Recipe.Ru

Общая фармакопейная статья «Хроматография. ОФС.1.2.1.2.0001.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том I») Общая фармакопейная статья «Рентгеновская порошковая дифрактометрия. ОФС.1.2.1.1.0011.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том I») Общая фармакопейная статья «Рентгеновская флуоресцентная спектрометрия. ОФС.1.2.1.1.0010.15» («Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том I»)

new_adm

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Хроматография
ОФС.1.2.1.2.0001.15
Взамен ГФ X
Взамен ст. ГФ XI, вып. 1

Хроматографией называется метод разделения смесей веществ, основанный на их многократном перераспределении между двумя контактирующими фазами, одна из которых неподвижна, а другая имеет постоянное направление движения. По механизму, лежащему в основе разделения, различают адсорбционную, распределительную, ионообменную и другие виды хроматографии. В настоящее время используются следующие хроматографические методы анализа, представленные на рис. 1

Рисунок 1. Методы хроматографического анализа

Результат хроматографического разделения представляется в виде хроматограммы.

ХРОМАТОГРАММА И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

Хроматограмма представляет собой графическое или иное представление сигнала детектора, концентрации веществ в элюате или другой количественной величины, используемой для измерения концентрации веществ в элюате, от времени или объема подвижной фазы, В планарной (плоскостной) хроматографии хроматограммой называют также зафиксированную на бумаге (бумажная хроматография) или ТСХ-пластинке (тонкослойная хроматография) последовательность зон адсорбции веществ исходной (анализируемой) смеси. Схематически хроматограммы представляют собой последовательность гауссовых пиков на базовой линии (рис. 2). Базовая линия — сигнал от подвижной фазы. Пик — часть хроматограммы, регистрирующая отклик детектора. Пик отображает постепенное нарастание концентрации вещества и последующее ее уменьшение. В случае линейной изотермы сорбции кривая, описывающая пик, приближается к кривой гауссова распределения. Основание пика — продолжение базовой линии, соединяющее начало и конец пика. Площадь пика (S) — площадь хроматограммы, заключенная между кривой, описывающей пик, и его основанием. Высота пика (H) — расстояние от максимума пика до его основания, измеренное параллельно оси отклика детектора.

Рисунок 2. Хроматограмма и основные хроматографические параметры: 1 и 2 — пики соединений 1 и 2; t1 и t2 — соответствующие времена удерживания; t0 — время удерживания несорбирующегося вещества; W1 и W2 — ширина пиков у основания; W0,5 — ширина пика на половине его высоты (предполагается гауссова форма пиков).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ДАННЫХ

Время удерживания (tR или t) — время, необходимое для элюирования вещества. Соответствует времени появления максимума пика на хроматограмме. Объем удерживания (VR) — объем подвижной фазы, необходимый для элюирования вещества. Может быть вычислен по времени удерживания и скорости потока (F).

VR = F · tR.

Объем удерживания, в отличие от времени удерживания, не зависит от скорости потока. Время удерживания несорбирующегося вещества (t0 или tM) — время, необходимое для элюирования неудерживаемого на сорбенте вещества. В эксклюзионной хроматографии t0 соответствует времени удерживания веществ, размер молекул которых больше, чем наибольшие поры сорбента. Объем удерживания несорбирующегося вещества {V0) — объем подвижной фазы, необходимый для элюирования неудерживаемого вещества. Может быть вычислен по времени удерживания неудерживаемого вещества и скорости потока (F):

V0 = F · t0.

В эксклюзионной хроматографии V0 соответствует объему удерживания веществ, размер молекул которых больше, чем наибольшие поры сорбента. Общее время удерживания подвижной фазы (tt) — в эксклюзионной хроматографии время удерживания веществ, молекулы которых меньше, чем наименьшие поры сорбента. Общий объем удерживания подвижной фазы (Vt) — в эксклюзионной хроматографии объем удерживания веществ, молекулы которых меньше, чем наименьшие поры сорбента. Константа (коэффициент) распределения (K0) — в эксклюзионной хроматографии характеристика элюирования вещества из определенной колонки, которую рассчитывают с помощью выражения:

.

Приведенное (исправленное) время удерживания вещества (t’R) — время удерживания вещества за вычетом времени удерживания несорбируемого вещества. Может быть рассчитано по формуле:

t’R = tR — t0

Исправленное время удерживания не зависит от объема трубопроводов хроматографической системы, установленных между инжектором и колонкой. Относительное время удерживания (r) — относительное приведенное (исправленное) время удерживания вещества 2 по веществу 1:

.

Нескорректированное относительное время удерживания (RRT) — относительное время удерживания вещества 2 по веществу 1:

.

Если не указано иное, значения относительного времени удерживания, приведенные в фармакопейных статьях, соответствуют нескорректированному относительному времени удерживания. Коэффициент емкости (k’)- коэффициент емкости колонки по веществу с временем удерживания tR, показывающий, во сколько раз исправленное время удерживания вещества больше, чем время удерживания несорбируемого вещества.

.

Эффективность хроматографической системы — параметр, характеризующий степень размывания хроматографического пика. Эффективность выражается числом теоретических тарелок (N):

или

где: W — ширина пика у основания;
W0,5 — ширина пика на половине высоты.

При расчете числа теоретических тарелок значения времени удерживания и ширины пика должны быть приведены к одинаковой размерности. Число теоретических тарелок зависит от природы определяемого вещества, его концентрации или объема, вводимого в систему, от колонки, температуры колонки и состава подвижной фазы. Если не указано иное, то эффективность хроматографической системы, требования к которой приведено в фармакопейной статье, рассчитывается по формуле, использующей ширину пика на половине его высоты. Фактор асимметрии (фактор симметрии) пика (Аs) рассчитывают по формуле:

,

где: W0,05 — ширина пика на 5% (1/20) его высоты; f — расстояние между перпендикуляром, опущенным из вершины пика, и восходящей стороной пика на 5% его высоты (рис. 3).

Если фактор асимметрии равен 1, то пик симметричен. Если фактор асимметрии больше 1, то это означает, что растянут задний фронт пика. Если фактор асимметрии меньше 1, то пик растянут спереди.

Рисунок 3. Схема расчета фактора асимметрии пика

Разрешение (Rs).
Разрешение между пиками двух веществ смеси элюирующимися друг за другом рассчитывают по формулам:

или

,

при этом tR2 tR1. При расчете разрешения величины времени удерживания и ширины пиков должны быть приведены к одинаковой размерности. Если не указано иное, то разрешение, требования к которому приведены в фармакопейной статье, рассчитывается по формуле, использующей ширину пиков на половине высоты. В случае, если пики несимметричны и если интенсивность пиков значительно различается, параметр Rs не всегда корректно описывает разделение хроматографических пиков. Таким образом, даже при значениях Rs 1,5 может наблюдаться неполное разделение пиков. В этих случаях при оценке разделяющей способности можно заменить параметр Rs на параметр «отношение максимум/минимум». Отношение максимум/минимум (p/v), называемое также отношением «peak-to-valley», «пик — долина». Этот параметр позволяет оценить разделительную способность хроматографической системы. Значение p/v рассчитывается по формуле:

,

где: Hp — высота меньшего пика относительно экстраполированной базовой линии; Hv — высота низшей точки (седловины) кривой, разделяющей пики, относительно экстраполированной базовой линии (рис. 4).

Рисунок 4. Хроматограмма не полностью разделяемых веществ

Данное соотношение применяется для оценки разделительной способности хроматографической системы, если вещества смеси разделяются не полностью. Рассчитанное отношение максимум/минимум в значительной степени зависит от выбранного варианта интегрирования хроматограммы. Результаты измерения соотношения p/v будут некорректны в случае разметки меньшего пика методом экстраполяции смещенной базовой линии (методом тангенциальной касательной). Отношение сигнал/шум (S/N).
Краткосрочный шум сигнала детектора (шум базовой линии) влияет на прецизионность количественного определения. Отношение сигнал/шум рассчитывают по формуле:

,

где: Н — высота пика, соответствующего рассматриваемому веществу на хроматограмме указываемого стандартного раствора, измеренная от максимума пика до экстраполированной базовой линии. Экстраполяция базовой линии проводится для сигнала на участке базовой линии во временном интервале, продолжительность которого не менее 5-кратного значения ширины пика на его полувысоте; h — размах фонового шума, измеряемый либо на хроматограмме контрольного (холостого) раствора (или раствора плацебо), либо на хроматограмме того же раствора стандартного образца.

Измерение размаха фонового шума проводится во временном интервале, продолжительность которого не менее 5-кратного значения ширины пика на его полувысоте, расположенном, если это возможно, равномерно по обе стороны от места возможного обнаружения пика. В случае использования для измерения шума хроматограммы контрольного (холостого) раствора (или раствора плацебо) измерение размаха фонового шума проводится во временном интервале, включающем в себя время удерживания рассматриваемого вещества, при этом продолжительность временного интервала, в котором проводится измерение шума, должна не менее чем в 5 раз превышать ширину на половине высоты для пика на хроматограмме указываемого раствора стандартного образца (рис. 5).

Рисунок 5. Вычисление отношения сигнал/шум

Объем задержки (D) (объем задержки градиента) представляет собой объем системы между точкой, в которой происходит смешение элюентов, и началом колонки. Объем задержки градиента влияет на времена удерживания веществ и общий профиль наблюдаемой хроматографической картины, получаемой при использовании градиентного элюирования. Объем задержки хроматографической системы определяется следующим способом. Колонка. Заменяют хроматографическую колонку капилляром (например, 1 м х 0,12 мм). Подвижная фаза.
Подвижная фаза А — вода.
Подвижная фаза В — 0,1% (об/об) раствор ацетона.

Время, мин
Подвижная фаза А,
% (об/об)
Подвижная фаза В,
% (об/об)
0-20
1000
0100
20-30
0
100

Скорость потока. Необходимая для создания давления, достаточного для стабильной работы насоса (например, 2 мл/мин). Детектор. Спектрофотометрический при длине волны 265 нм. Определяют время (t0,5) в минутах, когда оптическая плотность увеличилась на 50%. Вычисляют объем задержки:

D = tD · F,

где: tD = t0,5 — 0,5tG, мин;
tG — предварительно установленное время градиента (20 мин); F — скорость потока, мл/мин.

Рисунок 6. Определение объема задержки градиента

Прецизионность системы в условиях повторяемости Прецизионность системы в условиях повторяемости выражается в виде рассчитанного относительного стандартного отклонения в процентах [RSD (%)] по результатам последовательных измерений не менее чем 3 вколов или нанесений раствора сравнения и рассчитывается по формуле:

,

где: — среднее значение результатов определений; Хi — результаты единичных определений;
n — число определений.

В планарной хроматографии аналогом времени удерживания является фактор удерживания (Rf):

,

где: a — расстояние от точки нанесения пробы до центра пятна, характеризующего зону адсорбции; b — расстояние от линии старта до линии фронта элюента.

На экспериментально определяемые значения Rf заметно влияют условия хроматографирования. Оценкой хроматографической подвижности, менее чувствительной к влиянию отклонений в условиях проведения эксперимента» является величина Rst, представляющая собой отношение величины Rf одного вещества к величине Rf другого, принятого за стандарт:

.

Величины Rf и Rst используют для идентификации веществ. Обычно выбор стандарта осуществляется так, чтобы значение Rst анализируемого вещества было в пределах от 0,5 до 2,0. Схема определения этих величин приведена на рис. 7.

Рисунок 7. Схема определения значений Rf и Rst

Данные планарной хроматографии могут быть представлены в виде денситограмм.

РАСЧЕТ СОДЕРЖАНИЯ ОПРЕДЕЛЯЕМЫХ ВЕЩЕСТВ

При расчетах содержания определяемых веществ пики растворителей и реактивов, подвижной фазы или среды (матрицы) образца не учитываются. Существуют 4 основных метода расчета концентрации анализируемого вещества по хроматографическим данным,

  1. Метод нормирования (метод внутренней нормализации). Применение данного метода основано на предположении, что на хроматограмме зарегистрированы все вещества, входящие в состав анализируемой смеси, и что доля площади (высоты) каждого пика от суммы площадей (высот) всех пиков соответствует содержанию вещества в массовых процентах. Процентное содержание вещества в анализируемой смеси рассчитывается путем определения площади соответствующего пика как процентной части общей площади всех пиков, за исключением пиков, соответствующих растворителям или реактивам, подвижной фазе или матрице образца. Содержание каждого вещества в смеси в процентах может быть вычислено по формуле:

,

где: Si — площадь (высота) i-го пика;

Если чувствительность детектора различна по отношению к каждому из веществ, то вводят поправочные коэффициенты ki. Относительный коэффициент отклика детектора, обычно называемый фактором отклика, обозначает чувствительность детектора для данного вещества относительно стандартного вещества. Поправочный коэффициент — это число, обратное фактору отклика. Поправочные коэффициенты рассчитывают относительно основного вещества анализируемой смеси или другого стандартного вещества по формуле:

,

где: Сi и С0 — концентрация i-го вещества и стандартного вещества соответственно; Si и S0 — площадь (высота) пика i-го вещества и стандартного вещества соответственно.

Данные коэффициенты могут не учитываться в случае, если они находятся в пределах диапазона 0,8-1,2. При использовании поправочных коэффициентов выражение для расчета количественного содержания приобретает вид:

.

При проведении испытания на примеси методом нормализации или методом внешнего стандарта с использованием разведения раствора испытуемого образца в качестве раствора сравнения учитывают все указанные в нормативной документации поправочные коэффициенты, значение которых выходит за пределы диапазона 0,8-1,2.

2. Метод внешнего стандарта. Концентрацию испытуемого вещества определяют путем сравнения сигнала (пика), полученного на хроматограммах испытуемого раствора, и сигнала (пика), полученного на хроматограммах раствора стандартного образца. Концентрацию определяемого вещества в испытуемом растворе рассчитывают по формуле:

,

где: S и S0 — средние значения площадей (высот) пиков на хроматограммах испытуемого и стандартного растворов соответственно; С и С0 — концентрации определяемого и стандартного растворов соответственно.

Количественное определение содержания примесей методом внешнего стандарта предпочтительнее проводить с использованием стандартных растворов примесей с концентрациями, близкими к их ожидаемым концентрациям в испытуемом растворе. В качестве раствора стандартного образца для количественного определения примесей возможно использование раствора основного вещества. В этом случае разведение подбирается таким образом, чтобы концентрация основного соединения в растворе стандартного образца по отношению к его концентрации в испытуемом растворе была близка к ожидаемой концентрации примесей в испытуемом растворе. В этом случае следует учесть факторы отклика примесей по отношению к основному веществу, если их значения выходят за рамки 0,8-1,2. Частным случаем метода внешнего стандарта является метод калибровочной кривой, в ходе которого определяют взаимосвязь между измеренным или обработанным сигналом (у) и количеством (концентрацией, массой и т.д.) определяемого вещества (х) и рассчитывают уравнение калибровочной функции. Результаты испытания рассчитывают из измеренного или обработанного сигнала с помощью обратной функции.

3. Метод внутреннего стандарта. Концентрацию определяемого вещества определяют путем сравнения отношения сигналов (площадей или высот пиков), соответствующих определяемому веществу и внутреннему стандарту, на хроматограмме испытуемого раствора и отношения сигналов (площадей или высот пиков), соответствующих определяемому веществу и внутреннему стандарту, на хроматограмме раствора стандартного образца. Метод внутреннего стандарта основан на введении в анализируемую смесь определенного количества стандартного вещества (внутренний стандарт). В испытуемый и стандартный растворы вводят известные количества внутреннего стандарта, хроматографируют растворы и определяют отношения площадей (высот) пиков определяемого вещества к площади (высоте) пика внутреннего стандарта в испытуемом и стандартном растворах. Концентрацию определяемого вещества (X) рассчитывают по формуле:

,

где: — отношение площади (высоты) пика определяемого вещества к площади (высоте) пика внутреннего стандарта в испытуемом растворе;

В качестве внутреннего стандарта выбирается вещество, отсутствующее в испытуемой пробе, не взаимодействующее с определяемым веществом и другими веществами пробы, обладающее достаточной стабильностью, полностью отделяющееся от веществ пробы и не содержащее примесей с временами удерживания, совпадающими с временем удерживания определяемого вещества. Концентрация внутреннего стандарта должна быть близка к концентрации определяемых веществ, а структура и свойства по возможности аналогичны структуре и свойствам определяемых веществ.

4. Метод стандартных добавок. Концентрация определяемого вещества определяется путем сравнения сигнала (площади или высоты пика), соответствующего определяемому веществу, на хроматограмме испытуемого раствора, и сигнала (площади или высоты пика) определяемого вещества на хроматограмме испытуемого раствора с известной добавкой определяемого вещества. Метод стандартных добавок основан на введении в анализируемую смесь известного количества определяемого вещества и сравнения сигналов, полученных для испытуемого раствора со стандартной добавкой и без добавки определяемого вещества. При внесении стандартной добавки стараются минимизировать разбавление испытуемого образца, чтобы измерения раствора со стандартной добавкой и без проходили в одинаковых условиях с одинаковым влиянием матрицы. Количество вводимого в стандартной добавке определяемого вещества должно быть соизмеримо с его предполагаемым содержанием в испытуемом образце. После проведения испытания сравнивают полученные значения интенсивности и рассчитывают количественное содержание определяемого вещества Сx по формуле:

,

где: Сстд — концентрация стандартной добавки; Sx — интенсивность сигнала определяемого вещества (площадь или высота пика) для испытуемого раствора без стандартной добавки; Sстд+x — интенсивность сигнала определяемого вещества (площадь или высота пика) для испытуемого раствора со стандартной добавкой.

При необходимости формулу корректируют с учетом разбавлений испытуемого раствора за счет введения стандартной добавки.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО РАЗМЕТКЕ И ИНТЕГРИРОВАНИЮ ХРОМАТОГРАММ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ПРИМЕСЕЙ

Если не указано иное, в испытаниях на содержание примесей в качестве порога игнорирования (неучитываемый предел, уровень содержания вещества, при котором и при меньшем содержании пик не принимается во внимание) принимают величину 0,05% от содержания основного вещества. В случаях, когда при испытании на примеси требуется определение суммарного содержания примесей или количественного определения примеси, при интерпретации хроматограммы важно выбрать подходящие условия интегрирования и значения порога интегрирования [интенсивность сигнала пика соединения (высоты или площади)], при котором (и при меньшем) пик не учитывается системой сбора данных и не участвует в количественных расчетах. С целью разметки на хроматограмме всех пиков, подлежащих учету, заданный порог интегрирования системы сбора данных не должен превышать половину порога игнорирования. Интегрирование площади пика любой примеси, пик которой не полностью разделяется с основным пиком, предпочтительно проводить экстраполяцией смещенной базовой линии (методом тангенциальной касательной). Использование других способов интегрирования должно быть специально оговорено в фармакопейной статье.

ОЦЕНКА ПРИГОДНОСТИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Испытания пригодности системы являются неотъемлемой частью методики и используются для того, чтобы убедиться в надлежащем функционировании хроматографической системы и обеспечить выполнение предъявляемых к ней требований. При проведении испытаний используемое оборудование должно быть квалифицировано и способно к функционированию надлежащим образом. Для оценки пригодности системы указывают: — требования к параметрам, характеризующим форму пика [эффективность хроматографической системы N и фактор асимметрии (фактор симметрии) As; — требования к разделительной способности (разрешение между пиками Rs или отношение пик — долина p/v); — требования к воспроизводимости (относительное стандартное отклонение, RSD) значений площади или высоты пиков, а также времен удерживания пиков в случае оценки подлинности соединений;

,

где: К — константа (0,349), полученная из выражения:

,

в котором множитель , соответствует значению RSDmax после 6 повторных инжекций для В = 1,0; В — верхний предел содержания основного вещества, приведенный в фармакопейной статье, минус 100%; n — число повторных введений стандартного раствора, ();

Если в фармакопейной статье не указано иное, то значение RSD не должно превышать величин RSDmax, приведенных в таблице. Данное требование не применяется при испытаниях на примеси.

Таблица

Максимально допустимое относительное стандартное отклонение RSDmax в зависимости от верхнего предела содержания основного вещества и числа отдельных введений проб

В, %
Число отдельных введений проб (вколов)
3
4
5
6
Максимально допустимое относительное стандартное отклонение RSDmax 2,0
0,41
0,59
0,73
0,85
2,5
0,52
0,74
0,92
1,06
3,0
0,62
0,89
1,10
1,27

Соответствие критериям пригодности системы должно поддерживаться на протяжении всего испытания. В зависимости от различных факторов, например, частоты использования методики и опыта работы с хроматографической системой, аналитик выбирает соответствующую схему проверки, подтверждающую соответствие этим требованиям. В планарной хроматографии при проведении испытаний, регламентирующих наличие посторонних примесей/родственных соединений, должно быть предусмотрено определение предела обнаружения определяемых примесей и разделительной способности хроматографической системы. Для подтверждения пригодности системы возможно одновременное использование двух тестов: «Подтверждение разделительной способности» и «Подтверждение чувствительности». Тест «Подтверждение разделительной способности» проводят путем нанесения на пластинку и последующего хроматографирования специального стандартного раствора, содержащего два или более веществ с известными значениями Rf. После хроматографирования эти вещества должны разделиться, образуя зоны адсорбции, значения Rf которых равны заданным. Тест «Подтверждение чувствительности» позволяет оценить чувствительность проявления. Он заключается в нанесении определенного количества стандартного вещества, хроматографируемого в условиях предыдущего теста и проявляемого тем же реагентом. Зона адсорбции стандартного вещества должно четко обнаруживаться. В каждом случае природа стандартных веществ, состав стандартного раствора, наносимые количества, приблизительные значения Rf устанавливают в фармакопейных статьях. При необходимости для достижения требуемых критериев пригодности хроматографической системы проводится корректировка хроматографических условий.

КОРРЕКТИРОВКА УСЛОВИЙ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ

Далее приводятся пределы возможных изменений различных параметров хроматографической методики, которые могут быть внесены в нее для соответствия требованиям пригодности системы без принципиального изменения методик. Корректировка условий градиентного элюирования является более критичной, чем изократических условий, так как может вызвать сдвиг пиков на другую стадию градиента, и, таким образом, привести к некорректной идентификации пиков, наложению пиков или сдвигов, при которых элюирование интересующих соединений происходит после указанного времени регистрации хроматограммы. При внесении изменений, отличных от приведенных ниже, требуется проведение повторной валидации методики. Проверка пригодности системы должна быть включена в методики для подтверждения получения разделения, требуемого для надлежащего проведения испытания. Тем не менее, поскольку неподвижные фазы описаны только в общем виде, и существует огромное количество доступных коммерческих фаз, отличающихся по хроматографическому поведению, некоторая корректировка условий хроматографирования может потребоваться для выполнения требований пригодности системы. В методиках с использованием обращенно-фазовой жидкостной хроматографии корректировки различных параметров не всегда приводят к удовлетворительному разделению. В этом случае может возникнуть необходимость замены одной колонки на другую, такого же типа, обеспечивающую желаемое хроматографическое поведение. Если в фармакопейной статье не указано иное, допустимы следующие изменения параметров хроматографической системы.

Тонкослойная и бумажная хроматография

Состав подвижной фазы; количество растворителя, содержание которого в смеси наименьшее, может изменяться в пределах 30% (относительное содержание) или 2% (абсолютное содержание) в зависимости от того, какая из величин будет больше. Абсолютное содержание других веществ не может быть изменено более чем на 10%. Пример 1: для вещества, содержание которого составляет 10% подвижной фазы, изменение относительного содержания на 30% приведет к изменению его абсолютного содержания до 7-13%, тогда как изменение на 2% по абсолютному содержанию приведет к изменению абсолютного содержания до 8-12%. Допустимое изменение по относительному содержанию больше, чем допустимое изменение по абсолютному содержанию. Таким образом, допускается изменение содержания 7-13%. Пример 2: для вещества, содержание которого составляет 5% подвижной фазы, изменение относительного содержания на 30% приведет к изменению его абсолютного содержания до 3,5-6,5%, тогда как изменение на 2% по абсолютному содержанию приведет к изменению его абсолютного содержания в подвижной фазе до 3-7%. В этом примере допустимое изменение по абсолютному содержанию больше, чем допустимое изменение по относительному содержанию, и допустимым диапазоном содержания является 3-7%. рН среды водного компонента подвижной фазы: 0,2 рН, если иное не указано в нормативном документе, или 1,0 рН в случаях испытания неионизируемых веществ. Концентрация солей в буферном веществе подвижной фазы: 10%. Наносимый объем, При использовании пластинок с малым размером частиц сорбента (2-10 мкм) наносимый объем может быть изменен на 10-20% от заявленного объема.

Жидкостная хроматография: изократическое элюирование

Состав подвижной фазы: количество растворителя, содержание которого в смеси наименьшее, может изменяться в пределах 30% (относительное содержание) или 2% (абсолютное содержание) в зависимости от того, какая из величин будет больше. Абсолютное содержание других веществ не может быть изменено более чем на 10%. рН среды водного компонента подвижной фазы: 0,2 рН, если иное не указано в нормативном документе, или 1,0 рН в случаях испытания неионизируемых веществ. Концентрация солей в буферном веществе подвижной фазы: 10%. Скорость потока подвижной фазы: 50%, большая степень изменений допустима при одновременном изменении размеров колонки. При необходимости одновременного изменения размеров колонки и скорости потока сначала рассчитывается номинальная скорость потока для колонки, размеры которой отличаются от приведенной в нормативном документе, а затем допускается корректировка полученного значения скорости потока на 50%. Параметры колонки
Неподвижная фаза:
— замена типа неподвижной фазы недопустима (например, недопустима замена фазы С18 на фазу С8); — размер частиц: максимальное уменьшение размера частиц 50%, увеличение не допускается. Размеры колонки
Длина колонки: 70%,
внутренний диаметр колонки: 25%.
При изменении размеров колонки скорость потока пересчитывают, используя следующее уравнение:

,

где: F1 — скорость потока, указанная в нормативном документе, мл/мин; F2 — скорректированная скорость потока, мл/мин; l1 — длина колонки, указанная в нормативном документе, мм; l2 — длина используемой колонки, мм;
d1 — внутренний диаметр колонки, указанный в нормативном документе, мм; d2 — внутренний диаметр используемой колонки, мм.

Температура: 10% от указанной рабочей температуры, если не указано иначе. Длина волны детектора. Изменения не допускаются. Вводимый объем пробы. Может быть уменьшен при условии, что чувствительность фактически применяемой хроматографической системы (минимально определяемая концентрация) и прецизионность системы в условиях повторяемости для определяемых соединений остаются удовлетворительными.

Жидкостная хроматография: градиентное элюирование

Изменение хроматографических условий для систем с градиентом требует большей осторожности, чем для изократических. Состав подвижной фазы/профиль градиентного элюирования: незначительные изменения состава подвижной фазы и системы градиента являются приемлемыми при условии, что: — выполнены требования пригодности системы; — основной пик элюируется в пределах 15% от обозначенного времени удерживания; — элюирующая способность конечного состава подвижной фазы не менее предписанного состава. Если при использовании градиентного элюирования не может быть достигнуто соответствие требованиям пригодности системы, рекомендуется оценить объем задержки градиента или сменить используемую колонку. Объем задержки градиента. Конфигурация используемого оборудования может значительно изменить разрешение, указанные абсолютные и относительные времена удерживания. Это может произойти из-за отличия объема задержки градиента используемой системы от объема задержки градиента системы, с помощью которой проводилась валидация методики. В нормативном документе часто перед началом программы градиента включена изократическая стадия, чтобы можно было адаптировать систему к временным точкам градиента с учетом разницы объема задержки у системы, использованной для разработки методики, и у фактически использующейся системы. Решение о необходимости адаптации длительности изократической стадии для данного аналитического оборудования принимается пользователем. Если объем задержки, использованный при разработке методики, приведен в нормативном документе, то интервалы времени (t), указанные в таблице градиента, можно заменить адаптированными интервалами времени (tc), рассчитанными с помощью следующего уравнения:

,

где: D — объем задержки, мл;
D0 — объем задержки, использованный при разработке методики, мл; F — скорость потока, мл/мин.

Изократическая стадия, введенная с этой целью, может быть исключена, если имеются данные валидации по применению методики без этой стадии. рН среды водного компонента подвижной фазы. Изменения не допускаются. Концентрация солей в буферном веществе подвижной фазы. Изменения не допускаются. Скорость потока. Изменения допустимы при изменении размеров колонки. Параметры колонки
Неподвижная фаза:
— замена типа неподвижной фазы недопустима (например, недопустима замена C18 на C8); — размер частиц: изменения не допускаются; Размеры колонки
— длина колонки: 70%;
— внутренний диаметр колонки: 25%;
При изменении размеров колонки скорость потока пересчитывают, используя следующее уравнение:

,

где: F1 — скорость потока, указанная в нормативном документе, мл/мин; F2 — скорректированная скорость потока, мл/мин; l1 — длина колонки, указанная в нормативном документе, мм; l2 — длина используемой колонки, мм;
d1 — внутренний диаметр колонки, указанный в нормативном документе мм; d2 — внутренний диаметр используемой колонки, мм.

Температура. 5% от указанной рабочей температуры, если не указано иначе. Длина волны детектора. Изменения не допускаются. Вводимый объем пробы. Может быть уменьшен при условии, что детектирование (предел количественного определения) и сходимость отклика (RSD площадей или высот) для пика (пиков) определяемых соединений остаются удовлетворительными.

Газовая хроматография

Параметры колонки
Неподвижная фаза:
— размер частиц: максимальное уменьшение на 50%, увеличение не допускается (набивные колонки); — толщина пленки: от минус 50% до плюс 100% (капиллярные колонки). Размеры колонки
— Длина колонки: 70%;
— Внутренний диаметр колонки: 50%.
Скорость потока: 50%.
Температура: 10%.
Вводимый объем пробы. Может быть уменьшен при условии, что чувствительность фактически применяемой хроматографической системы и прецизионность системы в условиях повторяемости для определяемых соединений остаются удовлетворительными.

Сверхкритическая флюидная хроматография

Состав подвижной фазы. Для набивных колонок количество растворителя, содержание которого в смеси наименьшее, может изменяться в пределах 30% (относительное содержание) или 2% (абсолютное содержание) в зависимости от того, какая из величин будет больше; для систем с капиллярной колонкой изменения не допускаются. Длина волны детектора. Изменения не допускаются. Параметры колонки
Неподвижная фаза:
— размер частиц: максимальное уменьшение на 50%, увеличение не допускается (набивные колонки). Размер колонки
— Длина колонки: 70%:
— Внутренний диаметр колонки: 25% (набивные колонки), 50% (капиллярные колонки). Скорость потока: 50%.
Температура: 5%, если температура указана в нормативном документе. Вводимый объем пробы. Может быть уменьшен при условии, что чувствительность фактически применяемой хроматографической системы и прецизионность системы в условиях повторяемости для определяемых соединений остаются удовлетворительными.

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Рентгеновская порошковая дифрактометрия ОФС.1.2.1.1.0011.15
Вводится впервые

Рентгеновская порошковая дифрактометрия позволяет качественно и количественно определять различные фазы в их смеси на основе анализа дифракционной картины, создаваемой при облучении исследуемого образца рентгеновскими лучами. Преимуществами данного метода являются высокая достоверность и экспрессность; метод — прямой, так как дает сведения непосредственно о структуре вещества; метод не требует большого количества вещества (не более 0,1 г); анализ можно проводить без разрушения образца; метод позволяет оценить количество фаз в смеси.

МЕТОД

К рентгеновским лучам относят излучение, занимающее участок электромагнитного спектра от нескольких сотен до десятых долей ангстрема () (1 = 0,1 нм). Расстояние между атомами в кристаллической решетке твердых тел колеблется от единиц до полутора десятков ангстрем. Прохождение рентгеновских лучей через вещество сопровождается разными видами взаимодействия, одним из которых является рассеяние рентгеновских лучей. Вещество, которое подвергается действию рентгеновского излучения, испускает вторичное излучение, длина волны которого равна длине волны падающих лучей (когерентное рассеяние). Каждый изолированный атом рассеивает излучение равномерно во все стороны в виде концентрических сфер. Если падающая волна рентгеновского излучения перпендикулярна атомному ряду, то все атомы ряда одновременно излучают электромагнитные колебания. Поскольку расстояние между атомами соизмеримо с длиной волны вторичного когерентного излучения, то кристалл может служить для него дифракционной решеткой. Энергия этого излучения рассеивается в разных направлениях с различной интенсивностью: по одним направлениям усиливается, по другим — ослабляется и даже полностью гасится. Усиление колебаний происходит по тем направлениям, где разность хода рентгеновских лучей равна целому числу волн или четному числу полуволн. Это правило (условие интерференции) справедливо для любого излучения. В результате образуется серия плоских волн, которые распространяются в особых направлениях. Дифрагированный луч можно рассматривать как результат отражения от одной из плоскостей атомной решетки. Любая трехмерная решетка рассматривается как совокупность бесконечного числа параллельных атомных плоскостей, расположенных на равном расстоянии друг от друга. Отражение лучей будет происходить не только от внешней поверхности, а от всех атомных плоскостей (их серий), так как рентгеновский луч, в отличие от оптического излучения, проникает вглубь кристалла. Серия плоскостей характеризуется межплоскостным расстоянием d (рис. 1). Каждая плоскость отражает луч под одним и тем же углом, так как рентгеновские лучи распространяются в веществе практически без преломления. При отражении лучи могут интерферировать в том случае, если их разность хода (АОВ) будет равна целому числу волн ; .

Рисунок 1. Иллюстрация отражения лучей от серии плоскостей атомной решетки

Условие дифракции рентгеновских лучей (уравнение Вульфа — Брэгга) имеет вид:

,

где n — порядок отражения (n = 1, 2, 3).

При выполнении условия Вульфа-Брэгга рентгеновский луч регистрируется детектором или на фотопленке. Интенсивность максимума зарегистрированного луча зависит от количества и типов атомов, составляющих данное семейство плоскостей, то есть от «заселенности» атомной плоскости. Поэтому интенсивность отраженного луча также является характеристикой изучаемого объекта. Широкое распространение из-за простоты и универсальности получил метод порошка (метод Дебая-Шеррера), когда монохроматический пучок рентгеновских лучей направляют на поликристаллический образец. Так как кристаллы, из которых состоит образец, очень малы (микрокристаллы), то в исследуемом объеме образца их оказываются десятки миллионов. Отраженные разными микрокристаллами лучи различной интенсивности фиксируются либо на специальной фотопленке, либо детектором. Рассчитав полученную таким путем рентгенограмму (дифрактограмму), получают сведения о межплоскостных расстояниях в кристалле. Значение межплоскостных расстояний для каждого вещества строго индивидуально, поэтому рентгенограмма (дифрактограмма) однозначно характеризует исследуемое вещество.

ОБОРУДОВАНИЕ

По способу регистрации рентгеновских лучей вся аппаратура делится на два типа. К первому типу относятся приборы с фотографическим методом регистрации рентгеновских лучей на специальной рентгеновской пленке (в данном случае дифракционная картина представляет собой ряд концентрических пар черных полос), ко второму — приборы с ионизационным методом регистрации, при котором рентгеновское излучение регистрируется с помощью различного типа счетчиков (сцинтилляционных, пропорциональных, полупроводниковых). Усиленный сигнал записывается в файл, а совокупность сигналов затем обрабатывается специальной программой. Условия фокусировки при ионизационном методе регистрации рентгеновских лучей таковы, что максимальную светосилу получают при облучении рентгеновским пучком максимально большой поверхности образца. Дифрактометрические методы съемки рентгенограмм отличаются от фотографических тем, что дифракционная картина регистрируется последовательно во времени. Используется счетчик отраженных рентгеновских лучей, который перемещается по окружности таким образом, что угол дифракции 9 при этом непрерывно изменяется. Для получения интенсивных рефлексов на рентгенодифрактограмме необходимо использовать фокусирующие методы съемки, при которых в достаточно узкую щель счетчика попадает рентгеновское излучение, отраженное от образца с относительно большой поверхностью. В дифрактометрах применяется фокусировка лучей от плоского образца по методу Брэгга-Брентано, допускающая вращение образца в собственной плоскости. Образец расположен в центре окружности постоянного радиуса, по которой движется счетчик и на которой находится рентгеновская трубка. При этом образец вращается одновременно со счетчиком таким образом, чтобы поверхность образца все время была касательной к окружности фокусировки, на которой в данный момент находятся фокус рентгеновской трубки, центр образца и входная щель счетчика. Это условие выполняется, если угловая скорость вращения счетчика в 2 раза превышает угловую скорость вращения образца. Следовательно, если образец поворачивается на угол , то угол поворота счетчика будет (рис. 2). Измерение углов поворота осуществляется с помощью гониометра.

Рисунок 2. Принципиальная схема дифрактометра. 1 — источник высокого напряжения; 2 — рентгеновская трубка; 3, 3′ — диафрагмы; 4 — образец; 5 -счетчик квантов; 6 — фотоэлектронный умножитель; 7 — усилитель; 8 — дискриминатор; 9 — пересчетная схема; 10 — управляющий компьютер.

Источником рентгеновского излучения в рентгеноструктурном анализе являются откачанные рентгеновские трубки (с вакуумом 10-5 — 10-6 мм рт. ст.), представляющие собой мощный диод, в котором поток ускоренных, обладающих высокой энергией, электронов бомбардирует материал анода. Зеркало анода изготавливают из металлов, для которых длины волн рентгеновского излучения лежат в пределах от 2,29 до 0,71 (W, Cr, Fe, Cu, Ni, Co, Mo, Ag). Для дифракционных методов исследования органических веществ используют только характеристическое рентгеновское излучение, полученное на основе медных, молибденовых или кобальтовых анодов. Длины волн, используемые в дифракции методом порошка, соответствуют -излучению анода. В качестве фильтра используют либо металлическую пластину (-фильтр, имеющий край полосы поглощения между и длинами волн рентгеновского излучения), либо большой специальный кристалл-монохроматор, преломляющий и линии рентгеновского луча под различными углами. Рентгеновское излучение является опасным для здоровья человека, поэтому необходимо соблюдать рекомендации по мерам предосторожности и пределам уровней воздействия рентгеновского излучения, установленным национальным законодательством.

ПРОВЕРКА ПРИГОДНОСТИ ПРИБОРА (ЮСТИРОВКА)

Оптико-механическая система рентгеновского порошкового дифрактометра требует точной настройки (юстировки) и периодической проверки с использованием сертифицированных стандартных образцов. Минимизация систематических ошибок и оптимизация интенсивности дифрагируемых лучей, регистрируемых детектором, напрямую зависят от точности настройки и определяют качество результатов исследования методом порошковой дифрактометрии. Данную работу должен проводить только высококвалифицированный инженер-специалист.

ПРОБОПОДГОТОВКА

Для получения хороших рентгенограмм для съемки по методу «порошка» необходима тщательная подготовка образцов. Тонко измельченный порошок, который является поликристаллическим телом, набивают в капилляр диаметром 0,5-1 мм или насыпают и фиксируют в углублении специальной кюветы из кварцевого стекла (при съемке в дифрактометре). Для фиксации образца в кювете достаточно простого придавливания: можно применять органические клеи (БФ, цапонлак и т.д.), а также обычные технические масла. Кроме того, порошок можно спрессовать и применить для съемки в виде таблетки диаметром до 25 мм. Важным фактором, определяющим чувствительность метода, является размер кристаллов исследуемого вещества. Поэтому следует обратить внимание на тщательность растирания порошка, так как порошок, состоящий из крупных кристаллов, дает нечеткие, малоинтенсивные рентгенограммы. Растирать порошок следует в агатовой ступке агатовым пестиком (для исключения загрязнения пробы). Оптимальный размер кристаллов составляет около 5-10 мкм. Вместе с тем в некоторых случаях нельзя сильно перетирать пробу, так как сильное воздействие (особенно с давлением) приводит к нарушению кристаллической структуры препарата, появлению напряжений в кристаллах (а значит, к ухудшению качества рентгенограммы). Следует учесть, что в случае, если размер кристаллов менее 0,1 мкм, то интерференционные линии могут быть размыты (уширение полос спектра), и при малом количестве фазы ее линии могут сливаться с фоном.

КАЧЕСТВЕННЫЙ ФАЗОВЫЙ АНАЛИЗ

Качественным фазовым анализом называется установление числа фаз в данной системе и их идентификация. Рентгеновский метод фазового анализа основан на том, что каждое кристаллическое вещество дает специфическую интерференционную картину с определенным количеством, расположением и интенсивностью интерференционных линий, которые определяются природой и расположением атомов в данном веществе. Так как практически не существует двух кристаллических веществ, которые обладали бы одинаковой во всех отношениях кристаллической структурой, то рентгенограмма однозначно характеризует данное вещество. В смеси нескольких веществ каждое из них дает свою картину рентгеновской дифракции независимо от других. Полученная рентгенограмма смеси представляет собой сумму (наложение) ряда рентгенограмм индивидуальных веществ. Идентификация фазового состава образца обычно основана на визуальном или компьютерном сопоставлении его дифрактограммы с экспериментальной или рассчитанной дифрактограммой стандартного образца (сравнивают значения углов и относительные интенсивности пиков). При съемке дифрактограмм с органических веществ обычно используют излучение Си-Кa (интервал значений углов от 4° до 40°). При этом сходимость углов для одной кристаллической формы исследуемого вещества и стандартного образца находится в пределах 0,2°, тогда как относительные интенсивности пиков могут значительно различаться из-за эффектов преимущественной ориентации массы микрокристаллов.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ФАЗОВЫЙ АНАЛИЗ

Количественный рентгеновский фазовый анализ основан на зависимости интенсивности дифракционных отражений от содержания фазы в исследуемом многофазном поликристаллическом образце — интенсивность линии пропорциональна объемной доле данного компонента. Однако даже при одинаковом содержании определяемой фазы интенсивность дифракционного отражения будет меняться в зависимости от величины среднего коэффициента поглощения рентгеновских лучей в образце. Поэтому необходимо либо найти эту зависимость и определить коэффициент поглощения образца, либо использовать методы, позволяющие устранить влияние фактора поглощения. Известно несколько методов количественного фазового анализа: — метод подмешивания (метод стандартных добавок) основан на сравнении интенсивностей линий на дифрактограмме, принадлежащих определяемой фазе, с интенсивностями линий для стандартного образца, количество которого в смеси заранее задано; — метод независимого стандартного образца, при котором последовательно проводят съемку испытуемого вещества и стандартного образца — «метод внешнего стандарта» (наиболее распространенный метод); — метод гомологических пар — получение серии рентгенограмм смесей и нахождение на них линий различных фаз одинаковой интенсивности; — метод наложения состоит в сравнении рентгенограмм исследуемого образца и рентгенограмм отдельных составляющих в чистом виде; — метод съемки без стандартного образца основан на том, что интенсивность линий на рентгенограммах фаз пропорциональна объемному содержанию фазы, и измеряя абсолютную интенсивность линий каждой фазы на рентгенограмме или отношение интенсивностей линий различных фаз, можно определить концентрацию каждой фазы.

ПОЛИМОРФНЫЕ ОБРАЗЦЫ

В качестве стандартного образца (метод стандартных добавок) применяют вещество, коэффициент поглощения которого должен быть близким к коэффициенту поглощения определяемой фазы; исследуемая фаза и стандартный образец должны быть достаточно измельчены и тщательно перемешаны. Вещество, выбираемое в качестве стандартного, должно удовлетворять следующему требованию: давать интенсивные и резкие линии на рентгенограмме, в том числе интенсивную линию вблизи самой интенсивной линии определяемого компонента. Расчет количества фазы (Fa) в случае смеси двух полиморфных фаз (а, b) проводят по уравнению:

,

где К — отношение абсолютных интенсивностей двух чистых полиморфных фаз Ib/Ia, которое определяется измерением интенсивностей стандартных образцов.

Рентгенографический метод позволяет определить не только содержание кристаллической, но и аморфной фазы. Содержание аморфной фазы определяют либо по разности единицы и всех кристаллических фаз (в долях), либо независимым способом. При втором способе учитывают, что интенсивность когерентного рассеяния рентгеновского излучения аморфной фазы пропорциональна ее содержанию. Кривая рассеяния на рентгенограмме образца имеет один или несколько пологих максимумов, обычно в области небольших углов рассеяния. При определении содержания аморфной фазы (Сa) с помощью эталонов используют соотношение:

,

где: , — интенсивности рассеяния полностью аморфным (эталон) и исследуемым образцами под некоторым фиксированным углом ;

Более точной мерой интенсивности рассеяния аморфной фазой служит интегральная интенсивность одного или нескольких максимумов. Безэталонный метод основан на выделении средней интенсивности рассеяния рентгеновского излучения аморфной фазой из средней интенсивности рассеяния образца . Содержание аморфной фазы определяют по формуле:

.

Оба метода используют только для сравнительной оценки доли аморфной фазы (Сa). Основным недостатком является влияние изменений состава образца на результат определения.

ПРИМЕНЕНИЕ РЕНТГЕНОВСКОЙ ПОРОШКОВОЙ
ДИФРАКТОМЕТРИИ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

Метод дифракции рентгеновских лучей на порошковом образце является инструментом для исследования поликристаллических субстанций лекарственных веществ. Несмотря на то что рентгеноструктурный анализ монокристалла обеспечивает реальное понимание кристаллической структуры, использование такого метода для рутинных исследований кристалличности фармацевтических субстанций затруднено вследствие длительности (необходимость вырастить монокристалл) процедуры и трудоемкости. Для общей оценки качества и структуры вещества обычно достаточно установить его полиморфную форму и идентичность. Типичным применением метода рентгеновской порошковой дифрактометрии является оценка полиморфизма, сольватоморфизма, изучение переходов состояний «кристаллическое — аморфное» и оценка степени кристалличности, которую определяют с помощью калибровки. В этом случае необходимо иметь в качестве эталонов чистые вещества: 100% кристаллическое и 100% аморфное. Техника рентгеновской порошковой дифрактометрии — быстрый метод получения фундаментальной информации о кристаллической решетке вещества, поэтому его часто применяют для определения подлинности фармацевтических субстанций лекарственных препаратов, полученных в виде кристаллических порошков. Вследствие простоты и информативности метод рентгеновской порошковой дифрактометрии используют также для контроля степени кристалличности отдельных партий субстанций лекарственных веществ.

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Рентгеновская флуоресцентная спектрометрия ОФС.1.2.1.1.0010.15
Вводится впервые

Рентгеновская флуоресцентная спектрометрия — метод анализа, используемый для определения концентраций элементов от бериллия (N 4) до урана (N 92) в диапазоне от долей ppm до 100% в веществах и материалах различного происхождения. Погрешность рентгенофлуоресцентного анализа варьируется в пределах 0,2-3%.

Метод

Метод основан на зависимости интенсивности рентгеновской флуоресценции от концентрации элемента в образце. При облучении образца потоком рентгеновского излучения возникает характеристическое флуоресцентное излучение, которое пропорционально концентрации элемента в образце. Излучение разлагается в спектр при помощи кристалл-анализаторов, далее с помощью детекторов и счетной электроники измеряется его интенсивность. Математическая обработка спектра позволяет проводить количественный и качественный анализ. При облучении атомов образца фотонами с высокой энергией первичным рентгеновским излучением от рентгеновской трубки атомы переходят в возбужденное состояние, но спустя доли секунды возвращаются к стабильному (основному) состоянию. Такой переход электронов сопровождается испусканием энергии в виде вторичного фотона с возникновением флуоресценции. Энергия вторичного фотона находится в диапазоне энергий рентгеновского излучения, которое располагается в спектре электромагнитных колебании между ультрафиолетом и гамма-излучением. Рентгенофлуоресцентный анализ охватывает следующие диапазоны энергий и длин волн: Е = 0,11 — 60 кэВ, = 11,30 — 0,02 нм.
Разница энергии между энергетическими уровнями и частота колебаний поглощенного кванта соотносятся между собой уравнением:

Е = Е1 — Е2 = hv = hc /,

где: Е1 и Е2 — энергии орбиталей, между которыми произошел переход электрона, эВ; h — постоянная Планка (6,626 · 10-34 Дж · с); с — скорость света, с;

Длина волны флуоресценции является индивидуальной характеристикой каждого элемента и называется характеристической флуоресценцией. В то же время интенсивность (число квантов, поступающих за единицу времени) пропорциональна концентрации (количеству атомов) соответствующего элемента. Это позволяет проводить количественный элементный анализ вещества. В качестве единицы измерения интенсивности используется величина, равная числу рентгеновских квантов, измеренных за секунду, имп/с (количество импульсов за секунду) или кимп/с (количество килоимпульсов за секунду). Существуют два метода регистрации рентгеновской флуоресценции: волнодисперсионная и энергодисперсионная.

Качественный анализ

При прохождении рентгеновского излучения через образец происходит ослабление его интенсивности. Степень ослабления зависит как от энергии излучения, так и от химического состава поглощающего образца. Удельной характеристикой поглощения элемента является массовый коэффициент ослабления (), связанный с плотностью [г/см3] поглощающего материала и линейным коэффициентом поглощения [1/см]:

.

Коэффициент имеет размерность [см2/г]. Он зависит лишь от атомного номера поглощающего элемента и от энергии поглощаемых рентгеновских квантов. Рассчитывают по справочным значениям массовых коэффициентов ослабления элементов по известной формуле исследуемого образца. В случае неизвестного элементного состава измеряют интенсивность комптоновского рассеяния IU и рассчитывают величину по уравнению:

,

где а и b — угловые коэффициенты калибровочной кривой.

Количественный анализ

Для определения концентрации элемента в образце измеряют скорость счета для нескольких стандартных образцов, содержащих известные количества данного элемента в матрицах определенного состава, и рассчитывают или измеряют массовый коэффициент ослабления матрицы анализируемого образца. Калибровка. С целью точной оценки состава образца необходимо установить зависимость между измеренной интенсивностью линии и концентрацией соответствующего элемента в образце. При анализе водных растворов и сложных по составу образцов для калибровки применяют метод разбавления (прямой способ внешнего стандарта) добавлением к изучаемому образцу больших количеств слабого поглотителя или малых количеств сильного поглотителя. На графике зависимости определяют наклон калибровочной кривой b0 по уравнению:

,

где: — рассчитанный или измеренный массовый коэффициент ослабления матрицы М;

Определение суммарной интенсивности элемента в образце. Интенсивность флуоресценции, например, Кa-элемента, (NKa) пропорциональна числу квантов, поглощенных K-уровнем, и выходу флуоресценции для K-серии. Рассчитывают суммарную интенсивность излучения () определяемого элемента по измеренным интенсивностям флуоресцентной и фоновой линий, в предположении наличия в образце посторонних примесей. Определение следовых количеств элемента. Для разбавленных растворов, если концентрация элемента находится в линейной части калибровочной кривой, методом рентгенофлуоресцентного анализа можно рассчитать концентрацию (С) по уравнению:

,

где f — коэффициент разбавления.

Оборудование

Приборы рентгенофлуоресцентного анализа состоят из рентгеновского источника, держателя пробы и спектрометра. Спектрометр измеряет длину волны () или энергию (Е) и интенсивность флуоресцентного излучения, испускаемого пробой. В зависимости от параметра, непосредственно измеряемого спектрометром ( или Е), различают приборы с волновой и энергетической дисперсией, устройство которых принципиально различно. Рентгеновские источники, используемые для возбуждения атомов в пробе, как правило, не имеют принципиальных отличий в приборах с волновой и энергетической дисперсией. Наиболее широко используемым источником первичного рентгеновского излучения являются рентгеновские трубки. Волнодисперсионные спектрометры. Для разложения излучения в спектр (выделения различных длин волн) в волнодисперсионном методе используют разные кристаллы-анализаторы с кристаллическими плоскостями, параллельными поверхности и имеющими межплоскостное расстояние d. Для волнодисперсионных спектрометров существуют разные типы детекторов. Для относительно больших длин волн при анализе легких элементов используются газонаполненные пропорциональные детекторы (проточные и запаянные). Их действие основано на ионизации газа излучением и измерении числа электрических импульсов, прошедших через ионизированный газ. Для коротких длин волн (соответствуют тяжелым элементам) применяются сцинтилляционные детекторы, в которых измеряется ток фотоэлемента, чувствительного к светимости специального вещества — сцинтиллятора (NaI/Tl) при попадании на него рентгеновского излучения. Количество регистрируемых импульсов прямо пропорционально содержанию элемента в пробе. Многоэлементный анализ для фиксированного набора элементов на спектрометре с волновой дисперсией можно выполнить за несколько минут. Энергодисперсионные спектрометры. В энергодисперсионных спектрометрах диапазон энергий вторичного (характеристического) излучения от пробы регистрируется в один этап. Спектр представляет зависимость интенсивности пиков от энергий излучения элементов. Выделенное излучение поступает в детектор рентгеновского излучения для измерения его интенсивности. Детектирование флуоресцентного излучения основано на преобразовании энергии квантов флуоресцентного излучения в импульсы напряжения определенной амплитуды. Для детектирования флуоресцентного излучения используются полупроводниковые твердотельные детекторы, действие которых основано на ионизации внутри полупроводника. Полупроводниковый детектор изготавливается из Si или Ge. Энергодисперсионный метод обладает крайне высокой чувствительностью и экспрессностью, что позволяет определять в образцах элементы от натрия (Na) до урана (U), получать рентгенограммы в проходящих лучах, проводить двумерное и трехмерное картирование образцов по содержанию тех или иных элементов.

Пробоподготовка

Для уменьшения ошибки анализа, связанной с пробоподготовкой, образцы должны быть гомогенизированы. Твердые образцы подготавливают следующим образом: а) тщательно растирают стандарт и образцы в ступке по отдельности; б) берут одинаковые навески.
Для уменьшения эффектов поглощения и возбуждения, искривляющих калибровочные графики, анализируемую пробу разбавляют прозрачным для рентгеновских лучей веществом (полистирол, борная кислота, крахмал, алюминия гидроксид, вода и т.д.). Степень разбавления определяют экспериментально. Порошкообразную пробу с равномерно распределенным разбавителем и внутренним стандартом брикетируют или растворяют. Толщина брикета (таблетки) должна быть достаточно большой (около 1-2 мм), чтобы интенсивность излучения образца не зависела от величины навески. Если критическая толщина не достигнута, то интенсивность флуоресценции зависит от толщины образца, вследствие чего возникают ошибки измерения. Оценить критическую толщину образца можно по формуле:

,

где: d — критическая толщина образца (см), ниже которой интенсивность флуоресценции зависит от толщины;

Приготовленные брикеты (таблетки) пригодны для многократных измерений. Испытуемое вещество может быть помещено в виде порошка непосредственно в кюветы прибора. Порошок образца может быть помещен в держатель из плексигласа и запрессован под полимерной пленкой или нанесен на клейкую пленку. Для уменьшения погрешности пробоподготовки следует прессовать образцы.

Exit mobile version