«Газохроматографическое определение концентраций метилового, этилового, изопропилового, пропилового, изобутилового и бутилового спиртов в крови. Методические указания. МУК 4.1.772-99» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 06.07.1999)
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
6 июля 1999 года
Дата введения —
6 сентября 1999 года
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ МЕТИЛОВОГО, ЭТИЛОВОГО, ИЗОПРОПИЛОВОГО, ПРОПИЛОВОГО, ИЗОБУТИЛОВОГО И БУТИЛОВОГО СПИРТОВ В КРОВИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.772-99
- Разработаны под редакцией академика РАЕН, д.м.н., проф. Зайцевой Н.В., к.б.н. Улановой Т.С, к.б.н. Нурисламовой Т.В., Карнажицкой Т.Д., Суетиной Г.Н., Поповой Н.В., Митрофановой В.М., Плаховой Л.В., Рудаковой Е.А. (ПНИКИ детской экопатологии).
- Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 6 июля 1999 г.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 «Методики выполнения измерений», ГОСТа Р 1.5-92 «Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов». Методика анализа метрологически аттестована и обеспечивает определение метилового, этилового, изопропилового, пропилового, изобутилового и бутилового спиртов в моче в следующих диапазонах:
метанол
0,016 — 2,0 мкг/куб. см,
этанол
0,010 — 2,0 мкг/куб. см,
изопропанол
0,005 — 2,0 мкг/куб. см,
пропанол
0,005 — 2,0 мкг/куб. см,
изобутанол
0,003 — 1,0 мкг/куб. см,
бутанол
0,003 — 1,0 мкг/куб. см.
МЕТИЛОВЫЙ СПИРТ
Мол. масса — 32,04
Метиловый спирт (метанол, древесный спирт) — бесцветная жидкость с характерным запахом. — 64,51 °С, — минус 97,88 °С. Растворим в воде, этиловом спирте, эфире, ацетоне, бензоле. Сильный, преимущественно нервный и сосудистый яд с резко выраженным кумулятивным эффектом. Типичны поражения зрительного нерва и сетчатки глаза. Пары метилового спирта сильно раздражают оболочки глаз и дыхательных путей. Относится ко 2 классу опасности.
ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ
Мол. масса — 46,07
Этиловый спирт (этанол, винный спирт) — бесцветная жидкость с характерным запахом. — 78,39 °С, — минус 114,15 °С. Смешивается в любых отношениях с водой, спиртами, эфиром, глицерином и другими растворителями. Оказывает наркотическое действие, класс опасности — 4.
ИЗОПРОПИЛОВЫЙ СПИРТ
Мол. масса — 60,09
Изопропиловый спирт (2-пропанол) — бесцветная жидкость с характерным спиртовым запахом. — 22,50 °С, — минус 89,5 °С. Смешивается в любых отношениях с водой, этиловым спиртом, Эфиром, растворим в ацетоне, хорошо растворим в бензоле. Раздражает слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей. Пары могут повредить сетчатку глаза и зрительный нерв. Относится к 4 классу опасности.
ПРОПИЛОВЫЙ СПИРТ
Мол. масса — 60,09
Пропиловый спирт (пропанол) — бесцветная жидкость с характерным спиртовым запахом. — 97,2 °С, — минус 126,2 °С. Смешивается в любых отношениях с водой, этиловым спиртом, эфиром, растворим в ацетоне, хорошо растворим в бензоле. Пары раздражают слизистые глаз и верхних дыхательных путей. Пропиловый спирт относится к 4 классу опасности.
БУТИЛОВЫЙ СПИРТ
Мол. масса — 74,12
Бутиловый спирт (1-бутанол) — бесцветная жидкость с характерным запахом. — 117,4 °С, — минус 89,53 °С. Смешивается в любых отношениях с этиловым спиртом, эфиром, хорошо растворим в ацетоне. Наркотик с раздражающим действием паров на слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей. Относится ко 2 классу опасности.
ИЗОБУТИЛОВЫЙ СПИРТ
Мол. масса — 74,12
Изобутиловый спирт — бесцветная жидкость с характерным запахом. — 29 °С, коэффициент распределения масло/вода — 0,44. Смешивается в любых отношениях с этиловым спиртом, эфиром, хорошо растворим в ацетоне. Наркотик с раздражающим действием паров на слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей. Относится ко 2 классу опасности.
Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью результата измерений при доверительной вероятности 0,95:
метанол
23,6%,
этанол
13,4%,
изопропанол
24,2%,
пропанол
22,2%,
изобутанол
24,0%,
бутанол
20,4%.
СУЩНОСТЬ МЕТОДА
Методика основана на предварительном выделении спиртов из биологического материала путем нагревания объекта в герметичном объеме и последующего газохроматографического анализа равновесной паровой фазы над жидкой пробой. Измерение концентрации метилового, этилового, пропилового, изопропилового, бутилового и изобутилового спиртов выполняют методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием. Нижний предел измерения в объеме пробы:
метанол
0,016 мкг,
этанол
0,010 мкг,
изопропанол
0,005 мкг,
пропанол
0,005 мкг,
изобутанол
0,003 мкг,
бутанол
0,003 мкг.
Определению не мешают ароматические углеводороды, спирты, альдегиды, карбоновые кислоты и другие органические соединения. Длительность анализа, включая подготовку пробы, — 40 мин.
СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ
При выполнении анализа применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.
Средства измерений
Газовый хроматограф серии «Цвет-500» с детектором ионизации в пламени (ПИД) или другие с аналогичными или лучшими характеристиками
Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические ГОСТ 24104-80Е
Разновесы -210
ГОСТ 73208-82
Термометр лабораторный ТЛ-2, пределы 0 — 100 °С, цена деления — 1 °С ТУ 25-2021-003-88
Секундомер «Агат»
ГОСТ 5072-79
Шприц медицинский стеклянный вместимостью 5 куб. см ТУ 64-1-378-83
Микрошприцы вместимостью 10 куб. мм и 100 куб. мм ТУ 2.833.104
Лупа измерительная
ГОСТ 25706-83
Линейка металлическая измерительная, цена деления 1 мм ГОСТ 17435-72
Колба мерная вместимостью 1000 куб. см
ГОСТ 1770-74
Стеклянный сосуд вместимостью 30 — 40 куб. см с герметично закрывающейся крышкой.
Вспомогательные устройства
Хроматографическая колонка стеклянная длиной 200 см и внутренним диаметром 2 мм
Дистиллятор
ТУ 61-1-721-79
Водяная баня
Редуктор кислородный
ТУ 26-05-235-70.
Материалы
Гелий в баллоне
ТУ 51-940-88
Водород технический
ГОСТ 3022-80.
Реактивы
Метанол для хроматографии, х.ч.
ТУ 6-09-1709-77
Этанол для хроматографии, ректификат
ТУ 6-09-1710-77
Пропанол-1 для хроматографии, х.ч.
ТУ 6-09-783-76
Изопропиловый спирт для хроматографии, х.ч. ТУ 6-09-4522-77
Бутанол-1 для хроматографии, х.ч.
ТУ 6-09-4522-77
Изобутиловый спирт, очищенный для хроматографии, чистота 99%
Полисорб-1, носитель для газовой хроматографии, фракции 0,125 — 0,150 мм, обработанный 5% неподвижной жидкой фазы полиэтиленгликоль 3000 (ПЭГ 3000)
Вода дистиллированная
ГОСТ 6709-72.
ТРЕБОВАНИЯ К БЕЗОПАСНОСТИ
Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям «Пожарных норм проектирования зданий и сооружений» (СНиП ПА-5-700) и «Санитарных норм проектирования промышленных предприятий» (СН 245-71) и СНиП-74. При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76. При работе необходимо соблюдать «Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях», утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М., 1981), и «Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением», утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989). При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.
ТРЕБОВАНИЯ К КВАЛИФИКАЦИИ ОПЕРАТОРА
К выполнению хроматографических измерений биологических проб допускаются лица, прошедшие обучение работе на жидкостном хроматографе.
УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ
При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия: — температура воздуха (20 +/- 10) °С;
— атмосферное давление 630 — 800 мм рт. ст.; — влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.
ПОДГОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЙ
Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка хроматографической колонки, приготовление стандартных смесей, установление градуировочной характеристики.
Подготовка хроматографической колонки
Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, гексаном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелия) с расходом 30 куб. см/мин. при температуре 150 °С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.
Приготовление стандартных смесей
Исходный стандартный раствор для градуировки. В колбу вместимостью 1000 куб. см вводят микрошприцем по 10 куб. мм метилового, этилового, пропилового, изопропилового, бутилового и изобутилового спиртов и доводят водой до метки. Содержание спиртов в исходной стандартной смеси составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества):
метанол
7,97 мкг/куб. см;
этанол
7,89 мкг/куб. см;
изопропанол
7,85 мкг/куб. см;
пропанол
8,04 мкг/куб. см;
изобутанол
8,03 мкг/куб. см;
бутанол
8,10 мкг/куб. см.
Срок хранения исходного стандартного раствора в холодном месте — не более 2 суток.
Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной градуировки на градуировочных смесях спиртов. Она выражает зависимость площади пика на хроматограмме (кв. мм) от концентрации соответствующего спирта в крови (мкг/куб. см) и строится по 5 сериям стандартных растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из 5 рабочих стандартных растворов, готовят в герметично закрывающихся стеклянных сосудах (прилож. Б — не приводится). Для этого в каждый сосуд вносят 2 куб. см цельной крови, не содержащей спирты, и добавляют исходный раствор в соответствии с таблицей. Срок хранения растворов — 8 ч.
Таблица
СТАНДАРТНЫЕ СМЕСИ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ МЕТАНОЛА, ЭТАНОЛА, ИЗОПРОПАНОЛА, ПРОПАНОЛА, ИЗОБУТАНОЛА И БУТАНОЛА В КРОВИ (ФРАГМЕНТ ШКАЛЫ)
Номер смеси для градуировки
1
2
3
4
5
Объем исходного стандартного раствора, куб. см 5
25
50
200
400
Содержание метанола, мкг/куб. см
0,02
0,099
0,198
0,790
1,585
Содержание этанола, мкг/куб. см
0,019
0,098
0,197
0,790
1,578
Содержание изопропанола, мкг/куб. см
0,019
0,098
0,196
0,785
1,570
Содержание пропанола, мкг/куб. см
0,020
0,100
0,201
0,804
1,608
Содержание изобутанола, мкг/куб. см
0,020
0,100
0,200
0,803
1,605
Содержание бутанола, мкг/куб. см
0,020
0,101
0,202
0,810
1,619
Сосуд закрывают навинчивающейся крышкой с инертной прокладкой и нагревают на водяной бане при температуре 95 — 96 °С в течение 10 мин. 5 куб. см равновесной паровой фазы вводят в колонку хроматографа и анализируют при следующем режиме работы прибора:
начальная температура термостата колонок 60 °С;
время термостатирования
250 сек.;
скорость нагрева термостата колонок до конечной температуры 6 °/мин.;
конечная температура термостата колонок 110 °С;
время термостатирования
300 сек.;
температура детектора
130 °С;
температура испарителя
120 °С;
скорость подачи газов:
газа-носителя (гелия)
30 куб. см/мин.,
водорода
30 куб. см/мин.,
воздуха
300 куб. см/мин.;
скорость протяжки ленты самописца
0,3 мм/мин.;
шкала измерителя тока
4 х А;
время удерживания:
метанола
3 мин. 05 сек.,
этанола
5 мин. 20 сек.,
изопропанола
7 мин. 20 сек.,
пропанола
9 мин. 00 сек.,
изобутанола
10 мин. 30 сек.,
бутанола
11 мин. 35 сек.
На полученной хроматограмме определяют площади пиков соответствующих спиртов и по средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику. Градуировку проверяют 1 раз в неделю и при смене партии реактивов.
Отбор проб
Для отбора проб используют чистую посуду с плотно закрывающейся крышкой. Отобранную для анализа пробу венозной крови в количестве 2 куб. см сразу анализируют или хранят в холодильнике не более 24 ч при температуре не выше 4 °С.
ВЫПОЛНЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЙ
2 куб. см анализируемой крови переносят в сосуд, закрывают его инертной прокладкой и навинчивающейся крышкой с отверстием в центре и нагревают на водяной бане при температуре 95 — 96 °С в течение 10 мин. Затем отбирают подогретым стеклянным шприцем 5 куб. см равновесной паровой фазы и вводят в колонку хроматографа при вышеуказанном режиме работы прибора.
ВЫЧИСЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
Рассчитывают площадь пика соответствующего спирта по формуле:
, кв. мм,
где:
h — высота пика, мм;
L — ширина пика на половине высоты, мм. По градуировочному графику определяют концентрацию соответствующего спирта в крови (мкг/куб. см).
ВНУТРЕННИЙ ОПЕРАТИВНЫЙ КОНТРОЛЬ
Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).
Оперативный контроль сходимости
Контролируемым параметром является относительный размах выходных сигналов хроматографа при вводах трех параллельных проб градуировочного раствора. Контроль осуществляется при проведении градуировки, при периодическом контроле градуировочных коэффициентов, а также при выполнении измерений. Результат контроля признается положительным при выполнении условия:
,
где:
S — площадь пика, кв. мм;
- среднее арифметическое значение площади пиков при вводе 3 параллельных проб градуировочного раствора.
Оперативный контроль точности
Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля. Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50 — 150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы Х и рабочей пробы с добавкой Х’. Результаты анализа исходной рабочей пробы Х и рабочей пробы с добавкой Х’ получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д. Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:
,
где:
С — добавка к пробе в виде раствора с концентрацией мкг/куб. см;
- норматив оперативного контроля погрешности, мкг/куб. см. При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают:
,
где: и — характеристики погрешностей для исходной пробы и пробы с добавкой, мкг/куб. см.
и .
При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают, что:
.
При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.
