В нашем геноме около 20 000 генов. В течение клеточной жизни одни из них выключаются, другие включаются, но, так или иначе, в каждый момент примерно половина от этого количества генов работает. Для того чтобы понимать, как клетка живёт и развивается, желательно знать, какие гены функционируют и насколько активно. Обычно это можно определить по матричной РНК, синтезируемой на том или ином гене; потом эта РНК послужит матрицей для производства белка.
Однако просто знать, какие гены работают в каждый отдельно взятый момент, мало: нужна информация о том, где именно скапливается синтезированная РНК, в какой области вдруг клетки понадобился тот или иной белок. Важность таких сведений легко понять, если представить нейрон, который состоит из разных частей, довольно отличных по функциям: есть дендриты — отростки, принимающие сигнал от соседей, есть тело клетки, есть аксон — отросток, передающий сигнал, а на дендритах и аксонах ещё и синапсы формируются, в которых нейрон устанавливает контакты с другими нервными клетками. Понятно, что для синапса принципиальны одни белки (и соответствующие им мРНК), а для тела клетки — другие.
Но классические методы исследования заставляли исследователей мириться с тем, что про локализацию мРНК в клетке они мало что могут узнать. С одной стороны, часть таких методов предполагает разрушение клетки, и все РНК в ней будут, разумеется, перемешаны (пусть мы и сможем потом в точности определить состав этой смеси). С другой стороны, большинство способов клеточной визуализации, которые появились относительно давно и не перестают совершенствоваться, помогают определить локализацию белка, но не его мРНК. Между тем множество регуляторных событий в клетке связаны именно с локализацией самой мРНК, с её и белков транспортировкой из одного места в другое и с разрешениями/запретами на синтез белка (мРНК, скажем, может находиться в молчащем состоянии, дожидаясь своего часа, когда за неё примутся рибосомы).
Поэтому технология, описываемая в журнале Science группой учёных из Института Вайса при Гарвардском университете (США), можно назвать поистине долгожданной. Джордж Чёрч (George M. Church) и его коллеги придумали, как узнать «прописку» каждой РНК в клетке. По сути, метод сводится к секвенированию клеточных РНК на том месте, где она находилась в клетке. Образец ткани обрабатывали таким образом, чтобы клеточные мембраны исчезли, а РНК и белки оставались на месте; получалось что-то вроде РНК-«скелета», оставшегося от разрушенной клетки. Затем на этих РНК синтезировали с помощью обратной транскрипции ДНК, а полученную ДНК ещё и размножали до нескольких сотен копий. В итоге в местах локализации РНК образовывались скопления ДНК, которые были связаны друг с другом, формируя как бы слой, повторяющий расположение РНК.
Впрочем, у этого способа есть предшественники, которые позволяли разглядеть в клетке локализацию двух-трёх десятков РНК. Однако на этот раз удалось поднять чувствительность метода до тысяч РНК. Но всю эту массу нужно как-то различать. Даже если каждое скопление ДНК будет флюоресцировать, выделить отдельные точки в общей сияющей группе просто невозможно.
Чтобы понять, где что находится, исследователи прибегли к одному из методов секвенирования ДНК нового поколения, в котором одноцепочечная ДНК читается с помощью второй цепи ДНК, синтезирующейся на первой, как на шаблоне; при этом в сырьё для синтеза наряду с обычными нуклеотидами включены флюоресцирующие. Не вдаваясь дальше в тонкости метода, скажем, что по рисунку флюоресценции, образованному из разновеликих насинтезированных фрагментов ДНК, можно прочесть её последовательность.
Эту технологию учёные адаптировали к вышеописанным условиям, когда от клетки остаётся пространственный РНК-«скелет». Только в данном случае было позволительно ограничиться неким относительно небольшим фрагментом ДНК, прочитав который можно было определить, что этот фрагмент служит опознавательным знаком, «паспортом» РНК. И тут всё зависит от того, можно ли для конкретной РНК считать этот «паспорт».
То есть сначала мы синтезируем ДНК-копию РНК, а потом эту ДНК-копию слегка секвенируем.
FISSEQ: Flashing sequence from Wyss Institute on Vimeo.
Авторы работы опробовали метод (названный FISSEQ — fluorescent in situ RNA sequencing) на соединительнотканных клетках, которые мигрируют в рану при восстановлении повреждённых тканей. Из 6 800 видов РНК, которые удалось таким образом детектировать, у двенадцати были замечены изменения в активности, и среди них оказались восемь, которые были явно вовлечены в процесс клеточной миграции, но никогда в связи с этим не изучались.
Если к такому РНК-штрихкоду удастся создать ещё и белковый, то мы, наверное, узнаем всё о любой клетке. Перспективы метода очевидны: с его помощью можно изучать изменения в активности генов как внутри клетки, так и на уровне ткани. Возможно, теперь мы наконец-то разберёмся с такими загадочными (и довольно далёкими друг от друга) вещами, как клеточное устройство мозга и канцерогенез…
Подготовлено по материалам Института Вайса.
