ПОСТОЯННЫЙ КОМИТЕТ ПО КОНТРОЛЮ НАРКОТИКОВ
УТВЕРЖДЕНЫ
Постоянным комитетом
по контролю наркотиков
18 августа 1994 г.,
Протокол N 32
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
КРИМИНАЛИСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОПИЙНОГО И МАСЛИЧНОГО МАКОВ <>
<> Разработчики: А.В.Гаевский, Е.В.Коваленко (НПО «ВИЛАР»), В.Г.Савенко, Е.П.Семкин, В.И.Сорокин (ЭКЦ МВД РФ).
МЕТОДИКА ЭКСПЕРТНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Принцип химической диагностики снотворного мака основан на обнаружении с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле алкалоидов наркотолина, наркотина и ретикулина: — при наличии наркотолина либо при полном отсутствии наркотина и наркотолина образец относят к маку масличному; — при наличии значительного количества наркотина (более 15-20% от морфина) и полном отсутствии наркотолина образец относят к маку опийному; — при наличии ретикулина образец относят к украинским сортам масличного мака. (Этот признак используется в качестве дополнительного.) Для обнаружения наркотолина, ретикулина и других фенольных алкалоидов мака снотворного авторами разработан способ проявления хроматографических пластинок раствором стабилизированной соли диазония — прочного синего Б, ранее применявшийся только для обнаружения каннабиноидов. Этот способ существенно повышает чувствительность и селективность анализа и в сочетании с реактивом Драгендорфа позволяет однозначно идентифицировать наркотолин и ретикулин без применения эталонных веществ. Правомочность применения предлагаемого принципа химической диагностики и его методического решения подтверждена в процессе серийной оценки образцов мировой коллекции мака, а также местных форм из различных районов страны. Предлагаемая методика анализа образцов мака состоит из этапов: экстракции алкалоидов хлороформом, количественного (или полуколичественного) определения морфина любым общепринятым методом и последующего обнаружения сопутствующих морфину алкалоидов (наркотолина, наркотина, ретикулина) с помощью тонкослойной хроматографии. Перед началом исследования необходимо выяснить, относится ли представленное на исследование растение к маку снотворному. Для этого методом тонкослойной хроматографии определяют наличие в исследуемом объекте морфина, кодеина, тебаина. Наличие этого комплекса признаков позволяет отнести растение к маку снотворному. Подготовка проб для анализа. Исследуемый объект измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Влажную солому мака предварительно высушивают в сушильном шкафу (желательно с принудительной вентиляцией) при температуре 50-60 град. C. Затем 2 г измельченной растительной массы помещают в коническую колбу вместимостью 200 мл с пришлифованной пробкой, приливают 5,0 мл 5% раствора карбоната калия, тщательно перемешивают до равномерного увлажнения и оставляют на 15 мин. для набухания, после чего приливают 100 мл хлороформа, колбу закрывают пробкой и в течение 30 мин. встряхивают на качалке или перемешивают магнитной мешалкой. Прилипшие к стенкам колбы растительные частицы периодически погружают в раствор стеклянной палочкой с плоским концом. Полученный экстракт фильтруют через небольшой ватный фильтр в плоскодонную колбу. Первые 3-4 мл фильтрата отбрасывают. Порцию фильтрата объемом 20 мл, что соответствует 0,4 г сырья, переносят в маленькую круглодонную колбу и отгоняют растворитель досуха с вакуумом при температуре водяной бани 45-50 град. C. Эту пробу используют для проведения дифференциации: 40 мл фильтрата используют для количественного определения морфина. Методика определения. Перед началом определения необходимо установить содержание морфина в растительном сырье. Для этого можно применять любой из известных методов: газохроматографический, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, метод полуколичественного определения морфина. С этой целью две порции хлороформного экстракта из соломы мака объемом по 10 мл (что соответствует 0,2 г сырья) помещают в круглодонные колбы и отгоняют растворитель досуха. Сухой остаток в одной колбе растворяют в 5 мл метанола (хлороформа), во второй — в 2,5 мл. На стартовую линию пластинки размером 10 x 10 см с нейтральным слоем силикагеля наносят приготовленные растворы в количествах, указанных в табл. 1. Диаметр пятен на старте при нанесении не должен превышать 3 мм. Для каждого разведения наносят не менее двух серий пятен. После полного высыхания пятен пластинку хроматографируют в смеси растворителей толуол — ацетон — этанол — аммиак (25%) (45:45:6:2), затем высушивают под тягой в течение 30-40 мин. до полного исчезновения запаха аммиака. Пластинку опрыскивают реактивом Драгендорфа и отмечают минимальные объемы нанесенных на пластинку проб, при которых четко проявляются пятна морфина. По табл. 1 находят соответствующее содержание морфина в образце (в процентах).
Таблица 1
Содержание морфина в растительном сырье в зависимости от объема нанесенного экстракта
Количество раствора на пластинке, Содержание морфина в сырье, %
мкл
Разведение 5 мл
2,5 1,00 3,0 0,80 3,5 0,70 4,0 0,60 4,5 0,55 5,0 0,50
Разведение 2,5 мл
2,5 0,50 3,0 0,40 3,5 0,35 4,0 0,30 5,0 0,25 6,0 0,20 8,0 0,15 12,0 0,10
Если при различном разведении пробы или разных повторностях на пластинках будут получены разные показатели содержания морфина в образце, результаты усредняют. После получения показателей содержания морфина пробу, предназначенную для обнаружения наркотина, наркотолина и ретикулина, растворяют в различных объемах смеси метанола с хлороформом (3:1) либо в чистом хлороформе. Объем растворителя выбирается в зависимости от содержания морфина в испытуемом образце (табл. 2). Полученные растворы наносят на пластинки в количестве, указанном в той же таблице.
Таблица 2
Объем пробы, необходимой для нанесения на хроматографическую пластину, в зависимости от содержания морфина в растительном сырье
Содержание Объем морфина в образце, % для растворения сухого для нанесения на пластинку,
остатка, мл мкл
наркотолин, ретикулин наркотолин, ретикулин наркотин наркотин 0,1 1,0 0,5 8,8 12,0 0,15 5,8 9,0 0,20 2,0 1,0 8,8 12,0 0,25 7,0 10,0 0,30 5,8 9,0 0,35 4,0 2,0 10,0 15,0 0,40 8,8 12,0 0,45 7,8 11,0 0,50 7,7 11,0 0,55 6,0 3,0 9,6 15,0 0,60 8,8 12,0 0,65 8,1 12,0 0,70 7,5 11,0 0,75 7,0 10,5 0,80 6,0 9,0
Объем пробы и разведение выбраны с таким расчетом, чтобы наркотин проявлялся только при содержании более 20% от морфина. Для обнаружения наркотолина и наркотина на стартовую линию хроматографической пластинки с нейтральным слоем силикагеля наносят три порции исследуемого извлечения, а также 0,01 мл раствора стандартных образцов алкалоидов, как указано на схеме (рис. 1).
Рис. 1. Хроматограмма экстракта маковой соломы
() () 6 () () 5 () () () 4 () () 3 () () 2 () () () () () () 1 () () () а б в г д е
Система толуол — ацетон — этанол — аммиак (25%) (45:45:6:2). Пластинки многоразовые полимерные «Сорбил» или стеклянные производства различных фирм: 1 — морфин, 2 — кодеин, 3 — тебаин, 4 — наркотолин, 5 — папаверин, 6 — наркотин; а, в, д — испытуемые растворы; б, г, е — растворы стандартных образцов.
Пятна подсушивают в токе холодного воздуха, после чего пластинку хроматографируют восходящим способом в системе растворителей толуол — ацетон — этанол — аммиак (25%) (45:45:6:2). После прохождения фронта растворителя до конца пластинки ее сушат под тягой в течение 20 мин., закрывают стеклом зону «д-е», а оставшуюся часть опрыскивают свежеприготовленным 0,1% водным раствором прочного синего Б. Все проявленные пятна обводят карандашом и немедленно записывают их окраску. Через 15 мин. отмечают возможные изменения окраски пятен, закрывают стеклом зону «а-б», зону «д-е» открывают и опрыскивают пластинку концентрированным реактивом Драгендорфа. Все проявленные пятна обводят карандашом и фиксируют изменение окраски пятен ранее обнаруженных веществ. На хроматограммах «а» и «в» могут проявиться пятна наркотолина с величиной Rf, около 0,64. Окраска наркотолина с прочным синим Б вначале фиолетовая, а после проявления реактивом Драгендорфа — синяя. Остальные пятна на хроматограмме «в» после проявления реактивом Драгендорфа сливаются с фоном. На хроматограмме «д» небольшое пятно наркотолина располагается непосредственно под пятном папаверина. Наличие четкого пятна наркотолина позволяет отнести объект к масличному маку. Если наркотолин в образце не найден, то отмечают присутствие наркотина. Если наркотин в пробе не обнаружен, объект относят к масличному маку. При четком обнаружении наркотина и полном отсутствии наркотолина образец относят к опийному маку. Обнаружение ретикулина (проводится для отнесения образца к украинским сортам мака масличного, если в этом есть необходимость). На пластинку с нейтральным слоем сорбента наносят две порции извлечения, пятна подсушивают в токе холодного воздуха, а затем хромотографируют в системе хлороформ — изопропанол — аммиак (25%) (30:10:0,8). После окончания хроматографирования пластинку сушат в течение 30 мин., хроматограммы зоны «а-б» закрывают стеклом и опрыскивают 0,5% спиртовым раствором едкого натра, а затем 0,1% спиртовым раствором прочного синего Б. Затем стеклом закрывают хроматограммы зоны «в-г», хроматограммы зоны «а-б» открывают и опрыскивают пластинку реактивом Драгендорфа. Зона ретикулина располагается между зонами морфина и кодеина. Остальные алкалоиды выходят выше кодеина (рис. 2).
Рис. 2. Хроматограмма экстракта маковой соломы
() () } () () } () } 4 () } () () 3 () () 2 () () () () 1 () () а б в г
Система хлороформ — изопропанол — аммиак (25%) (30:10:0,8). Пластинки многоразовые, стеклянные производства различных фирм: 1 — морфин, 2 — ретикулин, 3 — кодеин, 4 — остальные алкалоиды опия; а, в — испытуемые растворы; б, г — растворы стандартных образцов. Следует отметить, что для хроматографирования согласно вышеизложенной методике должны применяться пластины, не содержащие в качестве связующего крахмал, т.е. не темнеющие при опрыскивании реактивом Драгендорфа. Этим условиям отвечают стеклянные пластины, производимые в Эстонии, пластины Merck 60 и 25 и отечественные пластинки «Сорбфил» на стеклянной или полимерной основе.
ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ И ФОРМИРОВАНИЕ ВЫВОДОВ
С целью полного расследования и правильной квалификации правонарушений, связанных с посевом и выращиванием наркотикосодержащих растений, на разрешение экспертизы ставится вопрос: к какому виду относится произраставшее на участке (указывается место изъятия) растение и является ли оно наркотикосодержащим? Для полного ответа на вопрос в отношении растений рода мак необходимо выявить анатомо — морфологические признаки растения мак (наличие и особенности стебля, листьев, коробочек, наружную и внутреннюю эпидерму, части сосудистопроводящей системы, млечники, пыльцевые зерна и т.п.), наличие основных алкалоидов опия: морфина, кодеина и тебаина (содержание морфина и кодеина превалирует над содержанием тебаина). На этом этапе эксперт устанавливает принадлежность растений к снотворному маку. Далее необходимо оценить содержание двух алкалоидов — наркотолина и наркотина. При этом возможны три варианта: — наличие в растительном объекте наркотолина служит достаточным основанием для вывода: представленное на исследование растение является маком масличным; — при отсутствии на хроматограмме зоны наркотолина обращают внимание на зону наркотина: если в растительном объекте наркотин присутствует (при указанных условиях разведения), то делается вывод: представленное на исследование растение является маком опийным; — при отсутствии на хроматограмме как зоны наркотолина, так и зоны наркотина растение также относят к маку масличному. Наличие в растительном объекте алкалоида ретикулина является дополнительным признаком принадлежности данного растительного объекта к маку масличному. Следует иметь в виду также, что сырье, длительно хранившееся во влажном состоянии, может резко отличаться по компонентному составу от сырья, свежесобранного или высушенного в оптимальных условиях. Поэтому растительное сырье, имеющее признаки загнивания (побурение, плесень и т.д.), использовать для проведения исследования нельзя. Приготовление раствора стандартных образцов алкалоидов 0,05 г морфина — основания, 0,025 г кодеина — основания, 0,01 г папаверина и 0,01 г наркотина растворяют в 25 мл смеси метанола с хлороформом в соотношении 3:1. Приготовление реактива Драгендорфа
Раствор 1: 0,85 г нитрата висмута основного растворяют в 40 мл воды и 10 мл уксусной кислоты. Раствор 2: 20 г йодида калия растворяют в 50 мл воды. Смешивают равные объемы растворов 1 и 2. К 40 мл смеси добавляют 30 мл уксусной кислоты и 100 мл воды.
