УТВЕРЖДАЮ
Первый заместитель Министра
здравоохранения России
Г.Г.ОНИЩЕНКО
3 февраля 1997 г. N МУ-8-12
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ДЕТЕКЦИИ БРУЦЕЛЛ В РАЗЛИЧНОМ БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Аннотация
Методические рекомендации предназначены для работников научно-исследовательских и практических учреждений, занимающихся вопросами идентификации микроорганизмов. Рекомендации разработали сотрудники Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока М.Ю.Шестопалов, С.В.Балахонов, А.И. Калиновский.
Введение
Сохраняющаяся высокая заболеваемость бруцеллезом людей и животных оставляет актуальным вопрос о ранней и эффективной диагностике этого заболевания. Существующие методы либо длительны и многоэтапны (бактериологический), либо не исключают перекрестных ложноположительных результатов с представителями других таксонов бактерий, имеющих антигенное сходство с бруцеллами (комплекс иммунологических тестов). Перспективным подходом к решению этого вопроса в лабораторной диагностике является использование полимеразной цепной реакции (ПЦР), превосходящей на несколько порядков по чувствительности и специфичности традиционные иммунологические тесты и позволяющей работать с исследуемым материалом без выделения чистой культуры. Данный метод дает возможность обнаруживать единичные клетки бруцелл в различном биологическом материале: крови, сыворотке крови, молоке, моче, гистологическом материале, объектах окружающей среды в ранние — от 4 до 6 часов — сроки, высокоспецифичен и максимально адаптирован к существующей лабораторной базе.
Принцип метода
Полимеразная цепная реакция открывает возможность многократно амплифицировать (синтезировать) в пробирке участок хромосомной ДНК бруцелл размером 269 пар, нуклеотидов, являющейся фрагментом гена оболочечного белка, с молекулярной массой 31 кД. Фрагмент, специфичный только для микроорганизмов рода Brucella, ограничен парой олигонуклеотидных праймеров, с которых термостабильная ДНК-полимераза осуществляет синтез этого участка ДНК в присутствии 4-дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) и солевого буфера,
2+
содержащего ионы магния (Mg ) и бычий сывороточный альбумин (BSA).
Синтез возможен только тогда, когда вносимая ДНК, выделенная из исследуемой пробы, окажется идентичной (комплементарной) праймерам, в противном случае амплификации не будет. Результат амплификации легко визуализируется, например, методом электрофореза в агарозном геле. ПЦР состоит из цикла повторяющихся температурных режимов: 94 град. С — 35 сек. — денатурация (расхождение) двойной цепи исследуемой ДНК до двух одиночных; 52 град. С — 35 сек. — присоединение («отжиг») праймеров к идентичным участкам на одиночных цепях исследуемой ДНК; 72 град. С — 35 сек. — синтез специфичного участка ДНК, Tag-полимеразой, путем удлинения праймеров.
За каждый такой цикл происходит удвоение числа копий этого
n участка ДНК, что можно выразить как 2 , где n — количество циклов амплификации. Таким образом, за 40-50 циклов амплифицируется фрагмент ДНК, в достаточном количестве для обнаружения его методом гель-электрофореза.
В целом же вся процедура ПЦР-диагностики состоит из 3 этапов: 1) Выделение ДНК из исследуемого материала 2) ПЦР
3) Учет результатов ПЦР.
Лабораторное оборудование
- Микроцентрифуга на 12000-14000 об./мин.
- Автоматические микропипетки на 20, 200 и 1000 мкл
- Одноразовые наконечники к пипеткам на 200 мкл
- Наконечники к пипеткам на 1000 мкл
- Пластиковые микропробирки объемом 500 мкл
- Пластиковые микропробирки объемом 1500 мкл
- ДНК-амплификатор с программным обеспечением (МС-2) или аналогичный
- УФ-трансиллюминатор
- Фотоаппарат с красным или оранжевым светофильтром
- Негативная фотопленка (типа ФН-64, «Микрат-300»)
- Аппарат для горизонтального гель-электрофореза
- Источник напряжения постоянного тока.
Химические реактивы
NaOH (категории х.ч. или ч.д.а.)
NaCl (х.ч.)
96% этанол
Трис-ОН (Трис-основной, м.в. 121.1)
ЭДТА x Na2 («Трилон-Б»)
H3BO3 (Борная кислота)
Агароза (желательно использовать агарозу с низким электроэндоосмосом и высокой плотностью геля, например, фирмы SIGMA type 1 или 2) Бромистый этидий
Мертиолят натрия
HCl концентрированная
Бромфеноловый синий
Глицерин.
Растворы для выделения ДНК из проб
10 М NaOH (хранить в полиэтиленовом флаконе) 5 М NaCl
96% этанол
80% этанол
ТЕ-буфер: 10 мМ Трис-HCl, pH 7,0, 1 мМ ЭДТА (стерилизовать автоклавированием).
Компоненты для проведения ПЦР и гель-электрофореза
- Солевой ПЦР-буфер для проведения амплификации 10х: 100 мМ Трис-HCl, pH 8,5 при 37 град. С 100 мМ MgCl2 1000 мМ KCl
- 2,5 мМ раствор dNTP
- Водный раствор BSA 2 мг/мл
- Дистиллированная или бидистиллированная вода
- Олигонуклеотидные праймеры: Bru 1 5′-GCA GTC AGA CGT TGC CTA TT-3′ Bru 2 5′-GTC TGA GGT GTT CAG CCT Т-3′.
Приготовление лизирующего раствора и выделение ДНК из проб
Приготовление растворов, выделение ДНК, ПЦР и гель-электрофорез осуществляют в раздельных помещениях для предотвращения контаминации компонентов, проб и оборудования. Для выделения ДНК из одной пробы объемом 10 мкл приготавливают щелочной, лизирующе-осаждающий раствор следующего состава: 1. 13 мкл 10 М NaOH
2. 22 мкл дистиллированной воды
3. 3 мкл 5 М NaCl
4. 144 мкл 96% этанола.
Общий объем этой смеси составляет 182 мкл. Данный раствор можно приготовить в отдельных пробирках объемом 1,5 мл (последовательно добавляя все четыре указанных компонента) перед внесением в них проб, либо в отдельном полиэтиленовом или пластиковом флаконе с расчетом на все число проб плюс одна (учитывая погрешности микропипеток). Щелочной раствор приготавливают перед выделением ДНК из проб и впрок не заготавливают. Исследуемую пробу объемом 10 мкл добавляют в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл, содержащую 182 мкл щелочного, лизирующе-осаждающего раствора и сразу же перемешивают путем легкого встряхивания. Пробирку выдерживают при комнатной температуре 10 — 15 мин. Пробу центрифугируют 5 мин. при 12000 — 14000 об./мин., супернатант сливают, остаткам раствора в пробирке дают стечь на фильтровальную бумагу. К осадку на дне пробирки (который может быть малозаметен) добавляют 500 мкл 80% этанола, пробирку несколько раз осторожно переворачивают и центрифугируют 2 минуты при 12000 — 14000 об./мин. Этанол сливают, а пробирку подсушивают на фильтровальной бумаге в течение 5 — 10 мин. К осадку добавляют 30 мкл ТЕ-буфера или дистиллированной воды и содержимое пробирки перемешивают путем пипетирования в отдельном стерильном наконечнике. Примечания. 1. ДНК можно выделять из проб менее и более 10 мкл — тогда соответственно необходимо сделать количественный пересчет компонентов щелочного, лизирующе-осаждающего раствора. 2. Выделенные препараты ДНК можно хранить в условиях холодильника в течение 1 месяца.
Проведение ПЦР
ПЦР проводят только в одноразовых микропробирках с использованием одноразовых наконечников для внесения всех компонентов амплификационной смеси. Подготавливают и пронумеровывают пробирки на 500 мкл по числу исследуемых проб, плюс три пробирки: для положительного и отрицательного контролей и разведенной в 10 раз дистилированной водой Tag-ДНК-полимеразы. На одну пробу готовят амплификационную смесь объемом 25 мкл следующего состава: 1) 1 мкл ПЦР-буфера
2) 1 мкл dNTP
3) 1 мкл BSA
4) Дистиллированной воды до 20 мкл, в зависимости от количества вносимых, праймеров 5) 4 pmol (пикомоля) каждого праймера
6) 0,2 мкл Tag-ДНК-полимеразы в 2 мкл дистиллированной воды 7) 3 мкл исследуемой пробы.
Исследуемую пробу всегда вносят в последнюю очередь, после чего всю смесь перемешивают пипетированием и закрывают 85 мкл вазелинового масла (три капли из наконечника объемом 200 мкл). В качестве положительного контроля используют ДНК B. melitensis Rev-1 или B. abortus 19-BA, выделенные описанным щелочным методом, в отрицательном контроле используется дистиллированная вода вместо анализируемой пробы. Пробирки закрывают и помещают в амплификатор со следующей температурно-временной программой одного цикла: 94 град. С — 35 сек.;
52 град. С — 35 сек.;
72 град. С — 35 сек.
Количество циклов 50. За это время в каждом цикле происходит удвоение числа копий ограниченного праймерами участка хромосомной ДНК, причем, каждая вновь синтезируемая цепь становится матрицей для присоединения праймеров и снова амплифицируется, что позволяет за 50 циклов синтезировать фрагмент ДНК в количестве достаточном для обнаружения его с помощью электрофореза в агарозном геле. Примечания. 1. Солевой ПЦР-буфер, раствор dNTP, раствор BSA, праймеры, Tag-ДНК-полимераза обязательно хранят в морозильнике и размораживают (кроме Tag-ДНК-полимеразы) перед приготовлением амплификационной смеси. 2. Амплификационную смесь, состоящую из ПЦР-буфера, dNTP, BSA и воды можно приготовить заранее в достаточных количествах и заморозить небольшими аликвотами.
Гель-электрофорез продукта ПЦР
После завершения программы амплификации, пробы смешивают с 2,5 мкл раствора для нанесения проб и помещают в лунки горизонтального 1,5% агарозного геля, содержащего 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Электрофорез проводят в 1х ТВЕ-буфере в присутствии бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл, при напряжении 30 В/см в течение 25 мин., не допуская выхода красителя бромфенолового синего из геля. Гель просматривают в Уф-свете и результат фоторегистрируют. Амплифицированные фрагменты идентифицируют по размеру, сравнивая флюоресцирующие при 254 — 302 нм в геле полосы анализируемых проб, с полосой положительного контроля. Положительными могут считаться только те пробы, амплифицированные фрагменты которых (флюоресцирующие полоски в геле) находятся строго на уровне фрагмента положительного контроля. Данный метод детекции бруцелл, с используемыми праймерами и представленными температурно-временными параметрами, позволяет обнаруживать единичные клетки в пробе за 50 циклов амплификации у всех представителей рода Brucella, что выражается флюоресцирующей полосой в геле агарозы, размером 269 пар нуклеотидов. Примечание. Бромистый этидий является сильным мутагеном, поэтому все работы, связанные с перемещением агарозного геля, проводите в перчатках.
