Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
29 октября 2008 года

Дата введения:
15 декабря 2008 года

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ CRONOBACTER SPP. (ENTEROBACTER SAKAZAKII) В ПРОДУКТАХ ДЛЯ ПИТАНИЯ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2428-08

(в ред. МУК 4.2.3144-13, утв. Роспотребнадзором 26.11.2013)

1. Разработаны Государственным учреждением «Научно-исследовательский институт питания» Российской Академии медицинских наук (В.А.Тутельян, С.А.Шевелева, И.Я.Конь, Н.Р.Ефимочкина, И.Б.Быкова, С.Ю.Батищева).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 октября 2008 г.
4. Введены в действие с 15 декабря 2008 г.
5. Введены впервые.
6. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок контроля и методы определения бактерий Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) — возбудителей пищевых токсикоинфекций у детей раннего возраста — при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи. (в ред. МУК 4.2.3144-13, утв. Роспотребнадзором 26.11.2013) 1.2. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, а также лабораторную диагностику заболеваний с пищевым путем передачи. Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке. 1.3. Контролю на наличие бактерий E. sakazakii подлежат детские молочные смеси и продукты прикорма сухие, а также специализированные продукты для лечебного и профилактического питания детей первого года жизни, при анализе которых на наличие патогенных микроорганизмов, в т.ч. сальмонелл, не были выявлены облигатные патогены, принадлежащие к родам Salmonella, Shigella, Yersinia, группам энтеровирулентных Escherichia coli, но выявлялся рост сопутствующей грамотрицательной неспорообразующей микрофлоры. 1.4. Необходимость контроля указанных групп продукции на наличие E. sakazakii обусловлена регистрацией в последние годы документированных спорадических случаев и вспышек септических инфекций и некротизирующего энтероколита у детей 1 года жизни, в первую очередь недоношенных, новорожденных с низкой массой тела или иммунокомпромиссных. Все случаи заболеваний связаны с употреблением детских молочных смесей, контаминированных E. sakazakii, в т.ч. при очень низких уровнях возбудителя (1-10 КОЕ/г). При этом установлено, что в первую очередь E. sakazakii может попадать в сухие молочные смеси с контаминированными ингредиентами, добавляемыми после сушки, или из окружающей среды в процессе упаковки готового продукта. 1.5. Предлагаемый метод определения бактерий E. sakazakii в пищевых продуктах, предназначенных для детей раннего возраста, предусматривает определение наличия или отсутствия указанных микроорганизмов в определенной массе (объеме) продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе. Настоящие методические указания также предусматривают определение количества E. sakazakii в пищевых продуктах для детей раннего возраста методом наиболее вероятного числа (НВЧ). 1.6. Обнаружение E. sakazakii в 300 г инстантных молочных смесей и продуктов прикорма сухих, предназначенных для детей 1 года жизни, или в 300 г сухих молочных смесей или специализированных продуктов для детей младше 6 месяцев должно рассматриваться как присутствие патогенных бактерий в исследуемых образцах, свидетельствующее о высокой степени риска для детей данной возрастной категории, и служить основанием для запрета использования такой продукции с принятием соответствующих мер, направленных на обеспечение безопасности продуктов детского питания. 1.7. Методические указания носят рекомендательный характер. (п. 1.7 введен МУК 4.2.3144-13, утв. Роспотребнадзором 26.11.2013)

2. Сущность метода

(раздел 2 в ред. МУК 4.2.3144-13,
утв. Роспотребнадзором 26.11.2013)

2.1. Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие неселективные среды для предварительного обогащения проб, пересеве в жидкие селективные среды для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры. Ниже представлена методическая схема определения Cronobacter spp.

Таблица 1

СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯ СУХИХ ДЕТСКИХ СМЕСЕЙ НА НАЛИЧИЕ CRONOBACTER SPP.

Этап
Продолжительность инкубации, ч
Температура
1. Подготовка реактивов и материалов

2. Растворение навесок продукта в забуференной пептонной воде (ЗПВ) в соотношении 1:9 (при необходимости определения количества — навесок массой 100, 10 и 1 г в 3 колбы или пробирки с ЗПВ каждая), смешивание и инкубация 18 +/- 2
37 °С
3. Посев 0,1 куб. см проинкубированной суспензии в селективный питательный бульон для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae и инкубация 24 +/- 2
44 °С
4. Персеев 0,1 мл проинкубированного бульона для выделения Enterobacteriaceae на поверхность хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. или фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-agar) 24 +/- 2
44 °С
5. Отбор 5 подозрительных на Cronobacter spp. колоний с поверхности хромогенного ESIA-агара, отбор всех типов колонии с поверхности фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-agar); пересев на триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) и инкубация 48 +/-2
25 °С
6. Отбор колоний с желтым пигментом, микроскопия по Граму и подтверждение их видовой принадлежности по биохимическим тестам идентификации

7. Интерпретация результатов. При необходимости — подсчет наиболее вероятного числа (НВЧ) по количеству положительных проб в каждой из засеянных навесок продукта

2.2. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к E.sakazakii (Cronobacter spp.). Подтверждение принадлежности к Cronobacter spp. производится путем получения развернутых биохимических характеристик штаммов. Допускается использование тест-систем для биохимической дифференциации энтеробактерий API 20E, Rapid 20E, ID 32E (ф. «БиоМерье», Франция) и др. Определение биохимических характеристик, подтверждающих принадлежность выделенных штаммов к роду Cronobacter spp. и дифференцирующих их от близкородственных представителей энтеробактерий Enterobacter cloacae и Pantoea agglomerans, приведены в табл. 2.

Таблица 2

БИОХИМИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ CRONOBACTER SPP.

Тест или субстрат
Реакции
E. sakazakii (Cronobacter spp.)
E. cloacae
P. agglomerans
Желтый пигмент при 25 °С
+
—
(+)
D-сорбит
—
+
(+)

+
(-)
—
Разжижение желатины (22 °С)
—
—
+
Оксидаза
—
—
—
Лизиндекарбоксилаза
—
—
—
Аргининдигидролаза
+
+
—
Орнитиндекарбоксилаза
+
+
(-)
Утилизация цитратов
+
+
+
Реакция Фогес-Проскауэра
+
+
(+)
Индол
—
—
(-)
Глюкоза
+
+
+
Маннит
+
+
+
Лактоза
+
+
(+)
Сахароза
+
+
(+)
L-рамноза
+
+
0)
D-мелибиоза
+
+
+
Амигдалин
+
—
(-)
Подвижность
+
+
(+)
Мукоидный рост
+
+
+
Примечания:
«+» — 90-100% штаммов положительные; «(+)» — 21-89% штаммов положительные; «-» — 0-9% штаммов положительные; «(-)» — 10-24% штаммов положительные.

Ведущими дифференцирующими признаками Cronobacter spp. являются: — способность к образованию желтого пигмента при культивировании на неселективных средах при температуре 25 °С; — наличие активности на хромогенных средах, содержащих ; — отсутствие способности к ферментации D-сорбита. Для дифференциации Cronobacter spp. от сорбитвариабельных и обладающих желтым пигментом представителей рода Pantoea agglomerans (Syn: Erwinia spp.) используется тест разжижения желатины.».

3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды

3.1. Аппаратура и инструментарий

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH +/- 0,01 ГОСТ 19881-74 Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C ТУ 64-1-28-70-76 Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 37 °C с отклонением от заданной +/- 1 °C ТУ 64-1-1382-83 Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 41,5 °C с отклонением от заданной +/- 1 °C ТУ 64-1-1382-83 Весы лабораторные общего назначения 2 и 4 класса точности с наибольшим пределом
взвешивания 200 г ГОСТ 24104-88 Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБР-1, МБР-3, МБС ГОСТ 8284-78 Стерилизаторы паровые медицинские или
аналогичные ГОСТ 19569-89Е Дистиллятор, обеспечивающий качество
дистиллированной воды в соответствии с ГОСТ 6709-72 Гомогенизатор перистальтического типа «Микс-2»,

 "Стомайкер" или других наименований                  AES Lab,                                                      Cat. N AESAP 1066 Гомогенизатор типа "вортекс" Микропипетки на 200-1000 мкл                         BIOHIT, Cat. N 720040                                                      или "Ленпипет" Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов                             ТУ-16-535-84 Холодильник бытовой электрический                    ГОСТ 16317-87 Пинцет медицинский                                   ГОСТ 21241-89 Ножницы медицинские                                  ГОСТ 21239-89 Скальпель хирургический, 15 см                       ГОСТ 21240-89 Часы механические сигнальные                         ГОСТ 3145-84 Электроплитка                                        ГОСТ 14919-83 

Аппарат универсальный для встряхивания
жидкости в колбах и пробирках
(или другая аппаратура для встряхивания) ТУ 64-1-2451-78

3.2. Лабораторная посуда и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76

Примечание.
ГОСТ 9412-77 утратил силу с 1 января 1996 года в связи с введением в действие ГОСТа 9412-93 «Марля медицинская. Общие технические условия».

Марля медицинская ГОСТ 9412-77 Колбы плоскодонные конические

 или круглые разной вместимости                       ГОСТ 1770-74 Воронки стеклянные                                   ГОСТ 25336-82 Вата медицинская гигроскопическая                    ГОСТ 5556-81 Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см            ГОСТ 29227-91 Пробирки типов П1, П2                                ГОСТ 25336-82 Стекла предметные для микропрепаратов                ГОСТ 6672-75 Спиртовки лабораторные стеклянные                    ГОСТ 23932-90 Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °C (цена деления шкалы 1 °C)             ГОСТ 13646-68 Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов                             ГОСТ 23932-90 Пакеты стерильные для гомогенизатора                 AES Lab.,                                                      Cat. N AES400/50G Отраслевой стандарт для визуальной оценки мутности N 10                                 ГИСК                                                      им. Л.А.Тарасевича Денситометр для бактериальных суспензий типа "Densi-La-Meter" или "Денсимат"                 ф. "Лахема",                                                      "BioMerieux" Стандарт Макфарланда N 1, 2, 3                       ф. "BioMerieux" 

Петля бактериологическая

3.3. Реактивы и питательные среды

 Агар микробиологический                              ГОСТ 17206-84 Вода дистиллированная                                ГОСТ 6709-72 D-глюкоза, ч.                                        ГОСТ 6038-79 D-лактоза, 1-водная                                  ТУ 6-09-22-98-79 

Маннит
D-сорбит
Рамноза

 Калия гидроокись                                     ГОСТ 24363-80 Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч.              ГОСТ 4198-75 Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный          ГОСТ 2493-75 Кислота соляная, х.ч.                                ГОСТ 3118-77 Литий хлористый, ч. или х.ч. или ч.д.а.              ГОСТ 4328-77 Масло иммерсионное для микроскопии                   ГОСТ 31739-78 

Набор реактивов для окраски по Граму
Натрий-аммоний фосфорнокислый

 двузамещенный, 4-водный, ч. или х.ч.                 ГОСТ 4170-78 Натрия гидроокись, ч.д.а.                            ГОСТ 4328-77 Натрий лимоннокислый, 5,5-водный, ч.д.а.             ГОСТ 22280-75 Натрий хлористый, ч. или х.ч. или ч.д.а.             ГОСТ 4233-77 Пара-диметиламинобензальдегид, ч.                    ТУ 6-09-3272-77 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей                             ГОСТ 13805-76 Спирт этиловый ректификованный технический           ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный                       ГОСТ 5962-67 Феноловый красный                                    ГОСТ 5853-51 Фенолфталеин                                         ГОСТ 5850-72 Фуксин основной                                      ТУ 6-09-4119-75 Хлороформ технический                                ГОСТ 2-15-76-72 Уксусная кислота                                     ГОСТ 61-75 

Сульфаниловая кислота
альфа-Нафтол
Цинк порошкообразный ГОСТ 3640 Желатин сухой
Экстракт дрожжевой сухой
Тест-штамм Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii), типичный по культуральным,

 морфологическим и биохимическим свойствам            ГИСК                                                      им. Л.А.Тарасевича 

(в ред. МУК 4.2.3144-13, утв. Роспотребнадзором 26.11.2013) Пептонная вода забуференная (сухая)

 Триптозный ГРМ-агар и ГРМ-бульон                     ФС 42-3377-97                                                      (ГНЦПМ) Питательный бульон и питательный агар                ТУ 10-02-02-789-176-94 Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA)                                   HiMedia M1214 Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB)                                   HiMedia M1263 

Среды Гисса с глюкозой, лактозой, маннитом, рамнозой, дульцитом, адонитом, сахарозой,

 сорбитом                                             ФС (ЦНИИВС                                                      им. И.И.Мечникова                                                      НИИ питательных сред) SIM-arap (сероводород-индол-подвижность)             Difco Среда Эндо                                           ТУ 9229-072-00419785 Агар желчный фиолетово-красный                       ТУ 9229-072-00419785 Среда Кесслер с глюкозой                             ГОСТ 30519-97 Бульон Мак-Конки с глюкозой                          ГОСТ 30519-97 Бульон с желчью, бриллиантовым зеленым и глюкозой                                           ГОСТ 30519-97 

Тест-системы биохимические для видовой
идентификации API 20E, Rapid 20E, ID 32E, для идентификации Enterobacteriaceae
и других грамотрицательных палочек BioMerieux Набор реактивов для окраски по Граму
Набор для постановки оксидазного теста
модифицированный лаурилсульфат триптозный бульон с ванкомицином (мЛСТ с ванкомицином)
(введено МУК 4.2.3144-13, утв. Роспотребнадзором 26.11.2013) Enterobacter sakazakii хромогенный агар  или селективные хромогенные среды аналогичного назначения, соответствующие требованиями стандарта ISO/TS 22964:2006 IDF/RM 210:2006
(введено МУК 4.2.3144-13, утв. Роспотребнадзором 26.11.2013)

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками, прошедших регистрацию в РФ в установленном порядке, после процедуры их стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа.

Питательные среды и биологические препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.

4. Подготовка к анализу

4.1. Приготовление растворов и реактивов

4.1.1. Пептонно-солевой раствор
По ГОСТ 26669-85
4.1.2. Изотонический (0,85%-й водный) раствор хлорида натрия По ГОСТ 26669-85
4.1.3. Приготовление растворов и реактивов для окраски препаратов по Граму По ГОСТ 10444.1 или в соответствии с инструкцией по применению 4.1.4. Стерильный фосфатный буфер с pH 7,2 +/- 0,1 KH2PO4 — 0,45 г, Na2HPO4 — 5,34 г в 1000 куб. см дистиллированной H2O, стерилизовать при температуре 121 °C в течение 30 мин.

4.2. Приготовление питательных сред

4.2.1. Среды промышленного изготовления, поименованные в п. 3.3, готовят согласно прописям на этикетке или в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. 4.2.2. Питательный агар с 5% глюкозы готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе». 4.2.3. Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом, триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом. Состав сред (г/л): ферментативный гидролизат казеина — 17,0; пептон соевый — 3,0; натрий хлористый — 5,0; фосфат калия однозамещенный — 2,5; глюкоза — 2,5; дрожжевой экстракт — 6,0; агар микробиологический (для TSYEA) — 15,0. Компоненты растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин. Готовые среды разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C. 4.2.4. Среда для определения подвижности: 20 г гидролизата казеина ферментативного, 6 г пептона мясного ферментативного и 5 г агара растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2, разливают в пробирки по 5-7 куб. см и стерилизуют при 121 °C в течение 15 мин. 4.2.5. Среды Гисса с углеводами: 10 г пептона ферментативного и 5 г натрия хлористого растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды и добавляют 10 г соответствующего углевода. Устанавливают pH 7,1 +/- 0,1, вносят 10 мл индикатора Андреде (также возможно использование индикатора бромкрезолового пурпурного, «ВР» и др.), разливают в пробирки и стерилизуют при 112 °C в течение 20 мин.

4.2.6. Забуференная пептонная вода

(п. 4.2.6 введен МУК 4.2.3144-13, утв. Роспотребнадзором 26.11.2013)

Состав среды
Концентрация, г/куб. дм
Хлорид натрия (NaCl)
5,0
Ферментативный гидролизат казеина
10,0
Двузамещенный фосфат натрия 12-водный 
9,0
Однозамещенный фосфат калия 
1,5

Компоненты растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН 7,0 +/- 0,2 при 25 °С, и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

4.2.7. Модифицированный лаурилсульфат триптозный бульон (мЛСТ) с ванкомицином

(п. 4.2.7 введен МУК 4.2.3144-13, утв. Роспотребнадзором 26.11.2013)

Состав среды
Концентрация, г/куб. дм
Хлорид натрия (NaCl)
34,0
Пептон ферментативный
20,0
Лактоза
5,0
Однозамещенный фосфат калия 
2,75
Двузамещенный фосфат калия 
2,75
Лаурилсульфат натрия 
0,1

Компоненты растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН 6,8 +/- 0,2 при 25 °С, разливают по 10 мл в пробирки и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин. Приготовление рабочего раствора ванкомицина: 10 мг ванкомицина растворяют в 10 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают и стерилизуют методом мембранной фильтрации. Готовый раствор ванкомицина может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 15 суток. Для получения готовой среды раствор ванкомицина вносят в каждую пробирку со стерильной основой мЛСТ в количестве 0,1 куб. см для получения конечной концентрации ванкомицина в готовой среде 10 мкг/куб. см. Готовая среда может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 1 суток.

4.2.8. Enterobacter sakazakii хромогенный агар 

(п. 4.2.8 введен МУК 4.2.3144-13, утв. Роспотребнадзором 26.11.2013)

Состав среды
Концентрация, г/куб. дм
Панкреатический гидролизат казеина (триптон) 7,0
Дрожжевой экстракт
3,0
Хлорид натрия (NaCl)
5,0
Деоксихолат натрия
0,6
 
0,15
Кристаллический фиолетовый
2 мг
Агар-агар
12,0-18,0 <>

<> В зависимости от способности агара к гелеобразованию.

Компоненты растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН 7,0 +/- 0,2 при 25 °С и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин. Стерилизованную агаровую среду охлаждают до температуры 44-47 °С и разливают по 15 куб. см в стерильные чашки Петри. Готовая среда может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 1 суток.

5. Отбор и подготовка проб к анализу

Примечание.
ГОСТ Р 51446-99 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов» утратил силу с 1 января 2010 года в связи с изданием Приказа Ростехрегулирования от 18.12.2008 N 480-ст.

5.1. Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 «Методы отбора проб для микробиологических анализов», ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов», МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов», ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96). Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования на патогенные микроорганизмы и минимально вдвое превышать аналитический образец. 5.2. От продукции в потребительской таре пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары, с тем чтобы количество было достаточным для проведения анализа. От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров (или неупакованной) пробы отбирают из разных мест с различной глубины, включая поверхность. 5.3. Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб на физико-химические и органолептические анализы стерильным инструментом в стерильную посуду. 5.4. Первичный посев исследуемых проб продуктов на патогенные микроорганизмы проводят в соответствии с порядком, изложенным в МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов». 5.5. При отсутствии роста облигатных патогенов, принадлежащих к родам Salmonella, Shigella, Yersinia, группам энтеровирулентных Escherichia coli, но при обнаружении роста сопутствующей грамотрицательной неспорообразующей микрофлоры в нормируемых навесках исследуемых продуктов, от них отбирают дополнительные пробы (2 навески по 100 г при первичном посеве 100 г продукта, 2 невески по 125 г при первичном посеве 50 г, 2 навески по 137,5 г при первичном посеве 25 г) и анализируют в соответствии с процедурой, изложенной в разделе 6.

6. Проведение анализа

(раздел 6 в ред. МУК 4.2.3144-13,
утв. Роспотребнадзором 26.11.2013)

6.1. Пробы продуктов массой 100 г, 125 г или 137,5 г вносят в забуференную пептонную воду (ЗПВ) по п. 4.2.6 в соотношении 1:9 по объему. Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (18 +/- 2) ч. 6.2. При количественном анализе общая масса (объем) навески должна быть не менее 400 г (куб. см). Из подготовленной по п. 5 пробы отбирают 4 навески (порции) продукта массой 100 г (куб. см) каждая для анализа. Производят посев каждой из трех навесок (порций) в 900 куб. см ЗПВ и перемешивают. Из четвертой навески (порции) массой (объемом) 100 г (куб. см) отбирают три навески (порции) продукта массой 10 г (куб. см) и производят посев в 90 куб. см ЗПВ и перемешивают. Из этой же пробы отбирают три навески (порции) продукта массой 1 г (куб. см) и производят посев в 9 куб. см ЗПВ. Для посева (при необходимости — предполагаемом высоком содержании Cronobacter spp. в продукте) меньших количеств продукта — 0,1 и 0,01 г, делают десятикратно убывающие разведения навески массой 10 г, и вносят по 1 куб. см (х 3) соответствующих разведений в 9 куб. см ЗПВ. Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (22 +/- 2) ч. 6.3. После термостатирования проб продукта в среде для первичного накопления 0,1 куб. см суспензии пересевают в 10 куб. см модифицированного лаурилсульфат триптозного бульона с ванкомицином (арбитражная среда) или в 10 куб. см одной из жидких селективных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae по ГОСТ 29184-91 — среду Кесслер с глюкозой или буферный глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью, или бульон Мак-Конки. Посевы термостатируют при температуре 44 °С в течение (24 +/- 2) ч. 6.4. Из посевов после термостатирования, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, делают пересев штрихом на поверхность хромогенного агара по п. 4.2.8 для выявления Cronobacter spp., содержащего (арбитражная среда), или на поверхность фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-arap). Чашки с агаризованной средой предварительно подсушивают. Посевы термостатируют при температуре 44 °С в течение (24 +/- 2) ч. 6.5. При отсутствии роста на поверхности хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. или VRBG-arapa анализ прекращают и дают заключение об отсутствии Cronobacter spp. в исследованной пробе. 6.6. После этапа селективного обогащения проб для обнаружения Cronobacter spp. (п. 6.3) допускается использовать ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в соответствии с процедурой, изложенной в МУК 4.2.2872-11. При получении отрицательных результатов исследований образцов предварительно обогащенных жидких селективных сред с применением ПЦР анализ прекращают и дают заключение об отсутствии Cronobacter spp. в исследованной пробе. 6.7. При обнаружении на чашках хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. роста подозрительных культур для дальнейшего изучения отбирают 3-5 характерных колоний. При обнаружении на поверхности VRBG-агара роста дальнейшему изучению подвергают все обнаруженные варианты культур, для чего отбирают по 3-5 колоний каждого типа. 6.8. Отобранные для исследования 3-5 характерных колоний пересевают на поверхность триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом и термостатируют при температуре 25 °С в течение (48 +/- 2) ч. В качестве положительного контроля используют референс-штамм E.sakazakii (Cronobacter spp.), типичный по фенотипическим свойствам. 6.9. Культуры, растущие на триптон-соевом агаре с образованием желтого или желто-коричневого пигмента, подвергают дальнейшему изучению для подтверждения принадлежности к Cronobacter spp.

7. Подтверждение принадлежности выделенных культур к Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii)

(в ред. МУК 4.2.3144-13, утв. Роспотребнадзором 26.11.2013)

7.1. Подтверждение принадлежности выделенных культур проводят с применением тест-систем для биохимической идентификации API 20E, Rapid 20E, ID 32E. 7.2. К бактериям Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) относят культуры, имеющие характерные признаки роста на дифференциально-диагностических средах, при микроскопии по Граму окрашенные отрицательно, подвижные, оксидазоотрицательные, соответствующие комплексу признаков, указанных в табл. 2, имеющие желтый пигмент, не ферментирующие сорбит и не разжижающие желатину. Бактерии Е. sakazakii обладают альфа-глюкозидазной активностью. (в ред. МУК 4.2.3144-13, утв. Роспотребнадзором 26.11.2013)

8. Учет результатов

8.1. Результаты оценивают по каждой исследованной пробе отдельно. 8.2. При получении положительного результата подтверждающего анализа дают заключение о выявлении E. sakazakii в исследованной навеске (объеме) продукта. При получении отрицательного результата дают заключение об отсутствии E. sakazakii в исследованной навеске (объеме) продукта. 8.3. Учет результатов при количественном определении. Результат оценивают по каждой исследованной пробе продукта отдельно. Регистрируют число положительных результатов в колбах и пробирках с посевами трех последовательно убывающих масс (объемов) продукта, в которых подтверждено наличие бактерий E. sakazakii при пересеве на твердые питательные среды и последующей идентификации. В зависимости от получаемой комбинации положительных и отрицательных результатов для каждого значения массы (объема) продукта составляют трехзначное число (индекс), по которому, используя таблицу, приведенную в Приложении, находят наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий E. sakazakii, соответствующее их содержанию в 1 г (куб. см) продукта. Для окончательного определения НВЧ бактерий E. sakazakii в анализируемом образце учитывают значение первой выбранной для расчета индекса НВЧ массы (объема) продукта с подтвержденным наличием E. sakazakii. Так, в случае если расчет ведется от посева массы (объема) 100 г (куб. см) (х 3) продукта, количество E. sakazakii в 1 г (куб. см) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ, взятого из таблицы соответственно установленному индексу, на 100. В случае, когда в качестве первого значения для расчета выбрана масса (объем) 10 г (х 3), количество E. sakazakii в 1 г (куб. см) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ из таблицы на 10. Пример: Бактерии E. sakazakii обнаружены в трех повторностях при посеве 100 г, в трех повторностях при посеве 10 г и в одной — при посеве 1 г.

Рисунок не приводится

Результат по числу секторов с подтвержденным ростом бактерий E. sakazakii из трех выбранных масс записывается как индекс 3:3:1, что соответствует НВЧ, равному 46 (см. Приложение). Соответственно, наиболее вероятное число бактерий E. sakazakii составляет 0,46 КОЕ в 1 г продукта. Если значение НВЧ по таблице составляет величину более чем 110 КОЕ (индекс 3:3:3), исследование целесообразно повторить, используя более высокие разведения образца, в которых исходная концентрация продукта будет в 10 или 100 раз ниже, чем в первоначально выбранном значении.

9. Требования безопасности

Исследования пищевых продуктов на наличие Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) проводят в соответствии с СанПиН 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами». (в ред. МУК 4.2.3144-13, утв. Роспотребнадзором 26.11.2013)

10. Нормативные ссылки

(раздел 10 в ред. МУК 4.2.3144-13,
утв. Роспотребнадзором 26.11.2013)

10.1. ГОСТ Р 54005-2010 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae». 10.2. ГОСТ ISO 7218-2011 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям». 10.3. ГОСТ Р 54004-2010 «Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний». 10.4. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов». 10.5. ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов». 10.6. ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе». 10.7. ГОСТ 26809-86 «Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу». 10.8. ГОСТ Р ИСО 707-2010 «Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб». 10.9. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». 10.10. МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов». 10.11. Стандарт ISO/TS 22964:2006 IDF/RM 210:2006 «Milk and milk products — Detection of Enterobacter sakazakii». 10.12. МУК 4.2.2872-11 «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий — возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией». 10.13. Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции».

Приложение

ТАБЛИЦА ДЛЯ РАСЧЕТА НАИБОЛЕЕ ВЕРОЯТНОГО ЧИСЛА МИКРООРГАНИЗМОВ

Число секторов с подтвержденным ростом E. sakazakii (из трех выбранных значений массы (объема)) НВЧ, КОЕ/г, куб. см
Действительное число микроорганизмов в 1 г (куб. см) с вероятностью, % 1,0
0,1
0,01
95
99
от
до
от
до
1
2
3
4
5
6
7
8
0
0
0
< 0,30
0,00
0,94
0,00
1,40
0
0
1
0,30
0,01
0,95
0,00
1,40
0
1
0
0,30
0,01
1,00
0,00
1,60
0
1
1
0,61
0,12
1,70
0,05
2,50
0
2
0
0,62
0,12
1,70
0,05
2,50
0
3
0
0,94
0,35
3,30
0,18
4,60
1
0
0
0,36
0,02
1,70
0,05
2,50
1
0
1
0,72
0,12
1,70
0,05
2,50
1
0
2
1,10
0,40
3,50
0,20
4,60
1
1
0
0,74
0,13
2,00
0,06
2,70
1
1
1
1,10
0,40
3,50
0,20
4,60
1
2
0
1,10
0,40
3,50
0,20
4,60
1
2
1
1,50
0,50
3,80
0,20
5,20
1
3
0
1,60
0,50
3,80
0,20
5,20
2
0
0
0,92
0,15
3,50
0,07
4,60
2
0
1
1,40
0,40
3,50
0,20
4,60
2
0
2
2,00
0,50
3,80
0,20
5,20
2
1
0
1,50
0,40
3,80
0,20
5,20
2
1
1
2,00
0,50
3,80
0,20
5,20
2
1
1
2,00
0,50
3,80
0,20
5,20
2
1
2
2,70
0,90
9,40
0,50
14,20
2
2
0
2,10
0,50
4,00
0,20
5,60
2
2
1
2,80
0,90
9,40
0,50
14,20
2
2
2
3,50
0,90
9,40
0,50
14,20
2
3
0
2,90
0,90
9,40
0,50
14,20
2
3
1
3,60
0,90
9,40
0,50
14,20
3
0
0
2,30
0,50
9,40
0,30
14,20
3
0
1
3,80
0,90
10,40
0,50
15,70
3
0
2
6,40
1,60
18,10
1,00
25,00
3
1
0
4,30
0,90
18,10
0,50
25,00
3
1
1
7,50
1,70
19,90
1,10
27,00
3
1
2
12,00
3,00
36,00
2,00
44,00
3
1
3
16,00
3,00
38,00
2,00
52,00
3
2
0
9,30
1,80
36,00
1,20
43,00
3
2
1
15,00
3,00
38,00
2,00
52,00
3
2
2
21,00
3,00
40,00
2,00
56,00
3
2
3
29,00
9,00
99,00
5,00
152,00
3
3
0
24,00
4,00
99,00
5,00
152,00
3
3
1
46,00
9,00
198,00
5,00
283,00
3
3
2
110,00
20,00
400,00
10,00
570,00
3
3
3
> 110,00