В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Определение белка колориметрическим методом (метод Лоури) в иммунобиологических лекарственных препаратах ОФС.1.7.2.0023.15
Вводится впервые
Настоящая фармакопейная статья предназначена для определения белка колориметрическим методом (метод Лоури) в иммунобиологических лекарственных препаратах с использованием стандартного образца. Общие принципы метода, требования к стандартному, контрольному и испытуемому образцам изложены в ОФС “Определение белка”. Для определения белка в иммунобиологических лекарственных препаратах применяют следующие модификации метода Лоури: – метод без предварительного осаждения белка (Метод I) для определения содержания белка от 0,04 до 0,16 мг/мл; – метод с предварительным осаждением белка (Метод II) для определения содержания белка от 0,1 до 0,13 мг/мл; – метод для сорбированных препаратов (Метод III) для определения содержания белка от 0,02 до 0,16 мг/мл;
- метод для сорбированных препаратов (Метод IV) для определения содержания белка от 0,01 до 0,02 мг/мл.
Метод I
(без предварительного осаждения белка)
Метод рекомендован для определения белка в химических вакцинах и иммунобиологических лекарственных препаратах (ИЛП), в составе которых отсутствуют компоненты, влияющие на результаты анализа. Определение белка без предварительного осаждения проводят в соответствии с методикой, указанной в ОФС “Определение белка” (метод Лоури, метод А). В качестве контрольного раствора используют 1 мл воды очищенной или буферного раствора, указанного в фармакопейной статье или нормативной документации. Содержание белка в препарате рассчитывают по калибровочному графику. Построение калибровочного графика. К 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 мл стандартного раствора, добавляют воду очищенную до 1 мл (концентрация белка: 0,04; 0,08; 0,12; 0,16 мг/мл соответственно), перемешивают и далее проводят определение по методу А (без предварительного осаждения белка) в соответствии с ОФС “Определение белка” (Метод Лоури, метод А). Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество белка в мг, а по оси ординат – среднее значение оптической плотности. Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе. Примечания.
1. Испытуемый раствор. 1 мл испытуемого раствора, содержащий от 0,04 до 0,16 мг/мл белка. 2. Стандартный раствор <>. Стандартный образец (CO) с аттестованным значением содержания белка разводят до концентрации 0,2 мг/мл в соответствии с инструкцией по применению.
<> В случае отсутствия CO, стандартный раствор может быть приготовлен, как указано в ОФС “Определение белка”.
Метод II
(с предварительным осаждением белка)
Метод рекомендован для ИЛП, содержащих компоненты, влияющие на результаты анализа (тиомерсал, ароматические аминокислоты, сахара и т.п.) К 1 мл испытуемого раствора прибавляют 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают на вихревой мешалке. Пробу выдерживают при температуре от 2 до 8 °С в течение 18-20 ч. Осадок отделяют центрифугированием при температуре 4-8 °С при 2000 об./мин. в течение 30 мин., промывают 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугируют в аналогичных условиях. Надосадочную жидкость удаляют, осадок растворяют в 0,2 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, доводят объем раствора водой до 1 мл и перемешивают. К 0,5 мл полученного раствора прибавляют 0,5 мл воды очищенной, перемешивают на вихревой мешалке, прибавляют 5 мл реактива В, вновь перемешивают на вихревой мешалке и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин. Далее анализ проводят по методу В в соответствии с ОФС “Определение белка” (метод Лоури, метод В). Примечания.
1. Испытуемый раствор. 1 мл испытуемого раствора, содержащий от 0,1 до 0,13 мг/мл белка. 2. Приготовление реактива В указано в ОФС “Определение белка” (Метод Лоури, метод А). 3. Приготовление 10% и 20% растворов трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Растворы готовят соответствующим разведением 80% раствора ТХУ. 4. Приготовление 80% раствора (ТХУ). Растворяют 150 г ТХУ в 100 мл воды очищенной. Титруют 1 мл полученного раствора 1 М раствором натрия гидроксида, (индикатор фенолфталеин). Концентрацию ТХУ (X), выраженную в процентах, рассчитывают по формуле:
X = a · 0,1634 · 100 = a · 16,34,
где: a – объем 1 М раствора натрия гидроксида, пошедший на титрование испытуемого раствора, мл; 0,1634 – количество ТХУ, соответствующее 1 мл 1 М раствора натрия гидроксида, г. Раствор ТХУ разводят в соответствии с полученными данными до концентрации 80%. Титр раствора проверяют не реже 1 раза в мес. При изменении установленной концентрации раствор готовят заново. 5. Приготовление фосфорномолибденово-вольфрамового реактива. Перед использованием 2 N фосфорномолибденово-вольфрамовый реактив (2 N коммерческий реактив Фолина) разводят в 2 раза водой очищенной или готовят реактив в соответствии с ОФС “Реактивы. Индикаторы”.
Метод III
(для сорбированных препаратов с содержанием белка 0,02-0,16 мг/мл)
В центрифужную пробирку отбирают 1 или 2 мл испытуемого раствора, тщательно перемешанного на вихревой мешалке, центрифугируют при температуре 4-5 °С при 3500 об./мин. в течение 30 мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок промывают 2 мл воды очищенной и вновь центрифугируют в тех же условиях, после чего надосадочную жидкость вновь сливают. К осадку прибавляют 1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, перемешивают, выдерживают 30 мин. при комнатной температуре, затем прибавляют 5 мл реактива В и снова перемешивают. Через 10 мин. прибавляют 0,5 мл фосфорномолибденово-вольфрамового реактива. Смесь перемешивают и центрифугируют при температуре 4-5 °С при 3500 об./мин. в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают в пробирку и через 10 мин. измеряют оптическую плотность по методике, указанной в ОФС “Определение белка” (метод Лоури, метод А). В качестве контрольного раствора используют 1 или 2 мл воды очищенной или буферного раствора, указанного в фармакопейной статье или нормативной документации, прибавляют 1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, 5 мл реактива В и 0,5 мл фосфорномолибденово-вольфрамового реактива. Содержания белка рассчитывают по калибровочному графику, как указано в методе I. Калибровочный график воспроизводят при каждом определении. Примечания.
1. Испытуемый раствор. 1 мл испытуемого раствора, содержащего от 0,04 до 0,16 мг/мл белка или 2 мл испытуемого раствора, содержащего от 0,02 мг/мл до 0,04 мг/мл белка. 2. Приготовление стандартного раствора – указано в методе I.
Метод IV
(для сорбированных препаратов с содержанием белка 0,01-0,02 мг/мл)
2 мл испытуемого раствора центрифугируют при 3500 об./мин. при температуре 4-5 °С в течение 30 мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок промывают 2 мл воды очищенной и центрифугируют в тех же условиях. Затем надосадочную жидкость вновь удаляют. К осадку прибавляют 0,4 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, перемешивают, выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин., затем прибавляют 2 мл реактива В и вновь перемешивают. Через 10 мин. прибавляют 0,2 мл фосфорномолибденово-вольфрамового реактива. Смесь перемешивают и центрифугируют при температуре 4-5 °С при 3500 об./мин. в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают в пробирку и через 10 мин. измеряют оптическую плотность по методике, указанной в ОФС “Определение белка” (метод Лоури, метод А). В качестве контрольного раствора используют 2 мл воды очищенной или буферного раствора, указанного в фармакопейной статье или нормативной документации, прибавляют 0,4 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, 2 мл реактива В и 0,2 мл фосфорномолибденово-вольфрамового реактива. Содержание белка рассчитывают по калибровочному графику, как указано в методе I. Построение калибровочного графика. К 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 мл, (концентрация белка: 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 мг/мл соответственно) добавляют воду очищенную до объема 0,4 мл перемешивают, добавляют 2,0 мл фосфорномолибденово-вольфрамового реактива и вновь перемешивают. Далее определение проводят по методике, указанной в ОФС “Определение белка” (Метод Лоури, Метод А). Примечания.
1. Испытуемый раствор. 2 мл испытуемого раствора с содержанием белка от 0,01 до 0,02 мг/мл. 2. Приготовление стандартного раствора указано в методе I. При определении белка в сорбированных препаратах в фармакопейной статье или в нормативной документации может быть указан коэффициент, учитывающий не полную десорбцию белка. В случае, если в исходном препарате содержание белка выше, чем указанно в методах I, II и III, его предварительно разводят до необходимой концентрации. Способ разведения и растворитель указывают в нормативной документации. При вычислении конечного результата учитывают степень разведения.
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Определение подлинности и чистоты иммунобиологических лекарственных препаратов методом вестерн-блот ОФС.1.7.2.0022.15
Вводится впервые
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод вестерн-блот, один из вариантов иммуноблоттинга, который используют для оценки подлинности и чистоты иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) на основе высокоочищенных белков, в том числе, полученных по технологии рекомбинантной ДНК. На первом этапе проводят электрофорез в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом (так называемый, SDS-PAGE электрофорез) для разделения белков. Затем белки переносят на нитроцеллюлозную мембрану или PVDF-мембрану (мембрана из поливинилденфторида). Детекцию проводят с помощью специфичных к определяемому белку антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена (прямой вариант ИФА), или последовательно с помощью первых антител к определяемому белку, и вторых антител (так называемой, антиглобулиновой сыворотки), специфичных к иммуноглобулину первых антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена (непрямой вариант ИФА). В данной ОФС изложен метод детекции на основе цветной реакции, как один из наиболее широко применяемых в настоящее время. Для детекции также могут быть использованы хемилюминесцентный метод, в том числе, с усилением хемилюминесценции, и методы радиоактивной или флуоресцентной меток (РИА или РИФ). Испытание проводят с фармацевтическими субстанциями или с готовой продукцией. При оценке подлинности, на этапе выполнения электрофореза, помимо испытываемых образцов, должно быть предусмотрено внесение в лунки геля следующих растворов: отрицательный контрольный образец (1-кратный буфер для приготовления образцов), смесь маркеров молекулярных масс (рекомендуется использование предварительно окрашенных маркеров молекулярных масс), стандартный образец испытываемого белка (при его наличии), аттестованный в установленном порядке. При оценке чистоты (примесей) дополнительно должно быть предусмотрено внесение образца с концентрацией белка, соответствующей пределу обнаружения или количественного определения примеси (в зависимости от назначения методики) и установленной на основании результатов валидации методики. При оценке чистоты необходимо сравнение результатов блота с результатами электрофореза в полиакриламидном геле; методика должна выявлять 1% примеси.
Методика
Для разделения белков по их молекулярным массам предварительно проводят электрофорез в соответствии с методикой, изложенной в ОФС “Электрофорез” и ОФС “Электрофорез в полиакриламидных гелях”. Для проведения переноса белков используют прибор для переноса белков. Все работы проводят в резиновых перчатках. Объем всех используемых растворов должен быть достаточен для полного погружения мембраны, на которую переносят белки. После проведения электрофореза для подготовки геля к иммуноблотингу, его заливают буферным раствором для переноса белков (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации), ставят на орбитальный шейкер и выдерживают в течение 10-15 мин. Затем подготавливают лист нитроцеллюлозной или PVDF-мембраны, соответствующий размеру геля. При использовании нитроцеллюлозной мембраны лист выдерживают 5 мин. в деионизованной воде, а затем 5 мин. в буферном растворе для переноса белков (если нет иных указаний в фармакопейной статье или нормативной документации). При использовании PVDF-мембраны ее необходимо выдержать в растворе метанола или спирта в течение 10-15 мин., а затем произвести аналогичные действия, что и для нитроцеллюлозной мембраны. Для переноса белков на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану собирают “сэндвич”. Для этого специальную губку, входящую в комплект прибора для переноса белков, смачивают в буферном растворе для переноса белков и помещают на специальную пластиковую рамку, на которую затем помещают от одного до трех листов фильтровальной бумаги (например, Whatman 3MM), предварительно обрезанных в соответствии с размером мембраны и смоченных в растворе для переноса белков. Сверху помещают гель, на поверхность которого аккуратно (без пузырьков воздуха) помещают приготовленный лист нитроцеллюлозной или PVDF-мембраны. На мембрану помещают от одного до трех листов фильтровальной бумаги, предварительно смоченных в растворе для переноса белков, и сверху прикрывают второй специальной губкой, смоченной в растворе для переноса белков. Рамку скрепляют зажимами и медленно погружают в прибор для электрофореза, заполненный раствором для переноса белков, лист мембраны должен быть обращен к аноду. Включают прибор. Электрофоретический перенос белков осуществляют при комнатной температуре в течение 25 мин., выставив ограничение по току из расчета Аmax = 2 мА/см2, (например, для геля размером 10×10 см2 Аmax = 200 мА), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации. Допускается использование оборудования для полусухого переноса белков с геля на мембрану в соответствии с инструкцией по его применению. По окончании переноса “сэндвич” разбирают. Мембрану промывают фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ). Оценивают полноту переноса белков визуально по переносу окрашенных маркеров молекулярных масс, все основные белковые полосы которого должны быть выявлены на мембране.
Детекция
Для детекции результатов метода вестерн-блот проводят обработку (гибридизацию) исследуемого препарата антителами. Для этого мембрану с перенесенными на нее белками помещают в контейнер с блокирующим буферным раствором и инкубируют на орбитальном шейкере в течение 30-60 мин. (если не предусмотрено иное в фармакопейной статье или нормативной документации) для предотвращения неспецифической сорбции антител на мембране. После этого промывают мембрану в буферном растворе для отмывки трижды по 5 мин., если не указано иное в фармакопейной статье или нормативной документации. Затем мембрану обрабатывают раствором первых антител к анализируемому белку, приготовленным с использованием буферного раствора для антител (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации) непосредственно перед использованием в соответствии с инструкцией по применению. Обработку антителами проводят при комнатной температуре в течение 30-60 мин. (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации). Далее трижды по 5 мин. проводят отмывку мембраны буферным раствором от несвязавшихся антител на орбитальном шейкере при комнатной температуре, если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации. После отмывки мембраны, проводят обработку (гибридизацию) раствором вторых антител. В качестве вторых антител используют поликлональные антитела к иммуноглобулинам того вида животного, которое использовалось для получения первых антител. Данные антитела конъюгированы с ферментом (пероксидаза из корней хрена или щелочная фосфатаза). Для выполнения этого этапа повторяют процедуру, описанную выше, заменив раствор первых антител раствором вторых антител. Затем проводят аналогичную первой отмывку мембраны от несвязавшихся вторых антител. Проявление картины иммуноблота на мембране проводят раствором тетраметилбензидинового субстрата (ТМВ) для антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, или раствором для проявления щелочной фосфатазы – при использовании антител, конъюгированных со щелочной фосфатазой (если нет иных указаний в фармакопейной статье или нормативной документации). Реакцию останавливают, промывая блот деионизованной водой. С поверхности мембраны удаляют излишек воды фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе в темном месте.
Оценка результатов
При оценке подлинности основные окрашенные полосы на проявленной мембране должны соответствовать основным окрашенным полосам на электрофореграмме. Количество анализируемого вещества и содержание примесей, а также их соотношение оценивают денситометрически. Содержание примеси, не выявляемой в блоте, не должно превышать величины, установленной в фармакопейной статье или нормативной документации.
Критерии пригодности системы
Результаты метода вестер-блот могут учитываться, если: – маркеры молекулярных масс распределены равномерно по всей длине соответствующей дорожки геля; – на блоте видны все основные полосы, выявленные при окрашивании геля Кумасси ярко-голубым R-250 или G-250; – выявляется образец с минимальной концентрацией, установленной в фармакопейной статье или нормативной документации.
Критерии приемлемости результатов
– Совпадение блота исследуемого образца с блотом образца сравнения, например, соответствующего стандартного образца на основе очищенного белка (субстанции); – соответствие молекулярной массы основного выявленного компонента требованиям спецификации; – соответствие содержания выявляемой примеси в стандартном образце диапазону, установленному в свидетельстве на стандартный образец. Методику определения подлинности и чистоты методом вестерн – блот следует использовать с подтвержденными валидационными характеристиками в отношении специфичности и предела обнаружения примеси.
Особенности валидация методики
При использовании методики для оценки подлинности необходимо обосновать критерии приемлемости результатов; целесообразно использование стандартного образца на основе очищенного белка, аттестованного в установленном порядке. При использовании методики для оценки чистоты необходимо обосновывать предел обнаружения примеси. При количественном определении необходимо обосновать предел количественного определения примеси, указать линейный диапазон при определении основного компонента и примесей, прецизионность и правильность методики. Для этого целесообразно использование стандартного образца на основе очищенного белка. При внесении изменений в методику, указанную в фармакопейной статье или нормативной документации, должны быть подтверждены валидационные характеристики ранее утвержденной методики. Валидации подлежат следующие изменения: – использование различного количества наносимых на гель проб; – изменение условий переноса белков с геля на мембрану, включая изменение используемого оборудования; – изменения состава буферных растворов; – изменение способа детекции исследуемого вещества. Примечания.
1. Буферный раствор для переноса белков pH 8,3. Если нет иных указаний в фармакопейной статье или нормативной документации, используют один из описанных ниже способов приготовления растворов (см. Вариант 1 и Вариант 2). Раствор для переноса можно использовать 2-3 раза. Раствор хранят в течение 6 мес. при температуре от 4 до 8 °С. Вариант 1. В градуированный химический стакан вместимостью 3000 мл помещают 7,86 г трис(гидроксиметил)аминометана, 33,75 г глицина, добавляют до 2400,0 мл деионизованной воды и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения. Измеряют pH, который должен быть равен 8,3-8,4 (доводить pH раствора кислотой или щелочью не допускается). Добавляют 600,0 мл спирта и перемешивают. Вариант 2. В градуированный химический стакан вместимостью 1000 мл помещают 5,8 г трис(гидроксиметил)аминометана, 2,9 г глицина, 11,55 мл 10% раствора натрия додецилсульфата, добавляют 800,0 мл деионизованной воды и перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения, измеряют pH (8,3-8,4). Добавляют 200,0 мл 100% метанола и перемешивают. Если используется PVDF-мембрана, то натрия додецилсульфат из буферного раствора исключают, а количество спирта уменьшают до 100,0 мл, увеличивая тем самым объем добавляемой воды до 900,0 мл. 2. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ), pH 7,2 (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации). В градуированную емкость наливают 4500,0 мл деионизованной воды и последовательно прибавляют: 40,0 г натрия хлорида, 1,0 г калия хлорида 5,75 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 2х-водного, 1,0 г калия фосфорнокислого однозамещенного (каждую следующую соль прибавляют после полного растворения предыдущей). Устанавливают pH до 7,2 раствором 70% ортофосфорной кислоты или раствором 45% натрия гидроксида. Доводят объем до 5000,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят в течение 3 мес. при температуре 4-8 °С. 3. Буферный раствор для отмывки. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 5,0 мл 10% раствора твин-20, доводят объем раствора до метки с помощью ФСБ и перемешивают. Раствор хранят в течение 1 мес. при температуре от 4 °С до 8 °С. 4. Блокирующий буферный раствор. К 100,0 мл буферного раствора для отмывки прибавляют 5,0 мг бычьего сывороточного альбумина (или другого белка), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации, и перемешивают до полного растворения. Раствор готовят перед использованием. 5. Буферный раствор для антител. К 100,0 мл буферного раствора для отмывки прибавляют 2,0 мг бычьего сывороточного альбумина (или других белков), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации, и перемешивают до полного растворения. Раствор готовят перед использованием. 6. Раствор ТМВ – раствор для проявления пероксидазы хрена. Используют ТМВ-субстрат, готовый к применению. 7. Раствор для проявления щелочной фосфатазы. Растворяют 1 таблетку субстрата BCIP/NBT в 10,0 мл деионизованной воды. Раствор готовят непосредственно перед использованием.
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Изоэлектрическое фокусирование
ОФС.1.7.2.0021.15
Вводится впервые
Метод изоэлектрического фокусирования используется для оценки генно-инженерных препаратов, а также некоторых высокоочищенных биотехнологических препаратов (содержание основного компонента не менее 95%), предназначенных для применения в качестве лекарственных средств. Электрофоретическое разделение белков методом изоэлектрического фокусирования происходит под действием электрического поля в градиенте pH в соответствии с их изоэлектрической точкой (pI). Местоположение каждого белка определяется значением его изоэлектрической точки. При достижении белком изоэлектрической точки в градиенте pH его суммарный заряд становится равным нулю и он перестает перемещаться в электрическом поле. В результате электрофоретического разделения исследуемого вещества может происходить диффузия белковых молекул из зоны фокусирования, но, попадая в более кислую или щелочную среду, молекулы белка будут терять нейтральность и под действием электрического поля снова возвращаться в зону изоэлектрической точки. Для создания градиента pH применяют смеси синтетических полиаминополикарбоновых кислот (амфолиты) в диапазоне изоэлектрических точек (pI) от 3,0 до 10,0 единиц pH. Смесь амфолитов помещают в стабилизационную среду (полиакриламидный или агарозный гель) и подают напряжение, в результате чего создается градиент, в котором pH увеличивается в направлении от анода (+) к катоду (-). Для ускорения процесса фракционирования белков используют максимально допустимую напряженность электрического поля. Ограничением служит невозможность эффективного отвода выделяемого тепла. Использование тонких гелей и эффективного охлаждения пластинки с помощью водяного термостата предотвращает перегревание геля и способствует хорошему разделению белков. Максимальное различие между значениями pI () компонентов, определяют по формуле:
,
где: D – коэффициент диффузии белка;
dpH/dx – градиент pH;
Е – напряженность электрического поля, выраженное в вольтах на сантиметр; (-du/dpH) – изменение подвижности вещества при изменении pH в области, близкой к pI.
Формула показывает, что хорошее разрешение может быть получено для веществ с низким коэффициентом диффузии и достаточно большим значением изменения подвижности в точке, близкой к изоэлектрической. Хорошему разрешению способствует высокая напряженность поля и плавный градиент pH. Разрешающая способность изоэлектрического фокусирования при использовании геля, приготовленного с применением амфолитов, составляет 0,02 единицы pH, а при использовании иммобилизованных гелей (с химически фиксированным градиентом pH) – около 0,001 единицы pH. Испытанию подлежат субстанция и очищенный белок до добавления стабилизаторов, наполнителей, консервантов и других компонентов, входящих в состав лекарственной формы. Методика также может использоваться для анализа готовой продукции в сравнении со стандартным образцом (стандартные образцы указываются в фармакопейной статье и нормативной документации).
Практические аспекты
Присутствие в генно-инженерных продуктах, а также некоторых высокоочищенных биотехнологических препаратах солей в высоких концентрациях (более 0,1М) может искажать градиент pH и форму сфокусированных белков. Для нейтрализации этого эффекта образцы лучше готовить в деионизованнои воде, 1-2% растворе глицина или амфолитов (амфолины, фармалиты, сервалиты, биолиты). При необходимости для пробоподготовки возможно использование специальных центрифужных концентраторов (фильтров), диализа или гель-фильтрации. Время завершения процесса изофокусирования в полиакриламидных гелях, как правило, определяют по предварительно окрашенным стандартным белкам – маркерам (например, гемоглобину), нанесенным на гель в различные точки одновременно с исследуемыми образцами. Процесс считается завершенным в том случае, если все стандартные образцы образуют полосы в установленном месте. Если завершение процесса изофокусирования определяют по времени, прошедшему с момента нанесения образцов, установленное время должно быть обосновано.
Метод изоэлектрического фокусирования может быть применен: – для подтверждения подлинности, когда подвижность испытуемого образца сравнима с подвижностью стандартного образца или маркера pI; – для оценки примесей по интенсивности окрашивания полос относительно основных компонентов по сравнению со стандартным образцом; – для количественного определения по интенсивности окраски полос с помощью денситометра или аналогичного оборудования. Допустимое различие подвижности испытуемого и стандартного образцов при оценке подлинности должно быть указано в нормативной документации. Для количественного определения примеси или основного компонента должно быть предусмотрено применение контрольных образцов с концентрацией, соответствующей пределу количественного определения примеси.
Оборудование
Прибор для проведения изоэлектрофокусирования состоит из: – высоковольтного источника питания с программой, специально разработанной для изоэлектрофокусирования в полиакриламидных гелях, с максимальным напряжением не менее 3000 В, током 300 мА и мощностью 300 Вт; – электрофорезной камеры из жесткой пластмассы, содержащей охлаждающую пластину из соответствующего материала для поддержания геля; – платиновых электродов, которые соединяются с гелем посредством электродных (бумажных или гелевых) полосок необходимой ширины, длины и толщины, пропитанных анодным и катодным буфером.
Изоэлектрофокусироваиие в полиакриламидных гелях
Форма для приготовления полиакриламидного геля состоит из двух стеклянных пластин, пластикового листа, прокладок (спейсеров) и зажимов, скрепляющих всю конструкцию. Для метода изоэлектрофокусирования используют гели с максимальной пористостью и достаточной механической прочностью. Эти свойства зависят от относительного содержания акриламида и бисакриламида (используемые для сшивки гелей). Поскольку молекулярная масса большинства известных белков не превышает 200000 Да возможно использование 7,5% гелей. Примечания.
1. Приготовление основного 30% раствора акриламида. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 29,1 г акриламида и 0,9 г метиленбисакриламида, прибавляют 70 мл воды деионизованной, перемешивают до полного растворения, доводят объем раствора деионизованной водой до метки и вновь перемешивают. Далее раствор фильтруют (условия фильтрования указывают в нормативной документации). Раствор хранят при температуре от 2 до 8 °С в емкости из темного стекла в течение 1 мес. 2. Приготовление полиакриламидного геля. Смешивают основной 30% раствор акриламида со смесью амфолитов в соотношении, указанном в нормативной документации, и осторожно перемешивают. Подготовленный раствор акриламида с амфолитами помещают на магнитную мешалку, прибавляют 0,25 объема 10% раствора аммония персульфата, 0,25 объема раствора ТЕМЕД (тетраметилендиамина) и перемешивают. Заливают полученный раствор в подготовленную форму. Полимеризация геля происходит в течение 30-40 мин.
Сборка формы для полиакриламидного геля
На нижнюю стеклянную пластину помещают пластиковый лист, на него помещают прокладки (спейсеры) и сверху помещают вторую стеклянную пластину, и всю конструкцию скрепляют зажимами.
Методика проведения изоэлектрофокусирования
Охлаждающую пластину помещают в камеру для электрофореза, соединяют с термостатом, установленным на температуру от 8 до 10 °С. На охлаждающую пластину наносят 1,0 мл воды деионизованной или керосина, Форму разбирают, гель на полиэфирной пленке (пластиковом листе) переносят на охлаждающую пластину таким образом, чтобы вода касалась всего края геля. Гель медленно и осторожно помещают на охлаждающую пластину, избегая появления пузырьков воздуха. Одну электродную полоску смачивают анодным буферным раствором и помещают на анодный конец геля (маркировка (+) на охлаждающей пластине). Вторую электродную полоску смачивают катодным буферным раствором и помещают на катодный конец геля (маркировка (-) на охлаждающей пластине). Составы катодного и анодного буферных растворов приводят в нормативной документации. Аппликаторы для нанесения испытуемых и стандартных образцов помещают на поверхность геля, наносят необходимое количество испытуемых и стандартных образцов, указанное в нормативной документации (при использовании метода для оценки чистоты, количество наносимого образца должно обеспечивать выявление 1% примеси). Для калибровки геля наносят растворы белков (маркеры) с известными величинами изоэлектрических точек (коммерческие наборы маркеров с диапазоном изоэлектрических точек 3-10; 2,5-6,5; 5-10,5 или с маркерами, указанными в фармакопейных статьях). Вместо бумажных аппликаторных полосок возможно использование геля с лунками для проб. Держатель электродов помещают в электрофоретическую камеру и устанавливают электроды вдоль центров электродных полосок на поверхности геля. Соединяют электроды с основной частью камеры и закрывают ее крышкой. Подключают камеру к источнику питания (тока). Условия изоэлектрического фокусирования указывают в фармакопейной статье или нормативной документации. После окончания электрофореза отключают источник питания, снимают крышку прибора, убирают электроды. Аккуратно, пинцетом удаляют электродные полоски и аппликаторы с геля. Гель немедленно переносят в емкость с фиксирующим раствором и выдерживают при покачивании, затем фиксирующий раствор удаляют. Гель промывают трижды деионизованной водой, прибавляют окрашивающий раствор Кумасси R-250 или G-250, состав и приготовление которых указывают в фармакопейной статье или нормативной документации. При окраске Кумасси R-250 гель отмывают в 25% растворе этанола и 8% растворе уксусной кислоты, а при окраске Кумасси G-250 – в деионизованной воде. Отмывку проводят до тех пор, пока на прозрачном фоне не станут четко видны полосы после изоэлектрофокусирования. Для окраски геля возможно применение раствора серебра нитрата, приготовление которого, а также условия отмывания, описывают в фармакопейной статье или нормативной документации. Время выдерживания геля в фиксирующем, окрашивающем растворах, время отмывания геля и регистрация положения и интенсивности полос должны быть указаны в фармакопейной статье или нормативной документации. Примечания.
1. Приготовление растворов. Описание приготовления растворов 10% раствора аммония персульфата, раствора ТЕМЕД (тетраметилэтилендиамин); фиксирующего раствора, 25% раствора спирта этилового и 8% раствора уксусной кислоты указано в ОФС “Электрофорез в полиакриламидном геле”. 2. Особенности методики, требующие внимания. Исследуемые образцы могут наноситься на любой участок поверхности геля, но для защиты белков от экстремальных величин pH пробы не должны наноситься в непосредственной близи от электродов. При валидации метода пробы могут быть нанесены на гель в трех позициях: посередине геля и на его концах. Следует не допускать слишком длительное фокусирование, т.к. в геле может возникнуть процесс, называемый катодным дрейфом, при котором с течением времени градиент pH разрушается. Причины данного явления не до конца изучены. Одними из факторов могут быть электроэндоосмос и абсорбция диоксида углерода. Катодный дрейф наблюдается в виде миграции сфокусированный белковой полосы от катодного конца геля. Для решения этой проблемы могут быть использованы иммобилизованные гели. Во время фокусирования необходимо обеспечить эффективное охлаждение пластины, на которую помещен гель, при температуре от 8 до 10 °С. Высокое напряжение электрического поля, используемого при изоэлектрическом фокусировании, может привести к перегреванию и влиять на качество разделения. Особенности методики, требующие внимания, должны быть указаны в фармакопейной статье или нормативной документации.
Возможные модификации методики
Особенности некоторых исследуемых веществ могут потребовать внесения следующих изменений в методику: – из-за снижения растворимости белков вблизи изоэлектрической точки и опасности их осаждения в состав геля вводят мочевину. Допускается добавление в гель от 3М до 9М растворов мочевины. Для предотвращения карбомоилирования белка следует добавлять только свежеприготовленные растворы мочевины; – добавление в гель детергентов: неионных (например, октилглюкозид, Тритон Х-100 или Nonidet Р-40 (NP-40)) или цвиттерионных (например, 3-3((3-холамидопропил)диметиламмоний-1-пропансульфонат – CHAPS или 3-3((3-холамидопропил)диметиламмоний-2-гидрокси-1-пропансульфонат – CHAPSO); – добавление амфолита к исследуемому образцу для предотвращения агрегации и преципитации белков; – использование альтернативных методов детекции. Модификации методики должны быть обоснованы и отражены в фармакопейной статье или нормативной документации.
Критерии пригодности системы
Результаты изоэлектрического разделения могут учитываться, если электрофореграммы удовлетворяют следующим критериям: – формирование стабильного градиента pH с необходимыми (требуемыми, заданными) характеристиками, оцениваемого, например, с использованием маркеров pI (стандартных образцов) с известными величинами изоэлектрических точек, в том числе, предварительно окрашенных; – другие обоснованные критерии приемлемости результатов (например, разделение двух выбранных белков или компонентов одного белка).
Критерии приемлемости результатов
- совпадение электрофореграммы исследуемого образца с электрофореграммой образца сравнения, например, соответствующего стандартного образца на основе очищенного белка (субстанции);
- выявление образца в минимально установленной концентрации. Для оценки генно-инженерных продуктов, а также некоторых высокоочищенных биотехнологических препаратов, можно использовать методику изоэлектрического фокусирования с подтвержденными валидационными характеристиками.
Особенности валидации методики
При использовании методики для оценки подлинности необходимо обосновать критерии приемлемости результатов. При использовании стандартного образца на основе очищенного белка аттестуемая характеристика должна быть научно обоснована, стандартный образец должен быть аттестован в установленном порядке. При использовании методики для оценки чистоты препарата необходимо представить данные, обосновывающие предел обнаружения примеси, а также минимальную разницу в pI компонентов, которую выявляет методика (разрешающая способность). При количественном определении – представить данные, обосновывающие предел количественного определения примеси, минимальную разницу в pI компонентов, которую выявляет методика, линейный диапазон при определении основного компонента, воспроизводимость методики. Целесообразно использование стандартного образца на основе очищенного белка с научно обоснованной аттестуемой характеристикой. При внесении изменений в методику изоэлектрического фокусирования должны быть подтверждены валидационные характеристики ранее утвержденной методики. Валидации подлежат следующие изменения: – использование коммерческих готовых гелей (precast gels), наборов для окрашивания и обесцвечивающих растворов; – использование гелей с иммобилизованным градиентом pH; – использование гелей с пластиковыми аппликаторами для нанесения образцов; – использование кассет с гелем различных размеров, включая ультратонкие (0,2 мм) гели; – использование различных объемов проб, электродных полосок и аппликаторов, изготовленных не из бумаги; – изменение условий проведения изоэлектрического фокусирования, включая изменения напряжения, размера геля и используемого оборудования, использование фиксированного времени разделения вместо слежения за достижением определенной точки выбранного маркера pI; – использование автоматизированного оборудования; – замена полиакриламидных гелей на агарозные.
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Определение бычьего сывороточного альбумина методом ракетного иммуноэлектрофореза в иммунобиологических лекарственных препаратах ОФС.1.7.2.0020.15
Вводится впервые
Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения бычьего сывороточного альбумина в иммунобиологических лекарственных препаратах (ИЛИ). Определение содержания бычьего сывороточного альбумина (БСА) проводят методом ракетного иммуноэлектрофореза. Метод основан на способности антигена мигрировать в электрическом поле в гель, содержащий антисыворотку; в результате реакции взаимодействия антигена с антисывороткой образуются линии преципитации в виде пиков (ракет), высота которых пропорциональна концентрации внесенного антигена.
Метод ракетного иммуноэлектрофореза (РИЭФ)
В химическую пробирку с 16 мл 1% геля агарозы, расплавленного и охлажденного до температуры 56 °С прибавляют 16 мкл сыворотки против БСА с титром 1:1000 или 32 мкл той же сыворотки с титром 1:500 или 80 мкл кроличьей диагностической сыворотки, преципитирующей белки сыворотки крови рогатого скота (анти-СРС), предназначенной для судебно-медицинских целей (титр антител 1:10000), и перемешивают, если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации. Содержимое пробирки выливают на стеклянную пластинку размером 120×90 мм, помещенную на ровную горизонтальную поверхность; толщина слоя агарозного геля должна составлять () мм. После застывания геля агарозы пластинку накладывают на трафарет (рис. 1) и пробивают лунки стерильным пробойником диаметром 4 мм. Гель из лунок удаляют с помощью вакуумного насоса или стерильной иглы. После этого подготовленную пластинку помещают в прибор для горизонтального электрофореза. В камеры прибора наливают 1,5 л электродного буферного раствора. Соединяют поверхность агарозного геля с буферным раствором с помощью 4-слойной фильтровальной бумаги размером 120×60 мм. Расстояние от края фильтровальной бумаги до лунок должно быть не менее 15 мм.
Рисунок 1. Трафарет для ракетного иммуноэлектрофореза (размеры указаны в мм)
В лунки агарозного геля вносят по 15 мкл испытуемого образца и стандартного образца “Содержания бычьего сывороточного альбумина для построения калибровочного графика”. Испытуемый образец вносят в 2 лунки. При использовании анти-СРС сыворотки для выявления преципитата БСА из испытуемого образца готовят 2 пробы: одна содержит воду очищенную, а вторая – БСА в конечной концентрации 2 мкг/мл. Время от начала внесения образцов до включения прибора не должно превышать 10 мин. Условия проведения электрофореза: напряжение – 6-8 В на 1 см длины геля, сила тока – 6 мА, время – 18-20 ч. По окончании электрофореза пластинку помещают в кювету с 0,9% раствором натрия хлорида и дважды промывают в течение 3 ч. После этого пластинку вынимают, накрывают фильтровальной бумагой, предварительно смоченной водой, прокалывают иглой отверстия над лунками (для предотвращения растрескивания геля) и сушат при температуре 18-20 °С. После высушивания с пластинки удаляют фильтровальную бумагу путем смачивания водой и переносят в кювету с красителем на 15-20 мин. Затем окрашенную пластинку помещают в кювету с раствором для обесцвечивания окрашенных гелей и выдерживают до достижения необходимой контрастности между преципитатом и фоном. Далее пластинку промывают водой и сушат при температуре 18-20 °С. С помощью металлической линейки измеряют высоту пика (h), длина шкалы до () мм. Измерения делают от края лунки до максимума внешней высоты пика (“ракеты”) (рис. 2).
Рисунок 2. Измерение высоты пика “ракеты”
Содержание БСА в испытуемой пробе определяют по калибровочному графику. Оно должно находиться в диапазоне от 0,5 до 2,0 мкг/мл. Построение калибровочного графика. СО “Содержания бычьего сывороточного альбумина для построения калибровочного графика” разводят в соответствии с инструкцией по применению до концентрации 2,0 мкг/мл. К 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 мл разведенного стандартного образца прибавляют воду до 0,4 мл (концентрация БСА – 0,25; 0,5; 1,0; 1,5 мкг/мл соответственно). Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество БСА в СО, в мкг/мл, а по оси ординат – высоту пика в мм. Калибровочный график должен проходить через начало координат. Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.
Примечания.
1. Испытуемый образец – 15 мкл испытуемого образца. 2. Получение сыворотки против БСА. Кроликов породы Шиншилла массой 2,5-3,5 кг иммунизируют 0,15% раствором БСА. Используют БСА с содержанием белка не менее 95%. Приготовление 0,15% раствора БСА. 0,15 г БСА помещают в градуированный цилиндр вместимостью 100 мл, растворяют в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. I цикл иммунизации состоит из 2 инъекций 0,15% раствора БСА с интервалом 7 сут. в дозе 1,0 мл в смеси с 1,0 мл адъюванта Фрейнда в область подколенных лимфатических узлов (последовательно в правую и левую лапу). II цикл иммунизации проводят через 30 сут. после I цикла: делают 5 внутрибрюшинных инъекций БСА с интервалом 2 сут. в возрастающих дозах: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 мл (за 1 ч до первой инъекции проводится десенсибилизация – 0,1 мл 0,15% раствора БСА подкожно). III цикл иммунизации проводят через 30 сут. после цикла II иммунизации, и он состоит из 3 внутривенных инъекций с интервалом 2 сут. в возрастающих объемах: 0,5; 1,0; 1,5 мл 0,15% раствора БСА (за 1 ч до первой инъекции проводится десенсибилизация – 0,1 мл раствора БСА подкожно). Через 7 сут. после последнего введения БСА у кроликов берут 2-3 мл крови и в сыворотке определяют титр антител против БСА методом ракетного иммуноэлектрофореза (отмечают разведение сыворотки, дающее пик высотой 1 мм с раствором БСА в концентрации 0,5 мкг/кг). Сыворотка, имеющая титр не ниже 1:500, годна к дальнейшему использованию в этом случае кроликов обескровливают тотально. Если титр сыворотки ниже 1:500, через 30 сут. проводят IV цикл иммунизации (аналогичный третьему циклу), через 7 сут. кроликов обескровливают тотально и устанавливают титр антител против БСА. Сыворотка, имеющая титр ниже 1:500, подлежит уничтожению. При обескровливании кроликов кровь от каждого из них собирают в отдельный флакон. Флаконы с кровью ставят в термостат при температуре () °С на 60-65 мин., затем обводят образовавшийся сгусток пипеткой и оставляют при температуре 4-8 °С на 18-20 ч. После этого сыворотку отбирают в стерильную посуду, прибавляют борную кислоту из расчета 20-25 мг на 100 мл сыворотки и разливают по 0,5 мл в ампулы из стекла НС-1. Ампулы запаивают и хранят при температуре минус 19-21 °С в течение 2 лет. 3. Приготовление концентрированного трис-боратного буферного раствора с натрия эдетатом (трилон Б) (pH 8,6-8,8). В мерном цилиндре вместимостью 1000 мл последовательно растворяют в воде очищенной 6,5 г трис(гидроксиметил)аминометана, 6,0 г натрия эдетата (трилон Б) и 19,0 г борной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. При необходимости полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр. Раствор хранят при температуре 2-8 °С не более 3 мес. 4. Приготовление электродного буферного раствора (pH 8,6-8,8). К 300 мл концентрированного трис-боратного буферного раствора с натрия эдетатом (трилон Б) (pH 8,6-8,8) прибавляют 1200 мл воды очищенной и перемешивают. Раствор хранят при температуре 2-8 °С не более 1 мес. при 4-кратном использовании. 5. Приготовление 1% геля агарозы. В колбу вместимостью 100 мл помещают 1 г агарозы, прибавляют 80 мл воды очищенной и растворяют при нагревании на кипящей водяной бане, прибавляют 20 мл концентрированного трис-боратного буферного раствора с натрия эдетатом (трилон Б) и вновь нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Гель агарозы разливают по 16 мл в химические пробирки вместимостью 20 мл и хранят при температуре 4-8 °С не более 2 мес. 6. Приготовление красителя. 0,5 г кислотного синего 92 растворяют в растворе, состоящем из 10 мл уксусной кислоты ледяной, 45 мл 96% раствора спирта этилового и 45 мл воды очищенной. Раствор перемешивают, фильтруют и хранят при комнатной температуре в течение 3 мес. 7. Приготовление раствора для обесцвечивания. К 200 мл уксусной кислоты ледяной прибавляют 500 мл 96% раствора спирта этилового, 300 мл воды очищенной и перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 3 мес. 8. Подготовка стеклянных пластинок. На стеклянные пластинки размером 120×90 мм, обработанные хромовой смесью, наносят 1 мл 1% расплавленного геля, растирают по поверхности пластинки с помощью стеклянной палочки и подсушивают. Подготовку стеклянных пластинок проводят непосредственно перед использованием.
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Определение О-ацетильных групп в полисахаридных вакцинах ОФС.1.7.2.0019.15
Взамен ГФ X
Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения О-ацетильных групп в полисахаридных вакцинах. Принцип метода заключается в способности О-ацетильных групп образовывать с гидроксиламином в щелочной среде гидроксамовую кислоту, которая в кислой среде дает цветную реакцию с ионами железа (III). Определение О-ацетильных групп проводится колориметрическим методом.
Колориметрический метод
К 1 мл испытуемого раствора прибавляют 2 мл свежеприготовленного реактива N 1, перемешивают и оставляют на 4 мин при температуре от 18 до 20 °С. К полученному раствору приливают 1 мл разведенной хлористоводородной кислоты, перемешивают, прибавляют 1 мл 0,37 М раствора железа (III) хлорида, вновь перемешивают и оставляют на 15 мин при температуре, указанной выше. По окончании инкубирования измеряют оптическую плотность испытуемого и калибровочных растворов при 540 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором, содержащим 1 мл воды очищенной и реактивы, указанные выше и добавленные в той же последовательности. Содержание О-ацетильных групп (X) в мкмоль/мл вычисляют по формуле:
X = A / B,
где: А – содержание О-ацетильных групп, найденное по калибровочному графику, мкмоль; В – объем испытуемого раствора, мл.
Содержание О-ацетильных групп в 1 мл испытуемого раствора должно быть от 1,5 до 2,5 мкмоль/мл с учетом содержания влаги в лекарственном препарате. Построение калибровочного графика. К 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 мл стандартного раствора ацетилхолина йодистого (5 мкмоль О-ацетильных групп) прибавляют воду очищенную до 1 мл (конечная концентрация О-ацетильных групп 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 мкмоль/мл соответственно). Далее анализ проводят, как указано выше. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс концентрацию стандартного раствора ацетилхолина йодистого в мкмолях О-ацетильных групп, а по оси ординат-показания оптической плотности стандартных растворов при 540 нм. Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.
Примечания.
1. Испытуемый раствор. 1 мл испытуемого раствора (0,1% раствор испытуемого образца в воде очищенной), содержащий 1,5-2,5 мкмоль О-ацетильных групп. Приготовление испытуемого раствора указывается в фармакопейной статье или нормативной документации. 2. Стандартный раствор ацетилхолина йодистого 5 мкмоль О-ацетильных групп в 1 мл. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,1360 г (точная навеска) ацетилхолина йодистого, прибавляют около 80 мл 0,001 М раствора натрия ацетата, перемешивают, доводят общий объем раствора тем же растворителем до метки и вновь перемешивают. Раствор хранят при температуре 4-8 °С в течение 3 мес. 3. 2 М раствор гидроксиламина, В мерной колбе вместимостью 500 мл растворяют 69,5 г гидроксиламина гидрохлорида в воде очищенной, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4-8 °С в течение 1 мес. 4. 3,5 М раствор натрия гидроксида. В мерной колбе вместимостью 500 мл растворяют 70,0 г натрия гидроксида в воде очищенной, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 3 мес. 5. Реактив 1. Смешивают равные объемы 1 М раствора гидроксиламина и 3,5 М раствора натрия гидроксида. Реактив готовят в день проведения анализа. 6. Хлористоводородная кислота разведенная. Смешивают 1 объем хлористоводородной кислоты концентрированной с 2 объемами воды очищенной. Раствор хранят в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 6 мес. 7. 0,37 М раствор железа (III) хлорида. Растворяют 50,0 г железа (III) хлорида 6-водного в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты в мерной колбе вместимостью 500 мл, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4-8 °С в течение 3 мес. 8. 0,001 М раствор натрия ацетата. Растворяют 0,0680 г натрия ацетата тригидрата в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 500 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Устанавливают в растворе pH 4,5 с помощью 1 М раствора уксусной кислоты. Раствор хранят при температуре 4-8 °С в течение 3 мес. 9. 1 М раствор хлористоводородной кислоты. В мерную колбу вместимостью 500 мл, содержащую 200-300 мл воды очищенной, помещают 4,13 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, доводят объем тем же растворителем до метки и перемешивают. Раствор хранят в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 6 мес.
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Определение нуклеиновых кислот по методу Спирина в иммунобиологических лекарственных препаратах ОФС.1.7.2.0018.15
Вводится впервые
Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения суммарного количества нуклеиновых кислот в иммунобиологических лекарственных препаратах (ИЛП). Определение количества нуклеиновых кислот проводится спектрофотометрическим методом после проведения кислотного гидролиза. Метод основан на измерении разности показателей оптической плотности гидролизатов ИЛП в ультрафиолетовой области спектра, характеризующей содержание фосфора нуклеиновых кислот. По результатам измерения оптической плотности растворов при 270 нм (максимум поглощения нуклеиновых кислот) и 290 нм (максимум поглощения примесей) определяется содержание нуклеиновых кислот.
Спектрофотометрический метод
К 1 мл испытуемого образца прибавляют 5 мл 0,5 М раствора хлорной кислоты и перемешивают. Смесь нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин. После охлаждения гидролизат центрифугируют в течение 20 мин. при 2000 об./мин., отделяют осадок от надосадочной жидкости и измеряют оптическую плотность надосадочной жидкости в кювете с толщиной слоя 10 мм при 270 и 290 нм по сравнению с контрольным раствором, содержащим 1 мл воды очищенной и 5 мл 0,5 М раствора хлорной кислоты. Содержание нуклеиновых кислот (X) в мкг/мл вычисляют по формуле:
,
где: A270 и A290 – значения оптической плотности, измеренные при соответствующих длинах волн; 0,19 – коэффициент удельной экстинкции нуклеиновых кислот (среднее значение разницы показаний оптической плотности (D270 – D290), соответствующее содержанию 1 мкг фосфора нуклеиновых кислот в 1 мл испытуемого раствора); 10,3 – коэффициент пересчета количества фосфора на нуклеиновые кислоты, мкг/мл; 6 – разведение испытуемого образца.
Метод применим при выполнении условия: показания оптической плотности при A270 и A290 не должны отличаться более чем на 15%. Содержание нуклеиновых кислот в ИЛП должно составлять от 15 до 35 мкг/мл.
Примечания.
1. Испытуемый раствор. Исследуют 1 мл испытуемого образца или приготовленного, как указано в фармакопейной статье и нормативной документации. 2. 0,5 М раствор хлорной кислоты. Раствор готовят с учетом удельного веса и процентной концентрации исходного раствора кислоты хлорной. Приготовление 0,5 М раствора хлорной кислоты из 70% раствора. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 42,07 мл 70% раствора хлорной кислоты с удельным весом 1,664, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят в склянке с притертой пробкой при температуре от 18 до 25 °С в течение 12 мес.
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Спектрофотометрическое определение фосфора в иммунобиологических лекарственных препаратах ОФС.1.7.2.0017.15
Взамен ОФС 42-0088-11
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод, предназначенный для количественного определения фосфора с помощью спектрофотометрии в иммунобиологических лекарственных препаратах (ИЛП). Метод основан на способности неорганического фосфора в кислой среде образовывать с молибденовой кислотой фосфорномолибденовую кислоту, которая в присутствии аскорбиновой кислоты дает цветную реакцию. Содержание фосфора определяется по результатам измерения оптической плотности растворов при 825 нм в видимой области спектра по калибровочному графику.
Определение фосфора с содержанием 1,2-2,4 мкг/мл
В термостойкую пробирку размером 250×20 мм вносят 0,2 мл испытуемого образца, прибавляют 0,15 мл реактива для минерализации, закрывают стеклянным колпачком и минерализуют на песочной бане при температуре 180 °С до образования темно-коричневой жидкости. Минерализацию продолжают при температуре 250 °С не менее 10 ч до обесцвечивания содержимого пробирки. Одновременно в аналогичных условиях минерализуют контрольный образец, содержащий 0,2 мл воды очищенной и 0,15 мл реактива для минерализации. Объем минерализата и контрольного образца доводят водой очищенной до 2 мл, перемешивают, прибавляют 2 мл цветного реактива и вновь перемешивают. Растворы помещают в водяную баню и выдерживают 2 ч при температуре 37 °С. Измеряют оптическую плотность испытуемых растворов при 825 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором, содержащим 0,15 мл реактива для минерализации, 1,85 мл воды очищенной и 2 мл цветного реактива. Содержание фосфора (X) в 0,5 мл исследуемого образца в микрограммах вычисляют по формуле:
;
где: А – количество фосфора, найденное по калибровочному графику; В – объем исследуемого образца, взятый на анализ, в мл.
Построение калибровочного графика. К 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 мл рабочего раствора калия дигидрофосфата (концентрация фосфора: 0,2; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2 мкг) прибавляют воду очищенную до 1,95 мл, 0,05 мл реактива для минерализации, 2 мл свежеприготовленного цветного реактива и выдерживают на водяной бане 2 ч при температуре 37 °С. Измеряют оптическую плотность калибровочных растворов, как описано выше, по сравнению с контрольным раствором, содержащим 1,95 мл воды очищенной, 0,05 мл реактива для минерализации и 2 мл цветного реактива. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество фосфора в мкг, а по оси ординат – среднее значение показателя оптической плотности при 825 нм. Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.
Примечания.
1. Приготовление испытуемого раствора. Содержимое каждого флакона (ампулы) растворяют в 0,5 мл растворителя (вода очищенная). 2. Приготовление основного раствор калия дигидрофосфата (80 мкг фосфора в 1 мл). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 0,3509 г (точная навеска) калия дигидрофосфата, доведенного до постоянной массы в эксикаторе над безводным кальция хлоридом, прибавляют 500 мл воды очищенной, 10 мл 5 М раствора серной кислоты, доводят объем раствора до метки и перемешивают. Основной раствор калия дигидрофосфата хранят при комнатной температуре в течение 18 мес. 3. Приготовление рабочего раствора калия дигидрофосфата (2 мкг фосфора в 1 мл). В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 1,25 мл основного раствора калия дигидрофосфата, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают. Рабочий раствор калия дигидрофосфата хранят при температуре 2-8 °С в течение 6 мес. 4. Приготовление реактива для минерализации. Смешивают в равных объемах серную кислоту концентрированную и 65-70% хлорную кислоту. Раствор хранят в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 18 мес. 5. Приготовление 5 М раствора серной кислоты. В мерную колбу вместимостью 1000 мл наливают 600-700 мл воды, осторожно при постоянном перемешивании добавляют 279,0 мл серной кислоты концентрированной, доводят объем водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 12 мес. 6. Приготовление 1,5 М раствора серной кислоты. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 500 мл воды, осторожно несколькими порциями при помешивании приливают 83,5 мл серной кислоты концентрированной, доводят объем раствора водой очищенной до метки, охлаждают и перемешивают. Раствор хранят в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 12 мес. 7. Приготовление 2,5% раствора аммония молибдата. Раствор готовят в конической колбе или химическом стакане вместимостью 1000 мл. Растворяют 25 г аммония молибдата при перемешивании в 700 мл кипящей воды очищенной и выдерживают на водяной бане 2 ч при температуре 37 °С. Раствор оставляют при температуре 18-22 °С на сутки, затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор фильтруют через два слоя фильтровальной бумаги и хранят в склянке из темного стекла с притертой пробкой при температуре 4-8 °С в течение 1 мес. 8. Приготовление 10% раствора аскорбиновой кислоты. В мерный цилиндр вместимостью 20 мл помещают 2 г аскорбиновой кислоты и растворяют в воде очищенной, затем объем раствора доводят до метки и перемешивают. Раствор готовят в день проведения анализа. 9. Приготовление цветного реактива. В химическом стакане при постоянном помешивании добавляют реактивы в следующем порядке: два объема воды очищенной, один объем 1,5 М раствора серной кислоты, один объем 2,5% раствора аммония молибдата и один объем 10% раствора аскорбиновой кислоты. Цветной реактив готовят перед проведением анализа.
В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.
Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Определение ионов алюминия в сорбированных иммунобиологических лекарственных препаратах ОФС.1.7.2.0016.15
Взамен ГФ X
Взамен ОФС 42-0090-11
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод, предназначенный для количественною определения ионов алюминия комплексонометрическим методом в сорбированных иммунобиологических лекарственных препаратах (ИЛИ). Метод основан на реакции комплексообразования ионов алюминия с натрия эдетатом (трилон Б) с последующим обратным титрованием избытка трилона Б.
Комплексонометрическое титрование
В колбу из термостойкого стекла вместимостью 100 мл вносят необходимое количество исследуемого образца, прибавляют 2 мл 10% раствора серной кислоты и перемешивают. При анализе сухого препарата (например, секстаанатоксина) делают разведение в соответствии с инструкцией к лекарственному препарату. На анализ отбирают испытуемый раствор и прибавляют 4-5 мл 5% раствора серной кислоты. Содержимое колбы доводят до слабого кипения. Во избежание выпаривания жидкости, в колбу после закипания раствора периодически вносят при перемешивании от 2 до 5 раз по 5 мл воды очищенной и продолжают нагревать до полного растворения осадка. Прозрачный раствор охлаждают до комнатной температуры, прибавляют 10 мл ацетатного буферного раствора, 10 мл точно отмеренного 0,01 М раствора трилона Б, перемешивают и нагревают до кипения. После охлаждения раствора до комнатной температуры прибавляют 25 мл 96° этилового спирта, 1 мл раствора дитизона и перемешивают. Избыток трилона Б титруют 0,01 М раствором цинка сульфата до перехода зеленой окраски раствора к красной. В аналогичных условиях проводят анализ контрольной пробы, содержащей 1 или 2 мл воды очищенной и все вышеперечисленные реактивы. Содержание алюминия (X) в мг/мл вычисляют по формуле:
;
где:
- поправочный коэффициент к титру 0,01 М раствора цинка сульфата; V – объем 0,01 М раствора цинка сульфата, пошедший на титрование контрольной пробы, в мл; V0 – объем 0,01 М раствора цинка сульфата, пошедший на титрование испытуемого образца, в мл; Vn – объем образца, взятое на анализ, в мл; 0,2698 – количество алюминия в миллиграммах, соответствующее 1 мл 0,01 М раствора трилона Б.
Примечания.
1. Испытуемый образец – 2 мл (содержание 0,5-1,0 мг/мл алюминия) или 1 мл (содержание алюминия 1-2 мг/мл). При испытании сухого образца (например, секстаанатоксина) делают разведение в соответствии с инструкцией по применению лекарственного средства. На анализ отбирают 1 мл испытуемого раствора. При содержании алюминия в пробе выше 1 мг/мл объем прибавляемых реактивов (трилон Б и ацетатный буферный раствор) увеличивают в 2 раза. Объем прибавляемого этилового спирта должен составлять не менее половины конечного объема реакционной смеси. Поправочный коэффициент к 0,01 М раствору цинка сульфата рассчитывают по формуле:
,
где:
10 – объем 0,01 М раствора цинка сульфата, взятое на титрование контрольного раствора, в мл; Vk – объем 0,01 М раствора цинка сульфата, пошедшее на титрование контрольного раствора, в мл. 2. Аммиачный буферный раствор (pH 9,5-10,0). В мерной колбе вместимостью 1000 мл растворяют 20 г аммония хлорида в 200-300 мл воды очищенной, прибавляют 100 мл концентрированного раствора аммиака, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят в таре из темного стекла с герметичной крышкой при комнатной температуре в течение 3 мес. в специально отведенном месте. 3. Приготовление ацетатного буферного раствора (pH 4,5-5,0). В мерный цилиндр вместимостью 1000 мл помещают 77 г аммония ацетата, прибавляют 60 мл уксусной кислоты ледяной и растворяют в 800 мл воды очищенной. Объем раствора доводят водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 3 мес. 4. Приготовление раствора дитизона. Растворяют 25 мг дитизона в 100 мл ацетона, перемешивают и хранят при температуре 4-8 С в течение 1 мес. 5 Приготовление 0,01 М раствора натрия эдетата (трилон Б). Раствор готовят из фиксанала или взвешивают 3,7225 г (точная навеска) трилона Б и растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 мл в 500 мл воды очищенной, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Титр раствора трилона Б устанавливают по 0,01 М раствору магния сульфата. К 20 мл точно отмеренного 0,01 М раствора магния сульфата прибавляют 5 мл аммиачного буферного раствора, около 0,2 г индикаторной смеси, 80 мл воды очищенной, перемешивают и титруют раствором трилона Б. Рассчитывают поправочный коэффициент аналогично расчету поправочного коэффициента к 0,01 М раствору цинка сульфата. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 1 мес. 6. Приготовление 0,01 М раствора магния сульфата. 0,1 М раствор магния сульфата готовят из 0,1 М стандарт-титра (фиксанала) магния сульфата в мерной колбе вместимостью 1000 мл согласно инструкции по приготовлению. Затем в мерную колбу вместимостью 100 мл наливают приготовленный раствор до метки, после чего содержимое колбы переливают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре течение 1 мес. 7. Приготовление индикаторной смеси. В фарфоровой ступке растирают 0,25 г индикатора эриохрома черного Т с 25 г натрия хлорида и перемешивают. На 100 мл титруемого раствора берут около 0,2 г индикаторной смеси. Смесь хранят при комнатной температуре в течение 1 мес. 8. Приготовление 0,01 М раствора цинка сульфата гептагидрата. 0,01 М раствор цинка сульфата гептагидрата готовят из фиксанала. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 1 мес. При отсутствии фиксанала раствор готовят одним из следующих способов: а) 2,8754 г (точная навеска) цинка сульфата гептагидрата растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 1000 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. б) 0,6538 г (точная навеска) металлического цинка растворяют в 40 мл 50% раствора серной кислоты в мерной колбе вместимостью 1000 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 1 мес. Титр раствора устанавливают по титрованному раствору трилона Б. К 20 мл (точно отмеренному) 0,01 М раствору трилона Б прибавляют 10 мл ацетатного буферного раствора, 25 мл этилового спирта и 1 мл раствора дитизона, перемешивают и титруют 0,01 М раствором цинка сульфата гептагидрата. После окончания титрования рассчитывают поправочный коэффициент.
