УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
9 августа 2006 года
Дата введения:
1 сентября 2006 года
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ 2-ХЛОРФЕНОЛА В БИОСРЕДАХ (МОЧА) ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.2109-06
- Область применения
Методические указания по определению концентраций химических веществ в биологических средах предназначены для использования Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, работающими в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды. Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием органических соединений в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды. Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 «ГСОЕИ. Методики выполнения измерений», ГОСТ Р 1.5-92 «ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов». Методика анализа обеспечивает выполнение измерений массовой концентрации 2-хлорфенола в моче в диапазоне концентраций: от 0,05 до 1,80 мкг/куб. см с погрешностью 23,0% при доверительной вероятности 0,95. 2-Хлорфенол
ClC6H4OH Молекулярная масса 128,56. 2-Хлорфенол — бесцветная жидкость с резким неприятным запахом. Температура кипения — 175 град. С. Кумулятивные свойства выражены умеренно. Вызывает нарушения функции почек и печени, при периодическом попадании на кожу — новообразования [1].
2. Сущность метода
Методика основана на предварительном концентрировании анализируемого соединения из биологического материала (моча) экстракцией бутилацетатом и последующем газохроматографическом анализе экстракта. Выполнение измерений массовой концентрации 2-хлорфенола выполняют методом газовой хроматографии с использованием детектора электронного захвата. Определению не мешают хлороформ, тетрахлорметан и другие хлорфенолы (температура кипения 3-хлорфенола — 214 град. С) в количествах, не превышающих верхнюю границу измеряемой концентрации 2-хлорфенола. Длительность анализа одной пробы мочи, включая экстракцию, — 40 мин.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и растворы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными или лучшими метрологическими и техническими характеристиками.
3.1. Средства измерений
Хроматограф газовый с детектором
электронного захвата
Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические ГОСТ 24104-01 Разновесы Г2-210 ГОСТ 7328-01 Секундомер "Агат" ТУ 25-1894.003-90 Микрошприцы МШ-10 ТУ 2.833.106-00 Линейка измерительная ГОСТ 427-75 Лупа измерительная ГОСТ 25706-83 Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74 Пипетки мерные 5, 10 куб. см ГОСТ 29227-91.
3.2. Вспомогательные устройства
Хроматографическая колонка стеклянная длиной 1,5 м и внутренним диаметром 3 мм
Бидистиллятор стеклянный БС ТУ 25-11.1592-81 Редуктор кислородный ТУ 26-05-236-73 Центрифуга СМ-4, 3000 об./мин. Воронка делительная ГОСТ 23932-90.
3.3. Материалы
Азот газообразный ГОСТ 9293-74.
3.4. Реактивы
3% ХЕ-60 на хроматоне N-супер фракции
0,16-0,20 мм — неподвижная фаза для
заполнения хроматографической колонки
(производство Германии)
2-Хлорфенол, ч ТУ 6-09-2875 Натрия хлорид, хч ГОСТ 4233-77 Соляная кислота, хч ГОСТ 3118-77 Бутилацетат, ч ГОСТ 22300-76 Камфара фарм. Серная кислота, осч ГОСТ 14262-78 Калия дихромат, чда ГОСТ 4220-75 Ацетон, осч ТУ 2633-039-44493179-00.
3.5. Растворы
Раствор калия дихромата, 3%-й
Раствор камфары, 20%-й
Соляная кислота, раствор (1:3).
4. Требования к безопасности
4.1. При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76. 4.2. При работе необходимо соблюдать «Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях» (утверждены МЗ СССР 20.12.82) и «Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением» (утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87). 4.3. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88. 4.4. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.
5. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.
6. Условия измерений
6.1. При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия: — температура воздуха (20 +/- 5) град. С; — атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.; — влажность воздуха не более 80% при температуре 25 град. С. 6.2. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, подготовка хроматографической колонки, приготовление аттестованных смесей, установление градуировочной характеристики.
7.1. Подготовка посуды
Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе дихромата калия в серной кислоте (3 г дихромата калия на 100 куб. см концентрированной серной кислоты), отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть бидистиллированной водой и просушить при температуре 120 град. С.
7.2. Подготовка хроматографической колонки
Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой, устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (азота) с расходом 30 куб. см/мин. при температуре 250 град. С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.
7.3. Приготовление растворов и реактивов
7.3.1. Раствор соляной кислоты (1:3). В мерный стакан объемом 100 куб. см, содержащий 75 куб. см бидистиллированной воды, вводят 25 куб. см соляной кислоты (ро = 1,19). Раствор переносят в стеклянную склянку с притертой пробкой. 7.3.2. Раствор камфары 20%-й. Растворяют 2 г кристаллической камфары в 10 куб. см бутилацетата. Раствор хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой не более 1 месяца. 7.3.3. Реагент для экстракции. К 100 куб. см бутилацетата прибавляют 0,4 куб. см 20%-го раствора камфары.
7.4. Приготовление аттестованных смесей
Для построения градуировочного графика собирают мочу, не содержащую определяемого компонента, и готовят серию аттестованных растворов. Исходный аттестованный раствор. В мерную колбу объемом 100 куб. см, содержащую 50 куб. см мочи, вводят 2 куб. мм 2-хлорфенола и заполняют колбу до метки мочой. Весовое содержание определяемого вещества в исходном аттестованном растворе составляет (с учетом плотности) 25,27 мкг/куб. см. Срок хранения — 12 ч.
7.5. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной калибровки. Она выражает зависимость площади пика на хроматограмме (кв. мм) от массы 2-хлорфенола (мкг) и строится по 5 сериям рабочих аттестованных растворов. Каждую серию, состоящую их 5 рабочих аттестованных растворов, готовят в мерных колбах объемом 50 куб. см. В колбу объемом 50 куб. см, содержащую 30 куб. см мочи, добавляют исходную аттестованную смесь для градуировки в соответствии с табл. 1. Затем объем в колбе доводят мочой до метки.
Таблица 1
РАБОЧИЕ АТТЕСТОВАННЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ 2-ХЛОРФЕНОЛА
Номер смеси для градуировки 1 2 3 4 5
2-Хлорфенол, объем исходного аттестованного 0,1 0,5 1,0 2,0 3,5 раствора (25,27 мкг/куб. см), куб. см
Содержание 2-хлорфенола, мкг/куб. см 0,05 0,25 0,5 1,0 1,77
Для построения градуировочной характеристики 2-хлорфенола аттестованный раствор в объеме 50 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, добавляют 30 г высаливателя (хлорид натрия), подкисляют раствором соляной кислоты (1:3) до pH = 2 и приливают 5 куб. м реагента для экстракции (раствор камфары в бутилацетате). Содержимое воронки интенсивно встряхивают 10 мин., после отстаивания эфирный экстракт сливают в пробирку и центрифугируют для денатурации белка 10 мин. В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 2 куб. м каждого экстракта аттестованного раствора и анализируют в условиях: температура термостата колонок — 110 град. С; температура испарителя — 170 град. С;
температура детектора — 250 град. С;
расход газа-носителя (азот) — 30 куб. см/мин.; скорость диаграммной ленты — 240 мм/ч;
время удерживания 2-хлорфенола — 1 мин. На полученной хроматограмме определяют площади пиков 2-хлорфенола и по средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику. Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.
7.6. Отбор проб
Отбор проб мочи в объеме не менее 200 куб. см производится в тщательно вымытый стеклянный сосуд с притертой пробкой. Анализ мочи проводить сразу или хранить в холодильнике не более 12 ч после отбора пробы.
8. Выполнение измерений
Для определения 2-хлорфенола мочу в объеме 50 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, добавляют 30 г высаливателя (хлорид натрия), подкисляют раствором соляной кислоты (1:3) до pH = 2 и приливают 5 куб. см реагента для экстракции (раствор камфары в бутилацетате). Содержимое воронки интенсивно встряхивают 10 мин., после отстаивания эфирный экстракт сливают в пробирку и центрифугируют для денатурации белка 10 мин. Полученный центрифугат хроматографируют и проводят количественное определение анализируемого соединения в подготовленной пробе по калибровочному графику. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб мочи. Условия выполнения измерений аналогичны условиям при установлении градуировочной характеристики (п. 7.5.).
9. Вычисление результатов измерений
На хроматограмме рассчитывают площадь пика и по градуировочной характеристике определяют концентрацию 2-хлорфенола в моче.
За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений Х , Х , расхождение между которыми не должно
max min
превышать значения предела повторяемости r (табл. 3).
n Расчет концентраций 2-хлорфенола ведут по формуле:
А х V экст. Ч = ----------, V х V 1 2
где:
А — количество компонента, найденное по калибровочному графику, мкг;
V - объем экстрагента, куб. см; экст. V - объем экстрагируемой мочи, куб. см; 1 V - объем хроматографируемой пробы, куб. см. 2 _
Результат измерений представляют в виде (Х +/- ДЕЛЬТА), мкг/куб. см, где:
_
Х — средний результат анализа, мкг/куб. см:
Х + Х _ max min Х = -----------, 2
при условии:
r Х + Х n max min Х - Х <= --- х -----------, max min 100 2
где:
Х - максимальный результат из 2-х параллельных измерений; max
Х - минимальный результат из 2-х параллельных измерений; min
r - значение предела повторяемости, %; n
ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мкг/куб. см, при Р = 0,95, равная:
_ дельта х Х ДЕЛЬТА = ----------, 100
где дельта - относительное значение характеристики погрешности, %.
10. Внутренний контроль качества результатов измерений
Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа". Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2 и 3.
Таблица 2
ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТОЧНОСТИ, ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ
Наименование Показатель повто- Показатель воспроиз- Показатель точ- определяемого ряемости (относи- водимости (относи- ности (границы компонента и тельное среднеква- тельное среднеквад- относительной
диапазон дратическое откло- ратическое отклоне- погрешности при измерений, нение повторяемо- ние воспроизводимо- вероятности мкг/куб. см сти), сигма , % сти), сигма Р = 0,95), r R , % +/- дельта, % _ Xl 2-Хлорфенол, от 11,7 12,3 23,0
0,05 до 1,80 вкл.
Таблица 3
ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ И ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ Р = 0,95
Наименование определяемого Предел повторяемос- Предел внутрилабораторной
компонента и диапазон ти (относительное воспроизводимости (относи- измерений, мкг/куб. см значение допускае- тельное значение допускае-
мого расхождения мого расхождения между между двумя резуль- двумя результатами измере- параллельных опре- ний, полученными в одной делений), r , % лаборатории, но в разных n условиях), R , % _ Xl 2-Хлорфенол, 22,3 28,4
от 0,05 до 1,80 вкл.
10.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики
Контроль стабильности градуировочного графика проводят раз в квартал в анализируемой серии измерений, определяют содержание исследуемого соединения в градуировочных растворах, которые соответствуют началу, середине и концу градуировочного интервала. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.
10.2. Контроль повторяемости
Относительное расхождение между результатами двух измерений, выполненных в соответствии с методикой одним оператором при измерении образцов одной и той же рабочей пробы с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов в течение возможно минимального интервала, не должно превышать значения предела повторяемости r (табл. 3).
n Повторяемость результатов параллельных измерений признают
удовлетворительной, если:
r Х + Х n max min Х - Х <= --- х -----------, max min 100 2
где:
r - значение предела повторяемости, %; n
Х - максимальный результат из 2-х параллельных измерений; max
Х - минимальный результат из 2-х параллельных измерений. min
Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.
10.3. Контроль воспроизводимости
Внутренний контроль воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:
R _ _ _ Х + Х _ _ Xl 1 2 |Х - Х | <= --- х -------, 1 2 100 2
где:
_
Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных 1
измерений, мкг/куб. см;
_
Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных 2
измерений, полученный в других условиях, мкг/куб. см;
R - значение предела внутрилабораторной воспроизводимости, %
_ Xl (табл. 3). _ _ Расхождение между результатами измерений Х и Х , полученных в разных 1 2 условиях, не должно превышать значений показателя воспроизводимости R при _ Xl
доверительной вероятности Р = 0,95, указанных в табл. 3. Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.
10.4. Оперативный контроль точности
Контроль точности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольной процедуры, равного разности между результатом контрольного измерения содержания 2-хлорфенола в пробе с известной добавкой _1 _ (Х ), в рабочей пробе без добавки (Х) и величиной добавки С (добавка
д должна составлять не менее 40% от содержания 2-хлорфенола в рабочей пробе) с нормативом точности К.
Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:
_1 _ |Х - Х - С | = К , д k
где:
_1
Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе с известной добавкой из 2-х параллельных измерений, мкг/куб. см;
_
Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, мкг/куб. см;
С - величина добавки к пробе, мкг/куб. см; д
/дельта _ 2 дельта _1 2 К = 0,84 х /(------ х Х) + (------ х Х ) . \/ 100 100
Качество контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении условия: К <= К.
k
При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, устраняют их и процедуру контроля повторяют. Периодичность ВКК регламентируется в Руководстве по качеству лаборатории.
Литература
- Бандман А.Л., Войтенко Г.А., Волкова Н.В. и др. Вредные химические вещества. Углеводороды. Галогенпроизводные углеводородов. Справ. изд./Под ред. В.А.Филова и др. Л.: "Химия", 1990.
Методические указания разработаны Пермским научно-исследовательским клиническим институтом детской экопатологии (Т.С.Уланова, Т.В.Нурисламова, Н.А.Попова).
