Утверждаю
Заместитель Председателя
Госкомсанэпиднадзора РФ
Г.Г.ОНИЩЕНКО
28 ноября 1994 года
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ НАДЗОР ЗА РОТАВИРУСНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Методические рекомендации подготовлены сотрудниками Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций с участием специалистов-практиков больниц N 3 и 15 г. Екатеринбурга. Рассмотрены и одобрены Ученым Советом института. Составители: Н.Я.Венедиктова, Н.В.Пацук, М.Г.Трофимова, С.Ф.Закирова, Н.Н.Сбитнева, Л.В.Власова, Т.Н.Быкова, Е.Н.Константинович, Г.А.Бабанова. Настоящие методические рекомендации предназначены для эпидемиологов, вирусологов, а также для врачей лечебно-профилактических учреждений (инфекционистов, педиатров и др.).
ВВЕДЕНИЕ
До настоящего времени острые кишечные заболевания (ОКЗ) занимают одно из ведущих мест в инфекционной патологии человека. Известно не менее 25 этиологических агентов, вызывающих острую диарею. Получены убедительные данные в пользу существования ОКЗ, вызванных кишечными вариантами аденовирусов (типы 38, 40, 41), калицивирусами, вирусом Норфолк, мелкими недифференцированными вирусными частицами. Реже при ОКЗ указывают на этиологическую роль аотровирусов, коронавирусов, нельзя полностью отрицать участие в возникновении острых диарей и энтеровирусов. Сравнительно недавно, с конца 70-х и начала 80-х годов, особое внимание привлечено к ротавирусам — наиболее значимым возбудителям острых гастроэнтеритов. Они вызывают, по данным разных авторов, от 30 до 80% всех случаев острых кишечных заболеваний у детей. Вероятно, эти цифровые различия в диагностике ротавирусных инфекций связаны не только с диагностическими возможностями используемых лабораторных тестов, но и с возрастом обследуемых, широтой распространения этих заболеваний в разных регионах. К сожалению, в большинстве случаев ротавирусные гастроэнтериты остаются этиологически нерасшифрованными из-за отсутствия систематической лабораторной диагностики. В то же время своевременно поставленный диагноз позволяет правильно вести больного, устраняет необходимость применения антибиотиков и способствует проведению целенаправленных противоэпидемических мероприятий. В Екатеринбургском НИИ вирусных инфекций накоплен большой опыт по изучению ротавирусных заболеваний в таком крупном промышленном городе, как Екатеринбург, по выявлению их клинических и эпидемиологических особенностей. Эта работа была начата в 1980 году и динамические ежегодные наблюдения проводили регулярно, включая эпидсезон 1991-1992 гг. Анализ имеющихся в институте собственных материалов с привлечением данных отечественных и зарубежных исследователей дал возможность сформулировать ряд положений, характеризующих основополагающие этапы системы эпидемиологического надзора за ротавирусной инфекцией.
I. Основные направления и задачи эпидемиологического надзора за ротавирусной инфекцией
Цель эпидемиологического надзора за наиболее распространенными в настоящее время инфекционными заболеваниями четко сформулирована в определении В.Д. Белякова. Согласно автору, под эпиднадзором понимается «динамическая оценка состояния и тенденций развития эпидемического процесса в пространстве и времени, обеспечивающая своевременное вмешательство в его ход с целью предупреждения и снижения заболеваемости». Это положение в первую очередь должно быть отнесено к острым кишечным инфекциям, этиологическая расшифровка которых является актуальной для большинства территорий России, где воздействие неблагоприятных условий окружающей среды, чрезвычайно высокий уровень урбанизации и относительно низкое социальное развитие обусловливают сохранение высокого уровня заболеваемости ОКЗ. Принимая во внимание изложенное, в систему эпидемиологического надзора за ротавирусными заболеваниями, составляющими значительный удельный вес в структуре ОКЗ неясной этиологии, особенно в крупных городах, должны входить следующие основные мероприятия: — своевременное выявление и лечение больных ротавирусными заболеваниями; — ретроспективный и оперативный эпидемиологический анализ заболеваемости ротавирусной инфекцией и контроль за качеством клинической и лабораторной диагностики; — контроль за циркуляцией ротавирусов среди различных возрастных и социальных групп населения и во внешней среде; — предупреждение вспышек ротавирусных заболеваний (внутрибольничных, в организованных детских коллективах, семейных и др.); — контроль за состоянием иммунитета к ротовирусам у лиц из «групп риска».
1.1. Клиническая характеристика ротавирусных заболеваний
Клиническая симптоматика манифестных форм ротавирусного гастроэнтерита весьма характерна. Инкубационный период заболевания продолжается от нескольких часов до 3-5 дней. Болезнь начинается остро, с повышения температуры до 38 °C (реже выше). Наблюдается общая слабость, рвота до 5-7 раз в сутки, опережающая появление жидкого водянистого стула, снижение аппетита вплоть до анорексии. При поступлении в стационар у преимущественного большинства детей (до 87%) состояние расценивается как среднетяжелое, а у остальных — как тяжелое. Поскольку клиническая характеристика ротавирусного гастроэнтерита к настоящему времени подробно изучена и изложена во многих руководствах по инфекционным болезням, в данном методическом документе считаем необходимым остановиться на тех ее особенностях, которые были выявлены нами при клиническом анализе историй болезни у детей г. Екатеринбурга с подтвержденной ротавирусной природой заболевания. Первая особенность клинического течения ротавирусного гастроэнтерита связана с возрастом заболевших. Так, выраженная температурная реакция до 38-39 °C была зарегистрировала лишь у детей в возрасте старше 6 месяцев (60%), а у детей первых 2-х месяцев жизни температура чаще оставалась нормальной или не превышала 37,5 °C. У больных этой возрастной группы токсикоз с эксикозом наблюдались в единичных случаях, тогда как у заболевших в возрасте старше 6 месяцев подобные явления регистрировались в 40% случаев. Эти особенности, вероятно, обусловлены тем, что дети до 3-х месяцев жизни, как правило, находятся на естественном или смешанном вскармливании, это и обеспечивает более благоприятное течение болезни. С увеличением возраста чаще наблюдали тяжелое течение болезни, особенно у больных с сочетанной вирусно-бактериальной инфекцией. Обращает на себя внимание тот факт, что у 50% таких детей при поступлении в стационар заболевание сопровождалось катаральными явлениями со стороны верхних дыхательных путей. Для ротавирусного гастроэнтерита характерна быстрая динамика восстановления: температура обычно нормализовалась ко 2-4 дню, рвота продолжалась не более 1-2 дней (до 3-го дня сохранялась у 33% заболевших), стул нормализовался к 5 дню у 75% детей. Все дети выписывались из стационара в удовлетворительном состоянии. Однако копрологические исследования выявили характерные для поражения тонкого кишечника ферментативные нарушения, которые несмотря на нормализацию стула сохранялись до момента выписки из стационара. При выписке из стационара больного ротавирусной инфекцией следует также иметь в виду, что продолжительность выделения вируса с калом колеблется от 3 до 13 дней. Причем, более длительное время ротавирусный антиген выявляется у лиц с сопутствующей патологией желудочно-кишечного тракта. Известно также, что клиническое выздоровление при ОКИ часто опережает по времени освобождение организма от возбудителя. Эти данные имеют несомненно важное эпидемиологическое значение. Для предотвращения рассеивания вируса и инфицирования окружающих больные ротавирусной инфекцией должны выписываться из стационара лишь с контрольными отрицательными анализами на ротавирусный антиген. Тем более, что, по имеющимся данным, инфицирование контактных может достигать 40% случаев. Второй особенностью клинического проявления манифестной формы ротавирусной инфекции, по нашим наблюдениям, является неодинаковая частота вовлечения в эпидемический процесс в отдельные эпидсезоны детей различного возраста. Так, в г. Екатеринбурге в эпидсезон 1985-1986 гг. значительно чаще болели дети в возрасте от 1 года до 2-х лет (заболеваемость среди них была почти в 2 раза выше, чем среди детей в возрасте от 6 мес. до 1 года), а в предыдущий эпидсезон (1984-1985 гг.) дети этих возрастных групп болели в одинаковом проценте случаев. В эпидсезон 1985-1986 гг. наблюдалась и первая возрастная особенность, проявляющаяся в утяжелении клинического течения ротавирусной инфекции у детей более старшего возраста, что требовало назначения инфузионной терапии не позднее первых 3-х суток у 86% больных (в предыдущий эпидсезон — у 41%). Подобные отличия в клинической картине ротавирусной инфекции возможно могут быть связаны с различными патогенными свойствами циркулирующих в разные эпидсезоны штаммов ротавирусов. При изучении электрофоретической подвижности ротавирусов установлено, что в 1984, 1985 гг. преобладали ротавирусы I и II электрофоретипов, а в 1987 г. появились типы III, IV и V. В то же время исследованиями, проведенными в последние годы, показано, что более тяжелое течение заболевания вызывают ротавирусы с «коротким» электрофоретипом РНК (подгруппа I). Характерно, что в эпидсезон 1985-1986 гг. наблюдалась и более высокая заболеваемость ротавирусной инфекцией взрослого населения г. Екатеринбурга. Это позволило провести у них объективный анализ клинического течения данной инфекции. Начало болезни у всех больных было острым: лихорадка (94%), появление симптомов интоксикации в виде снижения аппетита, тошнота (74%), рвота (38%), появление болей в животе, преимущественно в эпигастральной или околопупочной областях у 80% заболевших (у 38% больных боли носили постоянный, а у 42% схваткообразный характер). У всех больных отмечалась общая слабость, у 62% — температура была субфебрильной, у 24% — повышалась до 39 °C. В отдельных случаях (8%) она была и выше. У 75% больных наблюдался обильный многократный водянистый стул. Течение болезни во всех случаях ротавирусной инфекции у взрослых было благоприятным, с клиническим выздоровлением до 6 суток у 70% больных; максимальная длительность болезни составила 14 суток. Следует отметить, что в анамнезе 43% взрослых больных имелись указания на сопутствующие заболевания, из них у 83% были хронические заболевания желудочно-кишечного тракта. Изложенные клинические особенности ротавирусных заболеваний следует учитывать при их дифференциальной диагностике от других нозологических форм ОКИ, что будет способствовать своевременной госпитализации больных, определению правильной тактики лечения и противоэпидемических мероприятий в очагах инфекции.
1.2. Эпидемиологический анализ заболеваемости ротавирусной инфекцией и контроль за качеством клинической и лабораторной диагностики
Оперативному эпидемиологическому анализу непосредственно в период эпидсезона ротавирусной инфекции должен предшествовать и сопутствовать ретроспективный анализ характерных для нее основных проявлений эпидемического процесса. Учитывая свойственную ротавирусной инфекции сезонность, включающую 4-ый квартал предыдущего года и 1-ый, а в некоторых случаях и начало 2-ого квартала последующего года, ретроспективный анализ обусловленной ею заболеваемости необходимо проводить не по календарному году, а по эпидсезонам. Это позволит получать более информативные, достоверные и эпидемиологически сопоставимые данные по разным территориям. Согласно указанному принципу, был проведен анализ заболеваемости ротавирусными гастроэнтеритами, начиная с 1982 по 1992 гг., т.е. за 10-летний период изучения этой инфекции в г. Екатеринбурге. Эпидемиологической и статистической обработке был подвергнут материал за октябрь — ноябрь — декабрь каждого предыдущего года и за январь — февраль — март последующего. В результате проведенного анализа были выявлены 3 эпидсезона (1983-1984, 1984-1985, 1985-1986 гг.), когда заболеваемость лабораторно подтвержденной ротавирусной инфекцией как в целом у детей, так и в особенности в возрасте от 0 до 3 лет была самой высокой (59,1; 69,9; 61,8% соответственно). В последующие эпидсезоны наметилась явно выраженная тенденция к снижению заболеваемости, причем во всех возрастных группах. За весь период наблюдения наименьшее число случаев ротавирусной инфекции зарегистрировано в возрастной группе от 0 до 6 месяцев, что согласуется с данными других авторов. У детей этого возраста заболеваемость была в 2-3 раза ниже, чем у более старших возрастных групп. Подобная возрастная особенность ротавирусной инфекции может быть связана с тем, что в молоке кормящей матери обнаружены антитела к ротавирусу, и получив их, ребенок клинически остается здоровым, но может быть бессимптомным вирусоносителем, выделяя возбудитель во внешнюю среду. Однако следует иметь в виду, что такая резистентность новорожденных к ротавирусной инфекции непостоянна, и в некоторых случаях, особенно во время вспышек этих инфекций в роддомах, они подвержены заболеванию различной степени тяжести (тяжелые диареи, энтероколиты). Все исследователи, занимающиеся изучением ротавирусной инфекции, сходятся в одном мнении, что ею болеют преимущественно дети в возрасте от 7 месяцев до 2-х лет. По нашим наблюдениям, среди больных с лабораторно подтвержденной ротавирусной инфекцией дети этого возраста составили 2/3 заболевших и лишь в 8,2% — дети старше 3-х лет. Выявлены различия в обнаружении ротавирусного антигена у больных в отдельные месяцы эпидсезона в зависимости от возраста. Так, среди больных в возрасте 0-6 месяцев ротавирусный антиген, как указывалось выше, выявляли в низком проценте случаев, особенно в январе — феврале, а в марте число положительных находок возрастало в 4-6 раз. В возрастной группе больных 6-11 месяцев лабораторное подтверждение ротавирусной инфекции наблюдалось стабильно в высоком проценте случаев в течение всего эпидсезона. В следующей возрастной группе больных (от 1 года до 2-х лет) ротавирусный антиген выявляли в январе — марте в 1,5 раза чаще, чем в ноябре — декабре. Эти результаты дают основание предполагать, что первыми в эпидпроцесс ротавирусной инфекции вовлекаются дети в возрасте от 6 до 12 месяцев и только через 1-2 месяца «подключаются» возрастные группы от 1 до 6 месяцев и от 12 месяцев до 2-х лет. Заболеваемость взрослых ротавирусным гастроэнтеритом обычно начинает возрастать на 2-3 недели позже, чем у детей, что объясняется внутрисемейными или другими контактами с больными детьми. По нашим данным, наиболее высокий уровень заболеваемости ротавирусной инфекцией взрослого населения наблюдался в те эпидсезоны, когда она была максимальной среди детей. В такие эпидсезоны ротавирусную природу острых кишечных инфекций неясной этиологии (ОКИНЭ) удавалось подтвердить у взрослых в 19,0-34,0% случаев (в среднем в 26,5%). По возрасту больные распределялись следующим образом: до 20 лет — 12,0%; 21-30 лет — 40,0%; 31-40 лет — 8,0%; 41-50 лет — 26,0%; 51-60 лет — 6%; старше 60 лет — 8,0%. Следовательно, ротавирусная инфекция чаще всего регистрировалась у лиц молодого возраста (до 30 лет — 52%). К эпидемиологической особенности ротавирусной инфекции в г. Екатеринбурге на протяжении многих лет наблюдения относится наибольшая заболеваемость среди неорганизованных детей (они составляли 93% всех анализируемых случаев). Этот факт, по-видимому, объясняется возрастной структурой заболевших, поскольку дети до года и первого года жизни, т.е. те, которые составляют контингент «неорганизованных» детей, болеют в 3 раза чаще, чем 2-летние и в 5-6 раз чаще детей в возрасте 3-6 лет. В последующие годы, благодаря разработке доступных для широких вирусологических исследований средств и методов лабораторной диагностики ротавирусных заболеваний, убедительно доказано, что они составляют значительный удельный вес в структуре ОКИНЭ (до 50%). Этот факт очень важно учитывать для получения дополнительных сведений о динамике заболеваемости ротавирусной инфекцией тем более, что она официально не регистрируется и не входит в статистическую отчетность. В наших наблюдениях анализ заболеваемости ОКИНЭ среди детей в возрасте от 0 до 6 лет г. Екатеринбурга за 10-летний период (1982-1992 гг.) позволил выявить периодичность подъемов этих инфекций среди детей в возрасте от 0 до 2 лет, равную 4 годам. Подобной закономерности не отмечено среди детей в возрасте от 3 до 6 лет, заболеваемость которых была в 3-4 раза ниже и подвергалась в течение всего периода наблюдения незначительным колебаниям. Подобная тенденция наблюдалась и в отношении ротавирусной инфекции, о чем уже упоминалось выше. Таким образом, проведенный анализ заболеваемости ОКИНЭ позволил нам установить, что динамика развития эпидпроцесса при этих двух группах инфекционных заболеваний (ОКИНЭ и ротавирусной инфекции) в основе своей идентична, и недостающие данные по эпидемиологической характеристике заболеваемости ротавирусной инфекцией на каждой конкретной территории могут быть восполнены за счет сведений об ОКИНЭ (особенно при условии регистрации заболеваемости не по календарному плану, а по эпидсезонам). Проводя эпиднадзор за ротавирусными гастроэнтеритами, следует учитывать, что довольно часто для них характерна и непосредственная связь с кишечными инфекциями бактериальной природы. Так, при клинико-эпидемиологическом анализе около 1000 случаев ОКИНЭ ротавирусная инфекция установлена нами в 45,0% случаев, причем «чистые» ротавирусные гастроэнтериты составили 30,9%; в сочетании с условно-патогенной кишечной флорой (УПФ) у 11,1%; с шигеллезами, сальмонеллезами, эшерихиозами I-II категории — у 3,0% больных. Отмечены и возрастные особенности в спектре выделенных от больных этиологических агентов. «Чистые» ротавирусные гастроэнтериты с наибольшей частотой диагностированы у детей в возрасте от 1 года до 2-х лет, в 1,5 раза реже — у детей до 1 года и всего в 12,0% случаев — у больных в возрасте старше 2-х лет. В то же время ротавирусная инфекция в сочетании с УПФ (в основном клебсиелла, стафилококк, протей) и эшерихиозами выявлена преимущественно у детей в возрасте 6-12 месяцев, а с шигеллезами — у детей старше 1 года. Микст-инфекцию с сальмонеллезом диагностировали с одинаковой частотой во всех возрастных группах. Сочетание ротавирусной инфекции с энтеритами, вызванными патогенной или условно-патогенной бактериальной флорой, обусловливает утяжеление клинического течения и удлинение сроков выздоровления. Приведенные выше данные важны и в эпидемиологическом плане при оценке истинного уровня заболеваемости ротавирусной инфекцией, так как значительная часть этих заболеваний без вирусологического обследования больных может проходить под этиологическими диагнозами, связанными лишь только с условно-патогенной бактериальной флорой. Как отмечалось в разделе 1.1, при ротавирусных гастроэнтеритах до 50% случаев заболеваний сопровождалось симптомами ОРЗ. Это особенно важно учитывать при эпидемиологическом обследовании вспышек и семейных очагов ОКИ предположительно ротавирусной этиологии, довольно частое возникновение которых подтверждено целым рядом авторов и нашими наблюдениями. Большинство вспышек ротавирусной инфекции, как и спорадических заболеваний, зарегистрировано в зимние месяцы. Некоторые авторы связывают зимнюю сезонность этих заболеваний с лучшей выживаемостью ротавирусов во внешней среде при низкой температуре. Наряду с этим высказано предположение, что высокий «зимний» уровень заболеваемости ротавирусной инфекцией в значительной степени обусловлен сниженной общей резистентностью макроорганизма особенно у детей, которые именно в этот период часто болеют острыми респираторными заболеваниями. Это подтверждается тем, что групповые заболевания и вспышки ОКИ в организованных детских коллективах часто возникают на фоне повышения заболеваемости респираторными инфекциями. Более того, появились сообщения об успешном обнаружении ротавирусной РНК с помощью метода молекулярной гибридизации в носоглоточных смывах больных ротавирусной инфекцией, что позволило авторам предположить способность ротавирусов размножаться в слизистой оболочке носоглотки и обусловливать катаральный синдром при вызываемых ими заболеваниях. Вероятно, с этим связан, наряду с контактно-бытовым, воздушно-капельный путь передачи ротавирусной инфекции, особенно во время вспышек. Существование воздушно-капельного пути передачи ротавирусной инфекции подтверждается и совпадением сезонных подъемов заболеваемости ротавирусными гастроэнтеритами и ОРЗ. Принимая во внимание эти данные, считаем целесообразным рекомендовать обязательное обследование детей на носительство ротавирусов при выписке их в детские учреждения после перенесенных острых респираторных заболеваний. В литературе также имеются сообщения о вспышках ротавирусной инфекции водного и пищевого характера, что связано с высокой устойчивостью ротавируса в фекалиях и во внешней среде. Убедительно показана возможность внутрибольничного распространения заболеваний при участии медицинского персонала и родителей, ухаживающих за госпитализированными детьми. Такие данные получены и нами при обследовании на ротавирусы различных контингентов населения г. Екатеринбурга. Таким образом, ретроспективный эпидемиологический анализ дает возможность получить исчерпывающую информацию об особенностях развития эпидпроцесса ротавирусной инфекции на каждой конкретной территории. Все перечисленные выше данные анализа должны быть реализованы и в оперативном порядке. Но самой главной, неотъемлемой частью оперативного анализа является эпидемиологическое обследование семейных очагов ротавирусной инфекции и вспышек, особенно в дошкольных детских учреждениях, инфекционных и соматических детских стационарах. Учитывая широкое распространение и высокую контагиозность ротавирусной инфекции с различными путями и множественными факторами ее передачи, в задачу инфекционистов входит проявление особой настороженности в отношении ОКИНЭ в период с октября по март месяцы с обеспечением их своевременной диагностики и изоляции больных и последующего подтверждения этиологического диагноза, тем более, что в настоящее время имеются доступные для широких исследований средства и методы лабораторной диагностики ротавирусных заболеваний (тест-системы для иммуноферментного анализа, эритроцитарные диагностикумы для РНГА и др.). Эпидемиологи должны в указанный период осуществлять более тщательный анализ заболеваемости острыми кишечными инфекциями с целью предотвращения широкого распространения ротавирусной инфекции среди населения, возникновения групповых заболеваний и вспышек.
1.3. Контроль за циркуляцией ротавирусов среди различных возрастных, социальных групп населения и во внешней среде
Использование для диагностики ротавирусной инфекции только метода иммуноэлектронной микроскопии ограничивало проведение широких, разноплановых исследований, так как они были доступны в основном лишь для научных учреждений. Этим объясняется тот факт, что сведения о циркуляции ротавирусов среди здорового населения и во внешней среде немногочисленны, но и имеющиеся в отечественной и зарубежной литературе данные, а также наши наблюдения свидетельствуют о несомненной эпидемиологической значимости такой информации, особенно если учесть характерное для ротавирусных заболеваний соотношение манифестных форм и бессимптомного носительства в группах детей до 2-х лет как 1:1, 4; 3-6 лет — 1:7 и 7-14 лет — 1:25. Следовательно, при ротавирусной инфекции в полной мере реализуется феномен «айсберга», когда число манифестных (регистрируемых) форм намного меньше числа стертых и бессимптомных, проходящих под другими диагнозами. В настоящее время при наличии высокочувствительных и легко воспроизводимых методов индикации ротавирусных антигенов в различных инфекционных материалах проведение исследований как диагностического, так и профилактического характера доступно для всех практических вирусологических лабораторий, и они должны явиться обязательным элементом эпиднадзора за ротавирусной инфекцией на каждой административной территории Российской Федерации. Обнаружение ротавирусного антигена у здоровых лиц одни авторы трактуют как «здоровое» носительство, другие — как бессимптомную ротавирусную инфекцию. Но как бы не характеризовались эти лица, имеющиеся в литературе данные свидетельствуют об их несомненной роли в возникновении и развитии эпидпроцесса при ротавирусной инфекции. С целью определения эпидемиологической значимости бессимптомного носительства ротавирусов среди различных возрастных групп населения г. Екатеринбурга нами в течение двух эпидсезонов (1988-1989 и 1989-1990 гг.) проведено обследование с помощью РНГА здоровых детей в возрасте от 0 до 14 лет; изучена циркуляция ротавирусов в стационарах, где госпитализируются дети, больные ОРЗ, с гастро-нефропатологией; в родильных домах среди рожениц и их новорожденных. Исследования проводили также среди матерей госпитализированных детей, персонала соматических больниц, работников молокозаводов и детских молочных кухонь. Последние были взяты под наблюдение в связи с тем, что, как указывалось в разделе 1.2, среди больных с лабораторно подтвержденной ротавирусной инфекцией в г. Екатеринбурге в течение всего периода наблюдения (10 лет) преобладали неорганизованные дети, до 60% которых находились на искусственном или смешанном вскармливании. Установлено, что наибольшее носительство ротавирусов в различных возрастных группах населения наблюдалось в декабре и январе месяцах. В эпидсезон 1988-1989 гг., когда наблюдалась сравнительно высокая частота лабораторного подтверждения ротавирусной инфекции у детей и взрослых (40,0 и 26,7% соответственно), нам удалось выявить носителей среди здоровых детей в 5,0-13,8% случаев, а среди здоровых взрослых — 2,5%; у 3,7% персонала детских инфекционных и соматических больниц, у 10,7% — сотрудников детских молочных кухонь и у 13,3% матерей больных детей, госпитализированных в стационары. Выявлен довольно высокий уровень носителей ротавирусов среди рожениц (21,3%). В эпидсезон 1989-1990 гг., когда частота выявлений ротавирусного антигена у больных детей снизилась в среднем до 28%, существенно возросла инфицированность ротавирусами здорового населения: среди детей в возрасте от 0 до 14 лет в 11,5 раза, среди взрослых — в 3 раза. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что в эпидсезон 1988-1989 гг. в г. Екатеринбурге регистрировались в основном манифестные формы ротавирусной инфекции, а в последующий эпидсезон преобладали случаи бессимптомного носительства ротавирусов. Возможно, эта эпидемиологическая особенность ротавирусной инфекции связана со сменой циркулирующих среди населения серотипов ротавируса (см. раздел 1.1) или с формированием в период эпидсезона 1989-1990 гг. достаточно значительной иммунной прослойки к ротавирусам, обусловившей изменение клинического течения вызываемых ими заболеваний. При этом обращает на себя внимание тот факт, что у 70-85% больных лабораторно подтвержденной ротавирусной инфекцией, независимо от возраста, ротавирусный антиген выявлялся в пробах фекалий в титрах 1:80 и выше, в то время как у «здоровых» носителей среди детей и взрослых аналогичные титры наблюдались у 15% обследованных. Нами получены важные в эпидемиологическом отношении материалы обследования на носительство ротавируса сотрудников одного из молокозаводов г. Екатеринбурга. Среди них вирусоносители составили 26,9%, причем у 20,4% из них титр ротавирусного антигена был равен 1:80 и даже выше, что можно интерпретировать как проявление ротавирусной инфекции. Важно отметить, что среди этих лиц преобладали работники молокозавода, имеющие непосредственный контакт с выпускаемой продукцией (диетаппаратчицы, аппаратчицы розлива, изготовители творога и др.). Приведенные данные по обследованию работников предприятий, выпускающих молочную продукцию, а также сотрудников детских молочных кухонь дают нам основание рекомендовать обязательное проведение периодических контрольных обследований на носительство ротавирусов этих категорий работающих. В случае обнаружения у того или иного работника ротавируса следует отстранить его от работы для проведения санации иммуноглобулином, содержащим в высоком титре антитела к ротавирусам (1:320 и выше, по данным РНГА), или комплексным иммуноглобулиновым препаратом (КИП), полученным в Московском НИИЭМ им. Габричевского, который был успешно апробирован для лечения ротавирусной и других острых кишечных инфекций. Такие лица могут быть допущены к работе лишь при трех отрицательных на ротавирусы анализах (при ежедневном их взятии). Наряду с обследованием на носительство ротавирусов контактных в очагах ротавирусной инфекции (детей и взрослых лиц), персонала соматических и инфекционных больниц, рожениц, работников молочных кухонь и предприятий, выпускающих молочную продукцию, в эпидемиологическом плане представляет большую важность исследование проб из различных объектов внешней среды (водопроводная и сточная вода, вода открытых водоемов, молочные продукты, смывы с рук больных, контактных с ними лиц, а также различных предметов в очаге ротавирусной инфекции). Эпидемиологическая значимость контроля за циркуляцией ротавирусов во внешней среде подтверждается сообщениями о водных и пищевых вспышках ротавирусного гастроэнтерита. Результаты наших исследований наводят на мысль о том, что в качестве факторов передачи ротавирусных заболеваний могут служить молочные продукты. Об этом свидетельствуют приведенные выше данные о преимущественной заболеваемости ротавирусной инфекцией детей в возрасте до 1 года, находящихся на искусственном вскармливании и получающих питание из детских молочных кухонь. Прямых доказательств того, что источниками ротавирусной инфекции в г. Екатеринбурге явились работники взятых нами под наблюдение молочных кухонь и молокозавода получить не удалось, но выявление среди них не только носителей ротавируса, но, возможно, и наличие больных стертой формой ротавирусной инфекции подтверждает это предположение.
1.4. Контроль за состоянием иммунитета к ротавирусам у лиц из «групп риска»
Наши наблюдения и данные, полученные другими исследователями, свидетельствуют о том, что к «группам риска» по ротавирусной инфекции должны быть отнесены беременные женщины с измененной резистентностью организма на почве соматических и инфекционных заболеваний, персонал детских молочных кухонь, работники предприятий по выпуску молочной продукции. О возможной роли перечисленных групп в возникновении и развитии эпидпроцесса ротавирусной инфекции уже упоминалось в разделе 1.3. Поскольку ротавирусная инфекция может передаваться от матери ребенку не только при непосредственном контакте, но и через плаценту, беременные женщины, особенно, как указано выше, с неблагоприятным преморбидным фоном должны находиться под особым контролем, как возможные источники инфицирования новорожденных детей. Что касается лиц, связанных по роду своей деятельности с пищевыми, в частности молочными продуктами, то дополнительно обосновывать важность их периодического обследования на ротавирусы нет необходимости. Важно еще отметить и то, что в отношении всех указанных лиц, в случае обнаружения у них ротавируса, должна быть определена четкая тактика профилактических мер. Для этого необходимо в каждом случае точно знать, является данный человек транзиторным вирусоносителем или больным стертой формой ротавирусной инфекции. Получить ответ на этот вопрос можно лишь при серологическом обследовании путем определения титров антител к ротавирусу в реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА) или с использованием других доступных лабораторных тестов. Положительные результаты серологического обследования лиц, относящихся к «группам риска», явятся еще более убедительным доказательством необходимости проведения им лечения антиротавирусным иммуноглобулином, о чем говорилось в разделе 1.3. Схема лечения: 1,0-1,5 мл 2 раза в день в течение трех дней. Аналогичное лечение следует проводить и новорожденным, у которых матери были инфицированы ротавирусом.
II. Лабораторные методы диагностики ротавирусной инфекции
2.1. Характеристика клинического материала, сроки и техника его взятия
2.1.1. Материалом для вирусологических исследований являются фекалии больных острыми небактериальными гастроэнтеритами, контактных и здоровых носителей. Пробы фекалий (1-3 г) собирают в стерильные пенициллиновые флаконы в первые 3 дня болезни, поскольку частота обнаружения ротавирусов зависит от сроков забора инфекционного материала. Так, в испражнениях, взятых в течение первых суток от начала заболевания, ротавирус обнаруживается у 91,3% больных; через 2 суток у 84%; на 3-4 сутки у 77,3% и 70,5% соответственно; а на 5-8 сутки лишь у 53,3% больных. Собранные фекалии транспортируют в вирусологическую лабораторию в условиях, обеспечивающих температурный режим не выше -10 °C (рефрижераторные установки, контейнеры с сухим льдом, дюары с жидким азотом и др.), или хранят при температуре -20 — -70 °C. 2.1.2. Для серологических исследований используют сыворотку крови больных острыми гастроэнтеритами вирусной природы, контактных и здоровых лиц. Для определения уровня антиротавирусных антител могут быть использованы единичные сыворотки, однако трактовка этих результатов затруднена. Для выявления 4-кратной сероконверсии используют парные сыворотки крови от больных, взятые в первые 3 дня от начала заболевания (1-я проба) и через 12-15 дней после первого забора крови (2-я проба). Кровь забирают из вены или методом пальцевой пробы (не менее 1 мл) в стерильную пробирку и доставляют в вирусологическую лабораторию. Сыворотку отделяют от эритроцитарной массы и сгустка по общепринятой методике и хранят при температуре 4 °C. 2.1.3. Клинический материал должен быть промаркирован и иметь сопроводительный документ, содержащий следующие сведения: Ф.И.О., дата рождения, даты заболевания, госпитализации, взятия материала, первичный клинический диагноз, наименование материала, результаты бак. обследования. Сопроводительный документ подписывается врачом, направляющим материал для исследования.
2.2. Обработка клинического материала <х>
<х> В данных методических рекомендациях приводится подробное описание лишь двух методов лабораторного контроля за ротавирусными заболеваниями (РНГА и РТНГА), для постановки которых используются разработанные в нашей стране эритроцитарные иммунодиагностикумы.
2.2.1. Подготовка фекалий для РНГА.
К 1,0 мл фекальной массы добавляют 5,0 мл 0,9%-ного раствора NaCl, гомогенизируют в течение 5 мин. и осветляют центрифугированием при 3000 об./мин. в течение 20 мин. К полученной 20%-ной суспензии фекалий добавляют антибиотики (пенициллин и стрептомицин по 1000 Ед/мл), выдерживают в течение 1 часа при температуре 18-22 °C (или в течение ночи при 4 °C) и хранят в замороженном виде до исследований. Перед постановкой РНГА фекальные суспензии обрабатывают 50%-ной взвесью формалинизированных эритроцитов барана (ФЭБ) из расчета: на 0,5 мл фекальной пробы — 0,025 мл 50%-ных ФЭБ. Полученную взвесь встряхивают и выдерживают при температуре 37 °C в течение 1 часа (или в течение ночи при 4°C). Супернатант, полученный центрифугированием при 3000 об./мин. в течение 10 мин., используют в качестве антигена для РНГА. 2.2.2. Подготовка сывороток для РТНГА.
Исследуемые сыворотки разводят 1:10 0,9%-ным раствором NaCl, прогревают при температуре 56 °C в течение 30 мин. и обрабатывают 50%-ной взвесью ФЭБ из расчета: 0,025 мл 50%-ных ФЭБ на 1 мл сыворотки. Смесь выдерживают при температуре 37 °C в течение 60 мин. (или в течение ночи при температуре 4°C), центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин. Надосадок исследуют в РТНГА.
2.3. Компоненты, необходимые для проведений исследований методом непрямой гемагглютинации и торможения непрямой гемагглютинации
2.3.1. 0,9%-ный раствор NaCl (ГОСТ 4233-77) pH 7,0 +/- 0,1 предназначен для разведения сывороток и получения фекальной суспензии. 2.3.2. 0,15M фосфатно-буферный раствор pH 7,2 +/- 0,1 (ФБР-1) предназначен для приготовления ФБР-2 и рабочих разведений ротавирусного и контрольного диагностикумов. ФБР-1 готовят из рабочих растворов N 1 (0,15M Na2HPO4.2H2O — 26,7 г/л) и N 2 (0,15M KH2PO4 — 20,41 г/л) путем смешивания 76,1 мл раствора N 1 и 23,9 мл раствора N 2. Коррекцию pH осуществляют на потенциометре путем добавления раствора N 1 или N 2. 2.3.3. 0,15M ФБР-2 представляет собой ФБР-1, содержащий 0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА), 0,02%-ный детергент (твин-20 или твин-80) и 0,1% формальдегид в конечной концентрации (ГОСТ 1625-75). ФБР-2 используют при титровании антигенов в РНГА и сывороток в РТНГА.
2.4. Иммунодиагностикум эритроцитарный ротавирусный для РНГА и РТНГА, сухой
2.4.1. Ротавирусный иммунодиагностикум (РД) представляет собой 5%-ные формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные ротавирусным иммуноглобулином. РД предназначен для выявления антигенов ротавирусов группы A и специфических к ним антител. 2.4.2. Контрольный иммунодиагностикум (КД) представляет собой 5%-ные формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные иммуноглобулинами, полученными от интактных животных. КД предназначен для контроля фекальных проб на наличие неспецифических гемагглютининов. 2.4.3. Ротавирусный антиген (АГ) представляет собой антиген культурального ротавируса обезьян (штамм SA-II), инактивированный формальдегидом. АГ предназначен для контроля специфической активности ротавирусного иммунодиагностикума в РНГА и приготовления дозы антигена (4-8 АЕ) для РТНГА. 2.4.4. Ротавирусная сыворотка (РС) представляет собой сыворотку крови кроликов, иммунизированных ротавирусом обезьян (штамм SA-II). РС используется в качестве положительного контроля при определении уровня специфических к ротавирусу антител в РТНГА. 2.4.5. Формалинизированные эритроциты барана (ФЭБ) представляют собой 50%-ную взвесь эритроцитов барана, стабилизированных формальдегидом. ФЭБ предназначены для обработки исследуемого материала (фекальных проб и сывороток крови).
2.5. Обнаружение ротавирусных антигенов методом непрямой гемагглютинации
2.5.1. Техника постановки РНГА.
Реакцию проводят в объеме 0,1 мл в V-образных лунках набора Такачи или в микропанелях для иммунологических реакций. Готовят два ряда последовательных двукратных разведений исследуемых фекальных проб на ФБР-2 в объеме 0,05 мл, начиная с 1:10 до 1:640. Аналогичным образом готовят разведения АГ. В лунки первого ряда каждого исследуемого образца вносят по 0,05 мл ротавирусного диагностикума, а в лунки второго ряда — по 0,05 мл контрольного диагностикума в рабочем разведении (схема 1). Панели встряхивают и выдерживают в течение 2-х часов при температуре 20-25 °C (или в течение ночи при температуре 4 °C).
Схема 1
Исследуемый материал
N ряда
Диагностикум
Разведения антигенов
Кд <х>
Титр антигена
1/10
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640
АГ
1
РД
++++
++++
++++
++++
++++
++++
+++
—
1:640
2
КД
—
—
—
—
—
—
—
—
0
Фек. проба N 1
1
РД
++++
++++
++++
+++
++
+
—
—
1:160
2
КД
+++
++
+
—
—
—
—
—
1:20
Фек. проба N 2
1
РД
++++
++++
++++
++++
+++
++
+
—
1:320
2
КД
++
+
—
—
—
—
—
—
1:10
Фек. пр. N 3
1
РД
++++
++++
+++
++
+
—
—
—
1:80
2
КД
++++
++++
++
+
—
—
—
—
1:40
Фек. пр. N 4
1
РД
++++
++++
++++
++++
++++
+++
++
—
1:640
2
КД
++++
++++
++++
++++
++++
+++
++
—
1:640
<х> Контроль ротавирусного и контрольного диагностикума на неспецифическую гемагглютинацию. Фекальные пробы N 3 и N 4 имеют одинаковые титры как с РД, так и с КД, поэтому необходима дополнительная обработка этих проб 50%-ными ФЭБ и хлороформом (см. п. 2.5.2).
2.5.2. Учет результатов РНГА.
Результаты РНГА оценивают по условной 4-крестовой шкале: образование агглютинина в виде «зонтика» — 3-4 креста. Положительным результатом считают агглютинацию, оцениваемую на 2 креста (т.е. в агглютинации участвует не менее 50% эритроцитов). При отрицательном результате эритроциты оседают на дно лунки в виде «пуговки» или «кольца». РНГА считают положительной, если титр фекального образца с ротавирусным диагностикумом в 2 и более раза (на 2 разведения) выше, чем с контрольным диагностикумом. Фекальные суспензии, агглютинирующие ротавирусный и контрольный иммунодиагностикумы в равных титрах, подвергают повторной обработке 50% ФЭБ и дополнительной обработке хлороформом. Для этого в фекальную суспензию добавляют хлороформ из расчета: на 2 мл фекалий — 1 мл хлороформа. Смесь гомогенизируют в течение 5-7 мин. и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 15-20 мин. Обработанную 50% ФЭБ и хлороформом фекальную суспензию повторно исследуют в РНГА. 2.5.3. Контроли РНГА.
Постановка РНГА сопровождается следующими контролями: — контроль специфической активности ротавирусного иммунодиагностикума: готовят два ряда 2-кратных последовательных разведений ротавирусного антигена (схема 1) на ФБР-2. В лунки первого ряда вносят РД, а в лунки второго ряда — КД в объеме 0,05 мл. Ротавирусный антиген должен агглютинировать эритроциты РД в разведении 1:320 и выше. С контрольным диагностикумом реакция должна быть отрицательной; — контроль диагностикума на неспецифическую гемагглютинацию: в 2-3 лунки вносят по 0,05 мл ФБР-2 и добавляют по 0,05 мл диагностикума (РД или КД). Панели встряхивают в выдерживают 2 часа при 20-25 °C (или в течение ночи при температуре 4 °C). Реакция должна быть отрицательной (все эритроциты должны осесть на дно лунки).
2.6. Определение антител к ротавирусам группы A методом торможения непрямой гемагглютинации
2.6.1. Техника постановки РТНГА.
Реакцию проводят в объеме 0,1 мл в V-образных панелях набора Такачи или микропанелях для иммунологических реакций. Готовят последовательные 2-кратные разведения сывороток на ФБР-2 в объеме 0,025 мл, начиная с 1:20 до 1:640. К разведениям сыворотки добавляют по 0,025 мл ротавирусного антигена (АГ) в дозе 8-4 АЕ (дозу АГ предварительно проверяют в РНГА, где за 1 АЕ принимают последнее разведение антигена, вызывающее агглютинацию ротавирусного диагностикума на 2 креста) и выдерживают 1 час при температуре 37 °C (или в течение ночи при 4 °C). После контакта в каждую лунку вносят по 0,05 мл ротавирусного диагностикума, панели встряхивают и выдерживают в течение 2 часов при температуре 20-25 °C (или в течение ночи при температуре 4 °C). 2.6.2. Учет результатов РТНГА.
Результаты РТНГА учитывают по мере оседания эритроцитов в контрольных лунках. Отсутствие агглютинации эритроцитов оценивается как положительный результат РТНГА. Титром исследуемой сыворотки считают последнее ее разведение, которое тормозит РНГА с 8-4 АЕ ротавирусного антигена (схема 2).
Схема 2
Исследуемый материал
Разведения сыворотки
Ко <х>
Кд <хх>
Титр сыворотки
1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
1:640
РС
—
—
—
+
++
++++
—
—
—
1:80
Сыворотка
N 1
—
—
—
—
—
++
—
—
—
1:320
N 2
++++
++++
++++
++++
++++
++++
—
—
—
0
N 3
++++
+++
++
++++
++++
++++
++++
—
—
<ххх>
<х> Контроль сыворотки в разведении 1:20 на наличие неспецифических гемагглютининов. <хх> Контроль диагностикума на спонтанную агглютинацию. <ххх> В сыворотке N 3 присутствуют неспецифические гемагглютинины, которые необходимо удалить повторной обработкой сыворотки, 50%-ными ФЭБ.
2.6.3. Контроли РТНГА.
РТНГА сопровождается следующими контролями: — проверка рабочей дозы антигена: готовят два ряда разведений ротавирусного антигена, соответствующие 8; 4; 2; 1; 0,5 АЕ в объеме 0,05 мл и добавляют по 0,05 мл ротавирусного диагностикума. Эритроциты должны агглютинировать с 8, 4, 2 и 1 АЕ ротавирусного антигена (схема 3):
Схема 3
N ряда
Доза ротавирусного антигена (в АЕ)
Кд
8
4
2
1
0,5
1
++++
++++
++++
++
—
—
—
—
2
++++
++++
+++
++
+
—
—
—
- проверка отсутствия спонтанной агглютинации ротавирусного диагностикума: к 0,05 мл ФБР-2 добавляют 0,05 мл РД. Реакция должна быть отрицательной, т.е. эритроциты должны осесть на дно лунки;
- контроль специфичности РТНГА: готовят последовательные 2-кратные разведения ротавирусной сыворотки на ФБР-2 в объеме 0,025 мл, начиная с 1:20 до 1:640. В каждую лунку вносят по 0,025 мл ротавирусного антигена в дозе 8-4 АЕ. После инкубации в течение 1 часа при температуре 37 °C (или в течение ночи при температуре 4 °C) добавляют по 0,05 мл ротавирусного диагностикума в каждую лунку и выдерживают в течение 2 часов при температуре 20-25 °C (или в течение ночи при температуре 4 °C). Сыворотка должна тормозить РНГА с 8-4 АЕ в титре не менее 1:80 (схема 2);
- контроль исследуемых сывороток на наличие неспецифических гемагглютининов: к 0,05 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:20 (на ФБР-2) добавляют 0,05 мл ротавирусного диагностикума в рабочем разведении. Эритроциты должны осесть на дно лунки в виде «пуговки» или «кольца».
Отрывной лист учета эффективности использования методических рекомендаций
Направить в отделение планирования и внедрения Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций (620030, г. Екатеринбург, ул. Летняя, 23). 1. Методические рекомендации: «Эпидемиологический надзор за ротавирусными заболеваниями»
2. Заместителем Председателя ГК СЭН РФ Онищенко Г.Г. 28.11.94 г.
(кем и когда утвержден) 3. ________________________________________________________________________
(кем и когда получен) 4. Количество центров Госсанэпиднадзора и лечебно-профилактических учреждений, которые внедрили методы, предложенные документом ______________ 5. Формы внедрения (семинары, подготовка и переподготовка специалистов, сообщения и пр.) и результаты применения методов (количество наблюдений за 1 год и эффективность)
6. Замечания и пожелания __________________________________________________
Подпись ____________________________________________________
(должность, Ф.И.О. лица, заполнившего карту)
