УТВЕРЖДАЮ
Главный врач ФГУЗ «Федеральный
центр гигиены и эпидемиологии»,
Председатель Лабораторного совета
Федеральной службы по надзору
в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека
А.И.ВЕРЕЩАГИН
8 декабря 2006 г.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ РОДА SALMONELLA
МЕТОДОМ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
N 02.013-06
- Разработаны: ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора при участии ООО «Стай-лаб».
- Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (от 29 сентября 2006 г.).
- Утверждены и введены в действие Председателем Лабораторного совета, Главным врачом ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора А.И. Верещагиным 08.12.2006.
- Введены впервые.
- Область применения
Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях организаций, независимо от форм собственности, осуществляющих производственный контроль, а также в лабораториях иных организаций, аккредитованных на право проведения испытаний, исследований. Методические рекомендации могут быть использованы для целей определения бактерий рода Salmonella при скрининговых исследованиях пищевых продуктов и смывов.
2. Общие положения
Сальмонеллы принадлежат к семейству Enterobacteriaceae, их биологические характеристики во многом сходны с прочими энтеробактериями. Энтеробактерии обнаруживаются в почве, воде, на поверхности фруктов, овощей, в злаках и других объектах окружающей среды. Многие из этих микроорганизмов имеют эпидемиологическое значение в связи с их патогенностью для человека. Определение сальмонелл традиционными методами бактериологии в пищевых продуктах занимает длительное время и сопряжено со значительными трудозатратами. Требуется несколько дней для культивирования, селективного выделения и идентификации сальмонелл с последующим подтверждением результатов серологическими и биохимическими методами. При использовании иммунохимических технологий анализа, таких как твердофазный иммуноферментный анализ, процедуры определения сальмонелл могут быть существенно оптимизированы, а время исследования сокращено. Это актуально при поведении микробиологическими лабораториями производственного контроля пищевых продуктов, сырья и пр. при значительном объеме исследований.
3. Принцип метода твердофазного ИФА
Принципом иммунохимического определения бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах, смывах является твердофазный иммуноферментный анализ на полистироловых планшетах, покрытых моноклональными антителами к термостабильному антигену бактерий. Результатом проведения ИФА служит образование комплекса антиген-антитело при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями. Использование твердой фазы позволяет надежно разделять компоненты реакции за счет иммобилизации одного из компонентов, не участвующих в реакции. Для осуществления реакции данного типа используется тест-система LOCATE(R) Salmonella с высокоспецифичными моноклональными антителами к термостабильным «О»-антигенам и соматическим антигенам клеточной стенки бактерий рода Salmonella. Этим обеспечивается эффективное определение как подвижных, так и неподвижных штаммов бактерий. Тест-система LOCATE(R) Salmonella спроектирована в формате стрипованного 96-луночного ИФА-планшета, что позволяет выполнять исследования от 1 до 94 образцов одновременно как при визуальной, так и при автоматической оценке результата (с помощью ридера).
4. Аппаратура, материалы, питательные среды и тест-системы
Термостат электрический с диапазоном измерения от 15 до ТУ 64-1-1382-83 65 град. С с допустимой погрешностью регулирования температуры +/- 1 град. С
Стерилизатор паровой медицинский ГОСТ 19569
Шкаф сушильно-стерилизационный, обеспечивающий поддержание заданного температурного режима в диапазоне от 50 до 200 град. С с погрешностью +/- 2 град. С
Гомогенизатор бактериологический перистальтического типа Masticator (или Stomacher) со стерильными полиэтиленовыми пакетами
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 ТУ 16-535-84
Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания ГОСТ 24104 200 г и допустимой погрешностью +/- 2 мг
Холодильник бытовой электрический ГОСТ 16317
Пипетки градуированные исполнения 1, 2 классов точности ГОСТ 29227 вместимостью 1 куб. см, 10 куб. см
Пробирки бактериологические вместимостью не менее ГОСТ 25336 10 куб. см
Посуда широкогорлая ГОСТ 25336
Питательные среды: Забуференный бульон для обогащения сальмонелл Тетратионатный бульон Селенитовый бульон Висмут-сульфит агар XLD-агар
Компоненты набора тест-системы LOCATE(R) Salmonella: Микротитровальный стрипованный планшет на 96 лунок, 1 шт. покрытых моноклональными антителами на сальмонеллы
Коньюгат, в рабочем разведении 1 шт. Положительный контроль (термически дезактивированные 1 шт. бактерии рода Salmonella), 2 мл Отрицательный контроль (термически дезактивированные 1 шт. бактерии), 2 мл Концентрирующий моющий буфер, 25-кратный, 20 мл 2 шт. Субстрат, ТМБ, 15 мл 1 шт. Стоп-реагент, содержит 2% раствор серной кислоты, 15 мл 1 шт. Схема планировки планшета 1 шт.
5. Отбор и подготовка проб к анализу
Примечание.
ГОСТ Р 51446-99 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов» утратил силу с 1 января 2010 года в связи с изданием Приказа Ростехрегулирования от 18.12.2008 N 480-ст.
5.1. Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 «Методы отбора проб для микробиологических анализов», ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов», МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов», ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96), а также в соответствии с действующими ГОСТ и НД на конкретные виды продуктов. 5.2. Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования и превышать аналитический образец не менее чем в два раза. 5.3. От продукции в потребительской таре в мелкой фасовке пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары так, чтобы количество было достаточным для проведения анализа. 5.4. От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров или без упаковки пробы отбирают из разных точек: с поверхности и с различной глубины. 5.5. Пробы для микробиологических анализов отбирают стерильным инструментом в стерильную посуду до взятия проб на физико-химические и органолептические исследования. 5.6. Замороженные продукты предварительно размораживают до температуры внутри продукта 0 — (-1) град. С (не менее 1 ч в термостате при температуре 37 град. С); продукты, содержащие жиры (сливочное масло, мороженое), нагревают до температуры 40-45 град. С и перемешивают. 5.7. Отобранные образцы перемешивают и измельчают или доводят до однородной консистенции по ГОСТ 26669-85; из измельченной суспензии составляют навеску необходимой массы (25 г). 5.8. При посевах высококислотных или щелочных (с рН < 6 или > 7,5) жидких и твердых продуктов для предотвращения изменения рН питательных сред на 0,5 и более рН продукта перед посевом доводят до 7,0 +/- 0,2 по ГОСТ 30519-97 "Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella". 5.9. Смывы отбирают с помощью стерильных увлажненных тампонов, сделанных из марли или ваты, с поверхности оборудования и инвентаря площадью 100 куб. см, используя трафарет. Трафарет фламбируют перед каждым употреблением.
6. Определение бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах методом твердофазного иммуноферментного анализа
6.1. Предобогащение: внести 25 г подготовленной пробы в 225 мл бульона предобогащения. Перемешать образец в стомахере, блендере или с помощью другой техники, обеспечивающей достаточно хорошее перемешивание. Инкубировать в течение 18-24 ч при 37 град. С. 6.2. Селективное обогащение: после инкубации перенести по 0,1 мл предобогащенной пробы в 10 мл тетратионатного бульона и в 10 мл бульона Раппапорта-Вассилиадиса. Инкубировать бульоны в течение 18-24 ч при 42 +/- 0,5 град. С. Примечание 1:
Взамен одного из селективных бульонов на второй день допускается использовать селенитовый бульон с режимом инкубации 37 +/- 0,5 град. С 24 часа.
6.3. После инкубации перенести по 1 мл культуральной жидкости из каждого бульона селективного обогащения в две пробирки с 10 мл модифицированного GN-бульона <>, каждую пробирку с GN-бульоном подписать. Инкубировать в течение 4-6 ч при 42 +/- 0,5 град. С.
<> Модифицированный GN-бульон содержит 10 мкг/мл новобиоцина.
6.4. После инкубации перенести по 1 мл из каждой пробирки с GN-бульоном в одну стеклянную пробирку на 10 мл и проавтоклавировать при 121 град. С (допускается использовать кипящую водяную баню в течение 20 мин. для инактивации живых бактерий). Оставшиеся бульоны (не термообработанные) поместить в холодильник до конца исследования. 6.5. Охладить пробу до комнатной температуры. Тщательно перемешать бульон после охлаждения и использовать для ИФА.
7. Подготовка реагентов для ИФА
7.1. Для анализа используется иммуноферментная тест-система LOCATE(R) Salmonella производства R-Biopharm Rhone Ltd. 7.2. Приготовление рабочих разведений растворов, входящих в комплект тест-системы: 7.2.1. Подготовить моющий буфер в рабочем разведении: разбавить концентрат моющего буфера в 25 раз дистиллированной водой (смешать 20 мл буфера и 480 мл дистиллированной воды). Отметить дату приготовления на флаконе с буфером. Хранить буфер в холодильнике. 7.2.2. Рабочий раствор конъюгата: добавить 7 мл буфера для разбавления конъюгата во флакон с сублимированным конъюгатом. Отметить дату приготовления на крышке флакона (срок хранения 28 дней с момента приготовления). 7.2.3. Субстрат (ТМБ) поставляется в рабочем разведении. 7.2.4. Стоп-реагент поставляется в рабочем разведении. 7.2.5. Положительные и отрицательные контроли поставляются в рабочем разведении.
8. Проведение ИФА
8.1. Извлечь из пакета необходимое количество стрипов, разделить на необходимое количество лунок (по одной лунке на каждую пробу) и 2 лунки для контрольных растворов. Поместить лунки в планшетную рамку и зафиксировать. Немедленно упаковать оставшиеся лунки в пакет вместе с силикагелем. 8.2. Внести по 100 мкл растворов положительного и отрицательного контроля в соответствующие лунки. Внести по 100 мкл исследуемых термообработанных бульонов в соответствующие лунки. Обозначить положение каждой лунки на прилагаемой диаграмме. Инкубировать планшет при температуре 37 град. С в темноте 30 мин. 8.3. После инкубации с помощью автоматического вошера или многоканальной автоматической пипетки с переменным объемом внести в каждую лунку по 250 мкл моющего буфера. Повторить процедуру промывания еще 3 раза, после чего промыть лунки 1 раз дистиллированной водой. Перевернуть рамку и тщательно выбить капли дистиллированной воды путем постукивания рамки по столу, накрытой фильтровальной бумагой. 8.4. Внести по 100 мкл конъюгата в каждую лунку (при необходимости использования большого количества лунок использовать 8-канальную автоматическую пипетку). Инкубировать планшет при температуре 37 град. С 30 мин. 8.5. По окончании инкубации промыть лунки планшета, как описано в п. 8.3. 8.6. Внести по 100 мкл субстрата в каждую лунку (при необходимости исследования большого количества образцов использовать ванночку для реагентов и 8-канальную пипетку). Чтобы снять излишки субстрата с верхнего края лунок, необходимо промокнуть лунки фильтровальной бумагой. Немедленно поставить планшет в темноту, инкубировать его при температуре 37 град. С 30 мин. 8.7. Учет результатов:
— При визуальной интерпретации результатов: считывание результатов проводится сразу после инкубации. Стоп-реагент не добавляется. — При автоматизированном учете результатов: по окончании инкубации добавить в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента. В течение 5-ти минут (не более) после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке, используя фотометр планшетный (ридер) с длиной волны 450 нм.
9. Интерпретация результатов
9.1. Интерпретация результатов, полученных с помощью ридера: 9.1.1. При значении оптической плотности 0,3 и менее результат расценивается как отрицательный — в исследованной пробе пищевого продукта бактерии рода Salmonella не обнаружены. 9.1.2. При значении оптической плотности более 0,3 проба пищевого продукта расценивается как положительная, и требуется подтверждение наличия в исследуемом образце жизнеспособных бактерий рода Salmonella традиционными методами, описанными в разделе 10. 9.2. Интерпретация результатов при визуальном учете: 9.2.1. При окраске содержимого лунки в синий цвет результат расценивается как положительный, и требуется подтверждение наличия жизнеспособных бактерий рода Salmonella. 9.2.2. При окраске содержимого лунки в прозрачный или бледно-голубой цвет результат расценивается как отрицательный, то есть проба пищевого продукта не содержит жизнеспособных бактерий рода Salmonella.
10. Подтверждение положительных результатов
10.1. Из модифицированного GN-бульона, не подвергавшегося термообработке, отобрать 1 мл и перенести в 10 мл свежего модифицированного GN-бульона. Одновременно провести высев на плотные питательные среды (не менее 2). Инкубировать чашки 24 ч при температуре 37 град. С. При наличии подозрительных колоний провести биохимическое и серологическое типирование. 10.2. При положительном результате биохимического и серологического типирования проба пищевого продукта считается положительной и расценивается как содержащая жизнеспособные бактерии рода Salmonella.
11. Способы отбора смывов
11.1. В ходе производственного и инспекционного контроля пищевых предприятий, вырабатывающих и реализующих пищевые продукты, широко используется метод смывов с целью контроля эффективности санитарной обработки инвентаря, оборудования, посуды, санитарной одежды и рук персонала. Метод смывов дает возможность оценить санитарно-эпидемиологическое состояние обследуемых объектов. 11.2. Отбор смывов производится с помощью стерильных увлажненных ватных тампонов. Стерильные ватные тампоны на стеклянных, металлических или деревянных палочках, вмонтированных в пробки для пробирок, заготавливают заранее в лаборатории. В день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливается (в асептических условиях) по 5 мл бульона предобогащения (забуференная пептонная среда) таким образом, чтобы тампон не касался жидкости. 11.3. Непосредственно перед отбором смыва с поверхности тампон опускают в жидкость. 11.4. При проведении отбора смывов необходимо использовать трафарет в соответствии с установленным порядком контроля объектов. После отбора смывов пробирки со средой обогащения вместе с тампоном необходимо поместить в термостат на 24 ч, инкубировать при 37 град. С. 11.5. Далее исследование проводится в соответствии с п.п. 6.3-6.5.
12. Требования к помещениям и технике безопасности
Работа по определению бактерий рода Salmonella методом твердофазного иммуноферментного анализа должна осуществляться в соответствии с требованиями СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами», ГОСТ Р 51446 «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».
13. Чувствительность метода
13.1. Чувствительность метода составляет: 1 КОЕ бактерий рода Salmonella на 25 г пробы пищевого продукта до инкубации в средах предобогащения (по данным инструкции производителя тест-системы).
5 13.2. Чувствительность метода перед детекцией в ИФА — от 100 до 10 — 6
10 жизнеспособных бактерий рода Salmonella в 1 мл культуральной жидкости.
