УТВЕРЖДАЮ
Зам. Председателя
Комитета здравоохранения
И.А.ЛЕШКЕВИЧ
9 декабря 2000 г.
СОГЛАСОВАНО
Главный медицинский генетик
Комитета здравоохранения
Г.Г.ГУЗЕЕВ
9 декабря 2000 г.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ДЕТЕКЦИИ КЛЕТОК ПЛОДА В КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН В ЦЕЛЯХ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ
ИНФОРМАЦИОННОЕ ПИСЬМО
(N 21)
Председатель УМС
Комитета здравоохранения
Л.Г.КОСТОМАРОВА
8 декабря 2000 г.
Учреждение-разработчик: Медико-генетический научный центр РАМН. Составители: д.б.н. Т.В.Золотухина, к.м.н. Н.В.Шилова, к.б.н. И.А.Замулаева. Предназначение: для использования в учреждениях, специализирующихся на пренатальной диагностике и профилактике врожденных и наследственных заболеваний.
Новый неинвазивный подход в пренатальной диагностике хромосомных анеуплоидий базируется на возможности исследования клеток плода, выделенных из крови беременных женщин. Феномен трансплацентарной трансфузии различных клеток плода в периферическую кровь беременных женщин позволяет подойти к проблеме пренатальной диагностики хромосомных нарушений у плода без проведения инвазивных процедур. В связи с очень низкой концентрацией клеток плода в крови матери необходимо использование биотехнологических этапов их обогащения, сортировки (или сепарации) и высокоспецифичного анализа. На основании результатов проведенного исследования составлена настоящая инструкция по обогащению и детекции клеток плода с помощью методов сортировки и последующего FISH-анализа сортированных клеток с использованием хромосомо-специфичных ДНК-зондов на хромосомы наиболее частых трисомий у человека. Объектом сортировки последующего анализа были эритробласты плода, не сохраняющиеся в организме матери от плодов предыдущих беременностей. С согласия пациенток, 10-25 мл периферической венозной крови из локтевой вены забирали в стерильный флакон (Nunc), содержащий в качестве антикоагулянта 1-2 мл раствора гепарина (Richter) в растворе фосфатно-солевого буфера (0,01М PBS, рН 7,2) в соотношении 1:20. В случаях, когда проводилась пренатальная цитогенетическая диагностика, венозную кровь у женщин брали спустя 5-7 дней после инвазивной процедуры. Обычно полученные образцы крови до последующей обработки хранили при комнатной температуре в пределах 24 часов.
Методы обогащения материнской крови
плодными клетками
Для обогащения материнской крови клетками плода проводили центрифугирование образцов в градиенте плотности фиколла с целью выделения фракции мононуклеарных клеток. При этом нативную венозную кровь разводили 0,01М раствором PBS (рН 7,2) в соотношении 1:1, наслаивали на Ficoll Paque (Pharmacia Biotech) или фиколверографин (Панэко) с плотностью 1,077 г/куб. см в соотношении 2:1 и центрифугировали в градиенте плотности при 400 g 30 минут на центрифуге К-70. Фракцию мононуклеарных клеток отбирали пастеровской пипеткой, отмывали дважды в 0,01М растворе PBS, центрифугируя при 1500 об./мин. 15 минут на центрифуге ОПн-3. Концентрацию ядерных клеток в 1 мл крови определяли в камере Горяева.
Детекция эритробластов плода
В зависимости от последующих методов изоляции плодных эритробластов процедуры детекции отличались друг от друга.
При использовании флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (ФАКС) осадок выделенных мононуклеарных клеток ресуспензировали в 0,01М растворе PBS с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и подвергали прямому флуоресцентному окрашиванию с помощью моноклональных антител к поверхностным антигенам нормобластов: к гликофорину А, меченных фикоэ-ритрином (РЕ) (GPA + PE, клон D2.10, Coulter), из расчета 10 мкл на 1
7
x 10 ядерных клеток и к трансферрину, меченных изотиацианатом флуоресцеина
7 (FITC) (CD71 + FITC, Becton Dickinson), из расчета 20 мкл на 1 x 10 ядерных клеток. При отрицательной сортировке использовали моноклональные антитела к поверхностным антигенам лимфоцитов (CD45 + FITC, Becton
7 Dickinson) из расчета 20 мкл на 1 x 10 ядерных клеток. Клетки инкубировали 1 час в темноте при комнатной температуре, центрифугировали при 3000 Об./мин. 5 минут, осадок клеток ресуспендировали в 0,01М растворе PBS, центрифугировали при 3000 об./мин. 5 минут и полученный клеточный осадок фиксировали в 1 мл 1% раствора формальдегида в PBS. Образцы до непосредственной клеточной сортировки хранили при +4 град. С. Для прокрашивания ДНК за 20 минут до анализа к клеткам добавляли Hoechst 33342 (Sigma) в конечной концентрации 10 мкг/мл. При магнитно-активированной клеточной сортировке (МАКС) использовали моноклональные антитела, связанные с магнитными носителями. Сортировку клеток проводили в магнитном поле. Иммуномагнитные шарики предварительно отмывали в растворе PBS с 0,2% БСА в соотношении 1:20 с последующим разделением магнитных шариков и буферного раствора на кобальто-самариевом магнитном носителе (Immunotech) в течение 5 минут. Суспензию клеток с иммуномагнитными шариками инкубировали при комнатной температуре 10 мин., осторожно перемешивая после 5 мин. инкубации.
Флуоресцентно-активированная клеточная
сортировка (ФАКС)
Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре-сортировщике FACS Vantage (Becton Dickinson) не позднее, чем через 24 часа после окрашивания. Проточный цитофлюориметр был оборудован лазером (Enterprise 621, Coherent Inc.) с эмиссией 2-х волн: 364 нм (для возбуждения флюоресценции Hoechst 33342) и 488 нм (для возбуждения флюоресценции FITC и РЕ). Анализ клеток проводили по 5 параметрам: интенсивность бокового и прямого светорассеяния, флюоресценции FITC, РЕ и Hoechst 33342. Для измерения флюоресценции FITC использовали узкополосные фильтры 530/30 нм, РЕ — 575/26 нм, Hoechst 33342 — 424/40 нм. Мощность лазера составляла 20 mW для пучка с длиной волны 364 нм и 100-120 mW для пучка с длиной волны 488 нм.
Юстировку прибора проводили с помощью 2-мкм калибровочных шариков (Becton Dickinson), флюоресцирующих в диапазоне FITC и РЕ, а также тимоцитов теленка (Becton Dickinson), окрашенных Hoechst 33342. Качество сортировки проверяли с помощью 6 мкм шариков, окрашенных различными
3 флуорохромами. Анализ и сортировку проводили со скоростью 1,5-2,0 x 10 кл/сек. с использованием программы Lysys II (Becton Dickinson). ФАКС проводилась старшим научным сотрудником лаборатории пострадиационного восстановления Медицинского радиологического научного Центра РАМН к.б.н. Замулаевой И.А. (руководитель лаборатории — д.м.н., профессор Саенко А.С.). Отсортированные клетки наносили на ограниченные участки предметных стекол, обработанных 2% раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана в ацетоне. В первой серии образцов (с 1 по 14) на препараты с клетками наносили по 200 мкл 0,05М раствора КС1 и инкубировали при 37 град. С в течение 20 минут. Гипотонический раствор аккуратно сливали и наносили 200 мкл раствора, содержащего 30% фиксатора (метанол-уксусная кислота 3:1) и 70% 0,075М раствора КС1 на 5 минут при комнатной температуре. Затем раствор аккуратно сливали и на стекло наносили 1 мл свежеприготовленного фиксатора с высоты 50-60 см. После удаления фиксатора стекла высушивали при 60 град. С в течение 5 минут и дегидратировали в 70%, 80% и 96% этаноле. Во второй серии образцов (с 15 по 28) препараты с клетками инкубировали с 0,005% раствором пепсина в 0,01М растворе НС1 в течение 30 минут при 37 град. С. Стекла промывали в растворе PBS при комнатной температуре в течение 5 минут с последующей фиксацией в 1% растворе формальдегида в растворе PBS в течение 5 минут. Затем в течение 5 минут стекла промывали в растворе PBS и дегидратировали в 70%, 80% и 96% этаноле по 2 минуты в каждом.
Магнитно-активированная клеточная сортировка (МАКС)
Непосредственно после инкубации выделенных клеток с анти-CD45 иммуномагнитными шариками пробирку с клеточной суспензией помещали на кобальто-самариевый магнитный держатель на 10 минут. Не удаляя пробирку из магнитного поля, аккуратно переносили супернатант в чистую пробирку, которую повторно ставили на магнитный держатель на 10 минут. Супернатант собирали в чистую пробирку и наносили на ограниченные участки предварительно прогретых до 37 град. С предметных стекол, покрытых 2% раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана в ацетоне. На препараты с клетками наносили 200 мкл 0,05М раствора КС1 и инкубировали при 37 град. С в течение 20 минут. Гипотонический раствор аккуратно сливали и наносили 200 мкл раствора, содержащего 30% фиксатора (метанол-уксусная кислота 3:1) и 70% 0,075М раствора КС1 на 5 минут при комнатной температуре. Затем раствор аккуратно сливали и на стекло наносили 1 мл свежеприготовленного фиксатора с высоты 50-60 см. После удаления фиксатора стекла высушивали при 60 град. С в течение 5 минут с последующей дегидратацией в 70%, 80% и 96% этаноле.
Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH)
Флюоресцентную in situ гибридизацию (FISH) проводили на препаратах с итерфазными ядрами клеток плода, полученных из цельной периферической крови беременных женщин при использовании различных методов клеточной сортировки и культивирования по методу Pinkel с соавторами (Pinkel et al., 1986), в модификации, разработанной в лаборатории цитогенетики человека под руководством проф., д.б.н. Юрова Ю.Б. (НЦ психического здоровья РАМН). Во всех случаях при регулярных трисомиях у плодов были использованы биотинилированные центромерные альфа-сателлитные ДНК-пробы МCG13.21-01 (13; 21cen), MCG18-01 (18cen), MCGX-01 (Xcen), сконструированные в лаборатории цитогенетики человека НЦ психического здоровья РАМН под руководством проф. Юрова Ю.Б. Описание этих последовательностей представлено в работах проф. Юрова Ю.Б. с соавторами [Юров 1987, Юров и др. 1989, Yurov et al., 1997]. В двух случаях, когда кариотипы плодов были 46, XY, -14, +t(14/21)mat и 46, XX, -21, +t(21/21), мы использовали биотинилированный РАС-клон, несущий хромосомо-21-специфичную однокопийную вставку на район 21q22.3, полученный в лаборатории проф. Юрова Ю.Б. Кроме того, была использована биотинилированная ДНК-проба pY3.4, содержащая фрагмент длиной 3,4kb. из Нае III повторов гетерохроматинового района Y-хромосомы человека, сконструированная Dr. Lau Y.F. (University of California, San Francisco, CA). При проведении FISH с альфа-сателлитными ДНК-зондами по 1 мкл альфа-сателлитных ДНК-проб разводили в 9 мкл гибридизационной смеси (55% формамид, 2xSSC) до конечной концентрации 2 нг/мкл. Полученную смесь наносили на препараты с отсортированными клетками, предварительно обработанными различными способами в зависимости от метода детекции (пп. 2.3., 2.4., 2.5., 2.6.), накрывали покровными стеклами размером 22×22 мм и прогревали при 78 град. С в течение 7 минут для одновременной денатурации ДНК зонда и хромосом. Гибридизацию проводили во влажной темной камере при 37 град. С в течение 16-18 часов. После удаления покровных стекол препараты отмывали в 50% формамиде, 2xSSC при 42 град. С в течение 15 минут, затем в 0,1xSSC при 45 град. в течение 30 минут, однократно ополаскивали в 4xSSC/0,1% Triton Х-100. На препараты наносили по 20 мкл авидина, меченного FITC (FITC-avidin «Vector») в концентрации 5 мкг/мл в 0,5% растворе бычьего сывороточного альбумина в 4xSSC, накрывали покровными стеклами 22×22 мм и инкубировали во влажной камере 30 минут при 37 град. С. Затем удаляли покровные стекла и отмывали препараты в трех сменах раствора 4xSSC, 0,1% Triton Х-100 при 42 град. С по 5 минут. Для усиления гибридизационного сигнала проводилась иммунологическая амплификация с биотинилированными антителами к авидину (Antiavidin «Vector»). Для этого на препараты наносили 20 мкл антиавидина в концентрация 5 мкг/мл в 0,5% растворе БСА в 4xSSC, накрывали покровными стеклами размером 22×22 мм и инкубировали 30 минут при 37 град. С во влажной камере. Затем покровные стекла удаляли и препараты отмывали в трех сменах раствора 4xSSC/0,1% Triton X-100 при 42 град. С по 5 минут. Затем на препараты наносили по 20 мкл FINC-avidin в концентрации 5 мкг/мл, накрывали покровными стеклами размером 22×22 мм и инкубировали 30 минут при 37 град. С во влажной камере. После удаления покровных стекол препараты отмывали в трех сменах раствора 4xSSC, 0,1% Triton X-100 при 42 град. С по 5 минут. Для контрастирующего окрашивания ядер на препараты наносили 20 мкл смеси, состоящей из раствора йодистого пропидия в концентрации 200 нг/мл в фотозащитном растворе, содержащем противовыцветающий реагент — 2% 1,4-диазобицикло-[2.2.2]октан (DABCO) в 50% глицерине на 20мМ Tris-HCl (pH 8,0) и накрывали покровными стеклами 22×22 мм. При проведении FISH с pY3.4 ДНК-зондом по 1 мкл ДНК-зонда разводили в 6 мкл гибридизационной смеси до конечной концентрации 2 нг/мкл. Полученную смесь наносили на препараты с изолированными и предварительно обработанными клетками, в зависимости от способов детекции, и накрывали покровными стеклами размером 22×22 мм. Одновременную денатурацию препаратов и ДНК-зонда проводили в течение 7 минут при 78 град. С с последующей гибридизацией во влажной камере при 37 град. С в течение 16-18 часов. После удаления покровных стекол препараты отмывали в 50% формамиде, 2xSSC при 37 град. С в течение 30 минут, затем в 2xSSC при 37 град. С 30 минут. Для детекции гибридизационного сигнала на препараты наносили FITC-avidin «Vector» в концентрации 5 мкг/мл, накрывали покровными стеклами размером 22×22 мм и инкубировали во влажной камере при 37 град. С в течение 30 минут. Затем удаляли покровные стекла и отмывали препараты в трех сменах раствора 4xSSC по 5 минут при 37 град. С и однократно — в растворе PBS. Для окраски препаратов наносили по 20 мкл смеси, содержащей йодистый пропидий в концентрации 200 нг/мл в фотозащитном растворе и накрывали покровными стеклами размером 22×22 мм. В случаях, когда использовался однокопийный ДНК-зонд на теломерный участок хромосомы 21 (21q22.3), проводили раздельную денатурацию ДНК выделенных клеток и ДНК-пробы. Денатурацию препаратов с предварительно обработанными клетками проводили в 70% формамиде, 2хSSC при 70 град. С в течение 2 минут с последующей дегидратацией в серии спиртов 70 град., 80 град. и 96 град. по 5 минут в каждом. 50 нг фаговой ДНК-пробы смешивали с 2 мкг Cot 1 человеческой ДНК (Gibco BRL) в 10 мкл гибридизационной смеси, содержащей 50% формамид, 2xSSC, 10% декстрансульфат. Денатурацию ДНК-зонда в гибридизационной смеси осуществляли прогреванием в течение 5 минут при 100 град. С на водяной бане. Гибридизационную смесь по 10 мкл наносили на препараты, накрывали покровными стеклами размером 22×22 мм и инкубировали во влажной камере при 37 град. С в течение 16-18 часов. Постгибридизационная отмывка, детекция гибридизационного сигнала и иммунологическая амплификация проводились как описано в п. 2.9.1. Микроскопирование проводили на флуоресцентном микроскопе Opton Axioscop со светофильтром N 9 (длина волны 510 нм) для анализа флуоресценции FITC и на флуоресцентном микроскопе Jenalumar со светофильтрами «U-204» и «В-226» (длина волны 410 нм) для анализа флуоресценции Hoechst 33342. Фотографирование клеток осуществляли на пленку Kodak Ectachrome ASA 200. В результате проведенного исследования получены результаты, свидетельствующие о возможности выделения, детекции и анализа клеток плода, присутствующих в крови беременных женщин. Во всех образцах крови женщин, беременных плодами мужского, пола при использовании обоих методических подходов сортировки (ФАКС и МАКС), при последующем FISH-анализе с Y-хромосомо-специфичным ДНК-зондом были обнаружены эритробласты плода (Y + клетки) в среднем в 1,9% среди сортированных клеток. Эти результаты позволили использовать данный метод для изоляции и анализа клеток плода при хромосомных анеуплоидиях, диагностированных у плода при проведении классической пренатальной цитогенетической диагностики. Результаты FISH-анализа клеток плода, сортированных методом ФАКС из крови женщин, беременных плодами с хромосомными анеуплоидиями, убедительно свидетельствуют о том, что при использовании FISH-метода с соответствующими хромосомо-специфичными ДНК-зондами можно выявить аберрантные клетки плода в крови беременных женщин. Причем их концентрация в сортированных образцах была равна в среднем 4%, что статистически значимо выше, чем при беременности здоровым плодом (1,9%). При сравнении качества сортированных клеток и результатов их последующего FISH-анализа можно сделать вывод, что более физиологичным, и поэтому более предпочтительным, является метод магнитно-активированной сортировки, поскольку позволяет получить для анализа не поврежденные, структуированные (менее травмированные) клетки. Такое качество сортированных клеток способствует более эффективной гибридизации при FISH-методе и, соответственно, более корректному анализу гибридизационных сигналов с хромосомо-специфичными ДНК-зондами. Новый неинвазивный метод пренатальной диагностики хромосомных анеуплоидий может быть использован как дополнительный или даже как альтернативный при невозможности проведения инвазивной диагностики.
