Документ введен в действие с 21 октября 2013 года. Текст документа

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
21 октября 2013 года

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ, ЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ МАССОВЫХ МЕРОПРИЯТИЙ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
МР 4.2.0079/1-13

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Г.Г.Онищенко, Б.П.Кузькин, Е.Б.Ежлова, Ю.В.Демина); ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (В.В.Кутырев, С.А.Щербакова, Е.С.Казакова, И.Н.Шарова, И.Г.Карнаухов, Т.Ю.Красовская, В.Е.Куклев, С.А.Портенко); ФКУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт (А.Н.Куличенко, О.В.Малецкая, Д.В.Ефременко, Д.Г.Пономаренко, А.Г.Рязанова); Управлением Роспотребнадзора по Республике Татарстан (Татарстан) (М.А.Патяшина, Л.Г.Авдонина); ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Татарстан (Татарстан)» (В.Б.Зиатдинов, А.В.Чернышева, Е.Ф. Юмагулова); ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Санкт-Петербурге» (Ю.Н.Коржаев, Т.А.Гречанинова, Н.С.Григорьева).
2. Утверждены и введены в действие руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 21 октября 2013 г.
3. Введены впервые.
4. Область применения

1.1. Методические рекомендации определяют порядок организации лабораторной диагностики инфекционных болезней, лабораторного контроля объектов окружающей среды при проведении массовых мероприятий (далее — ММ). По данным ВОЗ, любое мероприятие может быть классифицировано как массовое, если оно требует заблаговременного планирования и обеспечения готовности страны-организатора к чрезвычайным ситуациям в целом. 1.2. Методические рекомендации определяют приоритетный комплекс методов и методических подходов, используемых на этапах подготовки проб и исследований с целью индикации возбудителей инфекционных болезней в клиническом материале и объектах окружающей среды в максимально короткие сроки. 1.3. Настоящие методические рекомендации предназначены для специалистов учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и организаций других ведомств, проводящих мероприятия, направленные на обеспечение биологической безопасности при проведении ММ.

2. Общие положения

Одним из важнейших аспектов при организации и проведении мероприятия является обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия. При этом значительная роль отводится лабораторному обеспечению эпидемиологического надзора, включающего исследования материала от людей и проб окружающей среды. В период проведения ММ возрастает риск преднамеренного применения патогенных биологических агентов (ПБА) в террористических целях, в связи с чем возникает необходимость проведения дополнительных скрининговых лабораторных исследований объектов окружающей среды (прежде всего пищевых продуктов, продовольственного сырья, воды) на наличие ПБА, в том числе биологических токсинов. В число приоритетных направлений по обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия ММ как в подготовительный период, так и в период проведения входят: — усиление надзорных мероприятий в отношении гостиниц, медицинских организаций (МО), поставщиков продуктов питания, предприятий общественного питания, особенно в отношении мест размещения, питания участников и гостей ММ; — усиление санитарно-гигиенического и микробиологического контроля объектов окружающей среды — воды водопроводной и поверхностных водоемов, продовольственного сырья и пищевых продуктов, атмосферного воздуха, радиационной обстановки; — организация и проведение дополнительного лабораторного скрининга объектов окружающей среды на наличие ПБА. В связи с указанными обстоятельствами значительно увеличивается объем лабораторных исследований, формируется высокая нагрузка на персонал лабораторий, прежде всего на центры гигиены и эпидемиологии филиалов на территории проведения ММ. В ряде случаев для усиления лабораторного обеспечения используются приданные силы — специализированные противоэпидемические бригады (СПЭБ) Роспотребнадзора, функционирующие на базе ФКУЗ «Научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (НИПЧИ), мобильные формирования и группы специалистов научно-исследовательских институтов эпидемиологического, микробиологического, радиологического профиля. В целях оптимизации объемов лабораторных исследований, с одной стороны, и адекватного лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора в период проведения ММ, с другой, необходима концентрация усилий, направленных на определение приоритетных показателей при исследовании объектов окружающей среды (питьевой воды, почвы, воды открытых водоемов и атмосферного воздуха), подлежащих санитарно-эпидемиологическому контролю в период проведения ММ. Также необходим выбор приоритетных показателей при лабораторном исследовании продовольственного сырья и пищевых продуктов. Приоритетные показатели при лабораторном исследовании объектов окружающей среды могут быть различными при проведении ММ на различных территориях и определяются эпидемиологической обстановкой и прогнозируемыми эпидемиологическими рисками на конкретной территории в рассматриваемый период. Выбор приоритетных показателей (номенклатура выявляемых ПБА, перечень показателей безопасности пищевой продукции и т.д.) в каждом случае должен быть нормативно закреплен в распорядительных документах Управления Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации, на территории которого проводится ММ. Важным фактором при обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия в период ММ является время выдачи лабораторией ответа при исследовании клинического материала от больного с подозрением на инфекционное заболевание, а также при проведении скрининговых исследований объектов окружающей среды на наличие ПБА. В особых ситуациях постановка лабораторного диагноза и определение этиологии болезни или детекция ПБА в исследуемых объектах должна быть осуществлена в максимально короткие сроки. Быстрая индикация ПБА обеспечит своевременное принятие соответствующих управленческих решений, проведение адекватных противоэпидемических и профилактических мероприятий. Максимально быстро результат исследований может быть выдан только на основании использования ускоренных методов лабораторной диагностики. Такой алгоритм организации и проведения лабораторных исследований вводится распорядительным документом Управления Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации.

3. Организация лабораторных исследований в условиях подготовки и проведения ММ

3.1. При проведении ММ все лабораторные исследования проб клинического материала и объектов окружающей среды выполняют в соответствии со специально разработанными документами — Порядками, согласованными руководителями заинтересованных служб и ведомств: «Порядок лабораторного обеспечения диагностики инфекционных болезней во время проведения ММ» (далее — Порядок — диагностика) и «Порядок лабораторного обеспечения исследований проб окружающей среды во время проведения ММ» (далее — Порядок — окружающая среда). Порядки разрабатываются на территории, планирующей мероприятия в рамках ММ и утверждаются руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 3.2. Все диагностические исследования проводятся на базе испытательных лабораторных центров (ИЛЦ) или испытательных лабораторий (ИЛ), аккредитованных в установленном порядке. В области аккредитации ИЛЦ (ИЛ) должны быть отражены все виды исследований, выполняемые ИЛЦ (ИЛ) при проведении ММ. 3.3. При усилении лабораторной базы ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации или противочумных учреждений (ПЧУ) за счет специалистов другого учреждения, издается приказ Роспотребнадзора о включении специалистов приданных сил в состав ИЛЦ на период проведения ММ. 3.4. При проведении лабораторных диагностических исследований в период ММ приоритетными являются методы специфической индикации, позволяющие проводить детекцию возбудителей инфекционных болезней в клиническом материале и объектах окружающей среды в максимально короткие сроки. 3.5. При возможности использования нескольких методов индикации для получения достоверных результатов применяют принципы комплексной лабораторной диагностики (например, ПЦР + МФА или ПЦР + ИФА и др.) с ориентацией на наиболее чувствительный тест. 3.6. При использовании только одного метода (например — ПЦР) предпочтение следует отдавать тест-системам, позволяющим проводить одновременную детекцию нескольких маркеров возбудителя, что значительно повышает достоверность получаемых результатов. 3.7. С целью сокращения количества исследований методом ПЦР необходимо использовать препараты, позволяющие проводить одномоментную детекцию нескольких видов ПБА (например, возбудителей чумы, туляремии, сибирской язвы или норо-, энтеро-, ротавирусов). 3.8. Для индикации ПБА сотрудникам научно-исследовательских организаций (НИО) допускается использование, наряду с зарегистрированными препаратами, экспериментальных серий тест-систем (наборов реагентов). 3.9. Для усиления лабораторной базы ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации, на территории которого проводится ММ, по распоряжению руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека могут привлекаться СПЭБ. В полном (или усиленном) составе СПЭБ задействуется для обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в ходе проведения ММ, когда необходимо решение нескольких задач: — обеспечение готовности к проведению лабораторной диагностики, противоэпидемических (профилактических) мероприятий при выявлении больного (подозрительного) на опасные инфекционные болезни и при регистрации очагов инфекционных болезней с групповой заболеваемостью; — оказание практической и методической помощи органам и организациям Роспотребнадзора, здравоохранения по вопросам готовности к работе в условиях чрезвычайных ситуаций (ЧС) санитарно-эпидемиологического характера; — участие в мониторинге за возбудителями инфекционных болезней в материале от людей и из объектов окружающей среды. В полном (или усиленном) составе СПЭБ также может привлекаться в случае осложнения эпидемиологической обстановки в период подготовки или проведения ММ — возникновения ЧС санитарно-эпидемиологического характера (вспышки опасных инфекционных болезней, в том числе новых). В виде отдельных лабораторных модулей или групп специалистов СПЭБ задействуется при необходимости: — выполнения большого объема исследований за короткий период (индикации возбудителей инфекционных болезней в объектах окружающей среды в максимально короткие сроки при проведения лабораторного скрининга объектов окружающей среды на наличие ПБА); — усиления местной противоэпидемической службы при осложнении эпидемиологической обстановки в период подготовки к ММ.

4. Организация работы по Порядку — диагностика

4.1. Во время подготовки к проведению ММ в рамках обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия Управление Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации совместно с ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации, органами здравоохранения в субъекте Российской Федерации, учреждением Роспотребнадзора, на базе которого функционирует СПЭБ, противочумными учреждениями региона разрабатывает документ: «Порядок лабораторного обеспечения диагностики инфекционных болезней во время проведения ММ» («Порядок — диагностика»), который утверждается руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 4.2. Указанный «Порядок — диагностика» носит межведомственный характер с учетом задействования в диагностической схеме лабораторий различных учреждений, имеющих соответствующие разрешительные документы на работу с возбудителями инфекционных болезней. В Порядке должны быть приведены расчеты объемов лабораторных исследований в соответствии с эпидемиологическим прогнозом. 4.3. Время действия «Порядка — диагностика» — с момента прибытия официальных делегаций, гостей ММ и до отъезда всех официальных делегаций. 4.4. В документе устанавливают перечень МО для первичного обращения больных различных клиентских групп и забора материала для исследования на инфекционные болезни, которые включают: — медицинские центры (МЦ) в местах проживания участников ММ; — медицинские пункты для участников на объектах проведения ММ; — медицинские пункты гостиниц;
— учреждения здравоохранения на территории проведения ММ (поликлиники, инфекционные больницы и др.). 4.5. При разработке «Порядка — диагностика» определяют перечень клиентских групп, подлежащих лабораторному обследованию на наличие возбудителей инфекционных болезней. В период проведения ММ в соответствии с эпидемиологической значимостью выделяют следующие контингенты участников и гостей: — VIP-персоны (руководящий состав государственных, спортивных и иных делегаций);

• участники ММ и аккредитованные лица при обращении в МЦ, не нуждающиеся в дальнейшей госпитализации;
• участники ММ и аккредитованные лица при обращении в МЦ, нуждающиеся в дальнейшей госпитализации в инфекционную больницу или госпитализированные скорой помощью;
• прочее население (население города, гости и лица, задействованные в обслуживании ММ) при обращении в амбулаторно-поликлинические учреждения города, не нуждающиеся в дальнейшей госпитализации;
• прочее население (население города, гости и лица, задействованные в обслуживании ММ) при обращении в амбулаторно-поликлинические учреждения, нуждающиеся в дальнейшей госпитализации или госпитализированные скорой помощью. 4.6. «Порядок — диагностика» определяет перечень лабораторий, осуществляющих лабораторную диагностику инфекционных болезней в период проведения ММ, с указанием наименования учреждения, лаборатории, адреса, телефона контактного лица. При этом должна быть указана численность специалистов лаборатории (в том числе приданных сил, прикомандированных с целью усиления) для расчета нагрузки на одного специалиста, оценки и поддержания готовности к выполнению возможных объемов исследований. 4.7. В период проведения ММ лабораторная диагностика инфекционных болезней осуществляется в круглосуточном режиме работы.

N п/п
Наименование учреждения
Наименование лаборатории
Адрес
Номер телефона контактного лица

4.8. В «Порядке — диагностика» должны быть отражены основные клинические синдромы, их клинические проявления и характерные инфекционные болезни в соответствии с эпидемиологической ситуацией и эпидемиологическим прогнозом на период проведения ММ.

N п/п
Наименование синдрома
Клинические проявления
Перечень нозологий, обусловленных синдромом

4.9. «Порядок — диагностика» регламентирует взаимодействие учреждений и проведение лабораторной диагностики при подозрении на определенный синдром: определяет клиентские группы, лаборатории, выполняющие исследования клинического материала, вид исследуемого материала, методы исследования, схему передачи информации.

Обследуемый контингент
Лаборатория, выполняющая диагностические исследования Материал для исследования
Условия забора и время доставки
Методы исследования
Передача информации

4.10. В приложении к «Порядку — диагностика» приводятся методы отбора проб клинического материала, требования к упаковке, маркировке, оформлению сопроводительных документов (направления), транспортированию и передаче проб на исследование в лабораторию. 4.11. При проведении лабораторной диагностики инфекционных болезней в особых ситуациях положительный ответ по данным методов специфической индикации (ускоренной диагностики) является основанием для оперативного принятия управленческих решений, проведения необходимых противоэпидемических и профилактических мероприятий с учетом анализа эпидситуации. 4.12. При положительном ответе, полученном с помощью методов специфической индикации, дается заключение: «Методом ПЦР (ИФА и т.д.) выявлена ДНК/РНК (антиген) наименование микроорганизма». 4.13. Положительный ответ по результатам специфической индикации может быть выдан как в случае положительных результатов по всем используемым методам, так и при получении положительных результатов с помощью одного метода, с учетом его диагностической точности (например, ПЦР). 4.14. При получении сомнительных результатов анализа положительный ответ не выдают, проводят повторное исследование исходного (нативного) материала для исключения ошибок на всех этапах исследования, включая подготовку проб. 4.15. В случае получения несовпадающих результатов при использовании разных методов специфической индикации вопрос, о выдаче положительного ответа решается индивидуально с учетом чувствительности, специфичности методов и анализа эпидемиологической ситуации. 4.16. В случае отрицательного ответа методов индикации выдается «отрицательный ответ по результатам специфической индикации», при продолжении исследований с применением культурального метода указывается: «анализ продолжается». 4.17. Ответ по результатам специфической индикации должен быть выдан на основании исследования нативного материала: через 2-6 ч. при использовании МФА, ИФА (РНГА), 6-8 ч. — ПЦР в режиме реального времени, 8-12 ч. — ПЦР с электрофоретической детекцией результатов анализа.

5. Организация работы по Порядку — окружающая среда

5.1. Во время подготовки к проведению ММ в рамках обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия Управление Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации совместно с ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации, НИПЧИ Роспотребнадзора, на базе которого функционирует СПЭБ, противочумными учреждениями региона разрабатывает документ: «Порядок лабораторного обеспечения исследований проб окружающей среды во время проведения ММ» («Порядок — окружающая среда»), который утверждается руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 5.2. «Порядок — окружающая среда» распространяется на проведение санитарно-гигиенических, радиологических исследований объектов окружающей среды, пищевых продуктов и продовольственного сырья в период проведения ММ в лабораториях ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте, в мобильных лабораториях приданных сил. 5.3. В «Порядке — окружающая среда» должны быть приведены расчеты планируемых объемов санитарно-гигиенических, микробиологических, вирусологических, паразитологических, радиологических исследований. 5.4. «Порядок — окружающая среда» начинает действовать за 7 дней до прибытия официальных делегаций для участия в проведении ММ и действует до отъезда всех официальных делегаций. 5.5. В «Порядке — окружающая среда» должен быть указан сгруппированный перечень подлежащих лабораторному контролю во время проведения ММ объектов: — питания по месту проживания участников ММ; — питания по месту проведения ММ;
— питания гостиниц;
— проживания и питания VIP-персон;

• пищевой промышленности (поставщики);
• окружающей среды, подлежащие плановому мониторингу;
• окружающей среды, подлежащие обследованию по эпидемиологическим показаниям;
• объекты массового посещения (торговые центры и т.д.). 5.6. В «Порядке — окружающая среда» должен быть отражен перечень лабораторий, уполномоченных осуществлять лабораторную диагностику объектов окружающей среды в период проведения ММ, с указанием наименования учреждения, лаборатории, адреса, телефона контактного лица. При этом должна быть указана численность специалистов лаборатории (в том числе приданных сил, прикомандированных с целью усиления) для расчета нагрузки на одного специалиста и оптимального формирования рабочих мест.

N п/п
Наименование лаборатории
Адрес
Телефон
Количество задействованных специалистов 1
ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте

2
Лаборатории приданных сил (ФКУЗ НИПЧИ МК СПЭБ)

5.7. При разработке «Порядка — окружающая среда» необходимо учитывать данные по максимальным объемам лабораторных исследований объектов окружающей среды, которые может выполнить ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте совместно с приданными силами в период проведения ММ.

Объект исследования
Виды исследований
Планируемое количество проб в период проведения ММ Планируемое количество исследований в период проведения ММ всего
в день
всего
в день

5.8. В «Порядке — окружающая среда» по каждому объекту следует указать наименование проб для исследования, вид и показатели исследований, планируемое количество отобранных проб, планируемое количество исследований, кратность отбора проб, учреждение, осуществляющее забор и транспортирование материала, и лабораторию, проводящую исследование.

Исследуемый материал
Вид исследований, показателя
Планируемое количество исследуемых проб в период проведения ММ Планируемое количество исследований в период проведения ММ Кратность отбора проб, количество проб в 1 доставке Учреждение, отбирающее пробы / учреждение, выполняющее исследования Наименование объекта, где отбирают пробы

5.9. Перечень определяемых показателей готовится органами и организациями Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации, в котором проводится мероприятие. 5.10. При проведении санитарно-гигиенических исследований необходимо использовать автоматические системы, анализаторы, обеспечивающие стандартность получаемых результатов и сокращение времени анализа. Для получения максимально быстрого результата идентификации допускается использование биологических анализаторов, не вошедших в утвержденные действующие нормативные документы (масс-спектрометры). 5.11. При проведении бактериологических, вирусологических исследований необходимо использовать одноразовый стерильный расходный материал (пакеты для отбора и транспортирования проб, проведения пробоподготовки, проведения бактериологических исследований и идентификации) в достаточном количестве. 5.12. В случае обнаружения ПБА при проведении исследований с помощью методов экспресс- и ускоренной диагностики данные о положительных находках передаются в Управление Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации, не ожидая выделения патогена культуральными методами, для принятия управленческих решений. В протоколе лабораторных исследований указывается метод выделения и прописывается фраза «исследование продолжается». Окончательный протокол формируется после получения результата классическими утвержденными методами. 5.13. Во время проведения ММ лабораторный контроль объектов питания и проб окружающей среды осуществляется в режиме круглосуточной работы всех задействованных лабораторий.

6. Организация лабораторного скрининга проб объектов окружающей среды, продуктов питания, продовольственного сырья на наличие возбудителей опасных инфекционных болезней

6.1. В связи с возрастанием потенциальной опасности и риска преднамеренного применения ПБА в террористических целях в период проведения ММ необходимо проведение дополнительного лабораторного скрининга объектов окружающей среды на наличие ПБА. Приоритетные показатели лабораторных исследований объектов окружающей среды во время проведения ММ определяют индивидуально для каждой ситуации, в зависимости от эпидемиологической обстановки и существующих эпидемиологических рисков на конкретной территории в конкретный период. 6.2. Дополнительный скрининг проводится по заданию руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и в соответствии с распорядительным документом Управления Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации и определяется особенностями ММ, характером клиентских групп и эпидемиологической ситуацией. 6.3. Организация лабораторного скрининга объектов окружающей среды на наличие ПБА с указанием определяемых показателей должна быть нормативно закреплена в распорядительных документах Управления Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации. 6.4. Лабораторный скрининг объектов окружающей среды на наличие ПБА проводят на базе научно-исследовательских организаций (в том числе на базе противочумных институтов) или в лабораториях СПЭБ, имеющих лицензию и санитарно-эпидемиологические заключения (для лабораторий) на диагностическую работу с возбудителями I-IV групп патогенности, высокотехнологичную материально-техническую базу и специалистов, подготовленных по широкому кругу вопросов лабораторной диагностики. Возможна организация лабораторного скрининга на базе ФКУЗ «Противочумная станция». 6.5. С целью получения результатов лабораторных исследований в максимально короткие сроки, для своевременного принятия соответствующих управленческих решений и проведения адекватных противоэпидемических и профилактических мероприятий, исследования осуществляются с применением методов специфической индикации. 6.6. Примерный перечень возбудителей инфекционных болезней, контролируемых при дополнительном скрининге объектов окружающей среды: — возбудитель сибирской язвы (Bacillus anthracis) <>; — возбудитель чумы (Yersinia pestis);
— возбудитель холеры (Vibrio cholerae) <>; — возбудитель туляремии (Francisella tularensis); — возбудители бруцеллеза: Brucella melitensis, Brucella melitensis biovar suis, Brucella melitensis biovar abortus; — возбудитель сапа (Burkholderia mallei); — возбудитель мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei); — возбудитель лептоспироза (Leptospira spp.); — возбудитель легионеллеза (Legionella pneumophyla); — возбудители острых кишечных инфекций (Salmonella spp., Shigella spp.) <>; — возбудители эшерихиозов <>;
— возбудитель натуральной оспы;
— возбудитель лихорадки Марбург;
— возбудитель лихорадки Эбола;
— холерный экзотоксин;
— стафилококковый энтеротоксин <>;
— рицин <>;
— ботулинический токсин типа А <>;
— ботулинический токсин типа Б <>.

---

<*> Отмечены ПБА, требующие обязательного контроля при тестировании пищевой продукции в период проведения ММ.

6.7. Отбор, упаковку, маркировку и доставку проб для лабораторного скрининга осуществляют в соответствии с действующими нормативно-методическими документами (НМД). Отбор проб продуктов питания и продовольственного сырья, воды водопроводной, воды бассейнов, воды систем кондиционирования на объектах питания и проживания с последующей доставкой в лабораторию СПЭБ или противочумного учреждения осуществляют специалисты Управления Роспотребнадзора либо специалисты ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в присутствии специалиста Управления Роспотребнадзора и представителя учреждения, в котором проводят отбор проб, в соответствии с действующими нормативно-методическими документами. Отбор проб из объектов окружающей среды (вода открытых водоемов, атмосферный воздух и пр.) с последующей доставкой в лабораторию СПЭБ или противочумного учреждения осуществляют специалисты ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» или специалисты эпидемиологической группы СПЭБ в соответствии с действующими нормативно-методическими документами. На пробы, отобранные на объектах питания, для лабораторного скрининга составляют акт отбора проб, в котором должны быть указаны: — наименование объекта, на котором отбирают пробы; — адрес объекта (фактический и юридический); — дата, время, место отбора;
— дата и время доставки;
— условия транспортирования и хранения; — цель отбора;
— дополнительные сведения;
— номер пробы, наименование, изготовитель, дата выработки, объем и номер партии, масса, объем отобранной пробы; — номер, вид документа, по которому получена продукция, вид тары, упаковки; — НМД, в соответствии с которым отобрана проба; — цель исследования;
— должность, Ф.И.О. лица, отобравшего пробу; — должность, Ф.И.О. лица представителя объекта; — должность, Ф.И.О. лица представителя ТУ Роспотребнадзора; — должность, Ф.И.О. лица, принявшего пробу. На пробы объектов окружающей среды:
— наименование объекта, на котором отбирают пробы; — адрес объекта (фактический и юридический); — дата, время, место отбора;
— дата и время доставки;
— условия транспортирования и хранения; — цель отбора;
— дополнительные сведения.
6.8. Подготовка проб пищевых продуктов осуществляется как с использованием стандартных методов (гомогенизация, перевод в жидкую фазу, концентрирование и др.), так и методических подходов (соскоб, смыв и др.), позволяющих отойти от рутинных операций, тем самым сократив время пробоподготовки. 6.9. На этапе постановки ПЦР допускается объединение проб: — с одного объекта (адреса);
— одного вида (мясные, молочные продукты и др.); — не более трех проб в одну.
Выделение нуклеиновых кислот из каждой пробы осуществляется индивидуально. При получении положительных результатов в объединенной пробе исследование повторяют с каждой пробой из этого пула индивидуально. 6.10. Перечень определяемых ПБА и используемых методов может меняться в зависимости от конкретной ситуации. 6.11. При получении положительных результатов лабораторного скрининга проводят полный бактериологический анализ (выделение и идентификация культуры возбудителя), аликвоты проб передают в Референс-центр по соответствующей нозологии для проведения молекулярно-генетического анализа и типирования. 6.12. Протоколы по результатам лабораторного скрининга передают в Управление Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации или в другое ведомство, обеспечивающее безопасность ММ, по запросу которого проводился лабораторный скрининг.

7. Нормативные ссылки

Федеральные законы

1. Федеральный закон от 30.03.99 N 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Федеральный закон от 21.12.94 N 68-ФЗ «О защите населения и территорий от чрезвычайных ситуаций природного и техногенного характера».

Приказы Министерства здравоохранения

1. Приказ Минздравсоцразвития России от 20.07.2007 N 485 «О совершенствовании организации работы специализированных противоэпидемических бригад, сформированных на базе федерального государственного учреждения здравоохранения «Научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора».
2. Приказ Минздрава СССР от 22.04.85 N 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».

Приказы Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и другие инструктивные документы

1. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 20.07.2007 N 225 «О совершенствовании организации работы специализированных противоэпидемических бригад, сформированных на базе федерального государственного учреждения здравоохранения «Научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора».

Санитарные правила и санитарно-эпидемиологические правила и нормативы

1. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».
2. СП 1.3.2628-10 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). Изм. и доп. 1 к СП 1.3.1285-03».
3. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
4. СП 1.3.2518-09 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Доп. и изм. 1 к СП 1.3.2322-08».
5. СП 1.3.2885-11 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Доп. и изм. 2 к СП 1.3.2322-08».
6. Международные медико-санитарные правила (Женева, 2005 г.).
7. СП 3.1./3.2.1379-03 «Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней».
8. СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности».
9. СП 3.1.7.2613-10 «Профилактика бруцеллеза».
10. СП 3.1.1.2137-06 «Профилактика брюшного тифа и паратифов».
11. СП 3.1.958-00 «Профилактика вирусных гепатитов. Общие требования к эпидемиологическому надзору за вирусными гепатитами».
12. СП 3.1.7.2614-10 «Профилактика геморрагической лихорадки с почечным синдромом».
13. СП 3.1.2.1382-03 «Профилактика гриппа. Доп. и изм. к СП 3.1.2.1319-03″.
14. СП 3.1.7.2615-10 «Профилактика иерсиниоза».
15. СП 3.1.3.2352-08 «Профилактика клещевого вирусного энцефалита».
16. СП 3.1.7.2811-10 «Профилактика коксиеллеза (лихорадка Ку)».
17. СП 3.1.7.2835-11 «Профилактика лептоспирозной инфекции у людей».
18. СП 3.1.7.2817-10 «Профилактика листериоза у людей».
19. СП 3.1.2.2512-09 «Профилактика менингококковой инфекции».
20. СП 3.1.1.1117-02 «Профилактика острых кишечных инфекций».
21. СП 3.1.7.2616-10 «Профилактика сальмонеллеза».
    

    ---

    Примечание. В официальном тексте документа, видимо, допущена опечатка: имеется в виду СП 3.1.7.2836-11, а не СП 3.1.7.2836-10.

    ---

22. СП 3.1.7.2836-10 «Профилактика сальмонеллеза. Изм. и доп. 1 к СП 3.1.7.2616-10″.
23. СП 3.1.7.2629-10 «Профилактика сибирской язвы».
24. СП 3.1.7.2642-10 «Профилактика туляремии».
25. СП 3.1.1.2521-09 «Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой на территории Российской Федерации».
26. СП 3.1.7.2492-09 «Профилактика чумы».
27. СП 3.4.2318-08 «Санитарная охрана территории Российской Федерации».
28. СП 3.4.2366-08 «Санитарная охрана территории Российской Федерации (приложение). Изм. и доп. 1 к СП 3.4.2318-08».
29. СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».
30. СП 2.1.5.1059-01 «Гигиенические требования к охране подземных вод от загрязнения».
31. СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».
32. СанПиН 2.1.4.1074-01 «Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».
33. СанПиН 2.1.4.1175-02 «Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана водоисточников».
34. СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод».
35. СанПиН 2.1.4.1110-02 «Питьевая вода и водоснабжение населенных мест. Зоны санитарной охраны источников водоснабжения и водопроводов питьевого назначения».
36. СанПиН 2.1.4.1116-02 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества».

Методические указания

1. МУК 4.2.2217-07 «Выявление бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды».
2. МУК 4.2.2413-08 «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы».
3. МУК 4.2.2787-10 «Лабораторная диагностика мелиоидоза».
4. МУК 4.2.1887-04 «Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов».
5. МУ 1.3.2970-11 «Лабораторная диагностика натуральной оспы».
6. МУ 4.2.2723-10 «Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды».
7. МУК 4.2.2831-11 «Лабораторная диагностика сапа».
8. МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры».
9. МУ 3.1.3.2600-10 «Мероприятия по борьбе с лихорадкой Западного Нила на территории Российской Федерации».
10. МУК 4.2.2963-11 «Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Escherichia coli, продуцирующих шига-токсины (STEC-культуры), и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах».
11. МУ N 04-723/3 от 17.12.84 «Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями».
12. «Методические указания по организации и проведению разведки для оценки медико-санитарных последствий чрезвычайных ситуаций», 1997.
13. МУК 4.2.992-00 «Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli 0157:H7».
14. МУК 4.2.2495-09 «Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чумы, сибирской язвы, холеры, туляремии, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза) к антибактериальным препаратам».
15. МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».
16. МУК 4.2.2136-06 «Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей».
17. МУ 3.4.2552-09 «Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения».
18. МУ 3.1/3.5.2497-09 «Организация и проведение противоэпидемических и дезинфекционных мероприятий при натуральной оспе».
    

    ---

    Примечание. В официальном тексте документа, видимо, допущена опечатка: имеется в виду МУ 3.1.3.2488-09, а не МУ 3.1.1.2488-09.

    ---

19. МУ 3.1.1.2488-09 «Организация и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий против Крымской геморрагической лихорадки».
20. МУ 3.1.3.2355-08 «Организация и проведение эпидемиологического надзора в природных очагах чумы на территории Российской Федерации».
21. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
22. МУ 3.1.1755-03 «Организация эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом».
23. МУ 3.4.1030-01 «Организация, обеспечение и оценка противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий в случае завоза или возникновения особо опасных инфекций, контагиозных вирусных геморрагических лихорадок, инфекционных болезней неясной этиологии, представляющих опасность для населения Российской Федерации и международного сообщения».
24. МУК 3.2.987-00 «Паразитологическая диагностика малярии».
25. МУК 4.2.2746-10 «Порядок применения молекулярно-генетических методов при обследовании очагов острых кишечных инфекций с групповой заболеваемостью».
26. МУК 1.3.1877-04 «Порядок сбора, упаковки, хранения, транспортирования и проведения лабораторного анализа биологического материала от больных (и умерших) пациентов с подозрением на тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС)».
27. МУ 3.1.1.2957-11 «Эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика и профилактика ротавирусной инфекции».
28. МУ 4.2.2723-10 «Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды».
29. МУ 3.4.3008-12 «Порядок эпидемиологической и лабораторной диагностики особо опасных, «новых» и «возвращающихся» инфекционных болезней».
30. МУ 3.1.7.1189-03 «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей».
31. МУ 3.1.1.2232-07 «Профилактика холеры. Организационные мероприятия. Оценка готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий на случай возникновения очага холеры».
32. МУ 3.1.3012-12 «Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих в природных очагах опасных инфекционных болезней».
33. МУК 4.2.2315-08 «Серологические методы в диагностике холеры». Доп. к МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры».
34. МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории».
35. МУ 3.1.1.2130-06 «Энтеровирусные заболевания: клиника, лабораторная диагностика, эпидемиология, профилактика».
36. Методические указания «Эпидемиологическая диагностика вспышки острых кишечных инфекций», 1998.
37. МУ 3.1.2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляремией».
38. МУ 3.1.1.2438-09 «Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза».
39. МУ 3.1.1128-02 «Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами».

Методические рекомендации и другие инструктивные документы

1. Методические рекомендации «Биологические и микробиологические факторы бактериологической диагностики брюшного тифа и паратифов А, В и С». Утв. Роспотребнадзором 29.12.2007 N 0100/13745-07-34.
2. МР N 0100/4434-06-34 от 18.04.06 «Быстрая диагностика гриппа и других ОРВИ иммунофлюоресцентным методом».
3. МР 0100/3556-04-34 «Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ».
4. Методические рекомендации «Выявление циркуляции арбовирусов. Методы вирусологических и серологических исследований. Клинико-эпидемиологические характеристики малоизученных арбовирусных инфекций. Подходы к мониторингу природных очагов арбовирусов»/Под ред. акад. РАМН Д.К.Львова //Итоги науки и техники. Сер. Вирусология. Т. 25. Москва, 1991. 16 с.
5. МР N 01/7161-9-34 «Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высокопатогенными штаммами вируса гриппа A (H1N1), у людей».
6. МР 2510/11646-01-34 «Организация и проведение противоэпидемических мероприятий при террористических актах с применением биологических агентов».
7. МР N 01/15701-8-34 «Организация мониторинга заносов и распространения гриппа птиц в природных условиях на территории Российской Федерации».
8. Руководство «Санитарно-противоэпидемическое обеспечение населения в чрезвычайных ситуациях». М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006.
9. Практическое руководство «Специфическая индикация патогенных биологических агентов»/Под ред. Онищенко Г.Г. М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006.
10. Практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней»/Под ред. ак. РАМН, проф. Г.Г.Онищенко, чл. корр. РАМН, проф. В.В.Кутырева. М.: ОАО «Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009.

ТР ТС и ГОСТ

1. Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции».
2. Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции».
3. ТР ТС 023/2011 «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей».
4. ТР ТС 024/2011 «Технический регламент на масложировую продукцию».
5. ТР ТС 027/2012 «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе диетического лечебного и диетического профилактического питания».
6. ТР ТС 029/2012 «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств».
7. ГОСТ Р 31904-2010 «Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний».
8. ГОСТ Р ИСО 7218-2011 «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».
9. ГОСТ ISO 11133-1-2011 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству культуральных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления культуральных сред в лаборатории».
10. ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов».
11. ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002) «Продукты пищевые. Методы выявления бактерий рода Salmonella».
12. ГОСТ Р 51921-2002 (ISO 11290:1998) «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes».

---

Документ введен в действие с 21 октября 2013 года. Текст документа

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей и
благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
21 октября 2013 года

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГНОЙНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕНИНГИТОВ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
МР 4.2.0078/1-13

1. Разработаны ФБУН ГНЦПМБ Роспотребнадзора (И.А.Дятлов, Я.В.Подкопаев, Л.В.Домотенко, Т.П.Морозова, М.В.Храмов); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е.Б.Ежлова, А.А.Мельникова, Н.А.Кошкина).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 21 октября 2013 г.
3. Введены в действие с момента утверждения.
4. Область применения

1.1. Методические рекомендации предназначены для врачей-бактериологов, эпидемиологов, лаборантов и других специалистов, занимающихся проблемами гнойных бактериальных менингитов и других инфекций, вызываемых Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae. 1.2. В методических рекомендациях приведены общие сведения о трех основных возбудителях гнойных бактериальных менингитов: N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae. Подробно обсуждаются вопросы, касающиеся свойств и использования питательных сред для выделения и культивирования основных возбудителей гнойных бактериальных менингитов.

2. Общие положения

2.1. Характеристика возбудителей

Гнойные бактериальные менингиты (ГБМ) — заболевания, при которых локализация инфекционного процесса происходит в мягких мозговых оболочках основания головного мозга и верхней части спинного мозга. Этиологическими агентами ГБМ могут быть различные микроорганизмы: N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и другие. Из них более 90% расшифрованных случаев бактериальных менингитов приходится на N. meningitidis, S. pneumoniae и Н. influenzae типа b, из-за чего основные усилия в лабораторной диагностике при подозрении на ГБМ направлены на выделение этих возбудителей. N. meningitidis — грамотрицательные неподвижные, неспорообразующие кокки. Экзотоксина не образуют, при гибели микробной клетки высвобождается эндотоксин липополисахаридной природы. В соответствии с особенностями строения полисахаридной капсулы менингококки подразделяют на 12 серогрупп: А, В, С, X, Y, Z, W-135, 29-Е, К, Н, L, I. Менингококки чрезвычайно чувствительны к воздействию внешней среды. Температурный оптимум жизнедеятельности 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием (5-10%) и влажности. Нуждаются в высокопитательных средах, содержащих нативные белки или кровь животного происхождения. Н. influenzae — небольшие (0,3-0,4 x 1-1,5 мкм) грамотрицательные, сферические, овальные и палочковидные клетки. Неподвижные, неспорообразующие, медленно окрашиваются анилиновыми красителями. Основной фактор вирулентности — капсула. Капсульные штаммы Н. influenzae содержат капсульный полисахарид одного из 6 типов (а, b, с, d, e, f), которые отличаются по составу входящих в него углеводов и антигенным свойствам. Большинство инвазивных инфекций вызывается штаммами Н. influenzae типа b. Капсула типа b состоит из полирибозилрибитолфосфата, то есть содержит в качестве мономера пентозу (рибозу) в отличие от других типов, содержащих гексозу. Бескапсульные штаммы обозначаются как нетипируемые. Для роста гемофильных палочек необходимо наличие в среде факторов роста X (гемин или гематин) и V (кофермент никотинамидадениндинуклеотид — НАД). Оптимальная температура культивирования 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием (5-10%). S. pneumoniae — грамположительные овальные, иногда вытянутые вдоль оси ланцетовидные кокки диаметром 0,5-1,0 мкм, располагаются парами и окружены общей капсулой, неподвижны, спор не образуют, являются факультативными анаэробами, хемоорганотрофы. По капсульному антигену проводят типоспецифическую дифференцировку пневмококков, которых насчитывают не менее 90 серотипов. Пневмококки нуждаются в богатых питательных средах с высоким содержанием аминного азота и нативного белка животного происхождения. Температурный оптимум жизнедеятельности 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием (5-10%).

2.2. Питательные среды, используемые для лабораторной диагностики бактериальных менингитов

Одним из основных этапов лабораторной диагностики ГБМ является бактериологический посев на питательные среды с целью выделения возбудителя заболевания. Для выделения N. meningitidis используют полужидкий сывороточный агар, сывороточный, кровяной и шоколадный агары. При культивировании S. pneumoniae предпочтение отдается кровяному агару. Кроме того, S. pneumoniae культивируют на шоколадном, сывороточных агарах и на полужидком сывороточном агаре. Н. influenzae не растет на простых и сывороточных питательных средах. Кровяные агары не подходят для культивирования Н. influenzae из-за содержащихся в нативной крови никотинамидадениндинуклеотидаз (НАДаз), инактивирующих фактор V. Основной средой для культивирования и выделения Н. influenzae является шоколадный агар. Термическая обработка, которой подвергается кровь в процессе приготовления шоколадного агара, позволяет частично лизировать эритроциты, высвобождая тем самым факторы роста и разрушая НАДазы. Оптимальной средой, поддерживающей рост всех трех основных возбудителей ГБМ, является шоколадный агар. В настоящее время в отечественной практике сывороточный, кровяной и шоколадный агары готовят в лабораторных условиях, в качестве основы используя агар Хоттингера, колумбийский агар, агар для бруцелл, питательную среду для определения чувствительности микробов к антибиотикам (АГВ), эритрит-агар. Руководством по лабораторным методам диагностики бактериальных менингитов, разработанных ВОЗ, для этих целей рекомендованы триптиказосоевый агар (trypticase soy agar), сердечно-мозговой агар (brain heart infusion agar) и гонококковый агар (GC agar). Биологические и физико-химические показатели качества шоколадного и кровяного агаров зависят от качества и типа используемой крови. Для приготовления данных сред используют дефибринированную баранью, лошадиную кровь и кровь крупного рогатого скота. Человеческая кровь содержит антитела, которые могут ингибировать рост микроорганизмов, поэтому она пригодна только для приготовления шоколадного агара. Кровь, используемая для приготовления питательных сред, не должна содержать консерванты, что ограничивает срок ее годности и температурный режим хранения. Все перечисленные факторы создают проблемы при лабораторном изготовлении кровяных и шоколадных питательных сред. Дополнительные трудности возникают при приготовлении шоколадного агара, поскольку его качество и стандартность зависят не только от качества используемой крови, но и от навыков и умения лаборанта в процессе прогревания питательной среды. Решение проблемы стандартности питательных сред возможно при использовании коммерческих питательных сред. Ряд иностранных фирм-производителей питательных сред выпускают питательные среды, в которых нативная кровь заменена сухим гемоглобином и ростовыми добавками. Эти среды, как сухие, так и готовые к применению, используются для выделения и культивирования всех трех основных возбудителей ГБМ. В нашей стране для выделения и культивирования основных возбудителей ГБМ разработаны три питательных среды: питательная среда для выделения возбудителей гнойных бактериальных менингитов, готовая к применению (шоколадный агар); питательная среда для культивирования и выделения гемофильной палочки, готовая к применению (гемофилус-агар) и питательная среда для выделения и культивирования возбудителей гнойных бактериальных менингитов, сухая (ГБМ-агар).

2.3. Гемофилус-агар

Предназначен для бактериологических исследований в клинической микробиологии при анализе клинического материала от больных с подозрением на бактериальный менингит и другими заболеваниями инфекционной природы, вызываемыми бактериями рода Haemophilus, a также при работе с чистыми культурами Haemophilus.

2.4. Шоколадный агар

Предназначен для бактериологических исследований в клинической микробиологии при анализе клинического материала от больных с подозрением на бактериальный менингит и другими заболеваниями инфекционной природы, вызываемыми бактериями Н. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis, а также при работе с чистыми культурами Н. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis.

2.5. ГБМ-агар

Предназначен для бактериологических исследований с целью выделения и культивирования бактерий Н. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis.

3. Аналитические и диагностические характеристики питательных сред

3.1. Гемофилус-агар

Обеспечивает рост тест-штаммов Н. influenzae 423 и Н. influenzae АТСС 9006 при посеве по 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения через 18-24 ч. инкубации при температуре °С в атмосфере 5-10% в виде слизистых, круглых, сероватого цвета, полупрозрачных колоний диаметром до 2 мм. Питательная среда подавляет рост тест-штаммов микробов-ассоциантов Streptococcus pyogenes Dick-1 и N. meningitidis A 208 при посеве 0,1 мл взвеси из разведения , приготовленной по отраслевому стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85-09П.

3.2. Шоколадный агар и ГБМ-агар

На шоколадном агаре и ГБМ-агаре без введения селективных добавок тест-штаммы растут следующим образом: — Н. influenzae 423, Н. influenzae АТСС 49247 — в виде слизистых, круглых, полупрозрачных, сероватого цвета колоний диаметром 1,0-2,0 мм при посеве 0,1 мл взвеси из разведения через 18-24 ч. инкубации при температуре °С в атмосфере 5-10% ; — N. meningitidis A 208, N. meningitidis АТСС 13102 — в виде полупрозрачных, выпуклых с ровными краями колоний диаметром до 2 мм при посеве 0,1 мл взвеси из разведения через 18-24 ч. инкубации при температуре °С в атмосфере 5-10% ; — S. pneumoniae АТСС 6305 — в виде нежных полупрозрачных четко очерченных, не склонных к слиянию колоний диаметром 0,4-0,6 мм при посеве 0,1 мл взвеси из разведения через 18-24 ч. инкубации при температуре °С в атмосфере 5-10% . Допускается наличие плоских с центральным углублением колоний. В зоне роста культуры на чашках с шоколадным агаром наблюдается позеленение питательной среды, на чашках с ГБМ-агаром — обесцвечивание питательной среды. При использовании соответствующих селективных добавок шоколадный агар и ГБМ-агар обеспечивают избирательный рост тест-штаммов. С селективной добавкой СД-Г обе питательные среды обеспечивают рост штаммов Н. influenzae 423 и Я. influenzae АТСС 49247 при посеве 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения и подавляют рост тест-штаммов: S. pneumoniae АТСС 6305, N. meningitidis A 208, N. meningitidis АТСС 13102 и С. albicans АТСС 60193 при посеве 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения через 48 ч. инкубации при температуре °С. С селективной добавкой СД-П обе питательные среды обеспечивают рост S. pneumoniae АТСС 6305 при посеве 0,1 мл взвеси тест-штамма из разведения и подавляют рост тест-штаммов: N. meningitidis А 208, N. meningitidis АТСС 13102, Н. influenzae 423, H. influenzae АТСС 49247 и С. albicans АТСС 60193 при посеве 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения через 48 ч. инкубации при температуре °С. С селективной добавкой СД-М обе питательные среды обеспечивают рост N. meningitidis A 208 и N. meningitidis АТСС 13102 при посеве 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения и подавляют рост тест-штаммов: S. pneumoniae АТСС 6305, Н. influenzae 423, Н. influenzae АТСС 49247 и С. albicans АТСС 60193 при посеве 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения через 48 ч. инкубации при температуре °С.

4. Проведение анализа

4.1. Приготовление питательных сред

Питательные среды готовят в соответствии с инструкциями по применению данных препаратов. Для приготовления гемофилус-агара и шоколадного агара бутылки с основами выдерживают в кипящей водяной бане до полного расплавления агара. Возможно расплавление основ питательных сред в автоклаве в режиме «стерилизации текучим паром». Содержимое флаконов с ростовыми добавками и, при необходимости, с селективными добавками растворяют в стерильной дистиллированной воде и добавляют в остывшую до (45-50) °С основу. Перемешивают и разливают в чашки Петри. Для приготовления ГБМ-агара навеску основы в количестве, указанном на этикетке для приготовления конкретной серии питательной среды, растворяют в дистиллированной воде, стерилизуют автоклавированием. Содержимое флаконов с ростовыми добавками и, при необходимости, с селективными добавками растворяют в стерильной дистиллированной воде и добавляют в остывшую до 45-50 °С основу. Перемешивают и разливают в чашки Петри. Растворы ростовых и селективных добавок не хранить, использовать немедленно после приготовления!

4.2. Посев и инкубация

Перед посевом чашки со средами выдерживают в термостате при температуре °С в течение 10-15 мин. Посев анализируемых образцов производят сразу же после их получения. Чашки с посевами инкубируют в перевернутом положении (крышкой вниз) в атмосфере, обогащенной углекислым газом (5-10%) при температуре °С, время инкубации зависит от типа образца и целей исследования.

4.3. Учет результатов

Учет результатов проводят визуально по наличию характерных колоний через 18-48 ч. инкубации. Н. influenzae формирует на всех средах слизистые, круглые, сероватого цвета колонии диаметром до 2 мм. N. meningitidis формирует на шоколадном агаре и ГБМ-агаре полупрозрачные, выпуклые с ровными краями колонии диаметром до 2 мм. S. pneumoniae формирует на шоколадном агаре мелкие, нежные, полупрозрачные, четко очерченные колонии с позеленением питательной среды в зоне роста культуры, а на ГБМ-агаре — мелкие, нежные, полупрозрачные, четко очерченные колонии с обесцвечиванием питательной среды в зоне роста культуры.

5. Условия хранения и эксплуатации питательных сред

Бутылки с основами гемофилус-агара, шоколадного агара и флаконы с ростовыми и селективными добавками хранят герметически закрытыми при температуре 2-8 °С. Банки с основой ГБМ-агара хранят герметически закрытыми при температуре от 2 до 25 °С. Срок годности гемофилус-агара и шоколадного агара — 1 год. Срок годности ГБМ-агара — 2 года.
Срок годности всех питательных сред в чашках Петри при температуре 2-8 °С — не более 7 дней. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкций по применению данных сред.

6. Меры предосторожности

При работе с клиническими образцами и микробными культурами необходимо соблюдать СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV группы патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» и «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения Российской Федерации» (М., 1981).

7. Заключение

Ключевым этапом в диагностике ГБМ является бактериологический посев на питательные среды. От их качества зависит достоверность и воспроизводимость результатов анализа. Применение питательных сред, изготовленных промышленным способом, позволяет стандартизовать и оптимизировать бактериологические исследования, а также повысить эффективность диагностики бактериальных менингитов.

Список литературы

1. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenza: WHO manual 2nd edition. WHO/IVB.11.09. World Health Organization, Geneva, 2011.
2. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae: методические рекомендации / Под ред. Л.С.Страчунского // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. Т. 2. N 2. С. 93-109.
3. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Streptococcus pneumoniae: методические рекомендации / Под ред. Л.С.Страчунского // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. Т. 2. N 1. С. 88-98.
4. Козлов Р.С. Пневмококки: уроки прошлого — взгляд в будущее. Смоленск: МАКМАХ, 2010. 128 с.
5. Королева И.С. и др. Менингококковая инфекция и гнойные бактериальные менингиты: руководство по лабораторной диагностике / И.С.Королева, Г.В.Белошицкий. М., 2007. 112 с.
6. Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов: методические указания. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2005. 48 с.
7. Медицинская микробиология / Под ред. В.И.Покровского, О.К.Поздеева. М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. 1200 с.

---

Документ введен в действие с 21 октября 2013 года. Текст документа

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
21 октября 2013 года

Дата введения:
с момента утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВНЕБОЛЬНИЧНЫХ ПНЕВМОНИЙ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.3115-13

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора; ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России; кафедрой пульмонологии РМАПО ГБОУ ВПО Минздрава России; НИИ антимикробной химиотерапии ГБОУ ВПО Смоленской ГМА Минздрава России; ГБОУ ВПО Нижегородской ГМА Минздрава России; ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 01.08.2013 N 2).
3. Утверждены и введены в действие руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 21 октября 2013 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
5. Введены впервые.
6. Область применения

1.1. Настоящие методические указания обосновывают и определяют методические основы и алгоритмы лабораторной диагностики пневмоний при осуществлении эпидемиологического надзора в отношении внебольничных пневмоний. 1.2. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами медицинских организаций и других заинтересованных организаций. 1.3. Методические указания являются обязательными при осуществлении эпидемиологического надзора в отношении внебольничных пневмоний, в ходе проведения противоэпидемических мероприятий и при эпидемиологическом расследовании возможных эпидемических вспышек внебольничных пневмоний.

2. Термины и сокращения

ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения. ВП — внебольничная пневмония.
ЛПО — лечебно-профилактическая организация. МКБ-10 — международная классификация болезней. ОРВИ — острая респираторная вирусная инфекция. ПЦР — полимеразная цепная реакция.
ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. РИФ — реакция иммунофлюоресценции.
ИФА — иммуноферментный анализ.
ИХА — иммунохроматографический анализ.
АБТ — антибактериальная терапия.
ОРИТ — отделение реанимации и интенсивной терапии. БАЛ — бронхоальвеолярный лаваж.

3. Общие сведения о внебольничных пневмониях

Пневмонии — группа различных по этиологии, патогенезу, морфологической характеристике острых инфекционных заболеваний, характеризующихся очаговым поражением респираторных отделов легких с обязательным наличием внутриальвеолярной экссудации. В Международной классификации болезней, травм и причин смерти 10-го пересмотра (МКБ-10, 1992 г.) пневмонии четко обособлены от других очаговых воспалительных заболеваний легких неинфекционного происхождения. Современная классификация пневмоний учитывает прежде всего эпидемиологические условия развития заболевания, особенности инфицирования легочной ткани и состояние иммунологической реактивности организма пациента. По характеру приобретения выделяют внебольничную пневмонию (ВП) и нозокомиальную (внутрибольничную) пневмонию. В последнее время помимо термина «нозокомиальные пневмонии» используют термин более широкого значения — «пневмонии, связанные с оказанием медицинской помощи» (healthcare-associated pneumonia). К этой категории помимо нозокомиальных относятся пневмонии у лиц, находящихся в домах престарелых или других учреждениях длительного ухода. Следует подчеркнуть, что такое подразделение никак не связано с тяжестью течения заболевания, основным критерием разграничения являются эпидемиологические условия и окружение, при которых развилась пневмония. Однако они, как правило, отличаются от ВП по этиологической структуре возбудителей и профилем антибиотикорезистентности. Под ВП следует понимать острое заболевание, возникшее во внебольничных условиях — то есть вне стационара или позднее 4 недель после выписки из него, или диагностированное в первые 48 ч. от момента госпитализации, или развившееся у пациента, не находившегося в домах сестринского ухода/отделениях длительного медицинского наблюдения 14 или более суток, — сопровождающееся симптомами инфекции нижних отделов дыхательных путей (лихорадка, кашель, выделение мокроты, возможно гнойной, боль в грудной клетке, одышка) и рентгенологическими признаками «свежих» очагово-инфильтративных изменений в легких при отсутствии очевидной диагностической альтернативы. В соответствии с формой 2 государственного статистического наблюдения «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях» (утвержденная приказом Росстата от 31.12.2010 N 482 «Об утверждении статистического инструментария для организации Роспотребнадзором федерального статистического наблюдения за заболеваемостью населения инфекционными и паразитарными болезнями и профилактическими прививками») в 2012 г. в Российской Федерации было зарегистрировано 493166 случаев ВП (345,0 на 100 тыс. населения), 3751 из которых закончились летальным исходом (0,76% от числа зарегистрированных случаев). Из числа заболевших 65,8% составляют взрослые, 79,0% — представлено городскими жителями. Современная классификация ВП, учитывающая состояние иммунологической реактивности организма пациента, позволяет выделить 2 основные группы, предполагающие различия в этиологической структуре пневмоний: — типичная ВП (у пациентов с отсутствием выраженных нарушений иммунитета); — ВП у пациентов с выраженными нарушениями иммунитета (синдром приобретенного иммунодефицита; прочие заболевания или патологические состояния).

4. Современные представления об этиологической структуре внебольничных пневмоний

Абсолютное значение этиологической роли того или иного возбудителя ВП можно определить лишь по отношению к конкретному региону, эпидемическому очагу или эпидемиологической ситуации. Более широкие обобщения позволяют выявить основную тенденцию, определяющую значение данного возбудителя в инфекционной патологии человека на основании соответствующего уровня стандартизации и частоты применения методов лабораторной диагностики, а также примерное соотношение ВП, вызываемых основным возбудителем пневмоний — пневмококком и другими возбудителями. По данным отечественных и зарубежных исследователей S. pneumoniae является доминирующим этиологическим агентом пневмоний, вызывая от 30 до 80% ВП у лиц всех возрастных групп (Покровский В.И. с соавт., 1995; Зубков М.П., 2002, Cuhna В.А., 2003, Чучалин А.Г., 2006). Среди других типичных бактериальных возбудителей пневмоний заметная этиологическая роль принадлежит H. influenzae, в меньшей степени представителям семейства Enterobacteriaceae (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli и др.), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) и St. aureus. Существенное место в этиологии ВП принадлежит группе микроорганизмов (облигатных и факультативных внутриклеточных паразитов), устойчивых к антибиотикам: Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae и Legionella pneumophila, на долю которых в сумме приходится от 8 до 25% случаев ВП. Достоверная этиологическая диагностика ВП, вызванных данными возбудителями, возможна только при строгом соблюдении современных стандартов лабораторной диагностики (Тартаковский И.С., 2003). В противном случае высока вероятность ложноположительной диагностики для персистирующих микроорганизмов — микоплазм и хламидий и ложноотрицательной — при тяжелых пневмониях легионеллезной этиологии. На фоне увеличения контингентов с тяжелыми дефектами иммунитета (ВИЧ-инфекция, врожденный иммунодефицит, онкогематологические заболевания и др.) за последние годы выросло этиологическое значение таких оппортунистических возбудителей ВП, как Pneumocystis juroveci, цитомегаловирус. С учетом высокого уровня носительства этих возбудителей диагностику соответствующей нозологии следует осуществлять только у контингентов групп риска с использованием современных алгоритмов лабораторных исследований. Понятие «вирусная пневмония» до настоящего времени не нашло широкого применения при постановке диагноза ВП, однако в МКБ-10 выделяют пневмонии, вызванные вирусами гриппа, парагриппа, аденовирусами и другими из группы возбудителей инфекции дыхательных путей. Вместе с тем вирусно-бактериальная этиология ВП достаточно широко известна и описана на фоне эпидемий гриппа и ОРЗ. В отечественный стандарт специализированной медицинской помощи при пневмонии тяжелой степени тяжести с осложнениями включены в качестве нозологических единиц — J10.0 «Грипп с пневмонией» (вирус гриппа идентифицирован) и J11.0 «Грипп с пневмонией» (вирус гриппа не идентифицирован). Вирусные инфекции дыхательных путей тяжелее протекают у детей до 5 лет и пожилых людей (старше 65 лет), что отражается в высоком уровне госпитализаций по поводу пневмоний и летальности среди лиц указанного возраста. В этих возрастных группах чаще регистрируются вирусные и вирусно-бактериальные пневмонии. Во время эпидемий гриппа риск развития пневмонии может увеличиваться для тех возрастных групп, у которых уровень анамнестических антител к циркулирующему в конкретный эпидемический сезон антигенному варианту вируса гриппа ниже защитного, как например, это наблюдалось в случае пандемического гриппа A/H1N1pdm2009 для лиц от 30 до 60 лет. К группам риска развития пневмонии при гриппе также следует относить лиц, страдающих хроническими заболеваниями сердечно-сосудистой системы, нарушениями обмена веществ (ожирение, сахарный диабет), хроническими заболеваниями бронхолегочной системы, и беременных женщин. Этиологическая структура ВП у детей существенно отличается от этиологии ВП у взрослых и варьируется в зависимости от возраста ребенка и тяжести заболевания, что должно учитываться в алгоритме диагностики пневмоний у детей. Группы риска тяжелой пневмонии составляют дети до 5 лет, часто болеющие дети и особенно рожденные на 24-28 неделе гестации. Бактериальные возбудители пневмонии обнаруживаются у 2-50% детей, чаще у госпитализированных детей, по сравнению с детьми, находящимися на амбулаторном лечении. Наиболее частыми бактериальными возбудителями внебольничных пневмоний у детей старше года считают S. pneumoniae, реже выделяют H. Influenzae тип b, S. pneumoniae является причиной одной трети пневмоний с рентгенологическим подтверждением у детей до 2 лет. В случаях тяжелого течения пневмоний, требующих интенсивной терапии, следует предполагать инфекцию, вызванную стрептококками группы А или S. aureus, которые обнаруживаются в 3-7% случаев. Moraxella catarrhalis обнаруживается от 1,5 до 3,0% случаев пневмонии у детей. Смешанные вирусно-бактериальные пневмонии диагностируют у детей по разным данным в 8,2-33,0% случаев, а при учете всех смешанных: бактериальных или вирусно-бактериальных пневмоний у детей, их частота колеблется то 8 до 40%. Среди пневмококковых пневмоний у детей сочетание с вирусными инфекциями отмечается в 62% случаев. При ВП у детей необходимо учитывать возможность смешанной бактериально-вирусной инфекции, этиологическое значение хорошо известных и недавно открытых респираторных вирусов: респираторно-синцитиального, метапневмовируса, бокавируса и риновирусов. Различные вирусные возбудители респираторных инфекций обнаруживаются в 30-67% случаев пневмонии у детей, причем их доля выше у детей младшего возраста (до 80% случаев от 3 месяцев до 2 лет), и значительно реже встречаются у детей старше 10 лет. М. pneumoniae и C. pneumoniae преимущественно вызывают пневмонии у детей школьного возраста, и не характерны для детей от 1 года до 5 лет. Данные возбудители чаще обнаруживаются во время эпидемических подъемов заболеваемости в очагах инфекции. В эндемичных регионах и по эпидемиологическим показателям при этиологической диагностике ВП необходимо учитывать возможность возникновения зоонозных инфекций, для которых характерны воспалительные процессы в легких (лихорадка Ку, орнитоз, туляремия и др.). Важным элементом обследования больных ВП является исключение этиологической роли возбудителя туберкулеза и других микобактерий.

5. Материально-техническое обеспечение
лабораторных исследований

1. Ламинарный бокс 2-го класса биологической безопасности.
2. Микроскоп бинокулярный с осветителем, набором объективов и окуляров.
3. Термостаты электрические для выращивания бактерий, поддерживающие температуру в камере в пределах °С.
4. — инкубатор, поддерживающий температуру в камере в пределах °С, содержание на уровне 3-7% или анаэростат.
5. Дистиллятор.
6. Автоклав электрический.
7. Холодильник, поддерживающий температуру 4-6 °С для хранения культур, биологических субстратов и реагентов.
8. Спиртовки и газовые горелки.
9. Счетчики колоний автоматические и полуавтоматические для подсчета колоний.
10. Одноразовые стерильные контейнеры для сбора и транспортирования мокроты, плевральной жидкости, трахеального аспирата, БАЛ с устойчивым основанием, изготовленные из прозрачного материала (желательно пластика с целью предотвращения поломки, облегчения дезинфекции и утилизации контейнера); крышка должна герметично закрывать контейнеры и легко открываться; контейнер не должен содержать химические вещества, негативно влияющие на жизнеспособность находящихся в мокроте бактерий.
11. Набор реагентов для окраски микропрепаратов по Граму.
12. Питательные среды для культивирования S. pneumoniae (например, кровяной агар, CNA-агар).
13. Питательные среды для культивирования бактерий рода Haemophilus (например, шоколадный агар), грамотрицательных бактерий и S. aureus (агар Эндо, МакКонки, желточно-солевой агар).
14. Чашки бактериологические (Петри) для выращивания микробиологических культур.
15. Стекла предметные и покровные стандартных размеров для микропрепаратов.
16. Штативы и подносы для пробирок и контейнеров, транспортирования чашек Петри, кюветы и штативы-рельсы для фиксации и окрашивания мазков.
17. Петли бактериологические.
18. Дозаторы переменного объема полуавтоматические.
19. Наконечники стерильные для дозаторов переменного объема.
20. Шпатели Дригальского стерильные.
21. Посуда мерная лабораторная стеклянная.
22. Пипетки пластиковые пастеровские для стандартизации объема и переноса жидкостей.
23. Стандарт мутности по МакФарланду или прибор для определения концентрации бактериальных клеток.
24. Диски с антибиотиками (оптохин, оксациллин, цефокситин и др.).
25. Иммуноферментный анализатор в комплекте.
26. Люминесцентный микроскоп в комплекте.
27. Оборудование для ПЦР-лаборатории, укомплектованной в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
28. Диагностические наборы реагентов (тест-системы) для выявления антигенов и ДНК/РНК возбудителей пневмоний, а также специфических антител к возбудителям пневмоний, разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке.
29. Диагностика внебольничных пневмоний

6.1. Диагностика пневмококковой пневмонии

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) является самым частым бактериальным возбудителем ВП. Пневмококковые пневмонии регистрируются у пациентов любого возраста, встречаются как в амбулаторной практике, так и в стационаре (в т.ч. среди госпитализированных в ОРИТ). Рост заболеваемости ВП пневмококковой этиологии в Северном полушарии отмечается в зимнее время года; пневмококковая пневмония чаще регистрируется среди пациентов с сопутствующими хроническими заболеваниями — хроническая обструктивная болезнь легких, сахарный диабет, алкоголизм, аспления, иммунодефицит, нередко протекает с бактериемией (до 25-30%). Для пневмококковой ВП, как правило, характерны острое начало, высокая лихорадка, боли в грудной клетке. Однако клинико-лабораторные и рентгенологические проявления ВП, вызванной S. pneumoniae, недостаточно специфичны и не могут считаться адекватным предиктором этиологии заболевания. Для диагностики пневмококковой ВП наиболее часто используют культуральные методы исследования. Клиническим материалом для исследования является мокрота, венозная кровь, реже — инвазивные респираторные образцы (БАЛ, материал, полученный при бронхоскопии, защищенной браш-биопсии и др.) и плевральная жидкость. При исследовании мокроты особое внимание следует обратить на необходимость оценки качества доставленного образца. Проведение анализа необходимо начать с приготовления мазка, так как результаты микроскопии влияют не только на оценку пригодности материала, но и на дальнейшее направление бактериологического исследования. Критериями пригодности мокроты для бактериологического исследования является наличие более 25 сегментоядерных лейкоцитов и не более 10 эпителиальных клеток в поле зрения при просмотре, как минимум, 20 полей зрения мазка, окрашенного по Граму (под увеличением х 100). При микроскопии мазка, окрашенного по Граму (под увеличением х 1000 при использовании иммерсионного объектива), обнаруживаются грамположительные кокки (чаще — ланцетовидные диплококки) диаметром 0,5-1,25 мкм, не имеющие спор и жгутиков; большинство имеет полисахаридную капсулу. Исследование плевральной жидкости предусматривает бактериоскопию мазка, окрашенного по Граму с последующим культуральным исследованием. Оно выполняется при наличии плеврального выпота и условий безопасного проведения плевральной пункции (визуализация на латерограмме свободно смещаемой жидкости с толщиной слоя > 1,0 см). Культуральное исследование инвазивных респираторных образцов при ВП рекомендуется проводить пациентам с иммунодефицитом, данный метод может использоваться в отдельных случаях при тяжелой ВП, а также неэффективности стартовой антибактериальной терапии (АБТ). Клинически значимыми при остром воспалительном процессе считаются микроорганизмы, выделенные из БАЛ в количестве КОЕ/мл, из биоптата, полученного с помощью защищенных щеток — КОЕ/мл, мокроты — КОЕ/мл. Для выделения S. pneumoniae из клинического материала необходимо использовать питательные среды, обогащенные дефибринированной кровью животных (барана, лошади или козла) в концентрации 5%. Несколько худшие результаты дает применение дефибринированной крови человека. В связи с дефицитностью дефибринированной крови в практических лабораториях и небольшим сроком ее хранения следует помнить о возможности использования для выделения пневмококков коммерчески приготовленного шоколадного агара, который параллельно применяется для выделения гемофилов. Еще одно условие культивирования S. pneumoniae — инкубация в атмосфере с повышенным до 3-7% содержанием , так как он является факультативным анаэробом. Вероятность выделения S. pneumoniae из респираторных образцов увеличивается при использовании селективных сред, содержащих добавки, ингибирующие рост сапрофитных и грамотрицательных микроорганизмов (колистин, налидиксовая кислота, гентамицин). Ключевым тестом дифференциации пневмококков от других стрептококков является чувствительность к оптохину (тест основан на способности оптохина селективно подавлять рост пневмококка в отличие от других зеленящих стрептококков). Однако среди S. pneumoniae растет число оптохинорезистентных штаммов, что требует использования альтернативных методов идентификации возбудителя (лизис в присутствии солей желчных кислот, тест Нейфельда, агглютинация с диагностическими пневмококковыми сыворотками). Информативность культурального исследования респираторных образцов и крови в значительной степени зависит от соблюдения общепринятых правил их сбора, хранения и транспортирования (см. прилож.). Кроме того, вероятность выявления St. pneumoniae значительно снижается при получении клинических образцов на фоне системной АБТ. Для культурального исследования крови предпочтительно использовать коммерческие флаконы с питательными средами. Среди некультуральных методов диагностики пневмококковой пневмонии наибольшее распространение в последние годы получил иммунохроматографический тест, предусматривающий выявление пневмококкового клеточного полисахаридного антигена в моче. Основное его преимущество — возможность использования «у постели больного» в связи с простотой выполнения и быстрым получением результата. Пневмококковый экспресс-тест демонстрирует приемлемую чувствительность (50-80%) и достаточно высокую специфичность (> 90%) при ВП у взрослых по сравнению с традиционными методами. К недостаткам теста относятся возможность получения ложноположительных результатов при пневмококковом носительстве (тест не рекомендуется проводить у детей младше 6 лет) и у лиц, недавно перенесших ВП. Разработаны методы выявления St. pneumoniae в клиническом материале с помощью ПЦР. В качестве мишеней для амплификации используются гены аутолизина (lytA), пневмококкового поверхностного антигена (psaA) и пневмолизина (ply) и другие гены мишени. Однако данные методы не получили широкого распространения в клинической практике и их место в этиологической диагностике ВП требует уточнения.

6.2. Диагностика других бактериальных пневмоний

Важным клинически значимым бактериальным возбудителем ВП является Haemophilus influenzae (Н. influenzae). Внебольничную пневмонию, как правило, вызывают нетипируемые штаммы Н. influenzae. По данным ряда исследований, Н. influenzae чаще встречается у пациентов с сопутствующей ХОБЛ и активных курильщиков, частота инфицирования данным возбудителем выше у пациентов с нетяжелой ВП. Представители семейства Enterobacteriaceae {Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli и др.) и Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) выявляются менее чем у 5% пациентов с ВП и относятся к категории редких возбудителей. Однако значимость данных микроорганизмов может возрастать у пациентов с тяжелой ВП, а инфицирование в несколько раз увеличивает вероятность неблагоприятного прогноза. Как показывают эпидемиологические исследования, частота встречаемости энтеробактерий выше у пациентов с хроническими сопутствующими заболеваниями, у лиц, злоупотребляющих алкоголем, при аспирации, в случае недавней госпитализации и предшествующей АБТ. Дополнительными факторами риска инфицирования Р. aeruginosa являются хронические бронхолегочные заболевания (тяжелая ХОБЛ, бронхоэктазы), длительный прием системных стероидов, цитостатиков. Еще один бактериальный возбудитель — Staphylococcus aureus {S. aureus) — редко встречается среди амбулаторных пациентов с ВП, в то же время у лиц с тяжелым течением заболевания его удельный вес может возрастать до 10% и более. К инфицированию S. aureus предрасполагают многие факторы — пожилой возраст, проживание в домах престарелых, наркомания, злоупотребление алкоголем. Известно, что актуальность S. aureus как возбудителя ВП значительно возрастает во время эпидемий гриппа. Каких-то специфических клинических, лабораторных или рентгенологических признаков, типичных для ВП, вызванной данными возбудителями, и позволяющих отличить ее от пневмоний другой этиологии, не существует. В отдельных случаях, преимущественно у лиц с иммуносупрессией или злоупотребляющих алкоголем, K. pneumoniae может вызывать долевую пневмонию с локализацией поражения в верхней доле легкого, быстрым прогрессированием симптомов заболевания и высокой летальностью. Для этиологической диагностики ВП, вызванной данными возбудителями, основное значение имеет культуральный метод исследования. Н. influenzae, как и пневмококк, относится к категории «прихотливых» микроорганизмов, требующих для культивирования наличия в питательных средах факторов X, V и 5-7% в атмосфере инкубации. Для выделения Н. influenzae из клинического материала обычно используется шоколадный агар или селективный агар для выделения бактерий рода Haemophilus. Посев клинического материала с целью выявления представителей семейства Enterobacteriaceae и Р. aeruginosa осуществляется на селективные среды для выделения грамотрицательных бактерий (агар Эндо, МакКонки и др.), S. aureus — на желточно-солевой агар, маннитол-солевой агар и др. Клиническим материалом для исследования может являться мокрота, венозная кровь, инвазивные респираторные образцы и плевральная жидкость. При исследовании мокроты, как и для выявления пневмококков, важное значение имеет оценка качества собранного образца. Исследование плевральной жидкости выполняется при наличии плеврального выпота и условий безопасного проведения плевральной пункции, инвазивных респираторных образцов — только по отдельным показаниям. Следует отметить, что нетипируемые штаммы Н. influenzae и S. aureus входят в состав нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей (ВДП), причем частота бессимптомного носительства может быть достаточно высокой. С возрастом, при наличии хронических сопутствующих заболеваний, а также недавней системной АБТ возрастает частота колонизации полости рта и ВДП энтеробактериями. Этот факт необходимо учитывать при клинической интерпретации результатов бактериологического исследования респираторных образцов, особенно мокроты. Информативность культурального исследования респираторных образцов и крови в значительной степени зависит от соблюдения общепринятых правил их сбора, хранения и транспортирования. Идентификация основана на определении питательных потребностей возбудителей и результатах биохимических тестов. Для идентификации всех указанных микроорганизмов разработаны коммерческие биохимические панели и наборы реагентов, могут использоваться автоматизированные микробиологические анализаторы, которые уменьшают трудоемкость культурального исследования. При подозрении на ВП, вызванную S. aureus, важное значение приобретает не только выделение и идентификация возбудителя, но и определение его чувствительности к оксациллину. Несмотря на отсутствие документированных фактов выявления метициллинорезистентного S. aureus у пациентов с ВП на территории Российской Федерации опасность их появления и распространения является вполне реальной. Среди фенотипических методов детекции метициллинорезистентности наиболее часто используются тестирование диско-диффузионным методом с диском, содержащим 30 мкг цефокситина или 1 мг оксациллина, или скрининг на агаре Мюллера-Хинтон с добавлением 4%-й NaCl и оксациллина в концентрации 6 мг/л. Для подтверждения инфицирования метициллинорезистентным S. aureus разработаны коммерческие тест-системы, основанные на выявлении в клиническом материале гена mecA методом ПЦР.

6.3. Диагностика пневмонии, вызванной Mycoplasma pneumoniae

Возбудителем респираторного микоплазмоза является Mycoplasma pneumoniae — представитель класса Mollicutes, объединяющего бесстеночные, способные к автономному существованию бактерии, по уровню структурной организации занимающие промежуточное положение между бактериями и вирусами. Респираторный микоплазмоз — распространенное антропогенное заболевание. Особенностью респираторного микоплазмоза является периодичность эпидемий с интервалами, по данным разных источников, варьирующими от 3 до 7 лет. Распространению инфекции способствует частота и длительность контактов среди лиц, пребывающих в закрытых и полузакрытых коллективах (военнослужащие, школы-интернаты), особенно при их формировании. В 3-10% случаев микоплазменной инфекции рентгенологически диагностируется пневмония. При пневмонии, вызванной М. pneumoniae. другие бактериальные или вирусные возбудители, как правило, не обнаруживаются, однако в редких случаях также выделяется S. pneumoniae. В 1-5% случаев заболеваний респираторным микоплазмозом требуется госпитализация. Микоплазменная пневмония сопровождается частым мучительным и продолжительным кашлем со скудной вязкой мокротой, которая плохо эвакуируется, отмечаются боли в грудной клетке, может развиться обструкция бронхов. Интоксикация нерезко выражена. Физикальные изменения в легких отсутствуют или слабо выражены. Рентгенологическая картина весьма вариабельна. В большинстве случаев выявляются поражения интерстиция, у части больных пневмония протекает по типу очаговой или сегментарной, иногда воспалительные изменения носят смешанный характер. Явления легочной недостаточности нехарактерны для микоплазменной пневмонии. Микоплазменная пневмония обычно имеет благоприятное течение, в редких случаях течение очень тяжелое. Диагностика микоплазменной пневмонии только на основании клинических или рентгенологических данных невозможна, поскольку не имеет патогномонических черт. Основная роль в подтверждении микоплазменной этиологии пневмонии отводится лабораторной этиологической диагностике. Для этиологической диагностики микоплазменной пневмонии применяют: — обнаружение ДНК М. pneumoniae методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), основным методом для прямого выявления ДНК М. pneumoniae является на настоящий момент стандартная полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией методом электрофоретического разделения ДНК, однако наибольшей специфичностью и чувствительностью обладает ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ); — выявление антигена микоплазм в реакции прямой иммунофлуоресценции (РИФ); — серологические исследования по обнаружению специфических антител класса IgM и IgG к M. pneumoniae в сыворотках крови методом иммуноферментного анализа (ИФА). Mycoplasma pneumoniae относится к трудно культивируемым микроорганизмам; процесс выделения занимает 3-5 недель, поэтому культуральный метод не может быть рекомендован для использования диагностическими лабораториями. С целью быстрой этиологической диагностики пневмонии рекомендуется использовать ПЦР при исследовании биологического материала, полученного из нижних дыхательных путей (мокрота при глубоком откашливании, аспираты из трахеи, мокрота, полученная в результате индукции посредством ингаляции гипертонического раствора натрия хлорида, жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), получаемая с помощью фибробронхоскопии). При получении положительного результата ПЦР при исследовании биологического материала, полученного из нижних дыхательных путей, этиология пневмонии считается установленной. При невозможности получения биологического материала из нижних дыхательных путей для ПЦР допустимо использовать мазки из верхних дыхательных путей (объединенный мазок из носоглотки и задней стенки глотки), и при получении положительного результата следует считать этиологию пневмонии предположительно установленной. Однако получение отрицательного результата ПЦР при исследовании мазков из верхних дыхательных путей не может свидетельствовать об отсутствии микоплазменной инфекции. В этом случае рекомендуется серологическая диагностика с учетом совокупности результатов по обнаружению специфических антител классов IgM и IgG в парных сыворотках, исследуемых одновременно. С целью ретроспективной диагностики, когда больной уже находится в стадии реконвалесценции, необходимо использовать серологические исследования. Первичный иммунный ответ характеризуется синтезом lgM-антител через 1-3 недели с момента заражения, обнаружение которых свидетельствует об острой фазе инфекции. Иммуноглобулины классов G появляются к концу 3-4 недели. Диагноз микоплазменной респираторной инфекции подтверждает 4-кратная сероконверсия специфических антител в парных сыворотках крови. Непосредственное обнаружение антигенов M. pneumoniae в различных биосубстратах (мазки из носоглотки, лаважная жидкость, биоптаты), полученных от больных с респираторной патологией, до настоящего времени в отдельных диагностических лабораториях проводят с использованием РИФ. Этот метод в сочетании с выявлением специфических антител к микоплазме в ИФА дает возможность подтвердить заболевание, вызванное Mycoplasma pneumoniae. Следует учитывать, что гуморальные антитела сохраняются несколько лет. Для достоверной и окончательной этиологической диагностики микоплазменной пневмонии с учетом возможности персистенции данного возбудителя в организме человека без выраженных клинических проявлений рекомендуется дополнительное подтверждение установленного диагноза каким-либо из перечисленных выше методов.

6.4. Диагностика пневмонии, вызванной Chlamydophila pneumoniae

Chlamydophila pneumoniae — патогенная для человека грамотрицательная бактерия с облигатным внутриклеточным типом паразитирования, обладает тропизмом к клеткам столбчатого цилиндрического эпителия слизистых оболочек человека, в частности, к эпителию бронхиол, бронхов, а также к альвеолярным макрофагам, моноцитам. Для C. pneumoniae-инфекции характерна генерализация процесса, вследствие чего возбудитель может инфицировать эндотелиальные клетки сосудов, синовиальные клетки, гепатоциты и ткани нервной системы. С. pneumoniae вызывает пневмонии различной тяжести, длительно протекающие бронхиты, фарингиты, синуситы. Пневмония, вызванная С. pneumoniae обычно имеет благоприятное течение, в редких случаях течение очень тяжелое. Микст-инфекция, например сочетание с пневмококком или наличие тяжелых сопутствующих заболеваний, особенно у пожилых лиц, осложняет течение заболевания и увеличивает риск летального исхода. Нередко инфекция протекает малосимптомно. В группу риска попадают все возраста, но частота заболеваемости хламидийной пневмонией выше у детей школьного возраста. Заболеваемость среди мужчин выше, чем среди женщин. Эпидемические вспышки происходят каждые 4-10 лет. Описаны эпидемиологические вспышки в изолированных и полуизолированных коллективах, случаи внутрисемейной передачи хламидийной инфекции. Ни один из известных в настоящее время методов диагностики хламидийной пневмонии не обеспечивает 100%-ю надежность выявления возбудителя, что диктует необходимость сочетания не менее двух методов. Микробиологическое выделение С. pneumoniae имеет ограниченное применение ввиду того, что является длительным и трудоемким процессом, характеризуется низкой чувствительностью и доступно только специализированным лабораториям. Однако в случае выделения жизнеспособного возбудителя диагноз может быть поставлен с наибольшей достоверностью без необходимости применения подтверждающих тестов. Культуральное выделение указывает на активный инфекционный процесс, так как при персистентной инфекции возбудитель переходит в некультивируемое состояние. Наиболее специфичным и чувствительным методом выявления возбудителя является ПЦР-диагностика. Высокая чувствительность и отсутствие ложноположительных результатов могут быть обеспечены использованием только лицензированных наборов для эффективного выделения ДНК из клинического материала и наборов для постановки ПЦР современного поколения на основе ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Метод не дает возможность дифференцировать острую и хроническую инфекцию. С целью быстрой этиологической диагностики пневмонии рекомендуется использовать ПЦР при исследовании биологического материала, полученного из нижних дыхательных путей (мокрота при глубоком откашливании, аспираты из трахеи, мокрота, полученная в результате индукции посредством ингаляции гипертонического раствора натрия хлорида, жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), получаемая с помощью фибробронхоскопии). Серологические тесты применяют для ретроспективной диагностики и ретроспективного анализа природы эпидемических вспышек. При получении положительного результата ПЦР при исследовании биологического материала, полученного из нижних дыхательных путей, этиология пневмонии считается установленной. Однако при пневмониях, вызванных Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae, кашель часто бывает непродуктивным, в таких случаях для ПЦР рекомендуется использовать мазки из верхних дыхательных путей (объединенный мазок из носоглотки и задней стенки глотки), и при получении положительного результата следует считать этиологию пневмонии предположительно установленной. При получении отрицательного результата ПЦР при исследовании мазков из верхних дыхательных путей при подозрении на инфекцию, вызванную С. pneumoniae, на основании эпидемиологических или клинических данных рекомендуется серологическая диагностика с учетом совокупности результатов по обнаружению специфических антител классов IgM и IgG в парных сыворотках, исследуемых одновременно. С целью ретроспективной диагностики, когда больной находится в стадии реконвалесценции, необходимо использовать серологические исследования. В настоящее время для обнаружения специфических IgM-, и IgG-антител к С. pneumoniae используют метод иммуноферментного анализа (ИФА) или реакцию иммунофлюоресценции (РИФ). Определены серологические критерии острой С. pneumoniae-инфекции: 4-кратное нарастание титров IgG-антител в парных сыворотках или однократное выявление IgM-антител в титре 1:16. Для достоверной и окончательной этиологической диагностики хламидийной пневмонии с учетом возможности персистенции данного возбудителя в организме человека без выраженных клинических проявлений рекомендуется дополнительное подтверждение установленного диагноза каким-либо из перечисленных выше методов.

6.5. Диагностика пневмонии, вызванной Legionella pneumonia

В связи со сходством клинических проявлений и симптоматики легионеллезной и пневмококковой пневмонии быстрая и эффективная лабораторная диагностика приобретает решающее значение для выбора тактики этиотропной терапии больных. В 1999 г. ВОЗ и в 2002 г. Европейской рабочей группой по легионеллезу в качестве диагностических критериев приняты стандарты, в соответствии с которыми диагноз легионеллеза в случае острой инфекции нижних дыхательных путей (клинически и рентгенологически подтвержденной) считается установленным: 1) при выделении культуры легионелл из отделяемого респираторного тракта или легочной ткани; 2) при 4-кратном или более нарастании титра специфических антител к Legionella pneumophila серогруппа 1 в реакции непрямой иммунофлюоресценции; 3) при определении растворимого антигена Legionella pneumophila серогруппа 1 в моче иммуноферментным (ИФА) или иммунохроматографическим методом (ИХА). При отсутствии сыворотки крови, взятой в ранние сроки болезни, выявление достоверно высокого уровня антител к Legionella pneumophila серогруппа 1 (1:128 и выше) в одиночной сыворотке методом непрямой иммунофлюоресценции позволяет считать диагноз легионеллеза предположительно установленным. Аналогичным образом интерпретируются результаты, полученные на основании выявления возбудителя или его ДНК в респираторном секрете или легочной ткани с помощью прямой иммунофлюоресценции или ПЦР. Пункты 2 и 3 стандартов лабораторной диагностики в настоящее время распространяются только на антитела и антиген, определяемые для Legionella pneumophila серогруппы 1. Для других серогрупп Legionella pneumophila результаты, получаемые по определению антител или выявлению антигена в моче, позволяют установить лишь предполагаемый диагноз. Выделение культуры возбудителя остается единственным методом стандартов, устанавливающим окончательный диагноз в случае инфекции, вызываемой другими серогруппами Legionella pneumophila или видами Legionella spp. В то же время следует отметить, что более 80% спорадических и групповых случаев легионеллеза вызваны штаммами Legionella pneumophila серогруппа 1, а при эпидемических вспышках внебольничных пневмоний этиологическое значение штаммов L. pneumophila серогруппа 1 подтверждено в 96% случаев. Основным методом стандартов, позволяющим осуществлять в настоящее время своевременную диагностику и мониторинг легионеллезной инфекции, является определение легионеллезного антигена в моче иммунохроматографическим или иммуноферментным методом. Метод позволяет окончательно подтвердить диагноз в течение 1-2 ч. Превосходство данного метода над другими, включенными в стандарт, методами состоит, прежде всего, в сроках исследования и доступности клинического материала. Бактериологический метод занимает не менее 4-5 суток, причем требуются инвазивные процедуры для получения материала бронхоскопии, биопсии, так как из мокроты, особенно после начала этиотропной терапии, возбудитель удается выделить далеко не всегда. Выявление диагностического нарастания титров антител в реакции непрямой иммунофлюоресценции возможно лишь на 3-й неделе заболевания, когда проведен курс антибиотикотерапии и исход заболевания обычно ясен. Необходимость исследования парных сывороток определяет ретроспективный характер диагностики легионеллеза данным методом. Метод ПЦР может быть рекомендован, прежде всего, для исследования БАЛ или биопсии при подозрении на легионеллезную пневмонию у иммунокомпрометированных больных. Если у данной категории больных инфекция вызвана штаммами L. pneumophila, не принадлежащими к серогруппе 1, то данный метод является единственным, позволяющим быстро установить диагноз.

6.6. Диагностика пневмонии, вызванной Pneumocystis jiroveci

Пневмоцистоз, как правило, протекает в виде острых респираторных заболеваний, обострений хронических бронхолегочных заболеваний, обструктивного бронхита, ларингита, а также по типу пневмоний с нарушениями газообмена (интерстициальных пневмоний). Типичная рентгенологическая картина при пневмоцистной пневмонии представлена двусторонней прикорневой интерстициальной инфильтрацией легочной ткани с нарастающей интенсивностью и большим объемом поражения в прямой зависимости с прогрессированием болезни. Реже встречаются единичные и множественные уплотнения легочной ткани, верхнедолевые инфильтраты и пневмоторакс. Плеврит и увеличение внутригрудных лимфатических узлов встречаются достаточно редко. При отсутствии патологии на рентгенограммах, КТ высокого разрешения может обнаруживать изменения по типу матового стекла или ячеистой деформации легочного рисунка. У взрослых пневмоцистная пневмония, как правило, развивается на фоне вторичного иммунодефицита. Инкубационный период краткий — от 2 до 5 суток, начало — острое. Пневмоцистная пневмония может развиться у больных, получающих иммуносупрессивную терапию (кортикостероиды). При медикаментозной иммуносупрессии это заболевание проявляется на фоне снижения дозы кортикостероидов. Продромальный период обычно продолжается 1-2 недели; у больных СПИД — 10 дней. Пневмоцистная пневмония при СПИД, как правило, характеризуется вялым хроническим процессом. Первоначально аускультативная симптоматика не выявляется. К летальному исходу приводит дыхательная недостаточность, связанная с резким нарушением вентиляции легких и газообмена. Возможны также абсцессы, спонтанный пневмоторакс и экссудативный плеврит. Пневмоцистоз у детей развивается обычно на 4-6-м месяце жизни, когда иммунная система новорожденного еще полностью не сформировалась. Наиболее подвержены этому заболеванию недоношенные, больные рахитом, с гипотрофией и поражениями ЦНС. У детей раннего возраста пневмоцистоз протекает как классическая интерстициальная пневмония с четкими стадиями патологических процессов. На основании морфологических изменений при манифестном течении заболевания выделяют три стадии пораженного легкого: — отечная (7-10 дней);
— ателектатическая (до 4 недель);
— эмфизематозная (ее продолжительность вариабельна). Группами риска в отношении инфицированности Pneumocystis jiroveci являются: — дети недоношенные, ослабленные новорожденные и дети раннего возраста с гипогаммаглобулинемией, гипотрофией и рахитом; — больные лейкозом, онкологические больные, реципиенты органов, получающие иммунодепрессанты; — больные туберкулезом, цитомегалией и другими инфекциями; — ВИЧ-инфицированные.
Для диагностики пневмоцистоза необходимо использовать комплекс лабораторных методов исследования, включающий паразитологический, иммунологические методы и ПЦР-диагностику. Для окраски паразитологических препаратов с целью выявления Pneumocystis jiroveci используют классические методы: импрегнация метенамин-серебряным нитратом по Гомори, окраска толуидиновым синим, гематоксилином и эозином, по Грамму и раствором Шиффа, а также методом Романовского-Гимза. Наиболее универсальным для выявления цист, трофозоитов и спорозоитов является метод Романовского-Гимза. Витальная окраска нейтральным красным также позволяет выявить возбудителя в активной фазе. Все перечисленные методы окраски требуют высокой квалификации исследователя для точной идентификации Pneumocystis jiroveci; к тому же эти методы служат лишь для индикации и направлены на общие грибные полисахариды оболочки цист. Иммунофлюоресцентный метод (РИФ) для выявления цист и трофозоитов с использованием моноклональных или поликлональных антител в лаважной жидкости обладает более высокой специфичностью и чувствительностью, нежели гистохимическое окрашивание препаратов. Иммунологический метод, выявляющий специфические антитела классов IgG и IgM (ИФА), также играет значительную роль в диагностике пневмоцистоза, особенно при диагностике, когда у больного невозможно взять лаважную жидкость или мокроту. Антитела класса G среди здорового населения выявляют достаточно часто (60-80%). Поэтому исследование антител должно происходить в динамике при обязательном титровании сыворотки. Выявление 4-кратного нарастания IgG и или определение антител IgM против Pneumocystis jiroveci говорит об остром инфекционном процессе, вызванном этим возбудителем. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из высокочувствительных методов диагностики, позволяющим выявлять единичные клетки или фрагменты ДНК возбудителя Pneumocystis jiroveci в мокроте или бронхоальвеолярном лаваже. Для достоверной этиологической диагностики пневмоцистной пневмонии с учетом возможности персистенции данного возбудителя в организме человека без выраженных клинических проявлений рекомендуется комплексное исследование: на основе методов прямого выявления возбудителя (паразитологическим методом, РИФ или ПЦР) и определения серологических маркеров в динамике.

6.7. Диагностика вирусных и вирусно-бактериальных пневмоний

Вирусную или вирусно-бактериальную этиологию пневмонии у взрослых можно подозревать во время подъема заболеваемости гриппом и ОРВИ, а также при возникновении групповых случаев заболевания в течение месяца после формирования закрытых и полузакрытых коллективов. В группу риска тяжелого течения вирусных пневмоний входят лица, страдающие сердечной недостаточностью и хроническими заболеваниями бронхолегочной системы. Сопутствующей патологией при тяжелом течении гриппа являются также ожирение, сахарный диабет, состояние беременности, особенно в третьем триместре. Основными возбудителями вирусных и вирусно-бактериальных пневмоний у иммунокомпетентных взрослых считают вирусы гриппа А и В, аденовирусы, РС-вирус, вирусы парагриппа; реже обнаруживается метапневмовирус. У взрослых больных гриппом в 10-15% случаев развиваются осложнения, причем 80% из них приходится на пневмонию. Важна диагностика вирусных инфекций при ВП у детей в этиологической структуре которых вирусные инфекции играют существенную роль. Современные методы этиологической диагностики острых вирусных инфекций дыхательных путей основаны прежде всего: на выявлении РНК/ДНК возбудителей методами амплификации нуклеиновых кислот, в частности, с помощью наиболее широко используемой ПЦР; на обнаружении антигенов методами иммунохроматографии (ИХА), иммуноферментного анализа (ИФА), иммунофлюоресценции (РИФ). Сохраняют значение в основном для ретроспективной диагностики методы по обнаружению специфических антител в сыворотке крови (реакция связывания комплемента (РСК), реакция нейтрализации (РН), реакция торможения гемагглютиниции (РТГА), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментный анализ (ИФА)). Культивирование возможно для вирусов гриппа А и В, респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 1-3-го типов, метапневмовируса человека и аденовирусов. Культуральные исследования отличаются трудоемкостью и продолжительностью, в рутинной практике используются только при мониторинге гриппа, при этом первоначальное обнаружение положительных образцов проводится в ПЦР, далее проводится выделение в культуре. Реакции иммунофлюоресценции позволяют обнаруживать антигены вирусов гриппа, респираторно-синцитиального вируса, вирусов парагриппа 1-3 и аденовирусов. Материал для исследований методом иммунофлуоресценции необходимо собирать не позднее трех дней от начала респираторной инфекции (в острой фазе заболевания, поскольку метод наиболее эффективен, когда внутриклеточное содержание вирусных антигенов бывает наиболее высоким), что делает данный метод малоинформативным для этиологической диагностики пневмоний. Помимо этого метод отличается субъективностью при интерпретации результатов анализа. Серологические тесты обнаруживают антитела к респираторно-синцитиальному вирусу (РН, РСК, РНГА, ИФА), вирусам парагриппа 1-4 (РТГА, РСК, ИФА) аденовирусам (ИФА), риновирусам (РСК); исследование, как правило, носит ретроспективный характер. По сравнению с РСК ИФА отличается большей чувствительностью. При интерпретации оценивают изменение титра специфических антител в динамике в парных сыворотках (полученных с интервалом в 2 недели), и их результаты в значительной степени зависят от состояния иммунной системы пациента. Признанным доказательством первично вирусной пневмонии (или смешанной вирусно-бактериальной пневмонии) согласно международным критериям (ESCMID 2011, BTS, 2009-2011), служит обнаружение нуклеиновых кислот вируса гриппа или другого респираторного вируса методом ПЦР. Чаще для диагностики используются мазки из носоглотки и с задней стенки глотки, при этом наибольшей чувствительности вследствие большего содержания вирусов в исследуемом образце удается добиться при комбинации мазков из обоих локусов. С этой целью, мазки у пациента берут двумя разными зондами со слизистой нижнего носового хода, а затем с задней стенки ротоглотки, при этом тампоны с обоих зондов после взятия мазков последовательно отламываются в одну пробирку. Однако, в случае вирусов гриппа, реплицирующихся в ткани легких (A/H5N1, A/H1N1pdm2009) на второй неделе пневмонии концентрация вируса в мазках уже может быть недостаточной для его обнаружения, особенно при неадекватном заборе материала. Кроме того, с целью одновременного обнаружения как вирусных, так и бактериальных агентов, целесообразно использовать материал нижних дыхательных путей (мокрота при глубоком откашливании, мокрота, полученная в результате индукции посредством ингаляции гипертонического раствора натрия хлорида, аспираты из трахеи, жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), получаемая с помощью фибробронхоскопии). Для идентификации наиболее значимых возбудителей острых респираторных вирусных инфекций: вирусы гриппа А и В, РС-вирус, метапневмовирус, вирусы парагриппа 1-4, коронавирусы (229Е, ОС43, NL63, HKUI), риновирусы, аденовирусы (В, С, Е), бокавирус доступны наборы реагентов для ПЦР в форматах с электрофоретической детекцией, детекцией по конечной точке флуоресценции, а также с детекцией накопления продуктов амплификации в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ). Максимального уровня специфичности и чувствительности достигают тесты на основе ПЦР в режиме реального времени, преимуществом обладают тесты с одновременным определением нескольких возбудителей. Использование в качестве мишеней специфичных консервативных участков генома вирусов обусловливает высокие показатели диагностической чувствительности и специфичности ПЦР, приближающиеся к 100%, по сравнению с культуральным исследованием. При диагностике гриппа реализуется возможность определения субтипа вирусов гриппа А, в том числе — высокопатогенного вируса гриппа птиц A/H5N1 и нового пандемического варианта А/Н1N1pdm2009, так называемого вируса гриппа свиней. Полимеразная цепная реакция в формате электрофоретической детекции требует особых мер предотвращения контаминации (ложноположительных результатов), достигаемых проведением специальных мероприятий и соблюдением особых правил организации лаборатории согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Этиологию «пневмонии, вызванной вирусом гриппа», следует считать установленной в случае обнаружения методом ПЦР РНК вируса гриппа (или в сочетании с другими вирусами) в материале нижних дыхательных путей при отрицательном результате бактериологического исследования крови (или при отсутствии ДНК бактериальных возбудителей пневмоний в крови по результатам ПЦР, или при обнаружении незначимых концентраций ДНК в материале нижних дыхательных путей в количественной ПЦР). При невозможности получения материала нижних дыхательных путей гриппозная этиология пневмонии с большой долей вероятности может быть доказана в случае обнаружения РНК вируса гриппа в мазках из носоглотки и ротоглотки. Этиология пневмонии, вызванной другими респираторными вирусами, считается установленной в случае обнаружения методом ПЦР РНК/ДНК одного респираторного вируса (или одновременно нескольких вирусов) в материале нижних дыхательных путей при отрицательном результате бактериологического исследования крови (или при отсутствии ДНК бактериальных возбудителей пневмоний в крови по результатам ПЦР, или при обнаружении незначимых концентраций ДНК в материале нижних дыхательных путей в количественной ПЦР). Вирусная этиология пневмонии считается предположительно установленной в случае обнаружения методом ПЦР РНК/ДНК одного респираторного вируса (или одновременно нескольких вирусов) в мазках из носоглотки и ротоглотки при отрицательном результате бактериологического исследования крови (или при отсутствии ДНК бактериальных возбудителей пневмоний в крови по результатам ПЦР, или при обнаружении незначимых концентраций ДНК в материале нижних дыхательных путей в количественной ПЦР), а также если бактериологические исследования не проводились. Вирусная этиология пневмонии считается предположительно установленной в случае обнаружения методом РИФ антигенов одного респираторного вируса (или одновременно нескольких вирусов) при отрицательном результате бактериологического исследования крови (или при отсутствии ДНК бактериальных возбудителей пневмоний в крови по результатам ПЦР, или при обнаружении незначимых концентраций ДНК в материале нижних дыхательных путей в количественной ПЦР), а также, если бактериологические исследования не проводились. Вирусно-бактериальная этиология пневмонии считается установленной в случае обнаружения методом ПЦР РНК/ДНК одного вируса (или одновременно нескольких вирусов) в материале нижних дыхательных путей при положительном результате бактериологического исследования крови (или обнаружении ДНК значимых концентраций в крови или в материале нижних дыхательных путей в количественной ПЦР). Вирусно-бактериальная этиология пневмонии считается предположительно установленной в случае обнаружения методом РИФ или ИХА антигенов одного респираторного вируса (или одновременно нескольких вирусов) при положительном результате бактериологического исследования крови (или обнаружении ДНК значимых концентраций в крови или в материале нижних дыхательных путей в количественной ПЦР). Результаты серологических исследований позволяют судить о наличии или отсутствии вирусной инфекции, на фоне которой развилась пневмония.

6.8. Дифференциальная диагностика с зоонозными заболеваниями, вызывающими поражения легких, и туберкулезом

Дифференциальная диагностика с зоонозными заболеваниями, вызывающими поражения легких (орнитоз, лихорадка Ку, туляремия и др.) проводится по эпидемиологическим показателям и в эндемичных для данных возбудителей регионах в соответствии с санитарными правилами «Профилактика орнитоза», «Профилактика лихорадки Ку», «Профилактика туляремии». Дифференциальная диагностика с туберкулезом является также важным и необходимым компонентом обследования больных тяжелыми пневмониями.

7. Алгоритм диагностики внебольничных пневмоний

Алгоритм лабораторной диагностики типичной ВП (у пациентов с отсутствием выраженных нарушений иммунитета) различен для пневмоний тяжелого и нетяжелого течения, для пациентов с выраженными нарушениями иммунитета и детей. Своевременная этиологическая диагностика ВП особенно важна при пневмониях тяжелого течения у пациентов, госпитализированных в ОРИТ. При тяжелых пневмониях в первую очередь необходимо провести бактериологическое исследование на пневмококк и другие бактериальные этиологические агенты с учетом спектра их чувствительности к антибиотикам, а также исключить легионеллезную этиологию с помощью экспресс-теста на определение антигена легионелл в моче пациентов. Во время подъема заболеваемости гриппом и ОРВИ достаточно высока вероятность тяжелых пневмоний вирусной или вирусно-бактериальной природы. В этом случае алгоритм диагностики тяжелых пневмоний должен учитывать возможность бактериальной, вирусной или вирусно-бактериальной этиологии. Недооценка на этапе лабораторной диагностики любого из вышеупомянутых этиологических вариантов тяжелых пневмоний у пациентов ОРИТ может привести к летальным исходам. Летальность при тяжелых ВП может составлять 25-50%. Термин «нетяжелая пневмония» используется для пневмоний, лечение которых проводится амбулаторно или в условиях стационара, но не требует госпитализации в ОРИТ. При отсутствии адекватной своевременной терапии нетяжелая пневмония может привести к серьезным осложнениям и хроническим заболеваниям бронхолегочной системы. Летальность при этом может составлять от 1 до 10%. Наряду с бактериологическим исследованием на пневмококк и другие бактериальные этиологические агенты, с учетом спектра их чувствительности к антибиотикам, диагностика нетяжелых пневмоний должна учитывать возможность микоплазменной или хламидийной этиологии. Во время подъема заболеваемости гриппом и ОРВИ высока вероятность нетяжелых пневмоний вирусной, а также микст-инфекции упомянутых вирусов с бактериями, хламидиями или микоплазмами. Требует расширенного анализа этиологической структуры ВП у пациентов с выраженными нарушениями иммунитета (синдром приобретенного иммунодефицита, прочие заболевания или патологические состояния). Помимо бактериологического исследования на пневмококк, другие бактериальные этиологические агенты, с учетом спектра их чувствительности к антибиотикам, и легионеллы для данной группы пациентов высока вероятность развития пневмонии, вызванной «оппортунистическими этиологическими агентами», прежде всего Pneumocystis jiroveci, а также цитомегаловирусом, грибами, вирусом герпеса. Дифференциальная диагностика с туберкулезом и другими микобактериозами является также важным и необходимым компонентом обследования пациентов с ВП, имеющими выраженные нарушениями иммунитета. Для исключения легионеллезной этиологии пневмоний у иммунокомпрометированных больных проводится исследование бронхоальвеолярного лаважа или биопсии с помощью бактериологического метода, или ПЦР на L. pneumophila серогруппы 2-15 и Legionella spp. При ВП у детей наиболее выражена полиэтиологичность, что необходимо учитывать в процессе лабораторной диагностики. Наряду с бактериологическим исследованием на пневмококк и другие бактериальные этиологические агенты, с учетом спектра их чувствительности к антибиотикам, диагностика пневмоний у детей должна учитывать широкий спектр респираторных вирусов, причем не только во время эпидемических подъемов заболеваемости гриппом и ОРВИ (вирусы гриппа, РС-вирус, метапневмовирус, вирусы парагриппа, аденовирусы, коронавирусы, бокавирус, риновирусы), а также этиологическую роль микоплазм и хламидий. При ВП у детей высока вероятность смешанной бактериально-вирусной инфекции, включая смешанную инфекцию с хламидиями и микоплазмами.

8. Контроль качества лабораторных исследований

Обязательным компонентом современной лабораторной диагностики является система качества лабораторных исследований и обеспечение ее функционирования. Система качества включает внутренний контроль на этапах лабораторного исследования и внешний контроль. Внутренний контроль качества микробиологических исследований — комплекс выполняемых лабораторией мероприятий и процедур, направленных на предупреждение неблагоприятного воздействия факторов, возникающих в процессе подготовки, выполнения и оценки результатов анализа, способных повлиять на достоверность результата. Внутренний контроль качества включает:
1. Контроль за соблюдением требований к условиям проведения анализа: (лабораторные помещения, воздушная среда, температурные режимы инкубации и хранения, режимы дезинфекции и стерилизации и т.д.). 2. Выполнение процедуры ведения эталонных бактериальных культур. 3. Контроль качества питательных сред.
4. Контроль качества тест-систем и реагентов. 5. Контроль качества дистиллированной воды. Структура организации внутреннего контроля качества, периодичность и частота выполняемых процедур устанавливается действующей в лаборатории системой менеджмента качества в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 и ГОСТ Р ИСО 15189. Документальное оформление результатов проведенных контрольных процедур осуществляется по утвержденным действующей системой менеджмента качества формам. Регистрация и хранение контрольных результатов могут осуществляться на электронных носителях. Обязательным разделом внутреннего контроля качества является проведение периодического, но не реже 1 раза в год, анализа результатов выполненных контрольных процедур, с учетом которого осуществляется корректировка руководства по качеству испытательной лаборатории. Обеспечение внутреннего контроля качества молекулярно-генетических (ПЦР) исследований дополнительно проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Внешний контроль качества осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025 и ГОСТ Р ИСО 15189 в форме участия в межлабораторных сравнительных испытаниях (МСИ) и/или программах проверки квалификации по показателям и с периодичностью в соответствии с установленными требованиями и потребностью лабораторий.

9. Требования безопасности

Исследования биологического (клинического) материала проводят в соответствии с действующими нормативными правовыми и методическими документами в отношении работы с микроорганизмами III-IV и I-II групп патогенности в зависимости от вида предполагаемого возбудителя.

Приложение

ПРАВИЛА
ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

С целью выяснения этиологического агента (агентов) инфекции нижних дыхательных путей при подозрении на ВП исследуется мокрота при глубоком откашливании, мокрота, полученная при индукции ингаляцией стерильного 5%-го раствора натрия хлорида через небулайзер, мокрота, полученная аспирацией из трахеи с помощью хирургического вакуумного или электрического отсоса, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), получаемый с помощью фибробронхоскопии, а также кровь и плевральная жидкость. В случае невозможности получения материала из нижних дыхательных путей при исследовании на респираторные вирусы, микоплазму и хламидию допустимо использование мазков из верхних дыхательных путей (из нижнего носового хода и с задней стенки глотки), которые берут у пациента как можно раньше от момента появления симптомов ОРЗ в одну пробирку и исследуют как один образец. При подозрении на легионеллезную или паразитарную этиологию инфекции нижних дыхательных путей исследуются прижизненный БАЛ или биоптаты ткани легких. У госпитализированных пациентов материал для исследования следует собирать как можно раньше при поступлении (не позднее вторых суток), поскольку в более поздние сроки не исключена возможность суперинфекции при контакте с другими пациентами. Сбор биологического материала для бактериологического исследования следует проводить до назначения антибиотиков. В случае летального исхода исследуется посмертный (аутопсийный) материал.

Правила получения свободно отделяемой мокроты для бактериологического и ПЦР-исследования

Для сбора мокроты необходимо использовать стерильные герметично закрывающиеся пластиковые контейнеры. Перед сбором мокроты необходимо попросить пациента тщательно прополоскать рот кипяченой водой. Сбор мокроты осуществляется натощак или не ранее 2 ч. после еды. Пациента просят сделать несколько глубоких вдохов с задержкой дыхания на несколько секунд, затем с силой выдохнуть, что способствует появлению продуктивного кашля и очищению верхних дыхательных путей от мокроты. Затем пациента просят хорошо откашляться и собрать отделяемое из нижних дыхательных путей (не слюну!) в стерильный контейнер. Объем образца мокроты должен быть не менее 3 мл для взрослых и около 1 мл для детей. До момента транспортирования образец вместе с направлением на бактериологическое исследование следует хранить в холодильнике при температуре 4-8 °С. Продолжительность хранения мокроты при комнатной температуре не должна превышать 2 ч. Для исследования методом ПЦР допускается хранение образца мокроты в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °С, более длительно — при температуре не выше -16 °С.

Правила получения венозной крови
для бактериологического исследования

Для сбора крови с целью бактериологического исследования используются коммерческие герметично закрывающиеся стеклянные флаконы или флаконы из ударопрочного автоклавируемого пластика двух видов (содержащие питательную среду для выделения аэробов и анаэробов). Забор крови производится шприцем, кровь асептически переносится во флакон с транспортной средой непосредственно через резиновую пробку. Забираются 2 образца венозной крови с интервалом 20-30 мин. из различных периферических вен — например, левой и правой локтевой вены. Один образец помещается во флакон для выделения аэробов, другой для выделения анаэробов. Объем крови при каждой венепункции должен составлять не менее 10 мл для взрослых и 3 мл для детей. Непосредственно перед венепункцией производится дезинфекция кожи в месте венепункции циркулярными движениями от центра к периферии дважды 70%-м раствором спирта или 1-2%-м раствором йода. Необходимо дождаться полного высыхания дезинфектанта, и провести манипуляцию, не касаясь места обработки кожи. После венепункции следует удалить оставшийся йод с поверхности кожи, чтобы избежать ожога. До момента транспортирования с целью бактериологического исследования образец вместе с направлением хранится при комнатной температуре (не более 2 ч.) или в термостате.

Правила получения венозной крови
для ПЦР-исследования

Взятие крови следует производить натощак или через 3 ч. после приема пищи из локтевой вены в положении сидя. Взятие крови осуществляют в пробирки с антикоагулянтом (ЭДТА). Непосредственно перед венепункцией производится дезинфекция кожи в месте венепункции циркулярными движениями от центра к периферии дважды 70%-м раствором спирта или 1-2%-м раствором йода. Необходимо дождаться полного высыхания дезинфектанта, и провести манипуляцию, не касаясь места обработки кожи. После венепункции следует удалить оставшийся йод с поверхности кожи, чтобы избежать ожога. После взятия крови пробирку следует несколько раз плавно перевернуть вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась. Пробирку поместить в штатив. До момента транспортирования в лабораторию с целью ПЦР-исследования образец вместе с направлением хранится при температуре 20-25 °С в течение 6 ч. с момента получения материала — для количественного определения нуклеиновых кислот, и в течение 12 ч. — для качественного определения нуклеиновых кислот; при температуре 2-8 °С — не более одних суток для качественного и количественного определения ДНК/РНК инфекционных объектов. Замораживание образцов цельной крови недопустимо.

Правила получения плевральной жидкости
для бактериологического и ПЦР-исследования

Взятие материала осуществлять в одноразовые, плотно завинчивающиеся пробирки объемом 10-15 мл. Перед манипуляцией производится дезинфекция кожи 70%-м этиловым спиртом, затем 1-2%-м раствором йода, избыток йода удаляется марлевой салфеткой, смоченной 70%-м спиртом во избежание ожога кожи пациента. После этого выполняется чрескожная аспирация для получения пробы плевральной жидкости при тщательном соблюдении правил асептики. Объем пробы должен составлять не менее 5 мл. Из шприца удаляются все пузырьки воздуха, после чего проба немедленно переносится в стерильный пластиковый контейнер. Контейнер плотно закрывается крышкой. До момента транспортирования образец вместе с направлением на бактериологическое исследование хранится в холодильнике при температуре 4-8 °С. Продолжительность хранения плевральной жидкости при комнатной температуре не должна превышать 2 ч. Для исследования методом ПЦР допускается хранение образца в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °С, более длительно — при температуре не выше -16 °С.

Правила получения бронхоальвеолярного лаважа при подозрении на легионеллезную или паразитарную этиологию тяжелой ВП

Бронхоскопия выполняется в условиях оксигенотерапии (ингаляция кислорода через носовые катетеры, с помощью маски Вентури либо маски с резервуаром). Если не удается обеспечить достаточную оксигенацию крови, бронхоскопия выполняется в условиях неинвазивной вентиляции легких. У больных на искусственной вентиляции легких процедура выполняется под общей анестезией в условиях миоплегии через адаптер респиратора, снабженный клапаном для бронхоскопа. Бронхоальвеолярный лаваж проводят по принятым правилам. Фибробронхоскоп проводят в бронх до его заклинивания, после чего вводят подогретый до 37 °С 0,9%-й раствор натрия хлорида с помощью одноразовых шприцев 8 порций по 20 мл (150-160 мл). С целью предотвращения коллапса альвеол отсасывание проводят при 50-80 мм рт.ст. Данная процедура позволяет получить необходимое количество альвеолярных макрофагов, в которых размножается возбудитель ВП.

Правила получения материала
для паразитологического исследования

С целью выяснения этиологического агента (агентов) инфекции нижних дыхательных путей при подозрении на паразитарную этиологию исследуется прижизненный (биоптаты) и посмертный материал. При жизни легочную ткань получают трансбронхиальной биопсией с помощью бронхоскопа, что позволяет выявить пневмоцисты в 66-98%, однако этот метод забора материала показан далеко не всем больным. Получение материала для исследования возможно и при открытой биопсии легкого или с помощью чрескожной интраторакальной аспирации легочной иглой у больных, которым противопоказано проведение трансбронхиальной биопсии при прогрессирующем течении заболевания. Метод открытой биопсии легкого дает наилучшие (100%) результаты и приравнивается по результату к хирургическому вмешательству, при этом получается достаточно большой объем материала для исследования и ложноотрицательный результат полностью исключается. В настоящее время в клиниках стали активно исследовать бронхоальвеолярный лаваж для выявления цист и трофозоитов. Посмертный материал собирают в течение первых суток после гибели больного, приготавливают мазки-отпечатки легкого или мазки из пенистого содержимого альвеол.

Правила получения трахеального аспирата для ПЦР-исследования

Манипуляцию проводят натощак после чистки зубов и полоскания полости рта водой. Пациента просят сделать несколько глубоких вдохов с задержкой дыхания на несколько секунд, затем с силой выдохнуть. Это способствует появлению продуктивного кашля и очищению верхних дыхательных путей от мокроты. После присоединения мукус-экстрактора через трубку-переходник к отсосу катетер для забора трахеального аспирата вводится в глотку через полость рта. Вследствие раздражения слизистой в области голосовой щели провоцируется кашлевой рефлекс и проводится извлечение трахеального содержимого через стерильный катетер (6-го или 7-го размера) с помощью отсоса. Объем трахеального аспирата должен составлять не менее 3-5 мл.

Правила получения индуцированной мокроты для бактериологического и ПЦР-исследования

Перед процедурой пациенты получают сальбутамол (дети — 200 мкг) через дозирующий ингалятор для предотвращения бронхоспазма. Затем в течение 15 мин. через струйный небулайзер (аэрозольный аппарат) подается кислород со скоростью 5 л/мин. с 5 мл 5%-го стерильного раствора NaCl. После этого проводится постукивание по передней и задней стенкам грудной клетки с целью стимуляции отхождения мокроты. Затем пациента просят хорошо откашляться и собрать отделяемое из нижних дыхательных путей (не слюну!) в стерильный контейнер. Объем образца мокроты должен быть не менее 3 мл для взрослых и около 1 мл для детей. В случае если мокрота не откашливается, процедуру рекомендуется комбинировать с последующим получением аспиратов из трахеи с целью отсасывания содержимого из трахеи с помощью стандартного отсоса с использованием стерильного катетера 6-го или 7-го размера. До момента транспортирования образец вместе с направлением на бактериологическое исследование хранится в холодильнике при температуре 4-8 °С. Продолжительность хранения мокроты при комнатной температуре не должна превышать 2 ч. Для исследования методом ПЦР допускается хранение в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °С, более длительно ~ при температуре не выше — 16 °С.

Правила получения мазков из верхних дыхательных путей для ПЦР-исследования

Материал берут после полоскания полости рта кипяченой водой комнатной температуры. Если полость носа заполнена слизью, перед процедурой рекомендуется провести высмаркивание. В течение 6 ч. перед процедурой нельзя использовать медикаменты, орошающие носоглотку или ротоглотку и препараты для рассасывания во рту. Мазки у пациента берут двумя разными зондами сначала со слизистой нижнего носового хода, а затем из ротоглотки, при этом концы зондов с тампонами после взятия мазков последовательно помещаются в одну пробирку объемом 1,5-2,0 мл с 0,5 мл транспортной среды. Мазки со слизистой носоглотки у детей берут сухим стерильным назофарингеальным велюр-тампоном на пластиковом аппликаторе. Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (3-4 см для детей и 5-6 см для взрослых). После забора материала конец зонда с тампоном опускают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой до места слома, при этом гибкая часть зонда сворачивается спиралью, далее, прикрывая сверху пробирку крышкой, рукоятку зонда опускают вниз, добиваясь полного отламывания верхней части зонда. Пробирку герметично закрывают. Мазки со слизистой носоглотки у взрослых допустимо брать также сухим стерильным зондом из полистирола с вискозным тампоном. Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (5 см для взрослых). После забора материала конец зонда с тампоном опускают на глубину 1 см в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой и отламывают, придерживая крышкой пробирки. Пробирку герметично закрывают. Мазки из ротоглотки берут сухим стерильным зондом из полистирола с вискозным тампоном вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки, аккуратно прижимая язык пациента шпателем. После забора материала рабочую часть зонда с тампоном помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой и зондом с мазком из носоглотки. Конец зонда с тампоном (1 см) отламывают, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку. Допускается хранение в течение трех суток при температуре 2-8 °С, более длительно — при температуре не выше — 16 °С.

Правила получения материала для серологической диагностики (Выявление специфических антител)

Для серологического исследования (определение антител) необходимы две пробы сыворотки крови, 1-я проба берется в день постановки первичного диагноза, 2-я проба — через 2-3 недели после первой. Взятие крови осуществляется из вены в объеме 3-4 мл, или из третьей фаланги среднего пальца в объеме 0,5-1,0 мл в одноразовую пластиковую пробирку без антикоагулянта. Пробы крови отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин. или помещают в термостат при 37 °С на 15 мин. После центрифугирования (10 мин. при 3000 об./мин.) сыворотку переносят в стерильные пробирки, используя для каждого образца отдельный наконечник с аэрозольным барьером. Срок хранения цельной крови — не более 6 ч., замораживание недопустимо. Срок хранения сыворотки крови при комнатной температуре — в течение 6 ч., при температуре 2-8 °С — в течение 5 суток, более длительно — при температуре не выше — 16 °С (многократное замораживание/размораживание недопустимо).

Правила получения аутопсийного материала для ПЦР-исследования

Посмертный материал собирают в течение первых суток после гибели больного стерильным индивидуальным инструментом (индивидуально для каждого органа) из зоны поврежденной ткани объемом 1-3 куб. см, помещают в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры с герметично завинчивающейся крышкой, замораживают и хранят при температуре не выше -16 °С.

Правила получения и транспортирования мочи для определения антигена легионелл или пневмококка

Образцы мочи для исследования объемом 5-10 мл помещают в стандартные пластиковые контейнеры и хранят при комнатной температуре (15-30 °С) не более 24 ч. после забора перед постановкой реакции. В случае необходимости образцы могут храниться при температуре 2-8 °С до 14 дней или при -20 °С в течение длительного времени для первичного или повторного исследования. В качестве консерванта может быть использована борная кислота. Перед постановкой реакции охлажденные или замороженные образцы мочи исследуют на наличие антигена после достижения комнатной температуры.

Требования к маркировке материала
для лабораторного исследования

На этикетке пробирок (контейнеров) с материалом указывается: фамилия и имя обследуемого, дата взятия материала, тип материала. В сопроводительном документе (направлении) к материалу, собранному для исследования в лаборатории, необходимо указать: — наименование учреждения, которое направляет материал на исследования, и телефон; — фамилию и имя обследуемого больного;
— возраст;
— дату заболевания или контакта с больным; — предполагаемый диагноз, тяжесть заболевания или повод к обследованию; — степень тяжести заболевания;
— данные о вакцинации против гриппа в текущем эпидемическом сезоне (вакцинирован/не вакцинирован/нет данных); — дату и подпись медицинского лица.
Транспортирование материала производится в термоконтейнерах при рекомендованной для хранения температуре. Образцы от каждого пациента дополнительно упаковываются в индивидуальный герметичный пакет с адсорбирующим материалом.

Обработка биологического материала
перед проведением лабораторных исследований

В лаборатории перед началом проведения ПЦР-исследований биологического материала вязкой консистенции (мокрота, аспираты из трахеи) необходима его предобработка с целью снижения вязкости, например с помощью препарата типа «Муколизин», согласно инструкции. Аутопсийный материал подвергается гомогенизации с последующим приготовлением 20%-й суспензии с использованием буферного раствора (физиологического раствора натрия хлорида или фосфатного буфера).

Список литературы

1. Внебольничная пневмония у взрослых: практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике: Пособие для врачей/А.Г.Чучалин, А.И.Синопальников с соавт. М., 2010. 106 с.
2. Пневмония/А.Г.Чучалин, А.И.Синопальников, Л.С.Страчунский. М., 2006.
   

   ---

   Примечание. В официальном тексте документа, видимо, допущена опечатка: имеется в виду приложение к Приказу Минздрава России N 741н от 09.11.2012, а не от 29.01.2013.

   ---

3. Стандарт специализированной медицинской помощи при пневмонии тяжелой степени тяжести с осложнениями: Приложение к приказу Минздрава России от 29.01.2013 N 741н.
4. Козлов Р.С. Пневмококки: уроки прошлого — взгляд в будущее. Смоленск, 2010.
5. СП 3.1.2.2626-10 «Профилактика легионеллеза».
6. СП 3.1.7.2811-10 «Профилактика коксиеллеза (лихорадка Ку)».
7. СП 3.1.7.2642-10 «Профилактика туляремии».
8. СП 3.1.7.2815-10 «Профилактика орнитоза».
9. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
10. МУ 3.1.2.3047-13 «Эпидемиологический надзор за внебольничными пневмониями».
11. МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 23.12.2005).
12. Методические указания МЗ РФ N 99/168 «Организация выявления больных туберкулезом с применением лучевых, клинических и микробиологических методов». 2000.
13. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
14. МУ 2.1.4.1057-01 «Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды».
15. MP N 01/14633-8-34 «Выявление антигена бактерий Legionella pneumophila серогруппы 1 в клиническом материале иммунохроматографическим методом» (утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 9.12.2008).
16. МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 4.03.2004).

---

ФЕДЕРАЛЬНАЯ ТАМОЖЕННАЯ СЛУЖБА

ПИСЬМО
от 18 октября 2013 г. N 01-11/46850

О НАПРАВЛЕНИИ
РЕКОМЕНДАЦИЙ О ПОРЯДКЕ ОТБОРА, НАПРАВЛЕНИЯ И ПРЕБЫВАНИЯ ДОЛЖНОСТНЫХ ЛИЦ И РАБОТНИКОВ ТАМОЖЕННЫХ ОРГАНОВ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ В ЛЕЧЕБНО-ОЗДОРОВИТЕЛЬНЫХ УЧРЕЖДЕНИЯХ ФТС РОССИИ

В целях реализации пунктов 5 и 6 статьи 51 Федерального закона от 21 июля 1997 г. N 114-ФЗ «О службе в таможенных органах Российской Федерации», подпункта 2 пункта 10 статьи 3 Федерального закона от 30 июня 2002 г. N 78-ФЗ «О денежном довольствии сотрудников некоторых федеральных органов исполнительной власти, других выплатах этим сотрудникам и условиях перевода отдельных категорий сотрудников федеральных органов налоговой полиции и таможенных органов Российской Федерации на иные условия службы (работы)», частей 4, 6 и 7 статьи 10 Федерального закона от 30 декабря 2012 г. N 283-ФЗ «О социальных гарантиях сотрудникам некоторых федеральных органов исполнительной власти и внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации» и Федерального закона от 27 июля 2004 г. N 79-ФЗ «О государственной гражданской службе Российской Федерации» ФТС России направляет для использования в работе Рекомендации о порядке отбора, направления и пребывания должностных лиц и работников таможенных органов Российской Федерации в лечебно-оздоровительных учреждениях ФТС России.

Заместитель руководителя
генерал-лейтенант таможенной службы
С.Г.КОМЛИЧЕНКО

Утверждаю
Заместитель руководителя ФТС России
генерал-лейтенант таможенной службы
С.Г.КОМЛИЧЕНКО
17.10.2013

РЕКОМЕНДАЦИИ
О ПОРЯДКЕ ОТБОРА, НАПРАВЛЕНИЯ И ПРЕБЫВАНИЯ ДОЛЖНОСТНЫХ ЛИЦ И РАБОТНИКОВ ТАМОЖЕННЫХ ОРГАНОВ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ В ЛЕЧЕБНО-ОЗДОРОВИТЕЛЬНЫХ УЧРЕЖДЕНИЯХ ФТС РОССИИ

I. Общие положения

1. Рекомендации о порядке отбора, направления и пребывания должностных лиц и работников таможенных органов Российской Федерации в лечебно-оздоровительных учреждениях ФТС России (далее — Рекомендации) устанавливают порядок отбора, направления и пребывания в лечебно-оздоровительных учреждениях ФТС России (далее — лечебно-оздоровительные учреждения) следующих категорий лиц: а) сотрудников таможенных органов Российской Федерации (далее — сотрудники), членов их семей, а также лиц, находящихся на иждивении сотрудника и проживающих совместно с ним <1>;

   ---

   <1> Часть 4 статьи 10 Федерального закона от 30 декабря 2012 г. N 283-ФЗ.

б) граждан Российской Федерации, уволенных со службы в таможенных органах с правом на пенсию и имеющих стаж службы (выслугу лет) в таможенных органах 20 лет и более (в том числе в льготном исчислении), за исключением лиц, уволенных со службы в таможенных органах по основаниям, указанным в части 8 статьи 3 Федерального закона от 30 декабря 2012 г. N 283-ФЗ «О социальных гарантиях сотрудникам некоторых федеральных органов исполнительной власти и внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации» (далее — пенсионеры), членов их семей и лиц, находящихся на иждивении пенсионера и проживающих совместно с ним <1>;

<1> Часть 6 статьи 10 Федерального закона от 30 декабря 2012 г. N 283-ФЗ.

в) граждан Российской Федерации, уволенных со службы в таможенных органах и ставших инвалидами вследствие увечья или иного повреждения здоровья, полученных в связи с выполнением служебных обязанностей, либо вследствие заболевания, полученного в период прохождения службы в таможенных органах (далее — лица, ставшие инвалидами) <1>;

<1> Часть 7 статьи 10 Федерального закона от 30 декабря 2012 г. N 283-ФЗ.

г) федеральных государственных гражданских служащих таможенных органов Российской Федерации (далее — гражданские служащие) и членов их семей; д) работников таможенных органов Российской Федерации, назначенных на должности работников организаций бюджетной сферы в соответствии с пунктами 7-9 статьи 3 Федерального закона от 30 июня 2002 г. N 78-ФЗ «О денежном довольствии сотрудников некоторых федеральных органов исполнительной власти, других выплатах этим сотрудникам и условиях перевода отдельных категорий сотрудников федеральных органов налоговой полиции и таможенных органов Российской Федерации на иные условия службы (работы)» (далее — работники), а также членов их семей; е) иных лиц, предусмотренных законодательством Российской Федерации. К членам семьи и лицам, находящимся на иждивении, относятся: — супруг (супруга), состоящие в зарегистрированном браке с сотрудником, пенсионером, гражданским служащим, работником; — супруг (супруга), состоявшие в зарегистрированном браке с погибшим (умершим) сотрудником на день гибели (смерти); — несовершеннолетние дети, дети старше 18 лет, ставшие инвалидами до достижении ими возраста 18 лет, дети в возрасте до 23 лет, обучающиеся в образовательных организациях по очной форме обучения; — лица, находящиеся на полном содержании сотрудника и пенсионера или получающие от него помощь, которая является для них постоянным и основным источником средств к существованию, а также иные лица, признанные иждивенцами в порядке, установленном законодательством Российской Федерации. В лечебно-оздоровительные учреждения принимаются дети в возрасте от 4 лет. Лица, имеющие право получения путевок по нескольким основаниям, получают путевки по одному основанию по выбору самого лица.

---

Примечание.
Нумерация разделов дана в соответствии с официальным текстом документа.

---

I. Организация и порядок отбора, направления лиц в лечебно-оздоровительные учреждения

2. В лечебно-оздоровительные учреждения направляются лица, указанные в пункте 1 Рекомендаций, не имеющие обострения основного заболевания или осложнений, а в случае наличия сопутствующей патологии — при относительной компенсации нарушенных патологическим процессом функций организма. 3. Направление лиц в лечебно-оздоровительные учреждения осуществляется в соответствии с планом распределения санаторно-курортных путевок (далее — путевки) по таможенным органам. План распределения путевок составляет Главное управление тылового обеспечения ФТС России (далее — Главное управление) и утверждает заместитель руководителя ФТС России, координирующий и контролирующий деятельность Главного управления. Плановые показатели распределения путевок на следующий год Главное управление доводит до лечебно-оздоровительных учреждений и таможенных органов до 1 декабря текущего года. 4. В соответствии с графиком заездов и планом распределения путевок государственное казенное учреждение «Санаторий «Победа» ФТС России» рассылает по таможенным органам ксерокопии путевок, заверенные печатью государственного казенного учреждения «Санаторий «Победа» ФТС России». 5. В соответствии с графиками заездов и планами распределения путевок Главное управление рассылает по таможенным органам ксерокопии путевок в государственное казенное учреждение «Санаторий «Электроника» ФТС России» и в государственное казенное учреждение «Пансионат «Белое солнце» ФТС России». 6. Ксерокопии путевок подлежат учету в таможенных органах. 7. Путевки в лечебно-оздоровительные учреждения выделяются не чаще одного раза в год. При наличии в таможенных органах невостребованных путевок в указанные ниже периоды они могут быть выделены во второй раз на основании решения санаторно-отборочных комиссий (далее — комиссии) согласно поданным заявлениям: — в государственное казенное учреждение «Санаторий «Победа» ФТС России» и его филиал в Республике Адыгея — с декабря по апрель; — в государственное казенное учреждение «Санаторий «Электроника» ФТС России» — с декабря по апрель; — в государственное казенное учреждение «Пансионат «Белое солнце» ФТС России» и его филиал в г. Светлогорске — с октября по май. 8. Отделы медицинского (социально-медицинского) обеспечения региональных таможенных управлений (далее — РТУ) распределяют выделенные путевки по таможням, осуществляют контроль за работой их комиссий в части рационального использования полученных путевок и обеспечивают обязательное использование выделенных РТУ путевок. Ежеквартально до 15 числа месяца, следующего за отчетным кварталом, РТУ, таможни, непосредственно подчиненные ФТС России, учреждения, находящиеся в ведении ФТС России, представляют в Главное управление отчет об использовании выделенных путевок (приложение N 1 к Рекомендациям). 9. Комиссии осуществляют отбор лиц для направления их на лечение и отдых на основании поданных заявлений (приложение N 3 к Рекомендациям) и справок для получения путевки (форма N 070/у-04) при направлении в государственное казенное учреждение «Санаторий «Победа» ФТС России» или государственное казенное учреждение «Санаторий «Электроника» ФТС России» из амбулаторно-поликлинических учреждений с обязательным учетом противопоказаний для проведения лечения в санаторно-курортных условиях. Сотрудники и пенсионеры, имеющие лиц, находящихся на их иждивении и постоянно проживающих с ними, представляют в комиссию копию документа о признании указанного лица иждивенцем. Пенсионеры (лица, ставшие инвалидами) обеспечиваются путевками по последнему месту службы. В случае ликвидации (реорганизации) таможенного органа пенсионеры (лица, ставшие инвалидами) прикрепляются в тот таможенный орган, который является правопреемником ликвидированного (реорганизованного) таможенного органа, или по согласованию с РТУ на основании заявления — в ближайший таможенный орган фактического проживания пенсионера (лица, ставшего инвалидом). Если пенсионер (лицо, ставшее инвалидом) изменил место жительства, то заявление на получение путевки он подает в комиссию ближайшего таможенного органа, которая обращается в комиссию таможенного органа по последнему месту службы, которая принимает решение о выделении ему путевки. При выделении путевки она направляется в таможенный орган по месту жительства пенсионера (лица, ставшего инвалидом), где ему и выдается путевка. Обратный талон путевки направляется в комиссию таможенного органа, выделившего путевку. Комиссии ведут поименный учет лиц, на которых распространяется действие однократного получения путевки в течение года. 10. Стоимость путевки в лечебно-оздоровительные учреждения устанавливается приказом ФТС России. Лица, указанные в подпунктах «а», «г», «д» и «е» пункта 1 Рекомендаций, оплачивают полную стоимость путевки. Пенсионеры приобретают путевки за плату в размере 25% стоимости путевки, члены семей пенсионеров и лица, находящиеся на иждивении пенсионеров и проживающие совместно с ним, приобретают путевки за плату в размере 50% стоимости путевки — один раз в год <1>.

---

<1> Часть 6 статьи 10 Федерального закона от 30 декабря 2012 г. N 283-ФЗ.

Лица, ставшие инвалидами, приобретают путевки за плату в размере 25% стоимости путевки <1>.

<1> Часть 7 статьи 10 Федерального закона от 30 декабря 2012 г. N 283-ФЗ.

11. Оплата путевки в лечебно-оздоровительные учреждения производится лицами, которым она выделена, в кассу лечебно-оздоровительного учреждения или предварительно безналичным путем на счет лечебно-оздоровительного учреждения. 12. Комиссии таможенных органов выдают заполненные путевки (их ксерокопии), заверенные печатью таможенного органа или учреждения, находящегося в ведении ФТС России, либо печатью комиссии. 13. При отсутствии возможности реализации путевок в лечебно-оздоровительные учреждения вследствие объективных причин РТУ, таможни, непосредственно подчиненные ФТС России, учреждения, находящиеся в ведении ФТС России, обязаны информировать об этом Главное управление не позднее чем за 1 месяц до даты заезда. В этих случаях возможна их передача по согласованию с Главным управлением в другие таможенные органы. 14. В случае невозможности реализации путевок к установленному сроку комиссии совместно с лечебно-оздоровительными учреждениями по согласованию с Главным управлением вправе направлять отдыхающих лиц по путевкам с сокращенным сроком пребывания с оплатой за путевку по указанному сроку. 15. Возврат денежных средств, перечисленных в лечебно-оздоровительные учреждения за неиспользованные путевки или в случае сокращения срока пребывания лиц в лечебно-оздоровительных учреждениях, возможен только в исключительных случаях (заболевание лица, смерть близкого родственника, отзыв из отпуска, подтвержденные соответствующими документами). Возврат денежных средств осуществляется на основании заявления лица, оплатившего путевку, письма начальника РТУ, начальника таможни, непосредственно подчиненной ФТС России, руководителя учреждения, находящегося в ведении ФТС России, начальника Главного управления (для центрального аппарата ФТС России) в лечебно-оздоровительное учреждение путем их перечисления на расчетный счет лица, оплатившего путевку. 16. Лицо, получившее путевку, по возвращении из лечебно-оздоровительного учреждения обязано сдать обратный талон к путевке, заверенный печатью лечебно-оздоровительного учреждения, в комиссию по месту получения ксерокопии путевки. Срок хранения обратного талона в комиссии — 3 года. 17. Дополнительные путевки (при согласии отдыхающих на уплотнение в номере санатория: размещение дополнительного койко-места) для членов семей лиц, поступающих в лечебно-оздоровительные учреждения, при наличии мест могут быть выделены Главным управлением по согласованию с лечебно-оздоровительными учреждениями.

II. Порядок приема и выписки лиц
в лечебно-оздоровительных учреждениях

18. Лица старше 18 лет при поступлении в лечебно-оздоровительные учреждения должны при себе иметь ксерокопию путевки, квитанцию об оплате путевки (в случае если оплата производилась безналичным путем), паспорт, санаторно-курортную карту для пребывания в государственном казенном учреждении «Санаторий «Победа» ФТС России», государственном казенном учреждении «Санаторий «Электроника» ФТС России» или справку об отсутствии медицинских противопоказаний — для пребывания в государственном казенном учреждении «Пансионат «Белое солнце» ФТС России», его филиале и в филиале государственного казенного учреждения «Санаторий «Победа» ФТС России» в с. Кабардинка, полис обязательного медицинского страхования (при его наличии). Лица, желающие получить лечение в государственном казенном учреждении «Пансионат «Белое солнце» ФТС России», его филиале и филиале государственного казенного учреждения «Санаторий «Победа» ФТС России» в с. Кабардинка, должны иметь при себе оформленную санаторно-курортную карту. Члены семьи, направленные в лечебно-оздоровительные учреждения без должностного лица, работника, пенсионера, должны иметь справку о родстве, заверенную кадровым подразделением (приложение N 2 к Рекомендациям). Лица, являющиеся иждивенцами, представляют копию нотариально заверенного документа о признании данного лица иждивенцем или копию с предъявлением оригинала такого документа. Пенсионеры, прибывшие в лечебно-оздоровительные учреждения, представляют справку, выданную комиссией таможенного органа, в котором они получают путевку, о том, что в текущем году они не использовали свое право на льготные путевки (приложение N 4 к Рекомендациям). 19. Дети в возрасте от 4 до 15 лет принимаются в лечебно-оздоровительные учреждения только на оздоровительный отдых, старше 15 лет — с предоставлением лечения. При этом представляются следующие документы: ксерокопия путевки, квитанция об оплате путевки (в случае если оплата производилась безналичным путем), свидетельство о рождении ребенка или паспорт, справка врача об отсутствии контактов ребенка с инфекционными больными по месту жительства, в дошкольных учреждениях или в школе. 20. Прием и выписка лиц производится в сроки, указанные в путевках. Обслуживание начинается с 8 часов утра в день заезда и заканчивается в 8 часов утра дня, следующего за последним днем, указанным в путевке. 21. В случае прибытия в лечебно-оздоровительные учреждения по уважительным причинам ранее установленного времени, но не более чем на 12 часов, срок нахождения лиц в санаторно-курортной организации заканчивается в 20 часов последнего дня, указанного в путевке. 22. При опоздании лиц к началу срока заезда, указанного в путевке, пропущенные дни не восстанавливаются и денежные средства за указанные дни не возвращаются. 23. Прием лиц в лечебно-оздоровительные учреждения не разрешается в следующих случаях: — при отсутствии ксерокопий путевок, выданных установленным порядком комиссией; — при отказе оплачивать пребывание в лечебно-оздоровительном учреждении; — при отсутствии у детей, поступающих в лечебно-оздоровительные учреждения, справки врача об отсутствии контактов ребенка с инфекционными больными по месту жительства, в дошкольных учреждениях или в школе. 24. За нарушение режима лица, находящиеся в лечебно-оздоровительном учреждении, могут быть выписаны досрочно. 25. Бланки путевок подлежат учету в лечебно-оздоровительных учреждениях в установленном порядке. Бланк использованной путевки хранится в бухгалтерии лечебно-оздоровительного учреждения в течение 5 лет.

Начальник Главного управления
тылового обеспечения
В.В.ГОРСКИЙ

Приложение N 1
к Рекомендациям о порядке отбора,
направления и пребывания
должностных лиц и работников
таможенных органов Российской
Федерации в лечебно-оздоровительных
учреждениях ФТС России

Образец

                  Отчет об использовании выделенных путевок               в лечебно-оздоровительные учреждения ФТС России                   за ____________ квартал __________ года                   _______________________________________                      (наименование таможенного органа)

   N     Фамилия,     Наименование  Категория       Лечебно-         Дата      N       п/п      имя,       таможенного                оздоровительное    заезда  путевки           отчество        органа                    учреждение                         

Начальник _____________________ Председатель комиссии ____________________

               (звание, ФИО,                            (ФИО, подпись, дата)               подпись, дата) 

---

---

Приложение N 2
к Рекомендациям о порядке отбора,
направления и пребывания
должностных лиц и работников
таможенных органов Российской
Федерации в лечебно-оздоровительных
учреждениях ФТС России

Образец

СПРАВКА <*>

Дана Иванову Николаю Ивановичу о том, что он (она) действительно является должностным лицом (пенсионером, работником, иным лицом, предусмотренным законодательством Российской Федерации) таможенных органов.

В личном деле Н.И. Иванова значатся: жена — Иванова Ирина Анатольевна, 1965 года рождения; дочь — Иванова Марина Николаевна, 1999 года рождения.

Настоящая справка выдана для представления в государственное казенное учреждение «Санаторий «Победа» ФТС России» (государственное казенное учреждение «Санаторий «Электроника» ФТС России», государственное казенное учреждение «Пансионат «Белое солнце» ФТС России»).

Начальник (заместитель начальника)
таможенного органа <**> ____________________

---

<> Справка заполняется на бланке таможенного органа и заверяется печатью кадрового подразделения таможенного органа. <*> Для должностных лиц центрального аппарата ФТС России справку подписывает начальник Управления государственной службы и кадров или его заместитель.

Приложение N 3
к Рекомендациям о порядке отбора,
направления и пребывания
должностных лиц и работников
таможенных органов Российской
Федерации в лечебно-оздоровительных
учреждениях ФТС России

                     Председателю санаторно-отборочной комиссии                     _______________________________________________________                                (наименование таможенного органа)                     от ____________________________________________________                                     (должность, подразделение)                     _______________________________________________________                               (фамилия, имя, отчество полностью)                     _______________________________________________________                                  (число, месяц, год рождения)                     телефон _______________________________________________                                     (служебный, мобильный, домашний)                     категория  (нужное подчеркнуть): сотрудник, федеральный                     государственный    гражданский    служащий,   работник,                     назначенный  на должность в  соответствии с пунктами 7-                     9 статьи 3 Федерального закона 30 июня 2002 г. N 78-ФЗ,                     гражданин  Российской  Федерации, уволенный со службы в                     таможенных  органах  с  правом на пенсию и имеющий стаж                     службы  (выслугу  лет)  в  таможенных  органах 20 лет и                     более   (в   том   числе  в  льготном  исчислении),  за                     исключением  лиц,  уволенных  со  службы  в  таможенных                     органах  по  основаниям,  указанным  в части 8 статьи 3                     Федерального  закона  от  30  декабря 2012 г. N 283-ФЗ,                     гражданин  Российской  Федерации, уволенный со службы в                     таможенных   органах  и  ставший  инвалидом  вследствие                     увечья  или  иного  повреждения здоровья, полученного в                     связи   с   выполнением  служебных  обязанностей,  либо                     вследствие    заболевания,    полученного    в   период                     прохождения  службы  в  таможенных  органах, иное лицо,                     предусмотренное законодательством Российской Федерации.                                  ЗАЯВЛЕНИЕ

Прошу предоставить путевку (путевки) в ____________________________________

---

(наименование санаторно-курортного учреждения) мне и членам моей семьи (жене, мужу, ребенку, иждивенцу) __________________

---

(фамилия, имя, отчество полностью, год рождения) на период ________________________________________________________________.

Согласен на обработку, хранение и предоставление в лечебно-оздоровительные учреждения ФТС России моих персональных данных и персональных данных членов моей семьи и лиц, находящихся на моем иждивении и совместно проживающих со мной.

Дата ________________________ Подпись ________________________

Ходатайствую по существу данного заявления

---

(подпись) (Ф.И.О. начальника подразделения)

К заявлению прилагаются:
1. Медицинская справка по форме N 070/у-04; 2. Для пенсионеров таможенных органов — копия пенсионного удостоверения с отметкой о праве на льготы; 3. Документ, подтверждающий инвалидность

Приложение N 4
к Рекомендациям о порядке отбора,
направления и пребывания
должностных лиц и работников
таможенных органов Российской
Федерации в лечебно-оздоровительных
учреждениях ФТС России

СПРАВКА <*>

Дана гр. ______________________________________________________________

---

о том, что он (она) действительно является пенсионером Федеральной таможенной службы (_________________________________) с выслугой 20 лет и

(наименование РТУ, таможни) более и право на приобретение один раз в год путевок на санаторно-курортное лечение за плату в размере 25 процентов стоимости путевки и 50 процентов стоимости путевки для членов семьи и лиц, находящихся на его (ее) иждивении и совместно проживающими с ним (с ней) на «__» _____________ 20__ г. не использовано.

Справка выдана для предъявления в лечебно-оздоровительное учреждение ФТС России.

---

(должностное лицо, выдавшее справку) (подпись) (ФИО)

«__» _______________ 20 г.

М.П.

---

<*> Справка выдается при получении путевки.

---