Утверждаю
Главный врач ФГУЗ «Федеральный
центр гигиены и эпидемиологии»,
Председатель Лабораторного совета
Федеральной службы по надзору
в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека
А.И.ВЕРЕЩАГИН
30 июня 2008 года
ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ С ПРИМЕНЕНИЕМ АВТОМАТИЧЕСКОГО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗАТОРА VITEK 2 COMPACT
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
МР 02.032-08
- Разработаны: ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора; НИИ Антимикробной химиотерапии ГОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»; ФГУЗ ФЦГиЭ Московской области; ФГУЗ ГЦГСЭН Министерства обороны РФ при участии ООО «Биомерье», г. Москва.
- Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом Роспотребнадзора (протокол N 4 от 30.06.2008).
- Утверждены и введены в действие Председателем Лабораторного совета, Главным врачом ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора А.И. Верещагиным 30 июня 2008 г.
- Введены впервые.
- Область применения
Настоящие Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях организаций, независимо от форм собственности, осуществляющих бактериологические исследования с целью выделения и идентификации патогенных биологических агентов (ПБА) бактериальной этиологии (бактерий, грибов) из клинического материала, объектов окружающей среды, а также определения их чувствительности к антимикробным препаратам.
2. Нормативные ссылки
2.1. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)». 2.2. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV группы патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». 2.3. СанПиН 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений». 2.4. «Временные рекомендации (правила) по охране труда при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Минздрава России». М., 2002. 2.5. «Инструкция по мерам профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебных и профилактических учреждений». М., 1991.
3. Общие положения
Идентификация основана на анализе изменения биохимических субстратов под действием микроорганизмов. Определение чувствительности производится на основании подавления роста микроорганизмов под действием различных концентраций антибиотиков. При этом определяются минимальные ингибирующие концентрации (МИК) антибиотиков, которые выражаются в мг/л и интерпретируются в виде категорий «устойчив», «чувствителен», «умеренно устойчив».
4. Сущность метода
Работа в анализаторе VITEK 2 Compact проводится с чистой культурой микроорганизма. В качестве расходных материалов используются пластиковые карты, содержащие биохимические субстраты (ID-карты, карты для идентификации) или антибиотики в различных концентрациях (AST-карты, карты для определения чувствительности). Карты под вакуумом, создаваемым анализатором, в автоматическом режиме заполняются суспензией чистой культуры микроорганизмов, запаиваются и помещаются в карусель, где они инкубируются и регулярно (каждые 15 минут) сканируются оптической системой анализатора. При этом для считывания ID-карт используется колориметрия (анализатор содержит 2 оптических модуля и использует волны 660, 428 и 568 нанометров), для считывания AST-карт — турбидиметрия (фиксируется изменение плотности микробной суспензии под влиянием антибиотика). Результаты сканирования подвергаются компьютерной обработке. По завершении идентификации анализатор найдет в базе данных соответствие тестируемому микроорганизму или проведет определение чувствительности к антибиотикам, после чего карта сбрасывается в специальный приемник.
5. Методы отбора и подготовки проб
Исследуемый материал инокулируется на питательные среды согласно методам микробиологических исследований, утвержденных в установленном порядке. Чашки инкубируются 18 — 24 (48) ч до получения изолированных колоний. Колонии микроорганизмов для исследования на VITEK 2 Compact рекомендуется брать с неселективных питательных сред. Используется только чистая культура микроорганизмов.
6. Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды
Анализатор Vitek 2 Compact
Суспензиальный раствор (0,45% раствор хлорида натрия) Диспенсер суспензиального раствора
Пластиковые пробирки для анализатора Vitek 2 Compact Карты для идентификации
Карты для определения чувствительности
Петли бактериологические
Тампоны стерильные
Денситометр
7. Подготовка к испытанию
Перед началом работы необходимо, следуя инструкциям программного обеспечения, ввести информацию об используемых AST-картах, а также произвести ряд общих настроек: настроить печать (автоматическая или по требованию) и прочие параметры, следуя инструкции пользователя по программному обеспечению. Чистая культура (материал одной или нескольких изолированных колоний) с помощью бактериологической петли или тампона вносится в пластиковую пробирку с суспензиальным раствором и гомогенизируется там до достижения требуемой плотности бактериальной суспензии <1>: для грамположительных и грамотрицательных бактерий: 0,5 - 0,63 McF <2>; для прихотливых бактерий: 2,7 - 3,3 McF; для бацилл: 1,8 - 2,2 McF;
для грибов: 1,8 — 2,2 McF.
<1> Работа с ПБА I - II должна проводиться в соответствии с СП 1.3.1285-03. <2> Стандарт 1 McF (мутности по МакФарланду) соответствует 300 миллионам бактериальных клеток в мл.
Выбор карты для исследования производится на основании окраски по Граму или пробы с КОН, позволяющей разделить бактерии на грамположительные и грамотрицательные. При этом следует использовать карты VITEK 2 GP (грамположительные) или VITEK 2 GN (грамотрицательные) соответственно. Микроорганизмы, прихотливые к условиям культивирования (нейссерии, гемофилы и прочие <3>), идентифицируются при помощи карт VITEK 2 NH, грибы - карт VITEK 2 YST. Карты VITEK 2 BCL предназначены для идентификации микроорганизмов рода Bacillus.
<3> Перечень микроорганизмов, идентифицируемых на различных картах, см. в Приложении.
Пробирки с суспензиями устанавливаются в кассету, напротив них в специальные прорези (слоты) устанавливаются соответствующие карты, так, чтобы относящаяся к карте пластиковая трубочка была погружена в пробирку.
8. Проведение испытания
8.1. Работа в режиме виртуальной кассеты Виртуальная кассета создается согласно инструкции по программному обеспечению. В соответствующие ячейки образовавшейся таблицы вводится номер штрих-кода (путем считывания штрих-кода ридером), рядом с которым проставляются лабораторные номера. Затем созданную «виртуальную кассету» необходимо сохранить в памяти компьютера. (Время от момента сохранения «виртуальной кассеты» до момента загрузки собственно кассеты с картами в прибор не должно превышать 30 минут.) Далее следует приступить к загрузке кассеты с картами в вакуумную камеру анализатора. Перед тем как загружать кассету в камеру, следует убедиться (это отображено на маленьком собственном мониторе анализатора), что статус прибора «ok», вакуумная камера готова к работе и в карусели имеется достаточное количество свободных мест. В том случае, если все эти условия соблюдены, можно открыть дверцу вакуумной камеры, поместить туда кассету с картами, плотно закрыть дверцу и нажать на клавишу «Начать заполнение». В процессе заполнения карт суспензией в вакуумной камере рекомендуется не отходить от анализатора и, дождавшись (ожидание занимает 70 секунд), когда раздастся сигнал и замигает стрелка индикатора, открыть камеру. При этом разблокируется дверца загрузочного модуля, которую следует открыть и переставить кассету с заполненными картами из одной камеры в другую. Затем дверцы анализатора следует закрыть в произвольной последовательности. Если кассета не будет перенесена из вакуумной камеры в загрузочный модуль в течение 10 минут, прибор не примет ее для дальнейшего исследования. После помещения кассеты в загрузочный модуль рекомендуется дождаться окончания процесса считывания штрих-кодов (занимает примерно 1 минуту), не отходя от анализатора. Мелодичный сигнал говорит о нормально прошедшем процессе считывания. Грубый звук сигнализирует об имеющихся ошибках. В последнем случае следует установить причину ошибок, вызвав их описание на дисплее анализатора. После нормально прошедшей загрузки индикатор загрузочного модуля будет показывать мигающую синюю стрелку. Кассету с оставшимися пробирками из этой камеры прибора можно извлечь сразу или в другое время (например, при загрузке следующей кассеты). 8.2. Работа в режиме постановки тестов с последующим описанием При данном режиме работы кассета с картами помещается в вакуумную камеру и дальше — в загрузочный модуль без предварительного этапа внесения данных в компьютер. В этом случае результаты обработки карт в окне результатов изолята появятся только после внесения необходимой информации (лабораторного номера) в таблицу окна постановки тестов с последующим описанием. 8.3. Внесение данных об образце
Внести данные об образце (если эта функция активирована) можно как до момента загрузки карт в анализатор, так и после завершения обработки карт. При этом нужно иметь в виду, что результаты анализов с отсутствующей информацией об образце не будут переноситься в архив.
9. Обработка результатов
После считывания карт полученные результаты анализируются программным обеспечением. Результаты исследования карт можно просмотреть (распечатать) в соответствующем окне интерфейса.
10. Ограничение метода
Корректная идентификация и определение чувствительности с использованием анализатора VITEK 2 Compact возможны только для микроорганизмов, имеющих клиническое значение.
Приложение
МИКРООРГАНИЗМЫ, ИДЕНТИФИЦИРУЕМЫЕ НА КАРТАХ VITEK 2
(Наименования идентифицируемых анализатором Vitek 2 Compact микроорганизмов приводятся в соответствии с 9-м изданием Определителя бактерий Берджи с учетом последних изменений, опубликованных в International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (www.bacterio.net).)
Бактерии, идентифицируемые на карте VITEK 2 GN
Enterobacteriaceae Не Enterobacteriaceae
Buttiauxella agrestis Achromobacter denitrificans Cedecea davisae (ранее Achromobacter Cedecea lapagei xylosoxidans ssp. denitrificans) Citrobacter amalonaticus Achromobacter xylosoxidans Citrobacter braakii (ранее Achromobacter Citrobacter farmeri xylosoxidans ssp. xylosoxidans) Citrobacter freundii Acinetobacter baumannii Citrobacter koseri Acinetobacter haemolyticus Citrobacter sedlakii Acinetobacter junii Citrobacter youngae Acinetobacter lwoffii Edwardsiella hoshinae Actinobacillus ureae Edwardsiella tarda Aeromonas hydrophila/Aeromonas Enterobacter aerogenes cavlae Enterobacter amnigenus 1 Aeromonas salmonicida Enterobacter amnigenus 2 Aeromonas sobria Enterobacter asburiae Aeromonas veronii Enterobacter cancerogenus Alcaligenes faecalis ssp. faecalis Enterobacter cloacae Bordetella bronchiseptica Enterobacter gergoviae Bordetella trematum Enterobacter intermedius Brevundimonas diminuta/vesicularis Enterobacter sakazakii Brucella melitensis Escherichia coli Budvicia aquatica Escherichia coli 0157 Burkholderia cepacia группа Escherichia fergusonii Burkbolderia gladioli Escherichia hermannii Burkholderia mallei Escherichia vulneris Burkholderia pseudomallei Ewingella americana CDC группа EF-4 (Pasteurella) Hafhia alvei Chromobacterium violaceum Klebsiella oxytoca Chryseobacterium gleum
Klebsiella pneumoniae ssp. ozaenae Chryseobacterium indologenes Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae Chryseobacterium meningosepticum
Klebsiella pneumoniae ssp. Comamonas testosteroni rhinoscleromatis Delftia acidovorans Kluyvera ascorbata Francisella tularensis Kluyvera cryocrescens Grimontia hollisae Leclercia adecarboxylata (ранее Vibrio hollisae) Moellerella wisconsensis Mannheimia haemolytica Morganella morganii ssp. morganii Methylobacterium spp. Morganella morganii ssp. sibonii Moraxella группа Pantoea agglomerans Myroides spp. Pantoea spp. Ochrobactrum anthropi Proteus mirabilis Oligella ureolytica Proteus vulgaris группа/Proteus Paracoccus yeeii (ранее CDC группа penneri EO-2) Providencia alcalifaciens Pasteurella aerogenes Providencia rettgeri Pasteurella multocida Providencia rustigianii Rasteurella pneumotropica Providencia stuartii Photobacterium damselae Rahnella aquatilis Piesiomonas shigelloides Raoultella ornithinolytica Pseudomonas aeruginosa Salmonella enterica ssp. anzonae Pseudomonas alcaligenes (ранее Salmonella choleraesuis ssp. Pseudomonas fluorescens arizonae) Pseudomonas luteola Salmonella группа Pseudomonas mendocina Salmonella ser. Gallinarum Pseudomonas oryzihabitans Salmonella ser. Paratyphi A Pseudomonas pseudoailcaligenes Salmonella ser. Typhi Pseudomonas putida Serratia ficaria Pseudomonas stutzeri Serratia fonticola Ralstonia mannitolilytica Serratia liquefaclens группа Ralstonia pickettii Serratia marcescens Rhizobium radiobacter Serratia odorifera Shewaneiia putrefaciens Serratia plymuthica Sphingobacterium multivorum Serratia rubidaea Sphingobacterium spiritivorum Shigella группа Sphingobacterium thalpophiium Shigella sonnei Sphingomonas paucimobilis Yersinia enterocolitica группа Stenotrophomonas maltophilia Yersinia pestis Vibrio alginolyticus Yersinia pseudotuberculosis Vibrio cholerae Yersinia ruckeri Vibrio fluvialis Yokenella regensburgei Vibrio metschnikovii Vibrio mimicus Vibrio parahaemolyticus Vibrio vulnificus Wautersia paucula (ранее Ralstonia paucula)
Высоко вирулентные виды Brucella melitensis Burlkholderia mallei Burlkholderia pseudomallei Escherichia coli 0157 Francisella tularensis Vibrio cholerae Yersinia pestis
Бактерии, идентифицируемые на карте GP
Abiotrophia defectiva Streptococcus constellatus Aerococcus urinae ssp. constellatus Aerococcus viridans Streptococcus constellatus Alloiococcus otitis ssp. pharyngis Dermacoccus nishinomiyaensis/ Streptococcus cristatus Kytococcus sedentarius Streptococcus downel Enterococcus avium Streptococcus dysgalactiae ssp. Enterococcus casseliflavus dysgalactiae Enterococcus cecorum Streptococcus dysgalactiae ssp. Enterococcus columbae equisimilis Enterococcus durans Streptococcus equi ssp. equi Enterococcus faecalis Streptococcus equi ssp. Enterococcus faecium zooepidemicus Enterococcus gallinarum Streptococcus equlnus Enterococcus hirae Streptococcus gallolyticus ssp. Enterococcus raffinosus gallolyticus Enterococcus saccharolyticus Streptococcus gallolyticus ssp. Erysipelothrix rhusiopahiae pasteurlanus Facklamia hominis Streptococcus gordonii Gardnerella vaginalis Streptococcus hyointestinalis Gemella bergeri Streptococcus infantarius ssp. Gemella haemolysans infantarius Gemella morbillorum Streptococcus infantarius Gemella sanguinis ssp. coli/Streptococcus bovis Giobicatella sanguinis Staphylococcus epidermidis Giobicatella suifidifaciens Staphylococcus equorum Granuiicatella adiacens Staphylococcus gallinarum Granuiicatella eiegans Staphylococcus haemolyticus Helcococcus kunziii Staphylococcus hominis Kocuria kristinae Staphylococcus hyicus Kocuria rosea Staphylococcus intermedius Kocuria varians Staphylococcus kloosii Lactococcus garvieae Staphylococcus lentus Lactococcus lactis ssp. cremoris Staphylococcus lugdunensis Lactococcus lactis ssp. lactis Staphylococcus saprophyticus Lactococcus raffinolactis Staphylococcus schleiferi Leuconostoc citreum Staphylococcus sciuri Leuconostoc lactis Staphylococcus simulans Leuconostoc mesenteroides ssp. Staphylococcus vitulinus cremoris Staphylococcus warneri Leuconostoc mesenteroides ssp. Staphylococcus xylosus dextranicum Streptococcus agalactiae Leuconostoc mesenteroides ssp. Streptococcus alactolyticus mesenteroides Streptococcus anginosus Leuconostoc pseudomesenteroides Streptococcus canis Listeria grayi Streptococcus intermedius Listeria innocua Streptococcus mitis/Streptococcus Listeria ivanovii oralis Listeria monocytogenes Streptococcus mutans Listeria seeligeri Streptococcus ovis Listeria welshimeri Streptococcus parasanguinis Micrococcus luteus/lylae Streptococcus pluranimalium Pediococcus acidilactici Streptococcus pneumoniae Pediococcus pentosaceus Streptococcus porcinus Rothia mucilaginosa Streptococcus pyogenes Staphylococcus arlettae Streptococcus salivarius Staphylococcus aureus <*> Streptococcus sanguinis Staphylococcus auricuiaris Streptococcus sobrinus Staphylococcus capitis Streptococcus suis I Staphylococcus caprae Streptococcus suis II Staphylococcus carnosus ssp. carnosus Streptococcus thermophilus Staphylococcus chromogenes Streptococcus thoraltensis Staphylococcus cohnii ssp. cohnii Streptococcus uteris Staphylococcus cohnii ssp. Streptococcus vestibularis
urealyticus С (ранее Staphylococcus Vagococcus fluvialis cohnii ssp. urealyticum)
<*> Staphylococcus aureus включает только подвид aureus.
Бактерии, идентифицируемые на карте NH
Actinobacillus ureae Haemophilus segnis Campylobacter coli Haemophilus parainfluenzae Campylobacter fetus ssp. fetus Kingella denitrificans Campylobacter jejuni ssp. jejuni Kingella kingae Capnocytophaga spp. Moraxella (Branhamella) catarrhalis Cardiobacterium hominis Neisseria cinerea Eikenella corrodens Neisseria elongata Gardnerella vaginalis Neisseria gonorrhoeae Haemophilus actinomycetemcomitans Neisseria lactamica Haemophilus aphrophilus/ Neisseria meningitidis paraphrophilus Neisseria sicca Haemophilus haemolyticus Oligella urethralis Haemophilus influenzae Suttonella indologenes
Haemophilus parahaemolyticus
Грибы, идентифицируемые на карте YST
Candida albicans Candida utilis Candida boidinii Candida zeylanoides Candida catenulata Cryptococcus albidus Candida colliculosa Cryptococcus laurentii Candida dubliniensis Cryptococcus neoformans Candida famata Cryptococcus terreus Candida freyschussii Cryptococcus uniguttulatus Candida glabrata Geotrichum capitatum Candida guilliermondii Geotrichum kiebahnii Candida haemulonii Kioeckera spp. Candida intermedia Kodamaea ohmeri Candida kefyr Malassezia furfur Candida krusei/Candida inconspicua/ Malaiassezia pachydermatis Candida lambica Pichia farinosa Candida lipolytica Prototheca wickerhamii Candida lusitaniae Prototheca zopfii Candida magnoliae Rhodotorula glutinis/Rhodotorula Candida norvegensis mucilaginosa Candida parapsilosis Rhodotorula minuta Candida peliculosa Saccharomyces cerevisiae Candida pulchemma Sporoboiomyces salmonicolor Candida rugosa Steplianoascus ciferrii Candida sake Trichosporon asahii Candida sphaerica Trichosporon inkin Candida tropicalis Trichosporon mucoides Zygosaccharomyces bailii
Бактерии, идентифицируемые на карте BCL
Aneurinibacillus aneurinilyticus Brevibacillus centrosporus Bacillus amyloliquefaciens Brevibacillus choshinensis Bacillus anthracis Brevibacillus invocatus Bacillus badius Brevibacillus laterosporus Bacillus cereus Brevibacillus parabrevis Bacillus circulans Geobacillus stearothermophilus Bacillus coagulans Geobacillus thermodenitrificans Bacillus firmus Geobacillus thermoglucosidasius Bacillus fusiformis Paenibacillus alvei Bacillus lentus Paenibacillus amylolyticus Bacillus licheniformis Paenibacillus durus (ранее Bacillus megaterium Paenibacillus azotofixans) Bacillus mycoides Paenibacillus glucanolyticus Bacillus pumilus Paenibacillus macerans Bacillus smithii Paenibacillus pabuli Bacillus sphaericus Paenibacillus peoriae Bacillus sporothermodurans Paenibacillus polymyxa Bacillus subtilis Paenibacillus thiaminolyticus Bacillus thuringiensis Paenibacillus validus Brevibacillus agri Virgibacillus pantothenticus Brevibacillus borstelensis Virgibacillus proomii
Brevibacillus brevis
