УТВЕРЖДЕНЫ
Начальником Управления
по внедрению новых
лекарственных средств
и медицинской техники
Э.А.БАБАЯНОМ
27 ноября 1985 года
Вводятся взамен утвержденных
24 августа 1977 года
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
К ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ И ИЗДЕЛИЙ ДЛЯ ЭНДОПРОТЕЗИРОВАНИЯ
Настоящие Методические указания распространяются на следующие материалы для имплантации: — стабильные (материалы для изготовления протезов различных внутренних органов, элементов опорно-двигательного аппарата, оболочек имплантируемых деталей стимуляторов внутренних органов); — биодеградирующие (соединительные элементы для внутренних органов, пластики тканей организма, штифты для остеосинтеза). Методические указания не распространяются на протезы кровеносных сосудов, клапанов сердца, имплантируемые катетеры, а также протезы стоматологического назначения.
- ГИГИЕНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ К МАТЕРИАЛАМ И ИЗДЕЛИЯМ, ИМПЛАНТИРУЕМЫМ В ОРГАНИЗМ
1.1. Полимерные материалы и изделия, имплантируемые в организм, не должны оказывать общетоксическое, аллергенное и местное раздражающее действие на ткани и вызывать отдаленные неблагоприятные последствия (канцерогенное, мутагенное, тератогенное, эмбриотоксическое действие и др.). 1.2. Изделия не должны оказывать токсического действия после стерилизации.
2. ЭТАПЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
2.1. Санитарно-химические исследования. 2.2. Токсикологические исследования:
— исследование реакции окружающей ткани, в том числе бластомогенного действия, на имплантат; — изучение общетоксического действия полимерного материала; — изучение биосовместимости образцов материала методами клеточной иммунологии.
3. САНИТАРНО-ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Условия приготовления вытяжек. Исследуемые вытяжки из изучаемых материалов готовят путем настаивания последних в дистиллированной воде при температуре, равной 70 град. C +/- 1,0 град. C. Соотношение между весом испытуемого материала и объемом модельной среды рассчитывается по формуле:
M - x K, V
где:
M — максимально возможное количество имплантируемого материала; V — объем крови в организме человека (5 л); K — коэффициент аггравации, равный 10.
Экспозиция вытяжек определяется продолжительностью контакта с организмом и может колебаться от 24 до 30 суток (в случае пожизненного ношения протеза). Режим приготовления вытяжек динамичный: на каждом сроке вытяжки сливаются и анализируются. Тот же образец материала заливается новой порцией модельной среды. 3.2. Химический анализ вытяжки.
3.2.1. Исследование вытяжек интегральными методами (определение окисляемости, бромируемости и pH среды). 3.2.2. Качественное и количественное определение мигрирующих в модельную среду компонентов композиции, остаточных количеств химических соединений, используемых в технологическом процессе синтеза некоторых композиций и изготовлении изделия, а также стерилизующих агентов, указаны в табл. 1.
Таблица 1
Материалы Исходные продукты Технологические Основные добавки химические соединения, подлежащие определению Нити полиэфирные Диметиловый эфир Дигликоль- Формальдегид терефталевой к-ты, терефталат, этиленгликоль метанол Полиамид (капрон) Капролактам, соль АГ Капролактам, (соль гексаметилен- гексаметилен- диамина и адипиновой диамин кислоты) Полипропилен Полипропилен Формальдегид Пропилен, (гранулы) формальдегид Полифен Тетрафторэтилен ОП-7, сульфат Ацетальдегид поливиниловый спирт аммония, сульфат цинка Полиметилмета- Метилметакрилат Метилметакрилат
крилат
Сополимер Винилпирролидон, Парафор 4А-4С Винилпирролидон, винилпирролидона Метилметакрилат Метилметакрилат
и метилметакрилата
Результаты позволяют получить информацию о стабильности полимерного материала или об интенсивности процессов деструкции. В случае если композиция изготавливается из новых компонентов или с использованием технологических добавок, не указанных в табл. 1, они подлежат определению с привлечением чувствительных и селективных методов физико-химического и химического анализа. 3.3. Оценка результатов санитарно-химических исследований. В случае обнаружения миграции в модельную среду веществ с известной токсикологической характеристикой в количествах выше порога хронического действия при пероральном введении (или выше ДКМ веществ, мигрирующих из пластмасс, контактирующих с пищевыми продуктами, если таковые известны) делается вывод о несоответствии изделия гигиеническим требованиям. Дальнейшее исследование его не проводится. При обнаружении уровня миграции ниже порога хронического действия вещества (или ниже ДКМ) либо при отсутствии достаточных данных о характере биологического действия веществ, мигрирующих в модельную среду, проводятся токсикологические исследования.
4. ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
4.1. Исследование реакции окружающей ткани на имплантат, в том числе бластомогенного действия
Для изучения тканевой реакции образец материала или изделия имплантируется внутримышечно в области бедра: исследуется местное действие полимерного материала с учетом возможного наличия бластомогенных свойств. Количество животных должно быть не менее 120, предпочтительно самцов одной разводки или равное число самцов и самок. Половине животных образец имплантируется в виде порошка, другой половине в виде пластины (или нескольких) соответствующего веса (см. п. 4.2.). Контрольным животным того же пола и в тех же условиях имплантируется фторопласт-4 того же веса и вида; имплантируемые образцы не должны иметь острых, травмирующих прилегающие ткани краев. Продолжительность эксперимента должна быть не менее 1 года 8 месяцев. К концу эксперимента в каждой из двух групп должно сохраниться не менее 30 животных. Сроки исследования: 3, 7, 14, 21 сутки, 1, 2, 4, 6, 9 месяцев, 1 год и 1 год 8 месяцев. На каждом сроке опыта забивают не менее трех животных как опытных, так и контрольных. Все животные на всех сроках эксперимента подвергаются патолого-анатомическому вскрытию с макроскопическим обследованием тканей вокруг образца и последующим гистологическим и гистохимическим их исследованием. При вскрытии животных обращается внимание на состояние окружающей имплантат ткани, форму, величину, консистенцию имплантированного материала, характер связи его с прилежащей тканью. Для дальнейшего исследования имплантат иссекают вместе с окружающей тканью, из которой готовятся гистологические микропрепараты. Микропрепараты окрашиваются гематоксилин-эозином по Ван-Гизону, имплантируются серебром по Футу, на жир — Суданом III, на гликоген по Шабадашу, на железо по Перлсу, на РНК по Браше, на мукополисахариды — метахроматической окраской толуидиновым синим. При микроскопическом исследовании в случае стабильных полимеров имеют значение выраженность и продолжительность асептического воспаления в окружающих тканях, стихающего между 1-й и 2-й неделями. Важным моментом являются толщина капсулы, ее клеточный состав, особенно количество лейкоцитов, сроки формирования и созревания капсулы, заканчивающегося приблизительно к первому месяцу. Нарушение процессов коллагенообразования и дифференцировки фибробластов, особенно на поздних сроках, может являться одним из показателей нарушения нормального развития капсулы. При исследовании биодеградабильного имплантированного полимера обращают внимание на степень и продолжительность асептического воспаления (отек, полнокровие, кровоизлияние, стазы, дистрофические изменения, лейкоцитарная инфильтрация), возникающего сразу после введения полимера и стихающего к 21 суткам. Особенно важны наличие, количество макрофагов и многоядерных гигантских клеток, ответственных за процесс рассасывания полимера, появляющихся на второй неделе или несколько раньше и присутствующих до окончательного его рассасывания. О фагоцитарной активности данных клеток позволяет судить гистохимическая реакция на кислую фосфатазу, являющуюся маркером лизосомального аппарата. Для выявления в них фагоцитированных фрагментов полимера, зачастую невидимых в проходящем свете, рекомендуется применять поляризационную микроскопию. О начале возникновения и путях формирования и созревания соединительных тканей вокруг имплантата судят по гистохимической реакции на кислые и нейтральные мукополисахариды, а о степени васкуляризации их — по реакции на щелочную фосфатазу. Обнаружение таких морфологических изменений, как мононуклеарная инфильтрация, бласттрансформация лимфоцитов, служит основанием для проведения специфической аллергодиагностики. Внутренние органы животных на всех указанных выше сроках подвергаются микроскопическому исследованию с целью динамического изучения возможных морфологических изменений в них.
4.2. Изучение общетоксического действия полимерного материала
Образцы материала имплантируют половозрелым белым крысам численностью не менее 10 голов в группе под нембуталовым наркозом (доза нембутала — 40,0 мг/кг) в ткани, с которыми материал будет иметь контакт при эксплуатации его в реальных условиях, или внутримышечно. Изучению подлежит такое количество материала, которое рассчитано по формуле:
M - x K, P
где:
M — максимальное количество материала (в граммах), имплантируемое человеку; P — вес тела человека (70 кг);
K — коэффициент аггравации, равный 20.
Контрольным животным того же пола, возраста и в тех же условиях производится операция без имплантации инородного тела (для стабильных полимеров с введением образцов фторопласта). Продолжительность эксперимента обуславливается сроком пребывания материалов в организме. При имплантации биодеградирующего материала период наблюдения за животными соответствует предполагаемому сроку деструкции материала или изделия. Контроль за процессом деструкции осуществляется при поэтапном забое животных и изучении соотношения имплантата и окружающих его тканей с помощью морфологических и гистохимических методов в соответствии с п. 4.1. Обследование животных проводится перед операцией, через две недели после имплантации и далее один раз в один или два месяца на протяжении рассчитанного периода исследования. У животных как обязательный минимум исследуются общее состояние и поведение, динамика веса тела, состояние центральной нервной системы (изучение условно-рефлекторной деятельности или определение способности суммировать подпороговые импульсы), морфологический состав периферической крови с подсчетом лейкоцитарной формулы, белково- и ферментообразующая и дезинтоксикационная функция печени (определение общего белка и соотношение белковых фракций сыворотки крови, определение количества бета-липопротеидов в сыворотке крови, изучение активности холинэстеразы, трансаминаз), содержание гистамина в крови, состояние окислительных процессов в организме. Функциональное состояние почек оценивается по величине спонтанного диуреза, концентрации белка в моче и выделению почками красителя фенола красного. Обязательными в хроническом эксперименте являются функциональные нагрузки (бромсульфалеином, гексанолом, нембуталом, спиртовая, изменение режима питания, холодовая, ортостатическая и др.). В ходе токсикологического эксперимента следует обращать внимание на такие неспецифические показатели, как изменение состояния форменных элементов крови (эозинофилия, лимфоцитоз, базо- и моноцитопения, тромбоцитопения), увеличение биогенных аминов и т.д., которые могут ориентировать исследователя в плане возможных аллергенных свойств изучаемого полимера и являться обоснованием для проведения аллергологического исследования. По окончании эксперимента проводят забой животных способом декапитации. Патолого-анатомическому вскрытию подлежат все животные, участвовавшие в эксперименте, а также контрольные. Морфологически исследуются внутренние органы (печень, почки, сердце, селезенка, надпочечники, органы воспроизведения, легкие). При выявлении у большинства опытных животных достоверных отличий от исходных величин и от контроля изучаемых показателей эксперимент может быть прекращен до окончания рассчитанного срока наблюдения за животными. Материал в этом случае не может быть рекомендован к использованию в клинике.
4.3. Изучение биосовместимости образцов материала методами клеточной иммунологии
Исследование и оценка результатов проводятся в соответствии с «Методикой определения биосовместимости полимерных материалов и изделий для эндопротезирования».
5. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Вывод о возможности (или невозможности) применения изучаемого в эксперименте материала в клинической практике делается на основании сопоставления результатов всех разделов исследования. Результаты санитарно-химического изучения полимерного материала позволяют обосновать лишь отрицательное гигиеническое заключение. Основополагающей информацией, на которую следует ориентироваться, являются сведения о действии материала на организм, полученные в хроническом эксперименте, поскольку в этом случае условия изучения токсических свойств его наиболее близки к реальным, клиническим. Полимерный материал или изделие считается нетоксичным, если он не вызывает статистически достоверные изменения изучаемых функций на протяжении эксперимента; применение нагрузочных проб не вызывает срыва компенсаторных механизмов: не обнаруживаются патологические изменения в формировании капсулы вокруг имплантата, не обнаруживаются патогистологические изменения во внутренних органах. Материал считается токсичным, если из него в модельную среду мигрируют химические соединения в количествах, превышающих порог хронического действия веществ при пероральном введении или выше ДКМ для пищевых пластмасс, если таковые известны. Аналогичный вывод делается при обнаружении статистически достоверных изменений (р < 0,05 при Т - 2,1) результатов количественных определений, наличия изменений поведенческих реакций животных, а также патоморфологических изменений в формировании капсулы вокруг имплантата, а также во внутренних органах. Оценку результатов при выявлении признаков бластомогенного действия следует проводить согласно "Методическому письму по исследованию бластомогенных (канцерогенных) свойств различных веществ в опытах на животных" N 819-69, утвержденному Главным санитарным врачом СССР, зам. министра здравоохранения СССР 16 июля 1969 г., раздел 1, п. 5 (А, Б, В). В случае положительной оценки изучаемого материала рецептура композиции, а также количества его, вводимые в организм, строго регламентируются. Такой материал может быть использован в клинике в конкретных условиях эксплуатации.
