 5.5., — статистическая обработка обязательна. Она проводится с использованием критерия «t» по Стьюденту. Для результатов цитохимических исследований (п. 5.2.3.) предпочтительнее метод Уилкоксона-Манна-Уитна. Результаты, полученные в опытной группе животных, сравниваются с контролем, которому вживлялся «инертный материал». Если этот контроль не имеет достоверных отличий от ложнооперированного контроля, опытная группа может быть сравнена непосредственно с интактным контролем.
