«Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах. Методические указания. МУК 4.2.2429-08» (утв. Роспотребнадзором 29.10.2008) (ред. от 26.06.2011) «МУК 4.2.2878-11. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах. Дополнения и изменения 1 к МУК 4.2.2321-08. Методические указания» (утв. Роспотребнадзором 24.06.2011) <Письмо> Минздравсоцразвития России от 24.06.2011 N 30-1/10/2-6165 <Об использовании национальных стандартов, устанавливающих требования по обеспечению беспрепятственного доступа инвалидов к объектам социальной инфраструктуры>
Изменения, внесенные Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011, введены в действие с 26 июня 2011 года. Текст документа
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
29 октября 2008 г.
Дата введения:
15 декабря 2008 года
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВЫХ ЭНТЕРОТОКСИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2429-08
(в ред. Дополнений и изменений 1,
утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
- Разработаны ГУ Научно-исследовательский институт питания РАМН; ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.
- Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
- Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 октября 2008 г.
- Введены в действие с 15 декабря 2008 г.
- Введены впервые.
- Область применения
1.1. Настоящие Методические указания устанавливают метод качественного определения стафилококковых энтеротоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, мясе и мясопродуктах; птице и птицепродуктах) на основе твердофазного иммуноферментного анализа. 1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в порядке, установленном Правительством Российской Федерации. 1.3. Методы предназначены для исследования пищевых продуктов при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора и контроля, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи. 1.4. Согласно настоящим Методическим указаниям предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов соответствует диапазону массовых концентраций от 0,2 до 2,0 мкг/кг (в зависимости от типа токсина и вида продукта), что ниже уровня 100-200 нг наиболее распространенного из числа известных иммунологических типов стафилококкового энтеротоксина типа A, обусловливающего развитие стафилотоксикоза у человека. 1.5. Настоящие методические указания устанавливают также метод качественного обнаружения стафилококковых энтеротоксинов типов A, B, C1, C2, C3, D, E (при совместном определении) в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, в мясе и мясопродуктах; в птице и птицепродуктах) на основе фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов при использовании данного метода составляет не менее 1,0 мкг/кг. (п. 1.5 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
2. Определения, обозначения и сокращения
СЭТ — стафилококковые энтеротоксины.
СЭА — стафилококковый энтеротоксин типа A. СЭВ — стафилококковый энтеротоксин типа B. ИФА — иммуноферментный анализ.
ИГ, IgG — иммуноглобулины.
Кг — конъюгат.
ОП — оптическая плотность.
Стандартный образец состава — стандартный образец, воспроизводящий значения величин, характеризующих содержание определенных компонентов (ГОСТ 8.315). Калибровочный раствор — раствор компонента, приготовленный из стандартного образца состава и необходимый для проведения испытания.
3. Сущность метода
3.1. Методы основаны на детекции СЭТ, продуцируемых Staphylococcus aureus и другими коагулазоположительными стафилококками, в подготовленной соответствующим образом пробе пищевого продукта путем постановки иммунохимических тестов непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющего обнаруживать эпидзначимые типы стафилококковых энтеротоксинов A (СЭА) или B (СЭВ) при раздельном определении (тест-системы по ВФС 42-235 и 42-236, ВС 89), а также энтеротоксины типов A, B, C, D и E при совместном дифференцированном и недифференцированном определении. (п. 3.1 в ред. Дополнений и изменений 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011) 3.2. Принцип метода. Определение СЭТ происходит за счет специфического взаимодействия стафилококковых иммуноглобулинов к различным типам СЭТ, адсорбированных на планшете, со стафилококковыми энтеротоксинами, содержащимися в исследуемом материале. Образовавшийся комплекс «антитело + антиген» выявляют с помощью конкурирующих стафилококковых иммуноглобулинов (конъюгатов), меченых пероксидазой. Образующийся аналитический сигнал, зависящий от результатов взаимодействия комплекса «антитело + антиген» с конъюгатом на поверхности ячеек планшета и выражающийся в ферментации субстрата — ортофенилендиамина (при раздельном определении СЭТ типов A и B) или тетраметилбензидина (при совместном определении СЭТ типов A, B, C, D и E) с изменением его окраски, измеряется по регистрируемому значению оптической плотности при длинах волн 492 и 450 нм соответственно. Схема анализа представлена в табл. 1.
Таблица 1
СХЕМА АНАЛИЗА
Последовательность этапов ИФА при определении стафилококковых энтеротоксинов
Отбор, подготовка проб и экстракция СЭА и СЭВ
Сенсибилизация планшетов иммуноглобулинами
Отмывка планшетов от непрореагировавших иммуноглобулинов
Взаимодействие иммуноглобулинов с антигеном (СЭА или СЭВ)
Отмывка планшетов от непрореагировавшего антигена
Взаимодействие комплекса «антиген — антитело» с конъюгатом
Отмывка планшетов от непрореагировавшего конъюгата
Внесение субстрата
Учет результатов
3.3. Для проведения раздельного определения используются тест-системы иммуноферментные для определения стафилококковых энтеротоксинов типов A и B в виде лиофилизированных компонентов. 3.4. Для проведения совместного определения СЭТ используются тест-системы иммуноферментные для одновременного определения стафилококковых энтеротоксинов типов A, B, C, D, E с использованием набора реагентов RIDASCREEN(R) SET A, B, C, D, E или других зарегистрированных в Российской Федерации в установленном порядке тест-систем иммуноферментных с аналогичными характеристиками. 3.5. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (ФС-ИФА) стафилококковых энтеротоксинов основан на связывании СЭТ, экстрагированных из пищевого продукта, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, конъюгированных щелочной фосфатазой и флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата). Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм дважды для каждого образца: перед внесением субстрата (фон) и после накопления продуктов гидролиза — флюоресцентного 4-метил-умбеллиферола, который катализируется щелочной фосфатазой. (п. 3.5 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011) 3.6. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы, позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферола при 450 нм и тест-наборы, в состав которых входят наконечники, сенсибилизированные антителами к СЭТ типов A, B, C, D, E, используемые в качестве пипетирующего устройства; и стрипы из 10 лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюоресцентного анализа. (п. 3.6 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011) 3.7. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы и тест-наборы, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке. (п. 3.7 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
4. Требования к выполнению анализов
(раздел в ред. Дополнений и изменений 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
4.1. Условия безопасного проведения работ
При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на приборы. Анализатор должен находиться в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила: — не использовать наконечники с поврежденной упаковкой; — не использовать поврежденные стрипы;
— не использовать набор по истечении срока годности; — не смешивать реактивы из различных партий; — положительный контроль и стандарт содержат очищенный стафилококковый энтеротоксин. При работе соблюдать осторожность. Работать в защитной одежде, перчатках, очках. При попадании внутрь следует немедленно обратиться к врачу; — реактивы содержат натрия азид, который со свинцом и медью образует взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их накопления; — пролитые жидкости необходимо тщательно вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие отбеливатель; — анализаторы необходимо регулярно чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.
4.2. Требования к квалификации специалистов
Выполнение измерений может проводить специалист, способный после освоения техники иммуноферментного анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности.
4.3. Условия выполнения измерений
Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях: — температура окружающего воздуха (20 +/- 5) град. С; — атмосферное давление (97 +/- 10) кПа; — относительная влажность (65 +/- 15) %.
5. Средства измерений, вспомогательное
оборудование, посуда, реактивы и материалы
5.1. Средства измерений и вспомогательное оборудование
Фотометр вертикального типа с диапазоном измерения оптической плотности 0,0-2,5 в комплекте с интерференционным светофильтром для длин волн 490-492 нм и 450 нм
Центрифуга лабораторная
Шкаф сушильный любого типа, обеспечивающий постоянство температуры (130 +/- 5) град. C по НД Шкаф холодильный любого типа, обеспечивающий постоянство температуры по НД
Весы лабораторные аналитические общего назначения и образцовые с наибольшим пределом взвешивания 200 г, не ниже 2-го класса точности ГОСТ 24104-88 Дозаторы пипеточные автоматические с диапазоном объема доз 20-200 мкл, 200-1000 мкл и
дискретности установки доз 5 мкл ТУ 64-16-55-90 Дистиллятор типа ДЭ-4-2 по НД
pH-метр по НД
Гомогенизатор ножевой или перистальтический типа «Стомайкер» Ступки фарфоровые с пестиками
Автоматический иммуноферментный анализатор типа VTDAS BioMerieux(R) или mini VTDAS BioMerieux(R), Франция или аналогичного типа
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Допускается использование оборудования, приборов и средств измерений, закупаемых по импорту, зарегистрированных в Госреестре РФ, соответствующих перечисленным по техническим характеристикам и позволяющих воспроизводить метрологические характеристики, указанные в настоящих Методических указаниях.
5.2. Лабораторная посуда и инструменты
Посуда мерная лабораторная: ГОСТ 1770-74 цилиндры исполнения 2 вместимостью 1000 куб. см; цилиндры исполнения 3 вместимостью 25 и 100 куб. см; пробирки исполнения 1 вместимостью 10 куб. см; колбы исполнения 2 вместимостью 100, 500 и 1000 куб. см
Пипетки 2-1-50 или 2-2-50 ГОСТ 20292-74 Посуда лабораторная стеклянная: ГОСТ 25336-82
колбы конические вместимостью 50-1000 куб. см Пинцеты, скальпели, ножницы
Стерильные фильтр-насадки
на шприц, диаметр пор 0,2 мкм (типа Millipore low protein binding Millex-GV-filters)
Автоматические пипетки на
50, 100 мкл и 1 мл с наконечниками
Шприцы на 20 мл
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Пипетка одноразовая на 500 мкл
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Пакет для гомогенизации с фильтром
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Центрифужные пробирки на 50 мл
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
5.3. Реактивы и материалы
Бычий сывороточный альбумин по НД ТУ 6-09-10-342-75 Тест-система иммуноферментная для определения стафилококкового энтеротоксина типа A по ВФС 42-235, ВС 89 с чувствительностью 2 нг/куб. см Тест-система иммуноферментная для определения стафилококкового энтеротоксина типа B по ВФС 42-236, ВС 89 с чувствительностью 1 нг/куб. см
Спирт этиловый ректифицированный ГОСТ 11547-80 Кислота серная концентрированная, хч ГОСТ 4204-77 Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72 Водорода перекись, хч ГОСТ 10929-76 о-Фенилендиамин по НД Калий хлористый ГОСТ 4234-64 Натрий углекислый ГОСТ 84-76 или натрий углекислый безводный ГОСТ 83-79 Натрий двууглекислый ГОСТ 2156-76 Натрий хлористый ГОСТ 4233-77
Натрий гидроокись
ТРИС-буфер
Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный 12-водный ГОСТ 4172-76 Калий фосфорно-кислый однозамещенный ГОСТ 4198-75 Твин-20 по НД Кислота лимонная 1-водная ГОСТ 3652-69
Наборы реагентов для иммуноферментного определения стафилококковых энтеротоксинов RIDASCREEN(R) SET A, B, C, D, E (ф. «R-Biopharm AG», Германия) н-Гептан
Фосфатный (PBS) буфер, pH 7,4
(0,55 г NaH2PO4 х H2O + 2,85 г Na2HPO4 х 2H2O + 8,7 г NaCl растворить в дистиллированной воде и довести до объема 1000 мл)
Набор реагентов типа «VIDAS(R)Staph enterotoxin II (SET2), BioMerieux(R), Франция или с аналогичными характеристиками
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Набор реагентов типа RIDASCREEN(R) SET Total (R-Biopharm AG, Германия) или с аналогичными характеристиками
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Индикатор pH (бумажный)
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Трихлоруксусная кислота 90% (5,5 N)
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Буфер ТРИС 0,3 М, pH 8,0
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Раствор NaOH 1 N и 4 N
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
Соляная кислота 5 N
(абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
5.4. Состав тест-систем для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В
Тест-система иммуноферментная для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В представляет собой следующие наборы: 1) иммуноглобулины к стафилококковому энтеротоксину, выделенные из сыворотки крови (кроличьей), сухие (ИГ) в ампулах; 2) иммуноглобулины к стафилококковому энтеротоксину, выделенные из сыворотки крови (кроличьей), ковалентно связанные с пероксидазой хрена, сухие, конъюгат (Кг) в ампулах; 3) стафилококковый энтеротоксин (СЭ) ампулированный; 4) о-фенилендиамин (ОФД) сухой;
5) Твин-20 или тритон Х-100 (жидкий);
6) бычий сывороточный альбумин (БСА);
7) смесь солей для приготовления карбонат-бикарбонатного буферного раствора (КББР), раствор N 1; 8) смесь солей для приготовления фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР), раствор N 2; 9) смесь содей для приготовления цитратно-фосфатного буферного раствора (ЦФБР), раствор N 3; 10) планшеты для иммуноферментного анализа (ИФА) однократного применения; 11) гидроперит в таблетках;
12) планшет 96-ячеечный полистироловый наборный по НД. Тест-системы из сухих реагентов хранят в защищенном от света месте при температуре (6 +/- 2) град. C. Срок годности при условии соблюдения правил хранения — 2 года с момента выпуска. В случае несоответствия используемых наборов требованиям специфичности и снижения активности биологических компонентов применение наборов данной серии прекращают.
5.5. Состав набора реагентов для иммуноферментного определения стафилококковых энтеротоксинов A, B, C, D, E
(п. 5.5 в ред. Дополнений и изменений 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
В состав набора для дифференцированного определения СЭТ типов A, B, C, D, E входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 12 проб с идентификацией энтеротоксинов (включая положительный контроль). Набор для твердофазного иммуноферментного анализа СЭТ A, B, C, D, E содержит:
Микротитровальный планшет (12 х 8), 96 лунок, 1 шт. сенсибилизированные специфическими антителами к энтеротоксинам стафилококка (SET)
Положительный контроль, готовый к использованию, содержит 1 шт. энтеротоксины стафилококка A, B, C, D, E, по 2 нг/мл каждого токсина, 1,25 мл
Коньюгат антител к SET с пероксидазой хрена, готовый к 1 шт. использованию, 11 мл: красная крышка
Субстрат, содержит пероксид карбамида, 7 мл: зеленая крышка
Хромоген, содержит тетраметилбензидин, 7 мл: голубая крышка 1 шт. Стоп-реагент, содержит 1 N серную кислоту, 14 мл: желтая крышка 1 шт. Моющий буфер, pH 7,2, концентрат, 10х, 100 мл, коричневая крышка 1 шт.
В состав набора типа RIDASCREEN(R) SET Total для недифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 96 проб (включая положительные и отрицательные контроли) без идентификации типов энтеротоксинов. Тест-набор для недифференцированного определения SET содержит:
Микротитровальный планшет (12 х 8), 96 лунок, 1 шт. сенсибилизированные специфическими антителами к энтеротоксинам стафилококка (SET)
Положительный контроль, готовый к использованию, содержит 1 шт. энтеротоксины стафилококков A, B, C, D, E, по 2 нг/мл каждого токсина, 2 мл
Отрицательный контроль, готовый к использованию, 2 мл 1 шт. Коньюгат 1 антител к SET, готовый к использованию, 11 мл 1 шт. Коньюгат 2 с пероксидазой, готовый к использованию, 11 мл 1 шт. Субстрат/хромоген, содержит тетраметилбензидин, 10 мл 1 шт. Стоп-реагент, содержит 1 N серную кислоту, 14 мл 1 шт. Моющий буфер, pH 7,2, концентрат, 10х, 100 мл 1 шт.
Примечание.
Нумерация пунктов дана в соответствии с Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011.
5.7. Состав тест-набора для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа
(п. 5.7 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
В состав набора должны входить материалы и реагенты в количествах, достаточных для исследования 26 проб и 4 контрольных образцов. Набор содержит следующие компоненты, готовые к использованию (табл. 1).
Таблица 1
Компоненты набора Обозна- Состав чение 30 стрипов для STR См. табл. 2
определения СЭТ
30 наконечников с SPR На внутреннюю поверхность наконечников SPR(R) конъюгированными нанесены антитела к стафилококковым антителами энтеротоксинам Стандарт S1 Очищенный энтеротоксин А (< 1,0 нг/мл) + кон- (1 флакон х 6 мл) сервант + белковые стабилизаторы. Доверитель- ный интервал указан на калибровочной карте Положительный C1 Очищенный энтеротоксин А (< 1,0 нг/мл) + контроль консервант + белковые стабилизаторы. определения Доверительный интервал указан на (1 флакон х 6 мл) калибровочной карте Отрицательный C2 ТРИС-забуференный физиологический раствор контроль (150 ммоль/л) - Твин pH 7,6 + консервант. определения (1 Максимальное приемлемое значение указано на флакон х 6 мл) калибровочной карте MLE после следующего: "Control C2 (-) Test Value Range" Концентрат буфера R1 ТРИС* 2,5 моль/л - Твин 10 г/л - MIT 10 г/л для экстракции СЭТ pH 8,0
(1 флакон х 55 мл)
1 калибровочная карта Лист спецификаций с фабричными установками для калибровки тестов, для данной партии реагентов
1 инструкция
Состав стрипа (табл. 2). Каждый стрип в тест-наборе для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа состоит из 10 лунок, запечатанных фольгой, на которую нанесен штрих-код, несущий информацию о типе анализа, номере партии и сроке годности. Фольга перфорирована над лункой для внесения образца. Последняя лунка представляет собой кювету, в которой происходит считывание результата. Прочие лунки содержат реактивы для анализа.
Таблица 2
Лунка Реактивы и назначение
1 Лунка для внесения 500 мкл образца
2 Предпромывочный буфер (400 куб. мм): NaCl-ТРИС (150 мм) - Твин pH 7,6 - белковый стабилизатор + консервант
3-4-5-7-8-9 Промывочный буфер (600 куб. мм): NaCl - ТРИС (150
мм) - Твин pH 7,6 + консервант
6 Коньюгат (400 куб. мм): меченные щелочной фосфатазой антитела к стафилококковым энтеротоксинам + консервант 10 Кювета, содержащая субстрат (300 куб. мм): 4-метил-умбелиферил-фосфат (0,6 мм) + диэтаноламин* (0,62 моль/куб. дм или 6,6%, pH 9,2) + консервант
6. Проведение испытаний методом твердофазного иммуноферментного анализа
(в ред. Дополнений и изменений 1,
утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
6.1. Отбор проб
Примечание.
ГОСТ Р 51446-99 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов" утратил силу с 1 января 2010 года в связи с изданием Приказа Ростехрегулирования от 18.12.2008 N 480-ст.
Отбор проб для анализа следует проводить в соответствии с ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) "Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований" или МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов".
6.2. Подготовка проб к анализу
(при раздельном определении СЭА и СЭВ)
Из асептично отобранных образцов пищевых продуктов готовят пробы к анализу и экстрагируют СЭТ, учитывая физическое состояние продуктов, следующим образом: а) экстракция СЭТ из твердых продуктов. Из произвольно отобранных точечных проб из 5 мест партии массой нетто 25 г каждая, готовят среднюю пробу массой 125 г, измельчают режущим инструментом, добавляют 125 куб. см стерильного забуференного физиологического раствора с pH 7,4, содержащего 8,5 г натрия хлорида, 0,55 г NaH2PO4 х H2O и 2,85 г Na2HPO4 х H2O на 1000 мл дистиллированной воды, и гомогенизируют до получения однородной массы. В полученном гомогенате с помощью 1 N раствора соляной кислоты устанавливают pH 4,5, затем центрифугируют гомогенат при 8000-9000 об./мин. в течение 45 мин. при охлаждении (допускается проводить центрифугирование при температуре не выше 15 град. C). После центрифугирования слой жира, собирающийся на поверхности надосадочной жидкости, удаляют шпателем или стеклянной палочкой. После удаления жира надосадочную жидкость (не менее 5 куб. см) переносят в новую стерильную пробирку, устанавливают в ней рН 7,3 +/- 0,1 при помощи 1 N раствора NaOH, осадок удаляют. К полученному таким образом экстракту добавляют Твин-20 до конечной концентрации 0,1% и бычий сывороточный альбумин (или нормальную кроличью сыворотку) до конечной концентрации 2,5% и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.; б) экстракция СЭТ из сыров. Из произвольно отобранных точечных проб сыра из 5 мест от партии массой нетто 25 г каждая готовят среднюю пробу массой 125 г, измельчают режущим инструментом, добавляют 125 куб. см стерильного 0,25 М ТРИС-буфера с pH 8,0, содержащего 30,28 г ТРИС гидроксиметиламинометана на 1000 мл дистиллированной воды, и гомогенизируют до получения однородной массы в течение 3 мин. при высокой скорости. Доводят pH до 4,0 с помощью 6 N раствора соляной кислоты. Гомогенат центрифугируют в течение 10 мин. при 3500 g, отделяют супернатант (не менее 5 куб. см) и доводят в нем рН до 7,0-8,0 6 N раствором NaOH; в) экстракция СЭТ из жидких продуктов и сухих молочных продуктов. В объединенной пробе молока объемом 125 куб. см с помощью 1 N раствора соляной кислоты устанавливают pH 4,5, затем центрифугируют образец при 8000-9000 об./мин. в течение 45 мин. при охлаждении. В надосадочной жидкости (не менее 5 куб. см) доводят рН до 7,0-8,0 6 N раствором NaOH. Образец сухого молока (25 г) смешивают с 125 куб. см 0,25 М ТРИС-буфера с рН 8,0 и гомогенизируют до получения однородной массы в течение 3 мин. при высокой скорости. Доводят pH до 4,0 с помощью 6 N раствора соляной кислоты. Гомогенат центрифугируют в течение 10 мин. при 3500 g, отделяют супернатант (не менее 5 куб. см) и доводят в нем pH до 7,0-8,0 6 N раствором NaOH.
6.3. Подготовка лабораторной посуды
Лабораторную стеклянную посуду следует мыть хромовой смесью, многократно промывать водопроводной водой и ополаскивать дистиллированной водой. Сушить посуду следует в сушильном шкафу.
6.4. Подготовка прибора к работе
Подготовку и проверку фотометра проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации и техническим описанием к прибору.
6.5. Проведение анализа при использовании тест-систем для определения стафилококковых энтеротоксинов типов A и B
6.5.1. Подготовка к проведению анализа
6.5.1.1. Раствор N 1. Карбонатно-бикарбонатный буферный раствор (КББР) 0,05 М, pH 9,5 +/- 0,1. Навеску солей из пакета с надписью "раствор N 1" разводят в 150 куб. см дистиллированной воды. Хранить при температуре (4 +/- 2) град. C в течение месяца. 6.5.1.2. Раствор N 2. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР) 0,1 М, pH 7,2 +/- 0,1. Навеску солей из пакета с надписью "раствор N 2" растворяют в 500 куб. см дистиллированной воды и доводят объем до 3 куб. дм. Хранить при температуре (4 +/- 2) град. C в течение месяца. 6.5.1.3. Раствор N 2А. К 1 куб. дм раствора N 2 добавляют 0,5 куб. см детергента (Твин-20 или тритон Х-100). Раствор N 2А хранению не подлежит. 6.5.1.4. Раствор N 2Б. Содержимое флакона с этикеткой "БСА" растворяют в 50 куб. см раствора N 2А. Хранению не подлежит. 6.5.1.5. Раствор N 3. ЦФБР 0,1 М, pH 5,5 +/- 0,1. Содержимое пакетика с надписью "лимонная кислота" (пакет N 3) 0,32 г растворяют в 25 куб. см дистиллированной воды. Содержимое пакета с надписью "натрий фосфорно-кислый 12-водный" 1,65 г также растворяют в 25 куб. см дистиллированной воды. Хранить по отдельности, не более двух недель. Перед употреблением растворы смешивают в соотношении 1:1. 6.5.1.6. Раствор N 4. Содержимое 1 ампулы с этикеткой "ИГ" растворяют в 1 куб. см дистиллированной воды, далее доводят объем до 30 куб. см раствором N 1. Одна ампула "ИГ" расходуется на 1 планшет. 6.5.1.7. Раствор N 5. Содержимое 1 ампулы с этикеткой "СЭА" или "СЭВ" растворяют в 1 куб. см дистиллированной воды. Исходный раствор СЭА и СЭВ можно хранить при температуре (4 +/- 2) град. C в течение 1 месяца. Рабочий раствор СЭА и СЭВ с конечной концентрацией 1 нг/куб. см готовят из исходного, используя раствор N 2А. Хранению не подлежит. 6.5.1.8. Раствор N 6. Содержимое ампулы с этикеткой "Кг" разводят в 1 куб. см дистиллированной воды, далее доводят до 10 куб. см раствором N 2Б. Хранению не подлежит. 6.5.1.9. Раствор N 7. Растворяют 4-5 мг ОФД в 10 куб. см раствора N 3. Раствор N 7 готовят за 10 мин. до использования, хранят в темном месте при комнатной температуре. (Содержимое флакона ОФД рассчитано на 50 куб. см, т.е. на 5 планшетов.) 6.5.1.10. Раствор N 8. Одну таблетку гидроперита растворяют в 10 куб. см дистиллированной воды. Полученный 30%-й раствор перекиси водорода хранят в темном месте при температуре (4 +/- 2) град. C. Срок хранения 1 месяц. 6.5.1.11. Раствор N 9. Смешивают 10 куб. см раствора N 7 и 0,17 куб. см раствора N 8, разведенного дистиллированной водой 1:10 (или 50 куб. см раствора N 7 и 0,85 куб. см 3%-го раствора перекиси водорода). Готовят непосредственно перед внесением в лунки. Хранению не подлежит. 6.5.1.12. Раствор N 10. Раствор серной кислоты в концентрации 1,5 моль/куб. дм растворяют 1,5 куб. см концентрированной (хч) серной кислоты в 15 куб. см дистиллированной воды. Хранят при температуре (20 +/- 2) град. C.
6.5.2. Подготовка проб к измерениям
Приготовление рабочих растворов исследуемых образцов. Экстракты из проб продуктов, полученные по п. 6.2, вносят в количестве 1,0 куб. см в пробирки и наносят маркировку, соответствующую номерам проб.
6.5.3. Проведение испытаний
6.5.3.1. Сорбция стафилококковых иммуноглобулинов на планшет. В ячейки планшета вносят с помощью автоматического дозатора пипеточного по 0,25 куб. см раствора N 4. Сенсибилизацию планшетов иммуноглобулинами проводят в течение 2 ч при температуре (37 +/- 2) град. C или 18-24 ч при температуре (4 +/- 2) град. C. 6.5.3.2. По окончании сорбции иммуноглобулины удаляют из ячеек планшета сильным встряхиванием перевернутого планшета и отмывают 4 раза по 5 мин. раствором N 2А (промывной раствор вносят до края ячеек), вытряхивают и высушивают постукиванием по фильтровальной бумаге. 6.5.3.3. Внесение на планшет положительного контроля. В ячейки А-1, В-1 вносят по 0,1 куб. см раствора N 5 (положительный контроль). В ячейки С-1, Д-1 вносят по 0,1 куб. см раствора N 2А (отрицательный контроль). В остальные ячейки планшета вносят по 0,1 куб. см исследуемого материала. 6.5.3.4. Планшеты выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 2) град. C в течение 1 ч, затем жидкость из ячеек удаляют в емкость с 6%-м раствором перекиси водорода, отмывают 5 раз и подсушивают, как указано в п. 6.5.3.2. 6.5.3.5. В каждую ячейку планшета вносят по 0,1 куб. см раствора N 6. 6.5.3.6. Планшеты выдерживают в термостате при температуре (37 +/- 2) град. C в течение 1 ч. 6.5.3.7. Удаляют жидкость из ячеек планшета встряхиванием и отмывают 6 раз, как указано в п. 6.5.3.2. 6.5.3.8. В каждую ячейку планшета вносят по 0,1 куб. см раствора N 9. 6.5.3.9. Планшеты выдерживают в темноте при температуре (20 +/- 2) град. C в течение 30 мин. до появления слабо-желтой окраски в контрольных ячейках (С-1, Д-1). 6.5.3.10. Реакцию останавливают внесением в ячейки по 0,1 куб. см раствора N 10. В ячейках, где прошла реакция, появляется окрашивание от желтого до оранжево-коричневого. В ячейках, где исследуемые пробы не содержат энтеротоксина, окраска отсутствует или светло-желтая. 6.5.3.11. Для каждого типа энтеротоксина следует использовать отдельный планшет, повторное использование планшета не допускается.
6.5.4. Учет результатов анализа
6.5.4.1. Инструментальный учет реакции проводят путем измерения оптической плотности (ОП) на вертикальном фотометре при длине волны 492 нм. Результаты записей оптической плотности переносят в таблицу и располагают в соответствии с номерами вариантов. 6.5.4.2. Величина оптической плотности в ячейках с положительным контролем - специфическим антигеном (А-1, В-1) - должна составлять не менее 0,30 +/- 0,05; в ячейках с отрицательным контролем (С-1, Д-1) - не более 0,10 +/- 0,05. Значения ОП в двух параллельных определениях одной и той же пробы не должны различаться более чем на 0,05. 6.5.4.3. Для всех ячеек-дублей рассчитывают средние арифметические значения оптической плотности (ОП) и находят отношения полученных к среднему значению оптической плотности для контроля. 6.5.4.4. Результат определения считается положительным, если ОП в исследуемом материале в 2 раза и более превосходит среднее арифметическое из двух значений ОП отрицательного контроля. 6.5.4.5. По результатам двух параллельных определений рассчитывают среднее арифметическое значение ОП в исследуемом образце. Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого, то среднее арифметическое принимают за результат анализа. В противном случае анализ следует повторить. 6.5.4.6. В протоколах анализа по раздельному определению СЭТ результаты представляют в виде: - СЭА или СЭВ обнаружены в образце массой 125 г (в 5 образцах по 25 г); - СЭА или СЭВ не обнаружены в образце массой 125 г (в 5 образцах по 25 г).
6.6. Проведение анализа при совместном определении стафилококковых энтеротоксинов A, B, C, D, E
Перед использованием набора необходимо довести температуру всех реагентов до комнатной, сразу после использования охладить все реагенты до температуры 2-8 град. C. В процессе выполнения анализа не допускать высыхания лунок планшета. Воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. На всех стадиях инкубации следует избегать воздействия прямого солнечного света. При инкубации рекомендуется прикрыть планшет крышкой. 6.6.1. Приготовление моющего буфера. Для приготовления моющего буфера смешивают 1 часть концентрированного моющего буфера и 9 частей дистиллированной воды (например, 10 мл концентрата и 90 мл дистиллированной воды). Если во флаконе с концентрированным буфером образовались кристаллы, следует предварительно их растворить, нагревая флакон в водяной бане при 37 град. C. Срок хранения готового моющего буфера при температуре 2-8 град. C составляет не более четырех недель. Температуру моющего буфера перед его использованием необходимо довести до комнатной. 6.6.2. Подготовка планшета. Фольгированная упаковка планшета открывается со стороны застежки. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2-8 град. C. 6.6.3. Положительный контроль. В качестве положительного контроля используют смесь энтеротоксинов A, B, C, D, E (концентрация каждого энтеротоксина составляет 2 нг/мл), раствор входит в комплект набора в готовом к использованию виде.
6.7. Проведение анализа
(п. 6.7 в ред. Дополнений и изменений 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
6.7.1. Проведение анализа для совместного дифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов типов A, B, C, D, E методом твердофазного иммуноферментного анализа
6.7.1.1. Вставить в рамку планшета стрипы в количестве, соответствующем количеству проб, подготовленных для анализа. 6.7.1.2. Добавить по 100 куб. мм исследуемого раствора в лунки A - G соответствующего стрипа, в лунку H добавить 100 мм положительного контроля, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре. 6.7.1.3. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку и тщательно выбить капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. С помощью 8-канальной пипетки заполнить лунки по 250 куб. мм готового моющего буфера и снова вылить жидкость. Выбить лунки, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок моющим буфером еще три раза. 6.7.1.4. Добавить в каждую лунку по 100 куб. мм коньюгата, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре. 6.7.1.5. Провести процедуру, описанную в п. 6.7.1.3. 6.7.1.6. Добавить по 50 куб. мм субстрата и 50 куб. мм хромогена в каждую лунку. Осторожно перемешать вручную и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. 6.7.1.7. Добавить в каждую лунку по 100 куб. мм стоп-реагента и осторожно перемешать вручную. В течение 30 мин. после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм ("бланк" или нулевое считывание по воздуху).
6.7.2. Проведение анализа для совместного недифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов методом твердофазного
иммуноферментного анализа
6.7.2.1. Вставить в рамку планшета стрипы в количестве, соответствующем количеству проб, подготовленных для анализа. 6.7.2.2. Добавить по 100 куб. мм исследуемых проб и контролей в соответствующие лунки стрипа, используя новый наконечник для каждой пробы. Закрыть лунки пленкой и инкубировать в течение 30 мин. при температуре (36 +/ 1) град. С. 6.7.2.3. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку и тщательно выбить капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. С помощью 8-канальной пипетки заполнить лунки по 300 куб. мм готового моющего буфера и снова вылить жидкость. Выбить лунки, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок моющим буфером еще 4 раза. 6.7.2.4. Добавить в каждую лунку по 100 куб. мм коньюгата 1, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 30 мин. при температуре (36 +/- 1) град. С. 6.7.2.5. Провести процедуру, описанную в п. 6.7.2.3. 6.7.2.6. Добавить в каждую лунку по 100 куб. мм коньюгата 2, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 30 мин. при температуре (36 +/- 1) град. С. 6.7.2.7. Провести процедуру, описанную в п. 6.7.2.3. 6.7.2.8. Добавить по 100 куб. мм субстрата/хромогена в каждую лунку. Осторожно перемешать вручную и инкубировать при температуре (36 +/- 1) град. С в течение 15 мин. в темноте. Немедленно просмотреть результаты. 6.7.2.9. Изменение цвета в лунках планшета из красного в голубой указывает на присутствие стафилококковых энтеротоксинов в пробах. Осторожно перемешать пробы вручную круговыми движениями микропланшета по поверхности стола для равномерного распределения окраски раствора в лунках. 6.7.2.10. Добавить в каждую лунку по 100 куб. мм стоп-реагента и осторожно перемешать вручную. Изменение цвета из голубого в желтый указывает на присутствие стафилококковых энтеротоксинов в пробах. Измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм.
6.8. Обработка результатов измерения
6.8.1. Определение пороговой величины. Для каждой пробы отдельно вычисляется среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках F и G (отрицательный контроль). Для того чтобы получить пороговую величину, к этому среднему значению следует добавить 0,15.
Пример: Отрицательный контроль 1 = 0,08
Отрицательный контроль 2 = 0,10 Среднее значение = 0,09 Пороговая величина = 0,09 + 0,15 = 0,24.
При совместном недифференцированном определении СЭТ методом твердофазного иммуноферментного анализа пороговую величину оптической плотности также устанавливают путем прибавления 0,15 к среднему значению оптической плотности, измеренной в лунках с отрицательным контролем. (абзац введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011) 6.8.2. Область достоверности (контроль качества анализа): 1) оптическая плотность, измеренная в лунках с положительным контролем, должна быть равна или больше 0,5; 2) средняя оптическая плотность, измеренная в лунках F и G (отрицательный контроль), должна быть равна или меньше 0,3; 3) если условия 1 и 2 не соблюдаются, результаты не подлежат интерпретации. 6.8.3. Интерпретация результатов. Результат интерпретируется как отрицательный, если величина оптической плотности ниже пороговой. Результат интерпретируется как положительный, если величина оптической плотности выше пороговой или равна ей.
6.9. Учет результатов анализа
В протоколах анализа по совместному определению СЭТ результаты представляют в виде: - СЭТ типов A, B, C, D и E обнаружены в образце массой 125 г (в 5 образцах по 25 г); - СЭТ типов A, B, C, D и E не обнаружены в образце массой 125 г (в 5 образцах по 25 г).
6.10. Идентификация стафилококковых энтеротоксинов
(п. 6.10 введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
При получении положительных результатов анализа с применением недифференцированного определения СЭТ методом твердофазного иммуноферментного анализа тип присутствующего в исследуемой пробе энетротоксина может быть установлен путем повторного дифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов типов A, B, C, D, E (п. 6.7.1).
7. Проведение фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа для качественного недифференцированного определения СЭТ типов A, B, C1, C2, C3, D и E
(раздел введен Дополнениями и изменениями 1, утв. Роспотребнадзором 26.06.2011)
7.1. Подготовка к анализу
7.1.1. Приготовление буфера для экстракции
Содержимое флакона R1 (концентрат буфера для экстракции) растворить в стерильной деминерализованной воде до конечного объема 1000 куб. см, тщательно перемешать. Буфер может храниться в течение 3 месяцев при температуре 2-8 град. С. Концентрат буфера можно разделить на аликвоты и разводить по частям в зависимости от частоты использования и скорости потребления.
7.1.2. Приготовление 90%-го раствора трихлоруксусной кислоты
Растворить 90 г трихлоруксусной кислоты в 40 мл деминерализованной воды. Довести конечный объем до 100 куб. см. Хранить раствор 1 месяц при температуре 18-25 град. С.
7.1.3 Измерение pH экстрактов
Для измерения pH использовать трехцветный бумажный индикатор pH с точностью определения не менее 0,5 единиц pH.
7.2. Проведение экстракции
7.2.1. Общий протокол экстракции СЭТ
Внести 25 г образца пищевого продукта и 25 куб. см буфера для экстракции в пакет для гомогенизации типа стомайкер. Гомогенизировать в течение 3 мин. на высокой скорости до получения гомогенной суспензии, оставить на 15 мин. при комнатной температуре. Центрифугировать пробу в течение 15 мин. при 3000-5000 g и температуре 18-25 град. С. Пропустить супернатант через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Измерить pH фильтрата и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. Отобрать 500 мкл готового экстракта для проведения анализа.
7.2.2. Молочные продукты (кисломолочные продукты, сухое молоко, сыры)
Внести 25 г образца в 40 куб. см деминерализованной воды нагретой до температуры (38 +/- 2) град. С. Гомогенизировать в течение 3 мин. на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Оставить на 30 мин. при 18-25 град. С. Измерить pH и, при необходимости, довести его до 3,5-4,0, используя раствор 5 N HCl. Центрифугировать 15 мин. при 3000-5000 об./мин. и температуре 18-25 град. С. Измерить pH надосадочной жидкости и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. Центрифугировать повторно 15 мин. при 3000-5000 g и температуре 18-25 град. С. При необходимости профильтровать как описано в п. 7.2.1. Отобрать 500 мкл готового экстракта для проведения анализа.
7.2.3. Молоко
Отобрать 25 куб. см пробы и довести pH до 3,5-4,0, используя 5 N HCl. Далее экстракцию СЭТ проводить как указано в п. 7.2.2.
7.2.4. Сырые мясо и мясопродукты, готовые мясные изделия, морепродукты
Гомогенизировать 25 г образца в 25 куб. см деминерализованной воды в течение 3 мин. на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Если суспензия слишком плотная, добавить еще 25 куб. см деминерализованной воды и гомогенизировать повторно. Отобрать весь экстракт. Измерить pH и, при необходимости, довести его до pH 4,0, используя раствор 5 N HCl. Оставить на 15-30 мин. при 18-25 град. С. Центрифугировать 15 мин. при 3000-5000 g и температуре 18-25 град. С. Пропустить надосадочную жидкость через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Измерить pH фильтрата и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. При наличии осадка центрифугировать повторно. Отобрать 500 куб. мм готового экстракта для проведения анализа.
7.2.5. Экстракция СЭТ из концентрированных пищевых продуктов (концентраты готовых блюд, сублимированные пищевые продукты)
Концентрированные продукты следует развести в соответствии с рекомендациями изготовителя. Измерить pH конечного продукта и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. При наличии осадка центрифугировать 15 мин. при 3000-5000 g и температуре 18-25 град. С, пропустить надосадочную жидкость через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Отобрать 500 куб. мм готового экстракта для проведения анализа.
7.2.6. Экстракция СЭТ из сухих (дегидратированных) продуктов
Сухие продукты (кроме сухого молока) восстановить в дистиллированной воде до объема, указанного изготовителем. Оставить на 1 ч при температуре 18-25 град. С, далее экстракцию СЭТ проводить как указано в п. 7.2.1.
7.2.7. Концентрирование проб трихлоруксусной кислотой
Метод используется для увеличения концентрации СЭТ при исследовании молочных продуктов, в том числе сыров. Приготовить раствор трихлоруксусной кислоты в соответствии с п. 7.1.2. Внести 25 г образца в 40 куб. см деминерализованной воды нагретой до температуры (38 +/- 2) град. С. Гомогенизировать в течение 3 мин. на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Оставить на 30 мин. при 18-25 град. С. Измерить pH и, при необходимости, довести его до 3,5-4,0, используя раствор 5 N HCl. Центрифугировать 15 мин. при 3000-5000 об./мин. и температуре 18-25 град. С. Измерить pH надосадочной жидкости и, при необходимости, довести его до 7,5-8,0, используя раствор 1 N NaOH. Измерить объем надосадочной жидкости (V). Добавить к надосадочной жидкости 90%-й водный раствор трихлоруксусной кислоты до его конечной концентрации 5%. Гомогенизировать и оставить на 30 мин. при 18-25 град. С. Центрифугировать 30 мин. при 3000-5000 g и температуре 18-25 град. С. Осторожно удалить надосадочную жидкость. Растворить осадок в 0,3 М буфере ТРИС, pH 8,0, в объеме, соответствующем 1/10 начального объема надосадочной жидкости V, обработанной трихлоруксусной кислотой. При необходимости довести pH до 7,5-8,0, используя раствор 4 N NaOH. При таком значении pH молочный раствор прозрачен. При наличии твердых частиц центрифугировать повторно 15 мин. при 3000-5000 g и температуре 18-25 град. С. Отобрать 500 куб. мм готового экстракта для проведения анализа.
7.3. Хранение экстрактов
Определение СЭТ с использованием наборов для проведения фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа следует проводить сразу после экстракции. Если нет возможности провести тест сразу, экстракты (кроме молочных продуктов) могут храниться при температуре не выше - 19 град. С в течение 7 суток.
7.4. Проведение анализа на автоматическом иммуноферментном анализаторе
Перед использованием наборов и реактивов новой партии в прибор необходимо ввести спецификации. Для этого используется калибровочная карта. Если не провести эту процедуру до проведения анализа, прибор не сможет распечатать результат. Процедуру необходимо проводить только один раз для каждой партии реактивов (лота). Данные с калибровочной карты вводят автоматически или вручную. Перед проведением анализа необходимое количество компонентов тест-набора оставить при комнатной температуре на 30 мин. 7.4.1. Стандарт перед использованием необходимо тщательно перемешать. Тестирование стандарта необходимо для подтверждения сохранности набора при транспортировании и хранении. Стандарт должен тестироваться в каждом наборе. Результаты тестирования хранятся в течение 2 недель и автоматически используются для анализа результатов теста. Рекомендуется тестирование стандарта в 2 стрипах. 7.4.2. Положительный и отрицательный контроли перед использованием тщательно перемешивают. Контроли тестируются в каждом наборе. Тестирование контролей необходимо для занесения пределов теста в компьютер. 7.4.3. В прибор вводят соответствующую информацию для создания рабочего листа. 7.4.4. Вносят 500 куб. мм готового экстракта в лунку для внесения образца на стрипе тест-набора. 7.4.5. Вносят 500 куб. мм стандарта и контролей в 1 лунку (отдельно для каждого) стрипа. 7.4.6. Вставляют стрипы и конусы в соответствующие отделения прибора, которые указаны в рабочем листе. Следует убедиться, что на стрипе и конусе указаны соответствующие буквы кода данного анализа. 7.4.7. Анализ проводят в соответствии с инструкцией, изложенной в руководстве пользователя. 7.4.8. Анализ полностью автоматизирован, длительность составляет 80 мин.
7.5. Интерпретация результатов
Оптический сканер прибора измеряет флюоресценцию дважды в оптической кювете для каждого образца. Первый раз измеряется фон субстрата и кюветы перед внесением в нее субстрата. Второй раз флюоресценция измеряется после внесения субстрата в конус и образования флюоресцирующего продукта в результате ферментативной реакции на поверхности конуса. Вычитание фона кюветы из последнего измерения дает относительную величину флуоресценции - ОВФ (Relative Fluorescence Value) тестируемого образца. Интерпретация значений ОВФ проводится прибором автоматически согласно формуле:
Результат теста = ОВФ образца / ОВФ стандарта.
В качестве стандарта в системе используют очищенный стафилококковый энтеротоксин типа A. Результаты тестирования для образца и контролей сравниваются со значениями ОВФ, хранящимися в базе данных: < 0,13, >= 0,13. Если полученное значение меньше 0,13, то результат интерпретируется как отрицательный. Если значение теста равно или выше 0,13, то результат интерпретируется как положительный. Результаты также считаются недействительными, если (1) значение ОВФ фона выше ожидаемого значения или (2) нет информации о значениях ОВФ стандарта. В первом случае возможно загрязнение субстрата, в связи с чем необходимо провести повторное тестирование образца с новым стрипом. Во втором случае должен быть протестирован новый стандарт из той же партии и результаты теста должны быть пересчитаны по этому стандарту. На принтер выводится информация - тип теста, номер образца, дата и время анализа, номер партии и дата окончания срока годности набора, значения ОВФ, результат и его интерпретация.
Приложение
(рекомендуемое)
ФОРМА ТАБЛИЦЫ ДЛЯ ЗАПИСИ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА
Маркировка Значения ОП ОП исследуемого образца/ СЭА СЭВ варианта ОП контроля показания по ячейкам среднее
Введен в действие с 24 июня 2011 года.
Текст документа
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
24 июня 2011 года
Дата введения:
с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
ДОПОЛНЕНИЯ И ИЗМЕНЕНИЯ 1 К МУК 4.2.2321-08
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.2878-11
- Разработаны Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания, ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве" при участии фирмы "BioMerieux".
- Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).
- Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24.06.2011.
- Введены в действие с момента утверждения.
- Введены впервые.
Внести дополнения и изменения в МУК 4.2.2321-08: 1. Раздел 1 "Общие положения и область применения" дополнить абзацем 1.3 следующего содержания: "1.3. Настоящие Методические указания устанавливают методы определения бактерий рода Campylobacter в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения на основе бактериологического анализа (качественного и количественного с идентификацией до вида), а также фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (качественного недифференцированного суммарного определения бактерий видов C. jejuni, C. coli, C. lari, обусловливающих основную часть ОКИ кампилобактериозной природы у человека)". 2. Раздел 2 "Сущность метода" изложить в новой редакции:
"2. Сущность методов
2.1. Бактериологический метод определения бактерий рода Campylobacter основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие селективные среды, содержащие антибиотики и аэротолерантные добавки, с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры. Все этапы инкубации посевов осуществляются в микроаэрофильных условиях. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к видам бактерий рода Campylobacter. 2.2. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа бактерий рода Campylobacter основан на связывании бактериальных антигенов, находящихся в бульоне обогащения, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), последующем удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, меченных щелочной фосфатазой, и флюоресцентно-меченого субстрата и измерении флюоресценции продукта гидролиза флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата), который катализируется щелочной фосфатазой. Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм. 2.2.1. Для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические анализаторы, позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферона при 450 нм, и тест-наборы, в состав которых входят сенсибилизированные антителами наконечники, используемые в качестве пипетирующего устройства, и стрипы из 10 лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюоресцентного анализа, зарегистрированные в РФ в установленном порядке. Предел обнаружения бактерий рода Campylobacter при использовании данного метода соответствует 1 клетке на 25 г (при наличии предобогащения). 2.2.2. Для определения бактерий рода Campylobacter методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют анализаторы иммуноферментные и тест-наборы, зарегистрированные в РФ в установленном порядке и обеспечивающие проведение измерений с характеристиками специфичности и чувствительности, указанными в п. п. 1.3 и 2.2.1". 3. В разделе 3 "Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды" пункт 3.1 "Аппаратура и инструментарий" дополнить строкой:
Автоматический ИФА-анализатор для
фермент-связанного флюоресцентного
иммуноанализа типа VIDAS(R) или
miniVIDAS(R), или с аналогичными
характеристиками, подобный BioMerieux,
Франция, или аналог.
4. В разделе 3 пункт 3.2 "Лабораторная посуда и материалы" дополнить строками:
Пакет для гомогенизации с фильтром, подобный BioMerieux, Франция, или аналог
Набор реагентов для определения бактерий рода Campylobacter типа VIDAS(R) Campylobacter (CAM) или с аналогичными характеристиками, подобный BioMerieux, Франция, или аналог.
5. Раздел 3 "Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды" дополнить пунктом 3.5 в следующей редакции:
"3.5. Состав тест-набора для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа
В состав тест-набора входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 26 проб и 4 контрольных образцов, состоящий из следующих компонентов:
30 стрипов для STR Готовы к использованию определения бактерий рода Campylobacter
30 наконечников SPR Готовы к использованию. На внутреннюю
поверхность наконечников нанесены антитела к поверхностным антигенам Campylobacter Стандарт S1 Готов к использованию. Очищенный и инактиви- (1 фл. по 6 мл) рованный антиген Campylobacter + консервант + белковые стабилизаторы. Доверительный интервал указан на калибровочной карте
Положительный C1 Готов к использованию. Очищенный и инактиви-
контроль рованный антиген Campylobacter + консервант определения + белковые стабилизаторы. Доверительный (1 фл. по 6 мл) интервал указан на калибровочной карте
Отрицательный C2 Готов к использованию. Забуференный
контроль физиологический раствор - твин + консервант. определения Максимальное приемлемое значение указано на (1 фл. по 6 мл) калибровочной карте 1 калибровочная Лист спецификаций с фабричными установками карта для калибровки тестов
1 инструкция
3.5.1. Состав стрипа для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Каждый стрип в тест-наборе состоит из 10 лунок, запечатанных фольгой, на которую нанесен штрих-код, несущий информацию о типе анализа, номере партии и сроке годности. Фольга перфорирована над лункой для внесения образца. Последняя лунка представляет собой кювету, в которой происходит считывание результата. Прочие лунки содержат реактивы для анализа. Распределение лунок в стрипе:
Лунка Реактивы
1 Лунка для внесения образца: внесите 0,5 куб. см бульона обогащения (обогащенной культуры), стандарта или контроля 2 Предпромывочный буфер (400 куб. мм): забуференный физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л) pH 7,6 + консервант
3 - 4 - 5 - Промывочный буфер (600 куб. мм): забуференный 7 - 8 - 9 физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л)
pH 7,6 + консервант
6 Конъюгат (400 куб. мм): антитела (IgG) к Campylobacter, меченные щелочной фосфатазой + консервант 10 Кювета, содержащая субстрат (300 куб. мм): 4-метил-умбелиферил-фосфат (0,6 М/л) + диэтаноламин (0,62 М/л или 6,6%, pH 9,2) + консервант
3.5.2. Для определения бактерий рода Campylobacter методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа допускается использование другого оборудования и тест-наборов аналогичного назначения, зарегистрированных в РФ в установленном порядке, с аналогичными характеристиками чувствительности и специфичности". 6. Раздел 4 "Подготовка к анализу" дополнить пунктом 4.3 в следующей редакции:
"4.3. Требования к выполнению фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа
4.3.1. Условия безопасного проведения работ При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор. Анализатор должен находиться в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила: - не использовать наконечники с поврежденной упаковкой; - не использовать поврежденные стрипы;
- не использовать набор по истечении срока годности; - не смешивать реактивы из различных партий; - пролитые жидкости необходимо тщательно вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие отбеливатель; - анализаторы необходимо регулярно чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации приборов. Тест-набор содержит едкий реактив диэтаноламин, а также натрия азид, который со свинцом и медью образует взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их накопления. 4.3.2. Требования к квалификации специалистов Выполнение измерений может проводить специалист, способный после освоения техники иммуноферментного анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности. 4.3.3. Условия выполнения измерений
Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях: - температура окружающего воздуха (20 +/- 5) °С; - атмосферное давление (97 +/- 10) кПа; - относительная влажность (65 +/- 15)%". 7. Раздел 7 дополнить пунктом 7.3 в следующей редакции:
"7.3. Проведение фермент-связанного
флюоресцентного иммуноанализа
7.3.1. Подготовка анализатора к работе: - Перед использованием реактивов новой партии в анализатор вводят (автоматически или вручную) спецификации реактивов, используя калибровочную карту, входящую в каждый набор. Процедуру необходимо проводить только один раз для каждой партии реактивов. - Для каждой новой партии реактивов проводят калибровку прибора, используя стандарт, входящий в состав набора. Калибровку проводят после ввода данных партии, но не реже одного раза в 14 дней. Для этого в отдельные стрипы вносят по 0,5 куб. см реактива C1, C2 и в два стрипа реактив S1 из тест-набора. Необходимо ввести информацию об образце и контролях в анализатор для создания рабочего листа. Установить стрипы и наконечники в анализатор и запустить программу. Эта операция необходима для построения точной калибровочной кривой и компенсации вариаций, которые могут возникнуть при хранении набора. Стандарт S1 необходимо тестировать в двукратной повторности согласно руководству по эксплуатации прибора. Результаты должны находиться в пределах установленного диапазона, указанного на калибровочной карте. Если результат не соответствует диапазону, следует повторить калибровку. 7.3.2. Подготовка образцов к фермент-связанному флюоресцентному иммуноанализу Отобрать в пробирку 1 - 2 куб. см бульона обогащения, инкубированного по п. 7.1 МУК 4.2.2321-08, закрыть и нагревать на водяной бане (15 +/- 1) мин. при 95 - 100 °С. Охладить 10 мин., перемешать и внести 0,5 куб. см в стрип из тест-набора. Оставшуюся часть бульона хранят в холодильнике при 2 - 4 °С для подтверждения положительных образцов. 7.3.3. Проведение фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа Перед проведением анализа необходимое количество компонентов тест-набора оставить при комнатной температуре на 30 мин. Для каждого анализа используется 1 стрип и 1 наконечник из тест-набора. В открытую лунку стрипа вносят 0,5 куб. см термостатированного образца по п. 7.3.2. Далее стрипы и наконечники устанавливают в анализатор, вводят название соответствующих образцов и запускают анализ. Время анализа приблизительно 70 мин. 7.3.4. Интерпретация результатов
Оптический сканер прибора измеряет флюоресценцию дважды в оптической кювете для каждого образца. Первый раз измеряется фон субстрата и кюветы перед внесением в нее субстрата. Второй раз флюоресценция измеряется после внесения субстрата в конус и образования флюоресцирующего продукта в результате ферментативной реакции на поверхности конуса. Вычитание фона кюветы из последнего измерения дает относительную величину флуоресценции - ОВФ (Relative Fluorescence Value) тестируемого образца. Интерпретация значений ОВФ проводится прибором автоматически согласно формуле:
[Результат теста = ОВФ образца / ОВФ стандарта]
Результат теста Интерпретация
< 0,1 Отрицательный
>= 0,1 Положительный
Результат теста со значением меньше порогового указывает на то, что образец не содержит антигена Campylobacter либо содержит его в концентрации ниже порога определения. Результат теста со значением, равным или больше порогового, свидетельствует о том, что образец загрязнен бактериями рода Campylobacter. В этом случае следует провести подтверждение положительного результата по п. 7.3.5. Результаты также считаются недействительными, если (1) значение ОВФ фона выше ожидаемого значения или (2) нет информации о значениях ОВФ стандарта. В первом случае возможно загрязнение субстрата, в связи с чем необходимо провести повторное тестирование образца с новым стрипом. Во втором случае должен быть протестирован новый стандарт из той же партии и результаты теста должны быть пересчитаны по этому стандарту. На принтер выводится информация - тип теста, номер образца, дата и время анализа, номер партии и дата окончания срока годности набора, значения ОВФ, результат и его интерпретация. 7.3.5. Подтверждение положительного результата Подтверждение положительного результата проводят путем высева 0,1 мл хранившегося в холодильнике бульона обогащения, полученного по п. 7.3.2, на поверхность одной из селективных сред (по п. 4.2.2). Инкубацию образцов проводят при температуре (42 +/- 1) °С в течение 20 - 24 ч, при отсутствии роста инкубировать еще 24 ч. При наличии характерных колоний необходимо провести идентификацию до 5 подозрительных колоний на принадлежность к бактериям рода Campylobacter по п. 8.1. При получении противоречивых результатов (положительных альтернативным методом, не подтвержденных стандартным методом) для проверки следует использовать дополнительные методы".
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПИСЬМО
от 24 июня 2011 г. N 30-1/10/2-6165
Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации считает целесообразным при реализации мероприятий программ субъектов Российской Федерации, обеспечивающих доступность приоритетных объектов и услуг в приоритетных сферах жизнедеятельности инвалидов и других маломобильных групп населения, использовать действующие национальные стандарты, устанавливающие требования по обеспечению беспрепятственного доступа инвалидов к объектам социальной инфраструктуры, в том числе: ГОСТ Р ИСО 12124-2009 "Акустика. Методы измерения акустических характеристик слуховых аппаратов на ухе человека"; ГОСТ Р ИСО 11683-2009 "Упаковка. Тактильные знаки предупреждения об опасности. Требования"; ГОСТ Р 52873-2007 "Синтезаторы речи для специальных компьютерных рабочих мест для инвалидов по зрению. Технические требования"; ГОСТ Р 52871-2007 "Дисплеи для слабовидящих. Требования и характеристики"; ГОСТ Р 52874-2007 "Рабочее место для инвалидов по зрению специальное. Порядок разработки и сопровождения"; ГОСТ Р 52875-2007 "Указатели тактильные наземные для инвалидов по зрению. Технические требования"; ГОСТ Р 52872-2007 "Интернет-ресурсы. Требования доступности для инвалидов по зрению".
М.А.ТОПИЛИН
