Общая фармакопейная статья “Общие принципы анализа цитокинов и интерферонов методом ВЭЖХ. ОФС.1.7.2.0015.15” (“Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II”) Общая фармакопейная статья “Метод спектроскопии ЯМР для определения подлинности полисахаридных вакцин. ОФС.1.7.2.0014.15” (“Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II”) Общая фармакопейная статья “Полимеразная цепная реакция. ОФС.1.7.2.0013.15” (“Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II”) Общая фармакопейная статья “Производственные пробиотические штаммы и штаммы для контроля пробиотиков. ОФС.1.7.2.0012.15” (“Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II”) Общая фармакопейная статья “Требования к клеточным культурам – субстратам производства иммунобиологических лекарственных препаратов. ОФС.1.7.2.0011.15” (“Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II”) Приказ Минздрава МО от 21.07.2015 N 1017 “О создании Экспертного Совета по педиатрии Министерства здравоохранения Московской области”

new_adm

8 лет назад

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

Примечание.
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/feml, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Текст документа

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Общие принципы анализа цитокинов и интерферонов методом ВЭЖХ ОФС.1.7.2.0015.15
Вводится впервые

Данная общая фармакопейная статья распространяется на анализ цитокинов и интерферонов методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Метод ОФ ВЭЖХ также используется для установления подлинности и определения содержания действующего вещества, специфических и неспецифических примесей группы цитокинов и интерферонов, а также ряда вспомогательных веществ, входящих в состав данной группы иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП).

Метод обращенно-фазной ВЭЖХ

Принцип метода ОФ ВЭЖХ основан на распределении компонентов смеси между полярным элюентом и неполярными группами алкидных цепочек на поверхности сорбента. В условиях ОФ ВЭЖХ для цитокинов и интерферонов характерно наличие нескольких точек связывания с сорбентом, вследствие чего переход от прочной, почти полной сорбции вещества в неподвижной фазе к его преимущественному нахождению в подвижной фазе может быть очень резким. Постепенное увеличение силы элюента (например, повышение концентрации органического растворителя) может длительное время оставаться без видимого эффекта. Затем, при достижении критического значения элюирования, происходит быстрое перераспределение вещества в пользу подвижной фазы. В связи с этим анализ цитокинов и интерферонов методом ОФ ВЭЖХ проводят в условиях градиентного элюирования, в процессе которого для каждого белка создаются условия быстрой десорбции.

Градиентное элюирование

Величина среднего фактора емкости (k), характеризующего удерживание сорбента в условиях градиентного элюирования, прямо пропорциональна продолжительности градиента и обратно пропорциональна разнице в содержании органического растворителя в начальной и конечной точках градиента. Для получения удовлетворительных значений k для молекул белков цитокинов и интерферонов необходимо использовать разделение с продолжительным временем градиента и, по возможности, с меньшей разницей в содержании органического растворителя в начальной и конечной точках градиента. Как правило, продолжительность градиента в большинстве методик анализа цитокинов и интерферонов не превышает 60 мин. Другим важным параметром является крутизна градиента – изменение процентного содержания ацетонитрила в подвижной фазе в единицу времени. В связи с тем, что в препаратах цитокинов и интерферонов наряду с основным действующим веществом содержатся, как правило, близкородственные примеси, нужно задавать необходимую пологую форму градиента ( в мин.), которая позволяет обеспечить достаточно четкое разрешение пиков для определения чистоты препарата. Выбор подвижной фазы. В обращенно-фазной хроматографии подвижная фаза состоит из буферного раствора и органического растворителя. При разделении белков и пептидов в состав растворов подвижной фазы, как правило, входят разбавленные растворы кислот: фосфорной, трифторуксусной, муравьиной, уксусной или гептафтормасляной. В качестве органического компонента подвижной фазы при анализе белков и пептидов методом ОФ ВЭЖХ наиболее часто используется ацетонитрил, обладающий низкой вязкостью и низким поглощением в УФ диапазоне с высоким разрешением и получением узких пиков правильной формы. Помимо ацетонитрила, в состав подвижной фазы могут входить метанол, пропанол и изопропанол. Детектирование пептидов и белков проводится по УФ-поглощению пептидной связи в диапазоне от 205 до 220 нм. Выбор колонки. Наиболее часто для анализа пептидов и белков используются колонки с сорбентами на основе силикагеля с привитыми лигандами в виде прямоцепочечных алкильных групп (C4, C8, C18 и размером частиц не более 5 мкм), увеличение длины цепи которых увеличивает время удерживания определяемых компонентов. Температура колонки. При испытании показателя подлинности лекарственных препаратов для получения воспроизводимых результатов времени удерживания анализируемых компонентов необходимо обеспечить термостатирование колонки с точностью °С.

Анализ вспомогательных веществ

Метод ОФ ВЭЖХ используется также для определения содержания в препаратах цитокинов и интерферонов таких вспомогательных веществ, как маннит, бензиловый спирт, м-крезол, полисорбат-80 и метионин. Все перечисленные вещества, за исключением метионина, анализируются в изократических условиях. Для анализа метионина используют режим градиентного элюирования. Для анализа всех веществ, за исключением маннита, используются колонки, заполненные обращенно-фазными сорбентами C18 или C8 с размером частиц 5 мкм и порами размером 60-120 . Для определения маннита используют колонку, заполненную силикагелем, к поверхности которого привиты лиганды, содержащие аминогруппы. При определении содержания маннита, полисорбата-80, м-крезола в качестве подвижной фазы используют смеси ацетонитрила или метанола в различной концентрации с водой. Для определения спирта бензилового используют смесь ацетонитрила (или метанол) с ацетатным буфером (pH 5,6). Полисорбат-80 определяют по количеству образовавшейся в процессе щелочного гидролиза олеиновой кислоты или по суммированным пикам без дополнительной обработки лекарственного средства. Для обнаружения всех вспомогательных веществ, за исключением маннита, используют УФ-детектор. При определении маннита применяют рефрактометрический детектор. Условия проведения анализа (пробоподготовка, тип колонки, состав подвижной фазы, вид элюирования, способ детектирования, учет и интерпретация результатов) должны быть изложены в фармакопейных статьях или нормативной документации.

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Метод спектроскопии ЯМР для определения подлинности полисахаридных вакцин ОФС.1.7.2.0014.15
Вводится впервые

Метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) предназначен для идентификации и контроля подлинности полисахаридных вакцин. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса – физический метод анализа, основанный на регистрации переходов между ядерными магнитными энергетическими уровнями молекул вещества, находящегося в постоянном магнитном поле. Переходы между ядерными магнитными уровнями возможны для ядер, обладающих ненулевым магнитным моментом, то есть для ядер со спиновым квантовым числом 1, не равным нулю. Практическое значение с точки зрения распространенности и чувствительности имеет наблюдение ЯМР на ядрах 1Н, 13С, 15N, 19F и 31P. Все перечисленные магнитно-активные ядра имеют спин, равный 1/2. Набор переходов между всевозможными магнитными энергетическими состояниями магнитно активных ядер в молекуле составляет спектр ЯМР. Спектр ЯМР является характеристическим для каждого вещества и поэтому может применяться для его идентификации. На результирующий спектр ЯМР оказывают влияние условия регистрации: агрегатное состояние вещества, температура, наличие других веществ в анализируемом образце. Основными характеристиками спектров ЯМР являются химический сдвиг, измеряемый в миллионных долях (м.д.), мультиплетность, интегральная интенсивность сигналов, а также константы спин-спинового взаимодействия, определяющие расщепление сигналов ЯМР и измеряемые в герцах (Гц). Эти характеристики зависят от химического окружения данного ядра или группы ядер, от типа и числа соседних ядер, обладающих магнитным моментом, от их пространственного расположения, а также от условий, в которых регистрируется спектр ЯМР, С целью идентификации и контроля подлинности полисахаридных вакцин регистрируются спектры ЯМР на ядрах углерода 13 (ЯМР 13C) в контролируемых условиях. Спектроскопия ЯМР на ядрах 1Н для образцов полисахаридов не является характеристической из-за сильного перекрывания сигналов.

Регистрация спектра ЯМР 13C

Предварительно в датчике спектрометра ЯМР устанавливают температуру 35 °С. В случае исследования вязких растворов температура может быть увеличена до 70 °С. Перед началом регистрации спектра исследуемый образец выдерживают в датчике спектрометра для установления необходимой температуры не менее 5 мин. Для калибровки шкалы химических сдвигов спектрометра регистрируют спектр ЯМР 13C 20% раствора 1,4-диоксана в дейтерия оксида (D2O). Химический сдвиг сигнала 1,4-диоксана устанавливают как 67,4 м.д. Спектры ЯМР 13C образцов полисахаридных вакцин регистрируют в тех же условиях. Параметры регистрации спектров ЯМР 13C образцов полисахаридных вакцин: Величина импульса: 45 °;
Спектральное разрешение: < 1 Гц/точка;
Время между импульсами: не менее 1 с;
Температура регистрации: 35 °С.
Параметры обработки спектров ЯМР 13C:
Взвешивающая функция: экспонента;
Параметр уширения взвешивающей функции: 2 Гц; Коррекция базовой линии: полиноминальная. Критерии пригодности спектров ЯМР 13C для анализа: Отношение сигнал/шум: ;
Результирующая ширина спектральных линий: < 20 Гц. Анализ спектров 13C образцов полисахаридных вакцин: - выделяется спектральный диапазон аномерных атомов углерода 95-105 м.д.; - в выделенном спектральном диапазоне идентифицируются характеристические сигналы для полисахаридов вакцины. Эти сигналы должны быть охарактеризованы определенными химическими сдвигами, уникальными для данного полисахарида, с соответствующими доверительными интервалами; - в выделенном спектральном диапазоне определяется отсутствие других сигналов, не относящихся к полисахаридам вакцины; - записывается 13C спектр, соответствующий спектральному диапазону аномерных атомов углерода, с указанием цифровых значений химических сдвигов всех характеристических сигналов. Также приводится запись полного спектра (0-210 м.д.) с указанием цифровых значений химических сдвигов характеристических сигналов. Для идентификации и определения подлинности полисахаридной вакцины требуется одновременное выполнение условий как наличия всех характеристических сигналов с определенными химическими сдвигами, находящихся в границах доверительных интервалов, так и отсутствия любых других сигналов, не относящихся к целевому полисахариду. Конкретный набор характеристических сигналов с соответствующими доверительными интервалами приводится в фармакопейной статье и нормативной документации. Примечания.
1. Испытуемый образец. Образец массой от 10 до 20 мг (количество должно быть достаточным для регистрации спектра 13C, пригодного для анализа в соответствии с критерием пригодности по соотношению сигнал/шум) растворяют в 0,6 мл дейтерия оксида (D2O) 99,9 ат.% D, раствор центрифугируют 20 мин. при 2000 об./мин. Надосадочную жидкость переносят в помеченную ампулу для регистрации спектров. 2. Раствор для калибровки. В ампулу для спектроскопии ЯМР помещают 480 мкл D2O, добавляют 120 мкл 1,4-диоксана и перемешивают.

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Полимеразная цепная реакция
ОФС.1.7.2.0013.15
Вводится впервые

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой многократное ферментно-опосредованное умножение (амплификацию) заданного участка ДНК длиной от десятков до нескольких тысяч пар оснований (п.о.), границы которого соответствуют коротким олигонуклеотидным последовательностям – праймерам, т.е. ПЦР представляет собой циклический синтез in vitro выбранного фрагмента ДНК. Каждый цикл состоит из трех этапов: денатурации, гибридизации и синтеза цепи ДНК. Для выявления РНК-содержащих микробов ПЦР проводят после процедуры обратной транскрипции. Специфичность реакции обеспечивается прежде всего правильным выбором праймеров. По окончании реакции наличие искомого фрагмента выявляют различными методами. Наиболее распространены электрофоретическое разделение и детекция флуоресценции в режиме реального времени. ПЦР может применяться как качественная реакция (по принципу “есть – нет”), так и как полуколичественный или количественный метод. Для проведения анализа могут быть использованы наборы реагентов для ПЦР, зарегистрированные в установленном порядке и валидированные для соответствующих целей.

Пробоподготовка

Определяемая ДНК может быть выделена из исследуемого образца или может вноситься в реакцию без предварительной подготовки. В первом случае следует подтвердить, что процедура выделения не влияет на результаты ПЦР. С этой целью целесообразно провести аналогичную процедуру выделения с использованием стандартного образца ДНК. Процедура выделения может быть ручной или в автоматическом режиме. Во втором случае при внесении в реакцию тестируемого материала без проведения его предварительной подготовки, необходимо подтвердить отсутствие влияния на результаты ПЦР веществ, входящих в состав исследуемого образца. Для этого целесообразно использовать метод добавок. Необходимо предусмотреть использование стандартных или контрольных образцов для оценки эффективности выделения нуклеиновых кислот. Используемое оборудование, реагенты, стандартные и контрольные образцы, приготовление растворов и все этапы пробоподготовки должны быть указаны в фармакопейной статье и нормативной документации или должна быть приведена ссылка на инструкцию по применению набора реагентов для выделения ДНК/РНК.

Проведение реакции

ПЦР проводят в буферно-солевом растворе с определенным значением pH, содержащем необходимую концентрацию ионов магния, четыре вида дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и термостабильную Taq-полимеразу (ДНК-полимераза ряда микроорганизмов, например, Termus aquaticus обладает уникальным свойством сохранять активность при температуре 95 °С). Состав буферного раствора, концентрацию реагентов, приготовление растворов указывают в фармакопейной статье и нормативной документации или приводят ссылку на инструкцию по применению набора реагентов для ПЦР. Реакция инициируется парой праймеров, каждый из которых представляет собой последовательность из 20-25 нуклеотидов, один праймер комплементарен последовательности ДНК с 5′-конца амплифицируемого участка, а другой – с 3′-конца. Последовательность праймеров, их концентрацию указывают в фармакопейной статье и нормативной документации. Для оценки эффективности амплификации следует использовать положительные и отрицательные стандартные и/или контрольные образцы, указанные в фармакопейной статье и нормативной документации или в инструкции по применению набора реагентов. ПЦР осуществляют в автоматическом режиме на специальных программируемых приборах – амплификаторах, контролирующих заданные параметры реакции: температуру и длительность отдельных этапов цикла (денатурация, гибридизация и синтез цепи ДНК), число циклов и т.д. Денатурация. Выдерживание при температуре от 94 до 96 °С в течение установленного времени; при этом двойная цепь денатурируется (расплетается) с образованием двух одноцепочечных молекул ДНК. Гибридизация (отжиг). При температуре 45-65 °С в течение установленного времени происходит гибридизация праймеров и одноцепочечной ДНК-матрицы, в процессе которого праймеры распознают комплементарные им участки матричной ДНК. Синтез цепи ДНК (элонгация). При температуре 65-72 °С в течение установленного времени происходит репликация (достраивание) одной из одноцепочечных ДНК от точки связывания праймера “вправо” (для одной цепи ДНК) и “влево” (для другой цепи ДНК). В результате вновь синтезируемые молекулы ДНК становятся, в свою очередь, матрицей для аналогичного синтеза новых копий. Продолжительность цикла составляет 0,5-5 мин. Сразу после окончания первого цикла процедура повторяется и происходит экспоненциальное увеличение содержания фрагментов ДНК. Обычно ПЦР состоит из 25-40 циклов. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка ДНК, приводящее к увеличению в геометрической прогрессии общего содержания продуктов реакции. Эффективность ПЦР и количество синтезированного при этом заданного фрагмента ДНК зависит от многих факторов, среди которых следует выделить: тип и термопроводящие характеристики амплификатора, тип используемой ДНК-полимеразы, состав буферного раствора, объем реакционной смеси; длину и первичную структуру праймеров; выбранную специфическую последовательность ДНК. Используемое оборудование и режим амплификации указывают в фармакопейной статье и нормативной документации или приводят ссылку на инструкцию по применению набора реагентов для ПЦР.

Детекция продуктов амплификации

Электрофоретическое разделение. Продукты амплификации анализируют с помощью различных методов электофореза в агарозном или полиакриламидном гелях. Для визуализации ДНК используют окрашивание интеркалирующим красителем (обычно – бромистым этидием, дающим характерное красноватое свечение при исследовании в проходящем ультрафиолетовом свете), серебра нитратом или используют мечение различными флюорохромами, дающими флюоресценцию определенной длины волны при возбуждении лазерным лучом. Для оценки размеров амплифицированных фрагментов используют маркеры и стандартные образцы. Концентрацию геля, приготовление растворов, маркеры, стандартные образцы и условия электрофореза указывают в фармакопейной статье или нормативной документации. Детекция флуоресценции в режиме реального времени. Способ детекции амплифицированного фрагмента с использованием флуоресцентных меток возможен при проведении ПЦР в реальном времени (Real Time PCR). Отличительной чертой данного метода, в сравнении с классической ПЦР, является возможность не только качественного (по конечной точке или в режиме “реального времени”), но и количественного определения ДНК/РНК в исследуемом материале, отсутствие стадии электрофореза и автоматическая регистрация детектируемого сигнала. Метод основан на измерении флуоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации. Интенсивность сигнала пропорциональна концентрации продукта ПЦР, что в сочетании с возможностью оценить кинетику процесса позволяет проводить количественное определение выбранной последовательности. Для постановки ПЦР в реальном времени необходим амплификатор, обладающий способностью возбуждать и детектировать флуоресценцию на каждом цикле амплификации. Прибор состоит из трех блоков: амплификатора (термический блок), флуоресцентного детектора и компьютера с прилагаемым программным обеспечением. Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют интеркалирующие красители (например, SybrGreen I) или специфические флуоресцентные зонды (например, система TaqMan). В первом варианте флуоресцентный краситель связывается с синтезируемой двухцепочечной ДНК с возникновением флуоресцентного свечения. Во втором варианте используются ДНК-зонды, в состав которых введена флуоресцентная метка и гаситель флуоресценции. На стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и по достижении участка зонда расщепляет его, благодаря наличию 5′-экзонуклеазной активности. В результате происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к появлению детектируемого свечения. Используемые реагенты, оборудование, условия ПЦР и программу расчета указывают в фармакопейной статье и нормативной документации или приводят ссылку на инструкцию по применению набора реагентов для ПЦР.

Оценка результатов

Полученные результаты учитывают, если одновременные испытания положительных и отрицательных стандартных или контрольных образцов дают соответственно положительные и отрицательные ответы. При необходимости определения нуклеиновой кислоты, для которой установлено предельно допустимое содержание ДНК, следует проводить сравнение с результатом ПЦР стандартного образца с соответствующей концентрацией. Для количественного определения специфической нуклеиновой кислоты следует использовать метод ПЦР в реальном времени и стандартный образец, аттестованный в установленном порядке.

Обеспечение качества

Используемое оборудование должно быть аттестовано в установленном порядке. Методика на основе ПЦР для неколичественного определения должна быть охарактеризована по специфичности и аналитической чувствительности. Аналитическую чувствительность определяют как минимальное количество целевых последовательностей (ДНК/РНК) в единице объема образца, которое может быть обнаружено в 100% образцов при 10-кратном проведении анализа или в 95% образцов при 24-кратном проведении анализа. Количество ДНК/РНК может быть выражено в международных единицах или числом копий. Методика для количественного определения должна быть охарактеризована по специфичности, диапазону линейности, правильности и прецизионности. Для установления указанных характеристик используются соответствующие международные стандартные образцы, а также стандартные образцы, аттестованные в установленном порядке.

Стандартные и контрольные образцы

Используемые стандартные образцы должны быть аттестованы в установленном порядке, контрольные образцы – охарактеризованы по необходимым показателям. Могут использоваться стандартные и контрольные образцы набора реагентов после валидации методики. При каждой постановке ПЦР необходимо предусмотреть использование следующих образцов: – положительный стандартный и/или контрольный образец, предназначенные для оценки эффективности всех этапов ПЦР, которые должны содержать определенное количество целевой последовательности; – положительный контрольный образец, содержащий определенное количество целевой последовательности, предназначенный для оценки этапа амплификации; – отрицательный контрольный образец, являющийся свободным от целевых последовательностей, для контроля отсутствия ложноположительных результатов, начиная с этапа пробоподготовки; – отрицательный контрольный образец, являющийся свободным от целевых последовательностей, для контроля отсутствия ложноположительных результатов на этапе амплификации.

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Производственные пробиотические штаммы и штаммы для контроля пробиотиков ОФС.1.7.2.0012.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на штаммы микроорганизмов, используемые для производства пробиотиков для медицинского применения. Для производства пробиотиков для медицинского применения используют производственные штаммы микроорганизмов с подтвержденным клиническим терапевтическим действием, депонированные в национальной или международной коллекции. В настоящей общей фармакопейной статье изложены требования к отбору, проверке и хранению рекомендуемых штаммов микроорганизмов (система предрегистрационного доклинического изучения безопасности рекомендуемых штаммов), требования к системе надзора за производственными и посевными культурами, используемыми при производстве пробиотиков, требования к биологическим свойствам тест-штаммов микроорганизмов, рекомендуемых для контроля антагонистической активности производственных штаммов и готовых лекарственных форм пробиотиков.

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Идентификация и дифференциация бактерий – определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизмов и их свойств – наиболее ответственный этап микробиологического исследования. Он осуществляется на основании изучения комплекса фенотипических и генотипических свойств микроорганизмов. Организмы, обладающие одинаковыми генотипами, в разных условиях могут отличаться по фенотипу, т.е. может наблюдаться некоторое разнообразие фенотипов. В ходе идентификации микроорганизмов определяют ряд фенотипических признаков: морфологические, тинкториальные, культуральные, ферментативные свойства, антигенная структура, спектр чувствительности к антибиотикам, бактериофагам и бактериоцинам, токсигенность; а также характеризуют их генотип – определяют нуклеотидный состав ДНК и содержание Г+Ц-пар в ДНК, степень гомологии ДНК, профиль плазмидной ДНК, электрофоретип, степень вирулентности. Идентификацию штаммов по генотипическим признакам проводят по степени ДНК – ДНК-гибридизации и содержанию Г+Ц пар нуклеотидных оснований. В настоящее время приемлемым способом является идентификация 16S рРНК, выявляющая консервативные нуклеотидные последовательности исследуемых микроорганизмов. При характеристике микроорганизмов следует использовать генетические и фенотипические методы, позволяющие сопоставлять последовательности генов и фенотипические признаки исследуемых культур микроорганизмов с музейными штаммами национальных или международных коллекций. Для дифференцирования патогенных и апатогенных штаммов внутри вида информативным методом является обнаружение в составе ДНК бактериальной клетки геномных “островков” патогенности. Повышенная их лабильность связана с тем, что они могут входить в состав транспозонов, плазмид и включаться в геном бактериофагов, формируя у разных непатогенных видов бактерий вирулентность. Все перечисленные исследования должны выполняться в аккредитованной лаборатории с использованием современного оборудования и технологий. К пробиотическим производственным штаммам предъявляются следующие требования. 1. Предлагаемый штамм должен быть идентифицирован до вида по фено- и генотипическим признакам и по профилю плазмидной ДНК. Штамм, имеющий R-плазмиды, транспозоны, конвертируемые бактериофаги (профаги), не может быть использован при производстве пробиотиков. При обнаружении других разновидностей плазмид следует представить материалы по характеристике их функциональных свойств. Устойчивость штамма к антибиотикам должна быть обусловлена только хромосомной природой, что необходимо подтверждать при ее выявлении. 2. Генетически модифицированные микроорганизмы должны стабильно экспрессировать клонированные целевые гены и при многократном пассировании in vivo на культуре клеток или при введении лабораторным животным должны сохранять исходные биологические свойства. Должны быть экспериментально установлены отсутствие неконтролируемой передачи клонированной ДНК “новым хозяевам” и невозможность широкого распространения их плазмид, следствием чего может быть нарушение микробной экосистемы; т.е. должна быть доказана их биобезопасность. Рекомбинантная ДНК, используемая для получения генетически модифицированных штаммов микроорганизмов, не должна содержать маркеров антибиотикорезистентности. 3. Штамм, независимо от вида и рода, должен обладать однородными морфологическими, тинкториальными, культуральными свойствами без признаков диссоциации. Не допускается образование слизистых колоний пробиотическими производственными штаммами и наличие у них капсул, которые являются признаками вирулентности бактериальных культур. Штамм с неясной характеристикой не может использоваться для производственных целей (раздел 1). 4. Штамм должен быть однороден по физиолого-биохимическим свойствам, охарактеризованным с помощью регламентированных методов или с использованием зарегистрированных тест-систем. Штаммы с неясной биохимической характеристикой не могут быть рекомендованы в качестве производственных (раздел 1). 5. Штамм не должен продуцировать ферменты, относящиеся к факторам патогенности, например, каталазу, гиалуронидазу, фибринолизин, плазмокоагулазу, гемолизин, летициназу С, нейраминидазу и др. (раздел 1). 6. Штамм должен обладать антагонистической активностью по отношению к клиническим свежевыделенным патогенным и условно-патогенным микроорганизмам и сертифицированным тест-штаммам (в соответствии с требованиями нормативной документации). Зона угнетения роста тест-культур должна быть более 10 мм (раздел 2). 7. Штамм не должен обладать высокими адгезивными свойствами (раздел 3). 8. Штамм должен обладать высокой устойчивостью к воздействию желудочного сока, желчи, щелочи или быть защищенным от их воздействия в лекарственной форме пробиотика (раздел 1). 9. Штамм должен быть охарактеризован по способности продуцировать биологически активные вещества (например, ферменты, витамины, кислоты, лизоцим, бактериоцины, антибиотикоподобные вещества и др.) (раздел 1). 10. Штаммы всех видов микроорганизмов, предлагаемые для производства пробиотиков, должны быть невирулентными, нетоксигенными, нетоксичными, безопасными для людей, включая, при необходимости, иммунологическую безопасность. Исследование осуществляют в соответствии с ОФС “Безопасность пробиотиков для медицинского применения” (раздел 3). 11. Штаммы, предлагаемые в качестве кандидатов на применение в составе пробиотика, должны быть изучены на лабораторных моделях для оценки механизма их терапевтического действия при введении способом, рекомендованным для человека. 12. В готовой форме препарата пробиотика оценивают соотношение терапевтической и безопасной дозы (клинические исследования, фаза I – оценка переносимости, безопасности, терапевтического действия, подтверждение механизма действия), сохранение способности к продукции биологически активных веществ, наличие живых микробных клеток на протяжении срока годности экспериментально-производственных серий препарата. 13. Рекомендуемый для изготовления пробиотических препаратов штамм должен быть депонирован в официальной национальной или международной коллекции с указанием источника и даты выделения, характеристики его биологических свойств. Штаммы, используемые при производстве пробиотиков, должны быть проверены по всем биологическим свойствам в соответствии с регламентированными требованиями. Проверка проводится не реже 1 раза в год. Подлинность. Штамм должен быть идентифицирован до вида с помощью микробиологических методов (например, микроскопического, бактериологического, биохимического и т.п.), которые могут быть дополнены методами молекулярной биологии (например, амплификация нуклеиновых кислот или секвенирование для подтверждения стабильности генома штамма). Штамм должен обладать однородными морфологическими, тинкториальными, биохимическими и культуральными свойствами без признаков диссоциации. Специфическая безопасность. Безопасность штамма определяется биологическими методами in vivo (например, исследованием безвредности, токсичности, токсигенности, вирулентности и т.п.) в соответствии с ОФС “Безопасность пробиотиков в тестах in vivo”, которые могут быть дополнены методами молекулярной биологии для подтверждения стабильности первоначальных биологических свойств. Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов. Испытание выполняют с использованием разнообразных селективных питательных сред для того, чтобы в выбранных условиях инкубации был обеспечен рост всех вероятных контаминантов. Штамм не должен содержать посторонней микрофлоры. Определение проводят в соответствии с ОФС “Микробиологическая чистота”. Количественное содержание живых микроорганизмов штамма. Испытание проводят в соответствии с ОФС “Определение специфической активности пробиотиков”. Содержание живых микроорганизмов выражают в определенном объеме (в 1 мл, в 1 дозе, в 1 ампуле/флаконе). Антагонистическая активность. Антагонистическую активность штамма в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов определяют микробиологическим методом, например, методом отсроченного антагонизма на плотной среде по зонам задержки роста тест-штаммов или методом совместного культивирования (определение проводят в соответствии с ОФС “Определение специфической активности пробиотиков”). Штамм должен проявлять антагонистическую активность по отношению к тест-штаммам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и не должен угнетать рост представителей нормофлоры. Тест-штаммы должны быть депонированы в национальной или международной коллекции с указанием источника и даты выделения, характеристики биологических свойств. Перечень тест-штаммов для контроля антагонистической активности определяют на основании результатов клинических (лечебное действие) и микробиологических (влияния на определенную группу патогенных и условно-патогенных микроорганизмов) испытаний эффективности и безопасности конкретных групп препаратов. Кислотообразующая активность. Определение активности кислотообразования препарата проводят титриметрическим методом в соответствии с ОФС “Определение специфической активности пробиотиков”. Кислотность выражают в градусах Тернера (°Т). Хранение и упаковка. Производственный штамм, расфасованный в первичную упаковку (ампулы, флаконы), в лиофилизированном виде хранят при температуре, обеспечивающей его стабильность. Коллекцию производственного штамма хранят при температуре минус 15 °С и ниже. Производственный штамм регистрируют в специальном журнале, в который вносят всю необходимую информацию о движении культуры (посевах) производственного штамма и результаты его контроля. Ответственность за производственный штамм несет определенный назначенный сотрудник. Производственный штамм, находящийся в коллекции предприятия, проверяется 1 раз в год по всем показателям, утвержденным в разработанной для него нормативной документации.

Этап получения посевной культуры.
Посевную культуру микроорганизмов получают из производственного штамма, выращенного на оптимальной питательной среде (не более 4-го пассажа) в соответствующих условиях методом поверхностного или глубинного культивирования с последующей лиофилизацией в количестве, необходимом для обеспечения производства посевной культурой на протяжении 1 года, если в нормативной документации не указаны другие требования. При необходимости использования штамма при производстве лекарственной формы препарата готовят посевную серию штамма в количестве, необходимом для выпуска определенного количества серий препарата. Для этого из коллекции штаммов берут 2-3 ампулы полностью проконтролированного штамма и осуществляют его посев на оптимальные для штамма питательные среды. Для высушивания посевной серии штамма используют 2-4 пассаж. Штамм может быть высушен в вакуумных ампулах или во флаконах, обеспеченных вакуумной крышкой. На этикетку ампулы ил флакона наносят следующие сведения: наименование штамма, порядковый номер серии, дата лиофилизации, срок годности, номер хранилища или контейнера. Производственную серию штамма контролируют не реже 1 раза в год по основным показателям качества, указанным в нормативной документации. Результаты контроля фиксируют в специальном журнале и отражают в паспорте штамма. Посевная культура должна соответствовать следующим требованиям: Подлинность. Подлинность посевной культуры определяется микробиологическими методами. Культура должна обладать однородными морфологическими и культуральными свойствами без признаков диссоциации. Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов. Испытание выполняют с использованием селективных питательных сред для того, чтобы в выбранных условиях инкубации был обеспечен рост контаминантов. Культура не должна содержать посторонней микрофлоры. Определение проводят в соответствии с ОФС “Микробиологическая чистота”, если в нормативной документации не указаны другие требования. Специфическая безопасность. Посевная культура должна быть безопасна при внутрибрюшинном, внутривенном, пероральном введении мышам с массой тела г. Вид испытания определяется индивидуально в зависимости от видовой принадлежности посевной культуры и способа назначения лечебного препарата. Испытание проводят в соответствии с ОФС “Безопасность пробиотиков в опытах in vivo”. Количественное содержание живых микроорганизмов штамма. Испытание проводят в соответствии с ОФС “Определение специфической активности пробиотиков”. Содержание живых микроорганизмов выражают в определенном объеме (в 1 мл, в 1 ампуле/флаконе). Хранение и упаковка. Посевную культуру хранят в лиофильно высушенном состоянии при температуре, обеспечивающей сохранение первоначальных биологических свойств на протяжении срока годности. На этикетку ампулы (флакона) с высушенным штаммом наносят следующие сведения: наименование и номер штамма, дата лиофилизации, порядковый номер лиофилизации, срок годности. Посевную серию штамма контролируют не реже 1 раза в год по основным показателям качества, указанным в нормативной документации. Результаты контроля фиксируют в специальном журнале и отражают в паспорте штамма.

Раздел 1. Изучение морфологических, тинкториальных и культуральных свойств пробиотических штаммов

1.1. Изучение морфологии и тинкториальных свойств культур

1.1.1. Микроскопия живых бактерий
Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми микробами в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии (метод “раздавленной” и “висячей” капли). 1.1.2. Окрашивание бактерий
На обезжиренном предметном стекле готовят мазок из микробной культуры, сушат и фиксируют его над пламенем горелки или химическим способом в смеси Никифорова. Затем окрашивают с помощью готовых наборов красителей или тест-систем, разрешенных к использованию, выбирая наиболее адекватный метод в зависимости от вида изучаемых микроорганизмов (по Граму – для выявления грамотрицательных и грамположительных бактерий; по методу Циля-Нильсена – для окрашивания кислотоустойчивых бактерий и обнаружения спор (в некоторых случаях); по способу Бурри или Бурри-Гинса – для выявления наличия капсул; по способу Ожешко (Ауески) или Пешкова – для выявления спор; по методу Нейссера – для выявления зерен волютина; по Романовскому-Гимзе – для изучения структуры протоплазмы и ядра клеток эукариотов при необходимости).

1.2. Изучение культуральных свойств штамма

Культуральные свойства характерны для каждого вида бактерий, поэтому являются важным дифференцирующим признаком. Культуральные признаки микроорганизмов определяют характером их роста на плотных, жидких и полужидких питательных средах различного назначения. Посев культур на плотные питательные среды проводят с применением методов, позволяющих получить изолированные колонии. В паспорте на штамм следует описать размер, форму колоний, характер контура края, рельеф и поверхность колонии, цвет, структуру и консистенцию колонии. Подробно описать характер роста культуры на жидких и полужидких средах. Характеристика культуральных свойств включает также учет особенностей культивирования – температурные границы роста, газовый состав атмосферы, влажность атмосферного воздуха, освещенность, время экспозиции и др. Рост культуры следует изучать при минимальной, оптимальной и максимальной температуре роста, при выращивании в аэробных, анаэробных или микроаэрофильных условиях. При правильном отборе и поддержании штамма культуры должны сохранять однородность по морфологическим и культуральным свойствам и не проявлять признаков диссоциации клеток и колоний. Не допускается присутствие среди исследуемых штаммов других микроорганизмов, отличающихся по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам от клеток и колоний предлагаемого производственного штамма

1.3. Изучение физиолого-биохимических свойств штамма

1.3.1. Сахаролитические свойства бактерий Изучение способности бактерий ферментировать углеводы используется для идентификации и дифференциальной диагностики микроорганизмов. Сахаролитическую активность предлагаемого штамма изучают с помощью зарегистрированных диагностических тест-систем для идентификации бактерий. Предлагаемый производственный штамм должен полностью соответствовать по этим свойствам типовым штаммам видовой принадлежности согласно современной классификации Определителя бактерий Берджи. Штаммы с неясной характеристикой не могут быть рекомендованы в качестве производственных. 1.3.2. Протеолитические свойства бактерий В процессе культивирования микроорганизмы выделяют во внешнюю среду различные протеолитические ферменты, которые можно разделить условно на 2 группы. В первую группу следует включить ферменты, относящиеся к факторам патогенности (например, гиалуронидаза, фибринолизин, плазмокоагулаза, гемолизин, лицитиназа С, лизоцим, нейраминидаза). Во вторую группу следует отнести ферменты, принимающие участие в обмене веществ микроорганизмов (дыхании и питании). Они расщепляют белки, пептиды, аминокислоты, в результате чего образуются легкоусвояемые микроорганизмами продукты питания и продукты метаболизма – кислоты, перекиси, индол, сероводород и др. Для оценки протеолитических свойств первой и второй групп чаще всего используются нижеприведенные методы.

Примечание.
Нумерация пунктов дана в соответствии с официальным текстом документа.

2.1. Ферменты, относящиеся к факторам патогенности

2.1.1. Тест на каталазную активность
Каталазная активность свойственна большинству патогенных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Облигатные анаэробы и многие микроаэрофилы каталазу не образуют. Известно, что отсутствие способности образовывать каталазу является характерным признаком молочнокислых бактерий. Однако у некоторых лактобактерий рядом авторов обнаружена каталазная активность в присутствии определенных субстратов или благодаря наличию у них так называемой псевдокаталазной активности. Псевдокаталаза обнаружена у штаммов Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum при выращивании их на питательном агаре с низким содержанием (до 0,05%) глюкозы. Собственно каталаза проявляет свою активность на средах с гретой кровью или гематином, тогда как псевдокаталаза – на средах с низкой концентрацией глюкозы (например, на среде Фелтона, содержащей 0,05% глюкозы). Эти ферменты не образуются при выращивании микроорганизмов на агаре с 1% глюкозы без добавления гематина или гретой крови. В свою очередь, на активность каталазы не влияет присутствие в среде 2% глюкозы, а также снижение pH среды с 7,0 до 4,5. Поэтому выявление продукции каталазы и псевдокаталазы осуществляют на следующих средах: основная среда, гематиновый агар, основная среда с 0,05% глюкозы, основная среда с 1% глюкозы. Основную среду и гематиновый агар разливают в чашки Петри, основные среды с 0,05 и 1% глюкозы скашивают в пробирках. Посев испытуемых кисломолочных культур и тест-культуры (каталазо-положительной) осуществляют так, чтобы получить рост отдельных колоний. Для выявления каталазной активности наносят каплю 10% раствора водорода пероксида на колонию или приливают к суспензии клеток. Выделение кислорода, хорошо заметное по образованию пузырьков газа, свидетельствует о продукции каталазы исследуемым штаммом. Положительный контроль – тест-штамм: S. aureus ATCC 6538-Р. Отрицательный контроль – тест-штамм: Е. faecalis CCM 4224. Предлагаемый производственный штамм должен быть каталазо-отрицательным. Для выявления псевдокаталазы используют среду Фелтона (Felton, et al., 1958). Примечания.
1. Приготовление основной среды. Мясной экстракт – 0,5 г; пептон – 0,5 г; дрожжевой экстракт – 0,5 г; твин-80 – 0,05 мл; марганца сульфата тетрагидрат – 0,01 г; глюкоза – 1 г; агар микробиологический – 1,5 г; вода очищенная – до 100 мл; pH среды 6,8 – 7,0. Стерилизацию проводят при температуре 121 °С в течение 15 мин. К 95 мл расплавленной основной среды добавляют 5 мл смеси (1:1) дефибринированной бычьей крови и воды, после чего ее прогревают при температуре 100 °С в течение 15 мин. для разрушения каталазы крови. 2. Приготовление гематинового агара. Пропись среды аналогична прописи основной среды. Вместо крови добавляют гематин в количестве 50 мкг/мл из основного раствора. Его готовят внесением 50 мг гематина в 10 мл воды очищенной, после чего добавляют 0,1 М раствор натрия гидроксида в объеме, необходимом для растворения гематина. После этого раствор прогревают при температуре 100 °С в течение 15 мин. 3. Приготовление среды Фелтона. Триптон – 1,0 г; глюкоза – 0,05 г; калия фосфат однозамещенный – 0,2 г; натрия хлорид – 0,5 г; дрожжевой экстракт – 0,5 г; агар микробиологический – 1,5 г; вода очищенная – до объема 100 мл; pH 6,8-7,0. Среду стерилизуют, разливают в чашки Петри. На этой среде исследуется способность бактерий разлагать водорода пероксид в присутствии незначительных концентраций глюкозы.

2.1.2. Тест на продукцию лецитиназы
Некоторые патогенные и условно-патогенные штаммы микроорганизмов могут продуцировать лецитиназу С (лецитовителлазу), вызывающую деполимеризацию мембран клеток хозяина. Ее наличие определяют по способности бактерий разрушать лецитин, входящий в состав желтка куриного яйца. В пробирку с бульоном, содержащим желток куриного яйца, вносят 1 петлю суточной культуры, выращенной на плотной питательной среде, и инкубируют при () °С в течение 24 ч. По истечении срока инкубации регистрируют наличие беловатой мути и всплывающих хлопьев, свидетельствующих о продукции микроорганизмом лецитиназы. Положительный контроль – S. aureus 6538-P ATCC; S. aureus “Жаев”, S. aureus “Виотко”. Отрицательный контроль – S. epidermidis 14990 ATCC. Предлагаемый производственный штамм не должен продуцировать лецитиназу. Примечания.
1. Приготовление бульона с яичным желтком. Один свежий яичный желток асептически вносят в 400 мл стерильного мясопептонного бульона (МПБ), хорошо перемешивают, разливают в стерильные пробирки по 4-5 мл и выдерживают в термостате при температуре () °С в течение 24 ч для проверки на стерильность (среда в пробирках не должна мутнеть). 2. Приготовление плотной среды для выявления летициназы. Среда предназначена для выявления фермента у стафилококков, иерсиний и некоторых анаэробов. Состав среды:

Гидролизат казеина панкреатический 40,0 г
Натрия гидроортофосфат 5,0 г
Калия гидроортофосфат 1,0 г
Натрия хлорид 2,0 г
Магния сульфат гептагидрат 0,1 г
Глюкоза 2,0 г
Агар микробиологический 25,0 г Вода очищенная до 1000 мл

Ингредиенты смешивают, растворяют при нагревании в 1000 мл воды. Устанавливают pH 7,6, стерилизуют при температуре 121 °С в течение 15 мин. Основа среды бледно-желтого цвета. К охлажденной до температуры 50-55 °С основе добавляют 2 желтка куриного яйца (1 желток на 500 мл среды). Перед использованием яйца тщательно моют в теплой воде, выдерживают 1 ч в 96% спирте этиловом. Готовую среду разливают в чашки Петри. 3. Приготовление желточно-солевого агара. Среда предназначена для выявления фермента лецитининазы у стафилококков. Состав среды:

Мясопептонный агар(МПА) 1000 мл
Натрия хлорид 90,0 г
Желточная взвесь (1 желток на 200 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида) 150,0 мл

К охлажденной до температуры 50-55 °С основе (солевому агару) добавляют 150 мл желточной взвеси. Готовую среду разливают в чашки Петри.

2.1.3. Определение плазмокоагулазной активности Некоторые патогенные и условно-патогенные штаммы микроорганизмов могут продуцировать плазмокоагулазу, которую можно выявить в тестах in vitro с помощью цитратной кроличьей плазмы, сыворотки крови кролика, взятой из сердца, или на специальных питательных средах, в которые добавлена плазма. Перед исследованием сухую кроличью цитратную плазму разводят 1:5 стерильным 0,9% раствором натрия хлорида, затем 0,5 мл разведенной плазмы вносят в стерильную пробирку и в ней суспендируют одну петлю 18-20-часовой агаровой культуры испытуемого микроорганизма. Пробирки помещают в термостат при температуре () °С и через 1; 2; 3; 18 и 24 ч проверяют наличие сгустка в пробирке вследствие свертывания плазмы. Реакция считается положительной независимо от степени свертывания плазмы. В качестве контроля ставят реакцию с коагулазо-положительным и коагулазо-отрицательным стафилококками, обладающим и не обладающим плазмокоагулазой соответственно. Положительный контроль – S. aureus ATCC 6538-Р. Отрицательный контроль – S. epidermidis ATCC 14990. Предлагаемый производственный штамм не должен продуцировать плазмокоагулазу.

2.1.4. Определение фибринолитических свойств Методика исследования основана на способности микроорганизмов, обладающих фибринолизином, вызывать растворение сгустка плазмы крови. В стерильные пробирки вносят 0,1 мл цитратной кроличьей плазмы, 0,4 мл 0,9% раствора натрия хлорида, 0,25 мл 18-20-часовой бульонной культуры испытуемого штамма и 0,25 мл 0,25% раствора кальция хлорида. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре () °С. Если в пробирке после 15-20 мин. инкубации образуется сгусток (так же, как и в контрольной пробирке, в которую вместо бульонной культуры добавляют стерильную питательную среду), и через 2 ч инкубации не отмечается его разжижение, то считают, что испытуемая культура не обладает фибринолитическими свойствами. Если в пробирке не образуется сгусток, или происходит его разжижение после 2 ч инкубирования в указанных условиях, культура характеризуется наличием фибринолизина. Положительный контроль – S. pyogenes “Гуров”. Отрицательный контроль – S. epidermidis ATCC 14990; S. saprophyticus 15305. Предлагаемый производственный штамм не должен продуцировать фибринолизин.

2.1.5. Тест нализоцим (мурамидазу)
Лизоцимную активность штамма определяют методом, который основан на способности лизоцима расщеплять -(1-4)-гликозидные связи мукополисахаридного комплекса клеточной стенки эталонного тест-штамма Micrococcus luteus (M. lysodeikticus). Готовят плотную среду, содержащую инактивированную культуру M. luteus NCTC 2665. Для этого предварительно чистую культуру M. luteus выращивают в течение 16 ч при температуре () °С на чашках Петри с МПА. Выросшую культуру смывают 0,9% раствором натрия хлорида (3 мл на 1 чашку), автоклавируют 15 мин. при температуре 120 °С и хранят при температуре от 2 до 8 °С. В стерильные чашки вносят расплавленную плотную питательную среду, содержащую автоклавированную суспензию микрококка в концентрации 2 · 109 КОЕ/мл по стандартному образцу (CO) мутности. Испытуемые пробиотические штаммы выращивают в жидкой (или плотной) питательной среде, используемой для их культивирования. Культуру второго пассажа засевают по одной посевной петле (диаметром 2-3 мм) бляшками на подготовленную подсушенную плотную среду, содержащую убитую культуру микрококка. На 1 чашку наносят не более 5 штаммов на равном расстоянии друг от друга и от краев чашки, посевы инкубируют в течение 2-4 сут. при температуре () °С в аэробных, анаэробных или микроаэрофильных условиях в зависимости от вида испытуемого штамма и регистрируют зону лизиса микрококка вокруг выросших колоний испытуемых штаммов. О степени лизоцимной активности судят по ширине зоны просветления: низкая – 1-3 мм, средняя – 4-7 мм, 8 мм и более – высокая. Положительный контроль – S. aureus АТСС 6538-Р и S. pyogenes Dick I. Перед проведением испытания целесообразно проверить тест-штамм M. luteus на лизируемость лизоцимом. Для этого, используя отраслевой стандарт мутности, готовят микробную взвесь с содержанием 109 микробных клеток в 1 мл и разливают ее в 2 пробирки по 1 мл. В одну (опытную) пробирку добавляют 8 мкг лизоцима, растворенного в 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида, создавая конечную концентрацию фермента 4 мкг/мл. Во вторую (контрольную) пробирку прибавляют 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Пробирки выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Культура считается пригодной для работы, если за этот период в опытной пробирке произойдет полный лизис клеток микрококка, что определяют по степени прозрачности содержимого пробирки. Примечание.
Некоторые виды бактерий нормальной микрофлоры (например, Lactobacillus fermentum) при отсутствии других факторов патогенности продуцируют лизоцим, что считается положительным свойством этих бактерий, т.к. определяет его антагонистическую активность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

2.1.6. Тест на гемолизин
Некоторые бактерии продуцируют такие факторы патогенности, как гемолизины – вещества, разрушающие эритроциты. В связи с этим продукция гемолизина во многих случаях является маркером вирулентности микроорганизма. На кровяном агаре колонии гемолизирующих бактерий окружены зонами просветления (гемолиза). Для адекватного определения гемолитической активности следует просматривать чашки с посевами против источника света, т.к. способность образовывать гемолизины (и, соответственно, размеры зон гемолиза) может быть вариабельной. Активность гемолизинов может проявляться в полном или неполном разрушении эритроцитов. Виды гемолиза подразделяют на альфа-, бета- и гамма-гемолиз. A. Альфа-гемолиз – неполное разрушение эритроцитов с сохранением клеточной стромы. Просветление среды вокруг колоний обычно незначительно; среда вокруг колоний может приобретать зеленовато-коричневую окраску вследствие образования метгемоглобина. Положительный контроль – S. aureus ATCC 6538-P; S. aureus 0-15. Отрицательный контроль – S. epidermidis ATCC 14990. Б. Бета-гемолиз – полное разрушение эритроцитов с ферментативным обесцвечиванием гемоглобина. Колонии бактерий окружены прозрачными зонами гемолиза различного размера. Положительный контроль – S. aureus “Лепин”; S. aureus 5. Отрицательный контроль – S. epidermidis ATCC 14990. B. Гамма-гемолиз – эритроциты остаются без изменения. Гемолитические свойства микробов проявляются по-разному на средах с дефибринированной кровью человека, барана, кролика или морской свинки. Положительный контроль – S. aureus “Лепин”; S. aureus 5. Отрицательный контроль – S. epidermidis ATCC 14990. Для получения изолированных колоний делают посев штрихом 18-часовой исследуемой культуры. Посевы инкубируют при температуре () °С в течение 24-48 ч, после чего проводят учет результатов. Для предохранения гемолизинов от разрушения кислородом посев культуры штрихом можно вначале произвести на питательный агар без крови. Затем на первый слой налить 10 мл расплавленного и остуженного до температуры 48-50 °С питательного агара с добавлением 5% крови. Вокруг погруженных в агар колоний гемолиз проявляется более четко. В некоторых случаях гемолиз лучше выявляется, если после 24-48 ч инкубации чашек в термостате их помещают на 18-24 ч в холодильник при температуре от 2 до 8 °С. При проведении реакции необходимо учитывать возможное воздействие на эритроциты образующихся в процессе жизнедеятельности ряда бактерий органических кислот (молочной, муравьиной, уксусной и др.), которые могут вызывать изменения гемоглобина, сходные с гемолизом, т.е. давать ложноположительную реакцию гемолиза. Поэтому следует представить фактические данные, подтверждающие, что данный штамм не продуцирует гемолизины (отсутствие плазмид или участка гена, кодирующих синтез гемолизина). Предлагаемые производственные штаммы не должны обладать гемолитической активностью. Примечание.
Приготовление 5% кровяного агара. К 100 мл растопленного и остуженного до температуры 45-50 °С МПА с 2% агара микробиологического в его составе (pH 7,4-7,6), соблюдая правила асептики, добавляют 5 мл стерильной дефибринированной крови кролика, лошади, барана или человека, не содержащей консервантов или антибактериальных препаратов. Смесь тщательно перемешивают, остерегаясь образования пены, и разливают в стерильные чашки Петри, предварительно подогретые в термостате. Перед розливом чашки устанавливают на ровную поверхность. Слой агара должен быть одинаковым по всей площади чашки и толщиной не более 3 мм.

2.1.7. Определение гиалуронидазы
Некоторые бактерии образуют гиалуронидазу – фермент, разрушающий гиалуроновую кислоту. Сущность метода состоит в том, что культуральную жидкость, полученную после выращивания испытуемого микроорганизма, смешивают с красителем трипановым синим и вводят внутрикожно животным. Наличие гиалуронидазы определяют путем сравнения площади распространения красителя, введенного в смеси с фильтратом культуральной среды и без нее. В ходе испытания исследуемый штамм выращивают в селективной жидкой среде в оптимальных для него условиях (температуре и времени экспозиции). По окончании инкубации культуру сначала центрифугируют при 8000 об./мин. в течение 30 мин., при необходимости – фильтруют через бактериальные фильтры. Животным – кроликам или морским свинкам – вводят смесь, состоящую из 0,1 мл испытуемого фильтрата и 0,1 мл 10% раствора трипанового синего. Результаты учитывают по отношению площади распространения краски в опыте и контроле, определяя индекс диффузии. Для исключения влияния местного воспаления на распространение краски опыты ставят не только на коже живого кролика (морской свинки), но и на снятой (предварительно депилированной) коже. Предлагаемый пробиотический штамм не должен продуцировать гиалуронидазу.

3. Ферменты, участвующие в обмене веществ

3.1. Тест на продукцию желатиназы

Метод 1. К питательной среде добавляют желатин (из расчета 10-15 г на 100 мл), разливают в пробирки высоким столбиком. Посев испытуемого штамма осуществляют уколом, погружая петлю с культурой вглубь питательной среды. Засеянную культуру инкубируют в термостате при оптимальной для нее температуре в течение 1-2 сут. Вместе с опытными пробирками в термостат ставят 2 пробирки с незасеянной желатиновой средой для контроля. При регистрации результатов учитывают интенсивность роста микроорганизма и характер (форму) разжижения среды с желатином. Метод 2. О продукции желатиназы судят по обесцвечиванию полоски фотопленки, помещенной в пробирку с исследуемой культурой. Полоски фотопленки размером 25×3 мм, освещенной и проявленной, прокладывают кусками фильтровальной бумаги, помещают в чашку Петри и автоклавируют при температуре 110 °С (0,5 атм.) в течение 30 мин. Исследуемую культуру бактерий засевают в пробирки с МПБ, под пробку пробирки вставляют полоску стерильной фотопленки так, чтобы верхняя часть ее оставалась не погруженной в среду. Посевы инкубируют в термостате при температуре () °С. Если культура разжижает желатин, погруженная часть пленки становится прозрачной, а черная пыль редуцированного серебра выпадает на дно пробирки. Большинство бактерий, продуцирующих желатиназу, обесцвечивают полоску в течение 1 сут. При отрицательных результатах посевы оставляют в термостате до 7 сут. Положительный контроль – Proteus mirabilis 3177; P. vulgaris 24a; Morganella morganii 417. Отрицательный контроль – Yersinia enterocolitica N 134. Предлагаемый производственный штамм не должен разжижать желатин. Примечание.
Приготовление желатиновой питательной среды. Среда предназначена для определения желатиназы. Состав среды:

Бульон Хоттингера 1000 мл
Желатин пищевой высшего сорта 100,0 г

Желатин вносят в бульон для набухания на 1,5-2 ч, нагревают на водяной бане при 40-50 °С до полного расплавления. Устанавливают pH 7,2. При необходимости среду фильтруют или осветляют с помощью суспензии куриных яиц (2 яйца, размешанных в двойном объеме холодной воды очищенной, вносят в среду, нагревают до свертывания белка, затем снова фильтруют). Разливают в пробирки по 8-9 мл. Стерилизуют при температуре 112 °С в течение 30 мин. Готовая среда имеет желтовато-коричневый цвет.

3.2. Тест на продукцию протеазы

У некоторых видов патогенных бактерий продукция протеазы является одним из факторов патогенности. О продукции протеазы судят по образованию прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в агаре, содержащем казеин. Испытуемую культуру засевают штрихом в чашки с казеиновым агаром и инкубируют в термостате при температуре () °С в течение 18 ч. По окончании инкубации в чашки наливают 5 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и наблюдают в течение 3 мин. за появлением прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в агаре. Положительный контроль – V. cholerae не-01 N Р-9741. Предлагаемый производственный штамм не должен обладать протеазой. Примечание.
Приготовление агара с казеином. Готовят 2% раствор казеина на 0,1 М буферном растворе трис-гидрохлорида (pH 7,0-8,0). Раствор подогревают до температуры () °С и смешивают в равных объемах с раствором 2% агара Дифко, охлажденного до той же температуры. Полученный казеиновый агар разливают в чашки Петри с соблюдением условий асептики.

3.3. Тест на продукцию амилазы

О продукции амилазы судят по образованию прозрачных зон гидролиза крахмала вокруг посевов в картофельном агаре. Испытуемый штамм засевают штрихом, инкубируют в термостате при температуре () °С в течение 24 ч. По окончании инкубирования выросшую культуру в чашках заливают 5 мл раствора Люголя и в течение 5 мин наблюдают за появлением прозрачных светло-коричневых зон вокруг посевов. Примечание.
Приготовление картофельного агара. Очищенный от кожуры сырой картофель промывают, нарезают ломтиками, заливают водой из расчета 130 г на 1 л воды очищенной, кипятят 30 мин., фильтруют и к фильтрату добавляют 20 г агара микробиологического и 2 г натрия хлорида. Нагревают, помешивая стеклянной палочкой, до полного расплавления агара, если необходимо, снова фильтруют, разливают во пробирки по 10 мл, укупоривают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве 30 мин. при температуре 110 °С (0,5 атм.) в течение 30 мин. Готовый картофельный агар разливают по 10 мл в стерильные чашки Петри.

3.4. Тест на продукцию липазы

О продукции липазы судят по образованию прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в агаре, содержащем твин-20. Культуру, выращенную на МПБ при температуре () °С в течение 18-24 ч, высевают штрихом на агаризованную среду с твином-20 и инкубируют при температуре () °С в течение 24 ч. По истечении срока инкубации регистрируют появление или отсутствие прозрачных зон гидролиза вокруг посевов в агаре. Примечание.
Приготовление агара с твином-20. Готовят 2% агар на 0,06 М фосфатном буфере (pH 7,4-7,6). Твин-20 нагревают на водяной бане до температуры () °С и вносят в расплавленный агар до конечной концентрации 1%. Быстро перемешивают встряхиванием и добавляют 10% раствор кальция хлорида до конечной концентрации 0,1%. Тщательно перемешивают, разливают в пробирки по 10 мл, укупоривают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют на кипящей водяной бане в течение 40 мин. После стерилизации разливают по 10 мл в стерильные чашки Петри.

3.5. Тест на продукцию аргининдегидрогеназы

Продукцию аргининдегидрогеназы изучают на среде Шеррис. Пробирку со средой Шеррис и контрольную (без аргинина) засевают 18-часовой культурой испытуемого штамма и заливают стерильным вазелиновым маслом. Посевы инкубируют при температуре () °С в течение 5 сут. О разложении аргинина свидетельствует появление фиолетовой окраски в опытной пробирке. Положительный контроль – S. aureus 6538-Р АТСС. Отрицательный контроль – Y. enterocolitica N 134.

3.6. Тест на редукцию нитратов

Восстановление нитратов до нитритов осуществляют микроорганизмы, имеющие нитратредуктазу, и использующие нитраты как источник азота. Тест предназначен для идентификации энтеробактерий и некоторых других микроорганизмов. Редукцию нитратов определяют путем культивирования бактерий на МПБ с 0,2% раствором KNO3 при температуре () °С в течение 7-10 сут., начиная наблюдение за результатами после 24 ч инкубирования. Образование нитритов определяют по крахмально-йодной пробе или с реактивом Грисса. В первом случае для выявления нитритов к 1 капле раствора, содержащего калий йодистый, крахмал и цинка(II) хлорид, добавляют по 1 капле исследуемой культуры микроорганизмов и раствора хлористоводородной кислоты. При наличии в среде нитритов наблюдается синее окрашивание. При выявлении нитритов вторым способом к капле испытуемой культуры добавляют 1 каплю реактива Грисса. Вследствие образования нитритов выявляется красно-розовое окрашивание. Положительный контроль – Proteus vulgaris, Escherichia coli. Отрицательный контроль – Micrococcus luteus. Примечание.
1. Приготовление среды для теста на нитрат-редуктазу. Питательная среда предназначена для определения способности бактерий редуцировать нитраты до нитритов. Состав:

Пептон 5,0 г
KNO3 (свободный от KNO2) 0,2 г
Вода очищенная 1000 мл

Ингредиенты растворяют в 1000 мл воды очищенной, подогревают, устанавливают pH 7,4, разливают в пробирки по 5,0 мл. Стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин. 2. Приготовление реактива Грисса.
Состав:

Раствор 1.

Сульфаниловая кислота 8,0 г
Уксусная кислота (5 N раствор) 1000 мл

Раствор 2.

Альфа-нафтиламин 5,0 г
Диметил-альфа-нафтиламин 6,0 г
Уксусная кислота (5 N раствор) 1000 мл

Реактивы готовят при слабом нагревании с особой осторожностью из-за их токсичности. Хранят при () °С в герметично укупоренных емкостях из темного стекла. Срок годности 2-3 мес.

3.7. Реакция Фогеса-Проскауэра

Некоторые микроорганизмы при сбраживании глюкозы способны образовывать ацетоин (ацетилметилкарбинол), который выявляют в реакции Фогеса-Проскауэра. Для постановки реакции Фогеса-Проскауэра культуру выращивают на среде Кларка при температуре () °С в течение 24-72 ч. Затем к 1 мл микробной культуры добавляют 0,6 мл альфа-нафтола (5% раствор в этиловом спирте) и 0,2 мл 40% раствора калия гидроксида и взбалтывают. При положительной реакции наблюдается вишнево-красное окрашивание. Положительный контроль – Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens. Отрицательный контроль – Escherichia coli. Примечание.
1. Приготовление среды Кларка для реакции Фогеса-Проскауэра. Состав:

Пептон 0,5 г
Калия гидроортофосфат 0,5 г
Глюкоза 0,5 г
Вода очищенная 80 мл

Перечисленные ингредиенты размешивают при подогревании в течение 20 мин. Фильтруют через бумажный фильтр, охлаждают до температуры 20 °С и доводят объем до 100 мл водой очищенной. Разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют 3 дня текучим паром по 30 мин. 2. Приготовление реактива к реакции Фогеса-Проскауэра Реактив 1. Навеску 5 г альфа-нафтола растворяют в 100 мл 96% спирта этилового. Реактив 2. Навеску 40 г калия гидроксида растворяют в 100 мл воды очищенной.

3.8. Тест на гидролиз мочевины (тест науреазу)

Тест на уреазу предназначен для дифференциальной диагностики некоторых микроорганизмов и заключается в способности некоторых бактерий гидролизовать мочевину с образованием аммиака и углекислоты. Это приводит к изменению pH среды до щелочных показателей. О наличии уреазы у бактерий судят по покраснению среды, содержащей мочевину. Готовят бульон с мочевиной: к 100 мл стерильного МПБ (pH 7,0) добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл фенолового красного (1,6% спиртовой раствор). Разливают по 2-3 мл в стерильные пробирки, укупоривают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют текучим паром в течение 10 мин. В пробирку с бульоном, содержащим мочевину, вносят 1 петлю суточной культуры, выращенной на МПА, инкубируют в термостате при температуре () °С в течение 24 ч. Изменение окраски среды с желтой до розово-красной свидетельствует о наличии фермента уреазы и способности испытуемой культуры гидролизовать мочевину. Положительный контроль – Y. enterocolitica N 134; P. mirabilis 3177; P. vulgaris 24a, P. vulgaris 222; M. morganii 417. Отрицательный контроль – L. monocytogenes 766, E.coli.

3.9. Тест на расщепление тирозина

О разложении тирозина судят по исчезновению кристаллов тирозина вокруг посевов в агаре. Готовят агар с тирозином: 0,5 г L-тирозина суспендируют в 10 мл воды дистиллированной, помещают в пробирку, укупоривают ватно-марлевой пробкой и автоклавируют при температуре 110 °С (1,5 атм.) в течение 30 мин. Охлажденный до температуры () °С раствор тирозина в стерильных условиях смешивают с 100 мл расплавленного стерильного МПА и разливают по 10 мл в стерильные чашки Петри. После застывания агара культуру высевают на чашки штрихом и инкубируют в термостате при температуре () °С в течение 24 ч. Наблюдают за исчезновением кристаллов тирозина вокруг посевов в агаре. Положительный контроль – P. mirabilis 3177. Отрицательный контроль – Y. enterocolitica N 134; P. vulgaris 24а, P. vulgaris 222; M. morganii 417.

3.10. Тест на утилизацию цитрата

Тест на утилизацию цитрата используют при дифференциальной диагностике энтеробактерий и близкородственных им микроорганизмов. Для изучения способности бактерий использовать цитрат в своем метаболизме обычно применяют нитратный агар Симмонса или Кристенсена, а также жидкую среду Козера. Положительный контроль – P. mirabilis 3177. Отрицательный контроль – Y. enterocolitica N 134; P. vulgaris 24а, P. vulgaris 222; M. morganii 417.

3.11. Тест на образование аммиака, индола, сероводорода

Многие бактерии обладают протеолитической активностью, о чем можно судить по их способности образовывать аммиак, индол или сероводород в качестве продуктов протеолиза при росте на соответствующих питательных средах. Об образовании этих веществ судят по изменению цвета индикаторов. Для обнаружения аммиака можно использовать лакмусовую бумагу (индикаторная бумага синеет). Для выявления индолообразования применяют реактивы Эрлиха или Ковача, которые дают сиреневое или малиновое окрашивание при положительном тесте на индол. А для определения способности бактерий образовывать сероводород в качестве индикатора используют раствор свинца уксуснокислого (наблюдается почернение индикаторной полоски). Кроме того, разработаны коммерческие питательные среды, содержащие индикаторы для выявления продуктов протеолиза бактерий.

3.12. Сквашивающая способность пробиотического штамма

Односуточную культуру исследуемого штамма засевают в стерильное молоко из расчета 3-5% посевного материала к объему молока. Пробирки с посевным материалом и со стерильным молоком без культуры (контроль) помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре в течение 2-3 сут. При регистрации результатов учитывают способность культуры сквашивать молоко и образовывать сгусток. Кислотность определяют титриметрическим способом. Данный метод рекомендован в качестве ориентировочного теста. Ряд штаммов кисломолочных культур могут не сквашивать молоко с образованием сгустков, но продуцируют вещества, изменяющие кислотность питательной среды. Поэтому следует определять активность кислотообразования, показатель которой выражается в градусах Тернера (°Т), по методу, описанному в ОФС “Определение специфической активности пробиотиков”.

4. Определение антагонистической активности пробиотических штаммов

Определение антагонистической активности испытуемых производственных пробиотических штаммов проводят методом отсроченного антагонизма в соответствии с ОФС “Определение специфической активности пробиотиков”.

5. Определение чувствительности пробиотических штаммов к антибиотикам

Чувствительность производственных пробиотических штаммов к антибиотикам определяют в соответствии с ОФС “Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар”. Исследованию по оценке антибиотикочувствительности подлежат чистые культуры испытуемых микроорганизмов, принадлежность которых к определенному виду подтверждена фено- и генотипическими методами исследования.

6. Определение устойчивости производственного пробиотического штамма к действию желудочного сока и желчи

Производственные штаммы должны быть устойчивы к действию желудочного сока, желчи, повышенному содержанию соли и щелочи при прохождении через желудочно-кишечный тракт для сохранения жизнеспособности культур, вошедших в состав пробиотиков. Если эти свойства у рекомендуемого штамма не обнаружены или снижены, а культура характеризуется продукцией уникальных биологически активных веществ, обладающих терапевтическим действием, следует провести исследования для подбора вспомогательных веществ или лекарственной формы (например, кислотоустойчивые капсулы, таблетки с защитным покрытием и др.), обеспечивающих максимальное сохранение жизнеспособности пробиотических культур. Способ 1. В пробирку, содержащую 9,0 мл желчи медицинской консервированной, засевают 1 мл испытуемой культуры с концентрацией 108 – 109 оптических единиц мутности. Культуры инкубируют в термостате при температуре 37-38 °С в течение 24-72 ч в зависимости от вида микроорганизма. Рост или отсутствие роста культуры отмечают визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности, а также выборочно контролируют путем световой микроскопии препаратов, приготовленных из испытуемой культуры по окончании инкубации в присутствии желчи. Способ 2. Исследуемый штамм засевают на стерильный лист целлофана, помещенного на адекватную агаризованную среду, и инкубируют при температуре 37 °С в течение 16-18 ч. После этого выросшую культуру смывают 0,9% раствором натрия хлорида в фосфатном буферном растворе (ЗФР) и доводят микробную концентрацию до 109 КОЕ/мл (по оптическому стандарту мутности). В пробирку с 1 мл бактериальной суспензии добавляют 9,0 мл биологической жидкости (желчь медицинская консервированная, желудочный сок “Эквин”). В контрольную пробирку к взвеси испытуемого штамма добавляют 9,0 мл ЗФР. Пробирки выдерживают в термостате при температуре () °С в течение 2 ч, затем определяют количество жизнеспособных клеток методом серийных разведений с последующим высевом на адекватную плотную питательную среду.

7. Тест на устойчивость производственного пробиотического штамма к щелочной реакции среды

В жидкую питательную среду, подходящую для культивирования исследуемого штамма (pH от 8,0 до 9,6), засевают испытуемую пробиотическую культуру (по 1 петле на 8-10 мл среды). Посевы выдерживают в термостате при оптимальной для штамма температуре в течение 24-48 ч. Рост или отсутствие роста культуры отмечают визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию помутнения среды.

8. Тест на устойчивость производственного пробиотического штамма к повышенным концентрациям солей

В жидкую питательную среду, используемую для культивирования испытуемого штамма, содержащую 2,4 и 6,5% натрия хлорида (pH 6,8-7,0), засевают исследуемую пробиотическую культуру (по 1 петле на 10 мл среды) и выдерживают в термостате при оптимальной для штамма температуре в течение 48 ч. Рост или отсутствие роста культуры отмечают визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию помутнения, а также выборочно контролируют путем микроскопии препаратов, приготовленных из культуральной среды по окончании инкубирования посевов.

9. Определение продукции бактериоцинов
производственным пробиотическим штаммом

На чашках с 1,5% питательным агаром Difco размечают точки, соответствующие количеству штаммов, и помещают на размеченные участки по 2-5 мкл суспензии 12-часовой культуры испытуемых микроорганизмов. Количество чашек должно соответствовать количеству тест-культур с учетом контрольных чашек. Чашки инкубируют при температуре () °С в течение 4-12 ч. Продукцию бактериоцина испытуемым штаммом инициируют УФ-облучением в течение 30 с, затем культуру инкубируют в тех же условиях еще 3-2 ч. После культивирования в течение 48 ч проводят инактивацию культур хлороформом следующим образом: чашку Петри переворачивают вверх дном, снимают крышку, поднимая чашку со средой, и кладут в крышку фильтровальную бумагу, смоченную 300 мкл хлороформа. После экспозиции в течение 30 мин заменяют крышки с хлороформом на чистые и стерильные, а инактивированные посевы проветривают около 15 мин. После этого на уже имеющийся слой агара наслаивают 3-5 мл 0,7% агара, содержащего 107 КОЕ/мл тест-штамма. Инкубируют в течение 12-16 ч при температуре () °С. После инкубации регистрируют наличие зон просветления в слое тест-культуры вокруг пятен исследуемых штаммов. Таким способом можно одновременно оценить способность исследуемого штамма продуцировать бактериоцины, а также определить чувствительность штамма к бактериоцинам, продуцируемым другими микроорганизмами.

10. Определение наличия фагов у производственных штаммов, используемых для изготовления пробиотиков для медицинского применения

Определение наличия фагов в геноме производственного штамма проводят путем высева взвеси испытуемой культуры второго или третьего пассажа на соответствующую плотную питательную среду в объеме не более 1 мл (концентрация 107 – 109 микробных клеток в 1 мл). Перед посевом чашки Петри с питательной средой подсушивают в термостате для удаления конденсата. Микробную взвесь равномерно распределяют по поверхности среды путем покачивания чашек, чтобы получить сплошной газон. Остатки взвеси отсасывают стерильной пастеровской пипеткой. Затем чашки помещают в термостат при температуре () °С. Через 19-36 ч учитывают результат посева. На сплошном росте посеянной культуры не должно быть зон фаголизиса.

Раздел 2. Требования к тест-штаммам, используемым для определения антагонистической активности производственных штаммов, посевных культур и готовых лекарственных форм пробиотиков

Исследование по изучению антагонистической активности осуществляют в соответствии с ОФС “Определение специфической активности пробиотиков”; набор тест-штаммов указывается в фармакопейной статье. Величина зоны угнетения роста изучаемых штаммов относительно друг друга не должна быть более 10 мм. Пробиотические штаммы должны проявлять антагонистическую активность по отношению к тест-штаммам патогенных и условно патогенных микроорганизмов и не должны угнетать рост представителей нормофлоры. Перечень тест-штаммов для контроля антагонистической активности определяют на основании результатов клинических (лечебное действие) и микробиологических (влияния на определенную группу патогенных и условно-патогенных микроорганизмов) испытаний эффективности и безопасности конкретных групп препаратов. Рекомендуемые тест-штаммы должны быть идентифицированы до вида по фено- и генотипическим признакам, должны быть однородны по морфологическим, тинкториальным, культуральным, физиолого-биохимическим свойствам и охарактеризованы по вирулентным свойствам и токсичности. Тест-штаммы должны быть депонированы в национальной или международной коллекции с указанием источника, даты выделения и характеристики их биологических свойств. Тест-штаммы должны соответствовать требованиям по следующим показателям. Подлинность. Подлинность каждого тест-штамма определяется микробиологическими методами. Культуры должны обладать однородными морфологическими, тинкториальным, культуральными и физиолого-биохимическими свойствами без признаков диссоциации. Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов. Испытание выполняют с использованием селективных питательных сред для того, чтобы в выбранных условиях инкубации был обеспечен рост контаминантов. Культура не должна содержать посторонней микрофлоры. Определение проводят в соответствии с ОФС “Микробиологическая чистота”, если в нормативной документации не указаны другие требования. Хранение и упаковка. Тест-штаммы хранят в лиофильно высушенном состоянии при температуре, обеспечивающей сохранение первоначальных биологических свойств на протяжении срока годности в помещениях, изолированных от производственных площадей. На ампуле (флаконе) с лиофильно высушенным штаммом указывают следующие сведения: наименование и номер штамма, дату лиофилизации, порядковый номер лиофилизации, срок годности. Тест-штаммы контролируют ежегодно по всем биологическим свойствам, указанным в нормативной документации. Результаты контроля фиксируют в специальном журнале и отражают в паспорте штамма.

Раздел 3. Исследование адгезивной активности пробиотических штаммов

Адгезивная активность пробиотических штаммов определяет их способность прикрепиться к эпителию кишечника и размножиться прежде, чем клетки слизистого слоя будут обновлены. Для обеспечения данной функции бактерии имеют ряд структур (пили/фимбрии, компоненты клеточной стенки), посредством которых происходит их прикрепление к эпителиальной клетке. Эти структуры называются факторами адгезии и колонизации и относятся к факторам патогенности. Бактерии способны экспрессировать различные типы фимбрий, которые кодируются различными хромосомальными и плазмидными генами. Это генетическое разнообразие позволяет клеткам адаптироваться к изменяющейся окружающей среде и использовать эту возможность по отношению к различным поверхностным структурам хозяина. Механизм специфической адгезии включает 2 фазы: обратимую и необратимую. Обратимая фаза может быть обеспечена гидрофобным взаимодействием, электростатическим притяжением, броуновским движением, а также атомными и молекулярными вибрациями. Необратимая специфическая фаза обеспечивается множеством связей типа “ключ-замок” между комплементарными молекулами на каждой из клеточных поверхностей; как только эти связи сформировались, прикрепление бактерий становится необратимым. Определение способности пробиотических штаммов к адгезии является важным критерием их отбора для создании препаратов пробиотиков медицинского назначения. Для исследования адгезии используют суточные культуры испытуемых штаммов. Суточную чистую культуру исследуемого штамма, выращенную на скошенной адекватной питательной среде, смывают ЗФР, pH 7,2 и затем дважды отмывают ЗФР путем центрифугирования (1500 об./мин. в течение 10 мин.). Испытуемые культуры можно также выращивать на плотной среде, покрытой целлофаном, при температуре 37 °С в течение 16-18 ч. После этого готовят суспензию, содержащую 2 · 109 КОЕ/мл. Подготовленные таким образом культуры, выращенные на целлофане, доводят до указанной концентрации без отмывания. 1. Метод определения адгезивности пробиотических штаммов к эритроцитам. Эритроциты дважды отмывают от консерванта в ЗФР путем центрифугирования (1000 об./мин. в течение 10 мин.) и доводят до нужной концентрации (108 клеток в 1 мл ЗФР). Подсчет концентрации эритроцитов производят в камере Горяева с помощью световой микроскопии по общепринятой методике. Затем в пробирку с 0,5 мл взвеси микробов указанной выше концентрации вносят 0,5 мл суспензии эритроцитов и инкубируют 30 мин. при температуре () °С, периодически встряхивая. Потом смесь трехкратно отмывают ЗФР от неадгезированных микробов (при 600 об./мин. по 10 мин.). После отмывки на предметном стекле готовят мазок, фиксируют смесью Никифорова, окрашивают по Романовскому-Гимзе и при микроскопировании проводят оценку уровня адгезии. Средний показатель адгезии (СПА) определяют по среднему числу микробов, прилипших к поверхности одного эритроцита, подсчитывая все имеющиеся эритроциты в 5 полях зрения, но не менее 50 эритроцитов. Степень адгезивности считают нулевой при СПА от 0 до 0,99; низкой – от 1,00 до 1,99; средней – от 2,00 до 3,99 и высокой > 4,00. Из числа учитываемых эритроцитов подсчитывают процент эритроцитов (К%), имеющих на своей поверхности прилипшие микробы. Кроме того, подсчитывают индекс адгезивности микроба (ИАМ) – среднее количество микробных клеток на одном эритроците, участвующем в адгезивном процессе, по формуле:

ИАМ = (СПА 100%) / К,

где: СПА – средний показатель адгезии испытуемого микроба; К – количество эритроцитов, имеющих на своей поверхности прилипшие микробы. Учет результатов. Микроорганизмы считают неадгезивными при ИАМ от 1,00 до 1,75; низкоадгезивными – ИАМ от 1,76 до 2,49; среднеадгезивными – ИАМ от 2,50 до 3,99 и высокоадгезивными – при ИАМ > 4,00. 2. Метод определения адгезивности пробиотических штаммов к эпителиальным клеткам кишечника крыс или мышей. Адгезивность штаммов изучают в системе in vitro на эпителиальных клетках тонкой и толстой кишки крыс линии Фишер или любой другой линии, или на беспородных белых мышах. Крыс или мышей умерщвляют углекислым газом. Из кишечника погибших животных выделяют кусочки размером 5×5 мм, тщательно отмывают их от слизи и содержимого с помощью ЗФР. После этого из кусочков слизистой кишечника на вибраторе модели ВПП получают эпителиальные клетки. Полученные эпителиоциты дважды отмывают охлажденным ЗФР (pH 7,2) при центрифугировании (800 об./мин. по 10 мин.). После определения исходной концентрации клеток с помощью камеры Горяева при световой микроскопии ее доводят до 2 · 106 клеток/мл с помощью ЗФР. Одновременно с подготовкой клеток эпителия готовят суспензию испытуемой пробиотической культуры в концентрации 2 · 109 КОЕ/мл. При проведении эксперимента на 0,5 мл взвеси эпителиальных клеток наносят 0,5 мл взвеси бактериальной культуры указанной концентрации. Клеточно-бактериальную смесь инкубируют в термостате при температуре () °С в течение 30 мин, периодически встряхивая. Затем смесь трехкратно отмывают ЗФР от неадгезированных микробов при центрифугировании (600 об./мин. по 10 мин.). Все манипуляции осуществляют на холоде. К полученному после отмывания осадку добавляют 1-2 капли ЗФР и готовят мазки на стекле. Препараты фиксируют 96° спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимзе. В световом микроскопе подсчитывают среднее количество бактерий, прилипших к 25 энтероцитам или колоноцитам. При оценке адгезивности каждого штамма микроорганизма опыт повторяют не менее 3 раз. Подсчитывают СПА – число микробов, адгезированных к 1 клетке-энтероциту, подсчитывая среднее количество “микроб/клетка” в 10 полях зрения и учитывая результаты всех опытов (учитывается не менее 25 энтероцитов в 10 полях зрения). Уровень адгезии отдельных штаммов бактерий условно разделен на 4 степени: неадгезивные штаммы (СПА = 0); слабоадгезивные (СПА = 1-5); среднеадгезивные (СПА = 5-10) и высокоадгезивные (СПА выше 10). 3. Определение уровня адгезивной активности штаммов-пробиотиков на модели эпителиальных клеток влагалища. Взятие материала для получения изолированных эпителиальных клеток производят при проведении диагностической гистероскопии и раздельном диагностическом выскабливании стенок шейки матки и цервикального канала при различных неинфекционных заболеваниях тела матки. В асептических условиях под внутривенной анестезией шейка матки обнажается куско- или ложкообразными зеркалами. После этого производят соскоб эпителия слизистой боковых стенок влагалища. После забора материал помещают в транспортный контейнер с жидкой питательной средой 199. Контейнер обкладывается льдом. Полученные клетки дважды отмывают охлажденным ЗФР (pH 7,2) центрифугированием при 800 об./мин. по 10 мин. После определения исходной концентрации взвеси клеток с помощью камеры Горяева с помощью светового микроскопа суспензию клеток разводят до концентрации (1,5-2) · 106 клеток/мл. Далее готовят суспензию испытуемого штамма с концентрацией 2 · 109 КОЕ/мл. В ходе испытания 0,5 мл взвеси эпителиальных клеток смешивают с 0,5 мл взвеси бактериальной культуры указанной концентрации. Клеточно-бактериальную смесь инкубируют в термостате при температуре () °С в течение 30 мин., периодически встряхивая. Потом смесь трехкратно отмывают ЗФР от неприлипших микробов при 600 об./мин. по 10 мин. Все манипуляции осуществляют на холоде. К осадку добавляют 1 – капли ЗФР и готовят мазки на стекле. Препараты фиксируют смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимзе. В световом микроскопе подсчитывают среднее количество бактерий, прилипших к 25 эпителиоцитам. При оценке адгезивности каждого штамма микроорганизма опыт повторяют не менее 3 раз. Подсчитывают СПА – число микробов, адгезированных к 1 клетке-эпителиоциту, подсчитывая среднее количество “микроб/клетка” в 10 полях зрения и учитывая результаты всех опытов (учитывается не менее 25 эпителиоцитов в 10 полях зрения). Степень адгезии отдельных штаммов бактерий определяют следующим образом: неадгезивные штаммы (СПА = 0); слабоадгезивные (СПА = 1-5); среднеадгезивные (СПА = 5-10) и высокоадгезивные (СПА выше 10). Штаммы с высокой адгезивной активностью не следует рекомендовать для производства пробиотиков.

Раздел 4. Определение безопасности пробиотических штаммов

Определение вирулентности, токсичности, токсигенности и безвредности осуществляют в соответствии с ОФС “Безопасность пробиотиков в опытах in vivo”. Животные. Для токсикологических исследований используют здоровых животных, полученных из сертифицированных питомников. Вирулентность, токсигенность, токсичность (“общую”, “острую” и “хроническую”), безвредность, дермонекротические и другие свойства испытуемых штаммов пробиотиков определяют не менее чем на 2 видах (нелинейных или линейных) или 2 линиях одного вида животных в зависимости от изучаемого штамма. Исследования проводят на животных обоего пола. Данные, полученные в опытах на самках и самцах, учитывают отдельно для оценки воспроизводимости результатов испытания. Для исключения большого разброса в исследуемых показателях следует использовать животных одного возраста. Разброс по исходной массе тела не должен превышать . Рекомендуемая масса тела животных в начале опыта: мыши – от 10 до 14 г; крысы – от 100 до 140 г; морские свинки – от 250 до 450 г; кролики – от 1,5 до 2,5 кг. Партия животных из питомника должна сопровождаться ветеринарным свидетельством или ветеринарной справкой. Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляет не менее 3-4 сут. В течение карантина проводят ежедневный осмотр животных (оценивают общее состояние и поведение). В случае гибели в этот период более 10% поступивших животных испытание токсичности на данной партии исключается. Клетки с животными помещают в отдельные комнаты. Световой режим: 12 ч – свет, 12 ч – темнота. Температуру воздуха поддерживают в пределах 19-25 °С, относительную влажность – 30-70%. Содержание экспериментальных животных должно соответствовать действующим санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). Рекомендуется давать животным стандартную диету в соответствии с действующими нормами. Для обеспечения водой мелких лабораторных животных целесообразно использовать автопоилки. Кормление следует производить в фиксированное время, т.к. прием пищи может изменить чувствительность животных. Наряду с подопытными животными из этой же партии в аналогичных условиях содержатся контрольные животные. Формирование групп подопытных и контрольных животных проводят методом случайной выборки (единица выборки – животное). Материалы: испытуемые тест-штаммы; оптический стандарт мутности на 5 и 10 ME; селективные питательные среды; шприцы вместимостью 1 мл с ценой деления 0,05 мл и вместимостью 2 мл с ценой деления 0,1 мл.

4.1. Определение дермонекротических свойств испытуемых штаммов пробиотиков

Для этой цели используют белокожих кроликов породы Шиншилла массой 1,5-2,5 кг или морских свинок массой 300-450 г. Разные концентрации микробной взвеси в объеме 0,1-0,2 мл вводят внутрикожно в область спины. При этом используют тонкие (N 18-20) острые иглы с небольшим скосом. Кожу в месте введения взвеси предварительно освобождают от шерсти и обрабатывают 70° спиртом. В месте введения кожу растягивают пальцами левой руки, правой рукой вводят иглу под острым углом. Конец иглы должен быть виден через эпидермис: при введении материала эпидермис приподнимается в виде четко ограниченного бугорка, кожа над ним становится прозрачной и пористой. Результат учитывают ежедневно в течение 3-4 сут. Отмечают появление отека, красноты, наличие некроза. Следует иметь в виду, что вследствие неодинаковой чувствительности животных необходимо использовать не менее 2 кроликов или морских свинок. Обязательно при испытании каждому животному следует ввести взвесь штамма бактерий, обладающего дермонекротической активностью (контроль чувствительности животных). При учете результатов отмечают размер гиперемии, отека и некроза, измеряя диаметр в мм.

4.2. Определение “острой” токсичности
испытуемых штаммов пробиотиков

При изучении “острой” токсичности для определения LD50 или максимально переносимой дозы однократно животным вводят несколькими способами (внутривенно, внутрибрюшинно, перорально) 3 или 4 разные дозы испытуемых культур пробиотических штаммов или готовых препаратов. Контрольной группе животных теми же способами вводят 0,9% раствор натрия хлорида. В той же группе оставляют интактных животных (контрольная группа 2). Внутривенные и внутрибрюшинные инъекции максимально переносимых доз испытуемых препаратов позволяют выявить органы-мишени для испытуемого штамма пробиотика, характер и степень выраженности морфологических изменений в этих органах. Сравнение параметров токсичности при разных путях введения может дать представление о сходстве или различии в механизмах токсического действия испытуемых штаммов или препаратов и причинах летального исхода у животных (табл. 1).

Таблица 1

Максимально допустимые объемы жидкости для некоторых видов лабораторных животных в зависимости от пути введения

Вид животных
Масса тела, г
Путь введения/объем введения, мл
в желудок
под кожу
в мышцу
в вену
в брюшную полость
Мышь
10-14
0,5-1,0
0,5-1,0
0,5
0,2-0,5
0,5-1,0
Крыса
100-140
3,0
5,0-10,0
5,0
2,0
5,0
Морская свинка
250-300
4,0-5,0
15,0
5,0
5,0-8,0
5,0
Кролик
1500-2500
100,0
30,0
15,0
20,0
20,0-30,0

Примечание. Максимальные объемы должны вводиться мышам в течение 5 с, крысам и морским свинкам – в течение 10 с, кроликам – в течение 20 с.

Общая продолжительность наблюдений за животными должна составлять не менее 7 сут. Ежедневной регистрации подлежат гибель животных, масса тела, а также наличие или отсутствие возможных клинических симптомов интоксикации, в т.ч. нарушение координации движения, наличие судорог, их характер, а также состояние волосяного и кожного покрова, окраска слизистых оболочек, положение хвоста. Через 24 ч и 7 сут. осуществляют взятие материала из внутренних органов выживших животных (не менее 5 животных на каждый способ введения соответственно). Обязательному исследованию подлежат все животные, павшие в течение срока наблюдения. Перед взятием материала из внутренних органов осуществляют их визуальный осмотр. Макроскопические изменения каждого органа фиксируют в журнале. Допускается проведение гистологического исследования органов одного вида животных, оказавшегося более чувствительным к токсическому воздействию препарата. Во всех экспериментах, предусматривающих выполнение патоморфологических исследований, используют равное количество контрольных животных (после введения 0,9% раствора натрия хлорида и интактных) (табл. 2).

Таблица 2

Схема определения “острой” токсичности производственных штаммов и лекарственной формы препарата пробиотика

Способ введения
Доза
Кратность введения
Срок опыта, сут.
Срок забора внутренних органов, сут.
Внутрибрюшинное и при необходимости внутривенное Не менее 3 доз для вычисления LD50 или максимально переносимой дозы в случае невозможности определения LD50 Однократно
7 с ежедневной регистрацией массы тела, признаков интоксикации, гибели животных 1 и 7
Перорально
Максимально переносимая доза
Однократно
7 с ежедневной регистрацией массы тела, признаков интоксикации 1 и 7

4.3. Определение “хронической” токсичности испытуемых штаммов пробиотиков

Целью хронических токсикологических экспериментов является характеристика степени повреждающего действия исследуемых штаммов или препаратов при их длительном введении, выявление наиболее чувствительных органов и систем организма, а также исследование степени обратимости вызываемых ими повреждений. “Хроническую” токсичность определяют не менее чем на 2 видах животных (или 2 линиях одного вида). Обязательным путем введения испытуемого штамма является пероральный способ независимо от лекарственной формы готового препарата. Продолжительность введения пробиотиков при изучении хронической токсичности зависит от предполагаемой длительности их применения в клинике (табл. 3).

Таблица 3

Схема определения “хронической” токсичности производственных штаммов и лекарственной формы препарата

Способ введения
Доза
Кратность введения
Срок опыта
Срок забора внутренних органов, сут.
Перорально
Эквивалент суточной человеческой дозы <*> Ежедневно в течение 14 или 30 сут. в зависимости от предполагаемого курса лечения 14 или 30 сут. с ежедневной регистрацией массы тела, признаков интоксикации 15 и 22
31 и 37

<*> Суточную дозу, эквивалентную человеческой (Эд) на кг массы тела животного, рассчитывают по формуле: Эд = Мж · ЧД/Мч, где: Мж – масса тела животного;
ЧД – человеческая доза;
Мч – масса тела человека (масса тела взрослого человека 70 кг, масса тела ребенка – 10 кг). Пример расчета: Мж = 10 г; Мч = 10 кг = 1 · 104 г; ЧД = 1 · 109 КОЕ/г Эд = 10 1 · 109/1 104 = 1 · 106 КОЕ/г

Препарат вводят не менее чем 20 животным 1 раз в сутки в дозе, эквивалентной предлагаемой для человека, при пересчете на 1 кг массы. Перерыв в курсе введения не допускается. Наблюдение за животными проводят в течение периода введения препарата и последующих 7 сут. Ежедневной регистрации подлежат гибель животных, масса тела, а также наличие или отсутствие возможных клинических симптомов интоксикации, в т.ч. нарушение координации движения, наличие судорог, их характер, а также состояние волосяного и кожного покрова, окраска слизистых оболочек, положение хвоста. Для проведения гистологического исследования на 1 и 7 сут. после последнего введения препарата забивают не менее 5 животных на каждый способ введения соответственно. Гистологическому исследованию подвергают также органы всех животных, павших в течение периода наблюдения. Допускается проведение гистологического исследования органов одного вида или линии животных, оказавшихся более чувствительными к токсическому действию препарата.

4.4. Патоморфологическое исследование

Забой животных проводят эфирным наркозом с последующей декапитацией. Вскрытие и осмотр внутренних органов проводят сразу после забоя, обращая внимание на состояние серозных покровов и содержимое полостей. Определяют, сравнивая с контролем, массу, цвет, степень кровенаполнения органов, цвет и вязкость крови, наличие кровоизлияний (табл. 4).

Таблица 4

Органы животных, подлежащие гистологическому исследованию

Способ введения испытуемого препарата
Исследуемые органы
Внутривенный
Головной мозг, печень, легкие, сердце, почки, надпочечники, тимус, лимфатические узлы разной локализации, стенка вены и подкожная клетчатка в месте введения Внутрибрюшинный
Головной мозг, печень, легкие, сердце, почки, надпочечники, тимус, лимфатические узлы разной локализации Пероральный
Головной мозг, печень, легкие, сердце, почки, надпочечники, тимус, корень языка, желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник, мезентериальные лимфатические узлы

Фиксацию тканей органов проводят в 10% растворе нейтрального формалина. Для этого 1 часть 40% раствора формальдегида разводят 9 частями воды. Готовят раствор обязательно на водопроводной воде, т.к. вода очищенная вызывает набухание тканей. После промывания кусочки подвергают дальнейшему уплотнению путем обезвоживания в спиртах увеличивающейся концентрации.

Методика окраски срезов

Депарафинирование срезов. Парафиновые срезы перед окрашиванием освобождают от парафина с помощью любого его растворителя – бензола, толуола, ксилола, бензина. Особенно тщательно удаляют парафин перед исследованием ткани в поляризационном микроскопе, т.к. парафин обладает двоякопреломляющим свойством. Депарафинирование осуществляют по следующей схеме (табл. 5).

Таблица 5

Методика депарафинирования срезов

Среда
Время, условия
Ксилол 1
10-15 мин., можно в термостате при 37 °С Ксилол 2
3-5 мин.
Спирт абсолютный 1
1-2 мин.
Спирт абсолютный 2
Ополоснуть
Спирт 96° 1
Ополоснуть
Спирт 96° 2
Ополоснуть
Вода очищенная
2 смены

После депарафинирования 100-350 препаратов реактивы заменяют. Методика окрашивания срезов гематоксилин-эозином. Наиболее часто применяется окрашивание срезов гематоксилин-эозином. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Для окрашивания ядер используется гематоксилин. Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха. Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96° спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл воды очищенной, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Для доокрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий: 1) срезы переносят в дистиллированную воду на 5-10 мин.; 2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2-5 мин.; 3) промывают в воде очищенной 1-2 с;
4) промывают в водопроводной воде 3-5 мин.; 5) осуществляют контроль под микроскопом; 6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1-2 с; 7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин. при частой смене воды; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей; 8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом); 9) промывают в воде очищенной 5-10 мин.; 10) наносят 1% водный раствор эозина на 0,5-1,0 мин.; 11) промывают в воде очищенной (и дифференцируют, т.к. вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза; 12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2-3 срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково. При необходимости для уточнения характера выявленных изменений могут быть использованы другие методы окраски (окраска на фибрин, липиды, мукополисахариды и т.д.). При изучении микропрепаратов обращают внимание на следующие изменения: 1. Нарушение в системе микроциркуляции (перераспределение крови с депонированием ее в паренхиматозных органах, стаз, агрегация эритроцитов в капиллярах и тромбообразование, повышение проницаемости стенок сосудов с развитием геморрагии, плазморрагий, мукоидной и фибриноидной дезорганизации, фибриноидного некроза). 2. Дистрофические и воспалительные изменения во внутренних органах. 3. Состояние бронхиальной системы (признаки бронхоспазма, отек стенок бронхов, десквамация слизистой оболочки, присутствие эритроцитов в просвете бронхов и альвеол) и перибронхиальных лимфатических узлов. 4. Изменения миокарда, эндокарда и перикарда (отек стромы, миоцитолиз, мукоидное набухание миокардиоцитов, воспалительная инфильтрация и продуктивная реакция). 5. Характер и степень выраженности изменений в клубочковом и канальцевом аппарате почек. 6. Характер перестройки в органах иммунитета и кроветворения (тимусе, селезенке, лимфатических узлах, костном мозге). 7. Дистрофические и микроциркуляторные изменения в ЦНС. Патологические изменения, возникающие у животных после введения высоких доз пробиотика, дают ценную информацию для характеристики его токсических свойств. Однако эта информация должна быть подвергнута тщательному анализу и полученные результаты следует рассматривать в качестве предупреждения, а не противопоказания для клинических испытаний. При решении вопроса о возможности передачи препарата на клиническое изучение исследователь должен учесть следующие факторы: 1. Соотношение терапевтической и безопасной дозы (LD50 или максимально переносимой дозы). 2. Характер и обратимость выявленной патологии. Заключение должно содержать суждения исследователей о степени воздействия штамма или препарата на внутренние органы испытуемых животных при исследовании “острой” и “хронической” токсичности для оценки возможных побочных реакций и определения необходимых ограничений при клинических испытаниях.

4.5. Содержание отчета об исследовании
“острой” и “хронической” токсичности

Отчет об изучении “острой” и “хронической” токсичности испытуемого пробиотического штамма или препарата пробиотика должен быть составлен по определенному плану и содержать следующие необходимые разделы. 1) Введение (цель и задачи исследования). 2) Материалы и методы (биологические характеристики производственного штамма и препарата, характеристики животных, условия их содержания, методы формирования групп и отработки доз, способы забоя животных, методы приготовления гистологических препаратов). 3) Результаты исследований (описание макро- и микроскопических изменений). 4) Заключение о наличии или отсутствии “острой” и “хронической” токсичности испытуемого штамма или препарата, в котором указываются возможные побочные эффекты и ограничения для проведения клинических испытаний. Результаты макро- и микроскопического исследования органов животных, получавших исследуемый препарат, препарат сравнения, а также контрольных животных регистрируют в протоколах и заносят в регистрационную карту; документируют микрофотографиями (табл. 6 и 7). На основании полученных результатов оформляют заключение о токсических свойствах испытуемого препарата. Указанные материалы вместе с другими формами документации представляют в соответствующий Государственный уполномоченный орган. Гистологические препараты и парафиновые блоки сохраняют до принятия решения по результатам доклинического испытания препарата.

Таблица 6

Форма протокола для макроскопического исследования по результатам исследования “острой” и “хронической” токсичности пробиотического штамма

Сроки проведения опыта
Испытуемый материал
Способ введения испытуемого материала
Вид/линия животных
Количество животных
Описание макроскопических изменений

Таблица 7

Форма протокола для микроскопического исследования по результатам исследования “острой” и “хронической” токсичности пробиотического штамма

Сроки проведения опыта
Испытуемый материал
Способ введения испытуемого материала
Вид/ линия животных
Количество животных
Внутренние органы <*>
ЦНС
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Головной мозг

<*> 1 – легкие, 2 – печень, 3 – селезенка, 4 – сердце, 5 – почки, 6 – надпочечники, 7 – тимус, 8 – место введения, 9 – желудок, 10 – тонкий кишечник, 11 – толстый кишечник, 12 – регионарные л/у.

В соответствии с Приказом Минздрава России от 29.10.2015 N 771 данный документ введен в действие с 1 января 2016 года.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Требования к клеточным культурам – субстратам производства иммунобиологических лекарственных препаратов ОФС.1.7.2.0011.15
Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья устанавливает требования к первичным и перевиваемым (диплоидным и гетероплоидным) клеточным культурам (КК) человека и животных, применяемым в качестве субстратов производства и контроля вирусных вакцин. Применение КК для производства и контроля иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) основано на системе создания главного (ГБК) и рабочего (РБК) банков клеток.

ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Клеточная линия (КЛ) – популяция клеток с определенными характеристиками, полученная путем последовательного субкультивирования первичной ткани донора в системе in vitro. Посевной пул клеток (ПК) – клеточная линия, полученная из одного вида ткани донора на определенном уровне пассажа и сохраняемая в контейнерах в равных частях однородного состава при температуре не выше минус 70 °С. Один или несколько контейнеров используются для создания главного банка клеток. Главный банк клеток (ГБК) – запас клеток, полученных из одного посевного пула клеток, сохраняемых в контейнерах в равных частях однородного состава на определенном уровне пассажа при температуре не выше минус 70 °С. Предназначен для последующего создания рабочего банка клеток. Рабочий банк клеток (РБК) – запас клеток однородного состава, полученных из ГБК на определенном уровне пассажа, сохраняемых в контейнерах в равных частях при температуре не выше минус 70 °С. Используются для получения производственной клеточной культуры. Производственная клеточная культура – клетки, полученные из РБК и используемые для производства ИЛП. Первичные клеточные культуры (ПКК) – культуры, полученные из клеток тканей или органов, взятых от одного или более организмов, которые выращиваются in vitro от начала субкультивирования. Диплоидные клеточные культуры (штаммы) (ДКК) – морфологически однородная популяция клеток человеческого или животного происхождения с ограниченным сроком жизни, сохраняющая диплоидный кариотип, идентичный донору. Гетероплоидные клеточные культуры (ГКК) – однородная популяция клеток человеческого или животного происхождения с неограниченным сроком жизни, сохраняющая стабильность биологических характеристик в течение установленного срока культивирования. Посторонние агенты – бактерии (в том числе, микобактерии, риккетсии, микоплазмы), грибы, вирусы, прионы (в том числе, вызывающие трансмиссивные губчатые энцефалопатии крупного рогатого скота), и др. которые случайно попали в ИЛП в ходе производственного процесса. ДНК инфекционная – вирусная ДНК, способная внедряться в клеточную ДНК и вызывать образование пролиферирующих клонов. Удвоение популяции – удвоение количества клеток при митотическом делении. Онкогенность – свойство биологических агентов (вирусов, нуклеиновых кислот, клеточного субстрата, химических веществ, субклеточных элементов и др.) вызывать онкогенную трансформацию клеток при введении животным (при этом опухоль состоит из клеток хозяина). Туморогенность – способность клеток образовывать опухоли у чувствительных животных в месте введения, возможно с образованием метастазов (опухоль состоит из инокулированных клеток). Пассаж – перенос клеток из одного культурального сосуда в другой для размножения и накопления необходимого количества клеточной массы. Эндогенный вирус (например, ретровирус) – вирус, геном которого интегрируется в геном чувствительной клетки хозяина и наследуется ее потомками.

Общие положения

Использование в качестве субстрата для производства перевиваемых клеточных линий (ДКК и ГКК) возможно только при создании системы клеточных банков. Процесс производства ИЛП в клеточных культурах основан на современной технологии, обеспечивающей высокую степень очистки получаемого продукта от клеточных компонентов и контаминирующих агентов, в том числе эндогенных вирусов, клеточной и инфекционной ДНК. Технологический процесс должен быть валидирован. Клеточные культуры, используемые в производстве ИЛП, получаемые из тканей животных и птиц, должны быть стерильными, жизнеспособными, морфологически однородными, неонкогенными, нетуморогенными и не содержать посторонних агентов. При производстве ИЛП путем культивирования клеточных культур должны использоваться культуральные питательные среды, сыворотки, трипсин и другие реактивы, разрешенные в производстве иммунобиологических препаратов. Результаты, полученные при изучении и аттестации главных (ГБК) и рабочих (РБК) банков клеток, оформляют в виде паспорта и передают для рассмотрения вместе с протоколами исследований и материалами по контролю и аттестации в установленном порядке, в котором должны быть отражены следующие показатели: 1. Наименование клеточной культуры;
2. Коллекционный шифр (клеточной линии, ГБК, РБК); 3. История получения (происхождение) клеточной культуры и создания ГБК и РБК; 4. Запас клеток (количество сохраняемых контейнеров в банках клеток, количество клеток в емкости); 5. Номер пассажа и дата закладки клеток на хранение; 6. Условия криоконсервации, режим хранения и жизнеспособность клеток после размораживания; 7. Ростовые свойства (способ культивирования, питательная среда, посевная концентрация, метод снятия клеток, кратность рассева, температура культивирования, частота пассирования); 8. Подлинность (морфология, кариологическая характеристика, молекулярно-генетические методы исследования); 9. Стерильность (отсутствие микробных агентов, в том числе микоплазм); 10. Присутствие посторонних вирусов, в том числе эндогенных; 11. Туморогенность (если применимо);
12. Онкогенность (если применимо);
13. Стабильность биологических свойств (количество рекомендованных для производства пассажей); 14. Сфера применения, чувствительность к производственному штамму вируса.

2. Первичные клеточные культуры (ПКК)

Для приготовления первичных клеточных культур материал должен быть получен от животных, свободных от патогенной флоры, из предварительно обследованных хозяйств, если иное не предусмотрено нормативной документацией. ПКК высоко чувствительны к различным вирусам. Однако наличие контаминации может приводить к изменению чувствительности ПКК к вакцинным штаммам вирусов, что делает их менее пригодным субстратом по сравнению с перевиваемыми (диплоидными и гетероплоидными) клеточными линиями.

3. Диплоидные клеточные культуры (ДКК)

ДКК получают из тканей или органов здорового донора (человека или животного), не имеющего в генеалогии онкологических, венерических и генетических заболеваний, врожденных аномалий, заболеваний гепатитами, туберкулезом и СПИД. ДКК получают общепринятыми методами дезинтеграции клеток. После формирования клеточного монослоя культуру периодически пассируют (один-два раза в неделю). В результате пассирования клетки становятся перевиваемыми линиями, сохраняющими диплоидный кариотип со структурой, идентичной донору. ДКК растут в богатых витаминами и минеральными солями питательных средах с содержанием 10-15% сыворотки крови плодов крупного рогатого скота. ДКК должны иметь ограниченный срок жизни, стабильный кариотип (2n не менее 75%), не содержать посторонних агентов (бактерий, в том числе, микоплазм, грибов, простейших, вирусов), сохранять стабильность всех биологических свойств в фазе активного роста (первые две трети срока жизни клеточных культур), обладать высокой чувствительностью к заражению специфическими агентами. Как правило, у ДКК отсутствует онкогенная и туморогенная активность.

4. Гетероплоидные клеточные культуры (ГКК)

ГКК могут быть получены при: серийном субкультивировании первично-трипсинизированных клеток опухолей человека или животных; трансформации нормальных клеток с ограниченным сроком жизни онкогенным вирусом (например, В-лимфоциты, трансформированные вирусом Эпштейна-Барр); серийном субкультивировании первично-трипсинизированных нормальных культур с выделением доминантной популяции спонтанно трансформированных клеток (например, Vero, BHK-21, CHO, MDCK); слиянии миеломных клеток с В-лимфоцитами, продуцирующими антитела (гибридомы). Основными преимуществами ГКК являются: возможность получения полной характеристики клеточной линии, нетребовательность к составу питательной среды, возможность адаптации к росту в бессывороточной среде, получение больших объемов в биореакторах, на микроносителях или в суспензии. ГКК должны иметь неограниченный срок жизни, типичную морфологию для данной линии, зимограмму и иммунологические маркеры, характерные для донора клеток, кариотип, определяющий видовую принадлежность клеточной культуры донора, обладать онкогенной и туморогенной безопасностью, высокой чувствительностью к заражению специфическим агентом, сохранять стабильность всех биологических свойств в течение срока, рекомендуемого для производства ИЛП. Вместе с тем, ГКК могут содержать и экспрессировать эндогенные вирусы, в том числе онкогенные, что не исключает теоретический риск онкогенной и инфекционной опасности готового продукта, связанной с остаточной клеточной ДНК и/или трансформирующими белками. Поэтому возможность использования таких клеток для получения ИЛП должна быть обоснована. В этом случае вопрос об их применении в качестве субстрата оценивается решением польза/риск. Препараты, изготовленные на гетероплоидных тканевых культурах, должны быть исследованы на содержание остаточной клеточной ДНК.

5. Криоконсервация

Среда для криоконсервации обычно состоит из базовой питательной среды, криопротектора и источника белка и подбирается в зависимости от вида культуры. В качестве криопротектора широко применяются глицерин или диметилсульфоксид (ДМСО), которые быстро проникают в клетки и прочно связывают в ней воду. Возможно также использование других криопротекторов. Для криоконсервации клетки ресуспендируют в смеси, состоящей из 80% питательной ростовой среды, 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, 10% глицерина (или ДМСО), разливают в ампулы, вместимостью 2,0 или 5,0 мл и замораживают в сосудах Дюара с жидким азотом. При замораживании температуру снижают постепенно на 1 °С в минуту до минус 25 °С, затем до минус 70 °С. Возможно использование других методов криоконсервации. Клеточные культуры могут храниться при температуре минус 196 °С в течение 10 и более лет. После размораживания следует исследовать жизнеспособность клеток, определяя их количество путем подсчета живых и погибших клеток после окрашивания. Для определения физиологического состояния клеток “сохранные/”поврежденные” широко применяется окрашивание 0,1% раствором трипанового синего в гемоцитометрах.

6. Методы испытания клеточных культур

Морфология.
Для морфологического изучения клеточные культуры выращивают на предметных или покровных стеклах в течение 48-72 ч, фиксируют 96% этиловым спиртом или жидкостью Карнуа в течение 10-15 мин. при температуре от 20 до 22 °С, окрашивают гематоксилин-эозином или азур-эозином и просматривают в световом микроскопе. В нормативной документации могут быть указаны иные условия приготовления препаратов. Определяют тип роста клеток (эпителиоподобный или фибробластоподобный), гомогенность цитоплазмы, наличие эозинофильных включений, характерные особенности ядра, ядрышек и др. органелл. Необходимо также описывать оптимальные условия и способ культивирования: стационарный, роллерный, суспензионный или псевдосуспензионный, на микроносителях (декстрановых, покрытых коллагеном или желатином, целлюлозных или полистироловых). Должны быть представлены: посевная доза, метод снятия клеток, кратность рассева, частота пассирования. Для изучения морфологии клеток применяют также метод электронной микроскопии, высокая разрешающая способность которого позволяет выявлять дифференцировку клеток, различать их тончайшие структуры и наличие многочисленных клеточных органелл.

Определение видовой идентичности.
В процессе пассирования клеточных культур возможна видовая и внутривидовая контаминация одних клеточных линий другими. Разработка методов идентификации клеточных культур предполагает определение и изучение стабильности клеточных признаков. С этой целью разработаны и применяются методы электрофореза, кариологического анализа хромосом и молекулярно-генетические методы (ПЦР). Основными биохимическими маркерами, специфичными для данного вида донора, позволяющими определять внутривидовую и видовую контаминацию клеточных культур, является анализ полиморфизма изоферментов, обладающих одинаковой специфичностью к субстрату. Такими изоферментами являются глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФДГ), лактат-дегидрогеназы (ЛДГ), нуклеозидфосфорилаза (НФ) и др. Метод основан на сравнении электрофореграммы изоферментов исследуемой линии клеток с электрофореграммой изоферментов клеток известного вида донора. Каждому виду соответствует определенный набор изоферментов. Совпадение электрофоретической подвижности полос в опытном и контрольном (стандартном) образцах позволяет заключить, что исследуемые клетки принадлежит данному виду. Изоферменты можно выявить при помощи электрофореза в полиакриламидном, агарозном гелях или на пленках из ацетата целлюлозы. В настоящее время используют в основном агарозные и полиакриламидные гели. Различные изоферменты мигрируют с различной скоростью и по окончании электрофореза могут быть выявлены окрашиванием с соответствующим хромогенным субстратом. Учет результатов на окрашенных гелях (зимограммах) может быть проведен визуально или денситометрией зимограммы (или ее фотографии) (ОФС “Электрофорез”). Видовая контаминация клеток может быть также выявлена при помощи гель-электрофорезной системы Authentikit, которая позволяет выявлять до 7 различных видов изоферментов.

Метод кариологического анализа хромосом. Метод кариологического анализа хромосом предназначен для определения стабильности кариотипа культур клеток в соответствии с требованиями к кариологическим параметрам видовой идентификации клеток, основанной на сравнении кариотипа испытуемого образца со стандартным образцом с нормальным кариотипом известного вида. Совпадение по кариотипу испытуемого и стандартного образцов позволяет заключить, что испытуемый образец принадлежит данному виду. Кариологический анализ хромосом проводят на фиксированных препаратах в период митотической активности клеток, используя методы дифференциального окрашивания (C, G, Q и R). Получение препаратов для кариологического анализа хромосом. Испытуемые клетки в концентрации от 1,5 · 105 до 2,0 · 105 в 1,0 мл выращивают во флаконах при температуре () °С. Через 36-48 ч после посева клеток во флакон вносят колхицин из расчета 0,1 мл 0,04% раствора на 1 мл питательной среды и оставляют при температуре () °С. Через 4-5 ч питательную среду сливают, клетки снимают с подложки 0,25% раствором трипсина, центрифугируют в течение 5 мин. при 1000 об./мин., надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе калия хлорида и оставляют на 20 мин. при температуре 37 °С. Затем к клеткам добавляют смесь для фиксации, состоящую из 3 частей метанола и 1 части ледяной уксусной кислоты. Клетки фиксируют при температуре от 8 до 10 °С в течение 30 мин. Смену фиксатора повторяют 2-3 раза с промежуточным центрифугированием при 1000 об./мин. в течение 5 мин. Несколько капель суспензии в фиксаторе наносят на влажные и охлажденные до температуры от 8 до 10 °С предметные стекла и высушивают в струе теплого воздуха. Для подсчета модального класса и полиплоидии хромосом клетки окрашивают 1% раствором красителя азур-эозина по Романовскому-Гимзе. Дифференциальное окрашивание С-методом применяют для выявления структурного гетерохроматина, локализованного в околоцентрических и центромерных районах хромосом, в коротких плечах акроцентрических аутосом и в длинном плече Y-хромосомы. Дифференциальное окрашивание G-методом применяют при выявлении структурных перестроек и для идентификации маркерных хромосом. Метод позволяет идентифицировать каждую хромосому. Дифференциальное окрашивание Q-методом применяют для идентификации Y-хромосомы и структурных перестроек. Он основан на окрашивании флюорохромами с двумя производными акрихина – акрихин-дигидрохлоридом и акрихин-ипритом с исследованием в люминисцентном микроскопе. Дифференциальное окрашивание R-методом выявляет различия в окрашивании гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом, что подтверждает специфичность и стабильность рисунка полос для каждой хромосомы. Отбор клеток, находящихся в метафазе, для подсчета полиплоидии и выявления аберраций хромосом, следует проводить по принципу общей цитологической пригодности. Частоту полиплоидии (2n, 4n и т.д.) в популяции делящихся клеток определяют под микроскопом на основании подсчета в метафазных пластинках. Точный подсчет хромосом и изучение структурных нарушений проводят с масляной иммерсией (объектив микроскопа 90x). При цитогенетическом анализе, как правило, учитывают: число исследованных метафаз, число аберраций, число аберрантных клеток, типы аберраций и их частоту, распределение аберраций по группам хромосом. Для изучения клеточных культур банка рабочих клеток необходимо исследовать как минимум 500 метафазных пластинок на уровне производственного или любого следующего пассажа на чистоту полиплоидии, провести точный подсчет хромосом, определить частоту разрывов хромосом, структурных нарушений, деспирализацию или заметное ослабление первичных или вторичных перетяжек. Для определения кариотипа отбирают метафазные пластинки для последующей компьютерной обработки препаратов.

Молекулярно-генетические методы идентификации клеточных культур. Описанный выше метод является информативным и специфичным, однако длительность проведения анализа и необходимость в профессиональных навыках оператора делают его трудоемким для выполнения и сложным для интерпретации. В настоящее время более широкое применение получил метод мультиплексной ПЦР с видоспецифическими праймерами. Метод основан на выявлении видоспецифических участков митохондриальной ДНК (мтДНК) в области гена, кодирующего субъединицу 1 цитохром с-оксидазы (СОХ1) и цитохрома b с помощью видоспецифичных праймеров с детекцией результатов с помощью электрофореза и ПЦР в реальном времени. Реакция проводится в соответствии с инструкциями по применению тест-систем после валидации методики. В последние годы широкое распространение получили молекулярно-генетические методы идентификации клеточных культур. Таким способом оценки генетического соответствия клеточной линии является секвенирование полноразмерного генома исследуемого образца с последующим сравнением с эталонным штаммом.

Иммунологические методы идентификации клеток. Иммунологические методы идентификации клеток включают реакцию гемагглютииации, метод смешанной агглютинации, реакцию гемадсорбции, иммунофлуоресценции (РИФ), определение антигенов гистосовместимости и различия в чувствительности клеток разных видов животных к отдельным группам вирусов. Существует также ряд методов, основанных на применении специфического связывания антител с клеточной поверхностью: иммунный лизис (используют антитела к нежелательным клеткам, например фибробластам в популяции эпителиальных клеток), направленная доставка цитотоксина, сортировка клеток с активацией флюоресценции или на магнитных гранулах с иммобилизованными антителами.

Изучение туморогенности.
Для оценки туморогенной активности клеток используются две биологические системы – in vivo и in vitro. Испытанию подлежат клетки из ГБК или РБК, субкультивированные в течение не менее трех пассажей, превышающих рекомендованные для производства ИЛП. В системе in vivo используют иммуносупрессированных или имеющих генетическую иммунную недостаточность животных (например, бестимусные мыши с мутацией по гену nude, мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИ) или с супрессией функции Т-клеток антитимоцитарным глобулином (АТГ), антитимоцитарной (АТС) или антилимфоцитарной (АЛС) сыворотками). Наиболее подходящей моделью, позволяющей получать достоверные и стандартные результаты для выявления туморогенности клеток, являются взрослые мыши nude. Изучение туморогенности в системе in vivo на бестимусных мышах Взрослым самкам мышей линии Balb/c с мутацией по гену nude (генотип nu/nu) массой 19-20 г (не менее 30 голов) подкожно или внутримышечно вводят по 1 млн. клеток исследуемой клеточной культуры. Контрольной группе мышей (30 животных) вводят по 1 млн. заведомо туморогенных клеток (например, линии HeLa). Мышей содержат в специализированном кондиционированном виварии. За животными опытной и контрольной групп наблюдают в течение 21 сут. Животных обследуют ежедневно путем пальпации места инокуляции клеток и лимфатических узлов (регионарных, аксиллярных и подколенных). Оценивают общее состояние мышей и отдельно фиксируют гибель животных, связанную с наличием иммунодефицита и появление опухолевого роста. Образовавшиеся узлы измеряют штангенциркулем (в мм) и вычисляют объем Vср по формуле:

Vcp = a · в · с,

где: а – длина, в – ширина, с – высота опухоли.

После окончания срока наблюдения проводят эвтаназию животных и при макроскопическом исследовании определяют наличие узлов в месте введения клеток, в лимфатических узлах, легких, почках, печени и селезенке. Все поражения, напоминающие опухоли, а также лимфатические узлы и органы всех животных исследуют гистологически. Если изучаемые клетки являются заведомо туморогенными, следует определить уровень их туморогенности, основанный на расчете значения 50% туморопродуцирующей дозы (ТПД50). Для расчета ТПД50 изучаемые клетки вводят экспериментальным животным в дозах 107; 105; 103 и 101 и данные выражают как 50% доза опухолеобразования (ДОО50).

Изучение туморогенности в системе in vitro методом инвазивности в органные культуры. Метод основан на внесении испытуемых клеток в органную культуру кожи куриного эмбриона и состоит из нескольких этапов: – приготовление эмбрионального экстракта из мышечной ткани 7 сут. куриных эмбрионов; – приготовление питательной среды, состав которой состоит из 100 мл раствора Эрла, 20 mM HEPES, 4,0 мл куриного эмбрионального экстракта, 4,0 мл сыворотки крови плода коровы, 10 мл 1% агара, разогретого до температуры 40-50 °С, и антибиотиков. Среду разливают в лунки пластиковой панели, закрывают крышкой и оставляют при температуре 20-22 °С до застывания среды. После этого в лунку со средой помещают фрагмент кожи (5-7 мм) 9 сут. куриного эмбриона. Испытуемые клеточные культуры снимают с подложки общепринятым методом, ресуспендируют в питательной среде 199, и на три кожных фрагмента наносят по 1,0 мл испытуемой клеточной суспензии в виде капли в концентрации 106 кл/мл. Таким же образом на 2-3 кожных фрагмента наносят суспензию клеток HeLa (положительный контроль). В качестве отрицательного контроля оставляют 2-3 неинокулированных фрагментов кожи. Панель закрывают крышкой и инкубируют в атмосфере CO2 при температуре 36-37 °С. Через 72 ч инкубации готовят гистологические препараты фрагментов кожи толщиной по 5-7 микрон и окрашивают гематоксилин-эозином. Опыт учитывают, если:
а) в контрольных фрагментах кожи не отмечено признаков деструкции органной культуры; б) в положительном контроле имеются признаки инвазии испытуемых клеток в органные культуры кожи куриного эмбриона, т.е. проникновение и распространение пролиферирующих клеток в собственно дерму. Клетки испытуемых клеточных культур рассматривают как туморогенные, если хотя бы в одном из образцов органной культуры наблюдается инвазивный рост.

Изучение онкогенности.
Онкогенная активность клеточного субстрата может быть обусловлена онкогенными компонентами, присутствующими в клетке (клеточной или вирусной ДНК, РНК или трансформирующими белками). На наличие онкогенности исследуют клетки, субкультивированные в системе in vitro в течение не менее трех пассажей, превышающих рекомендованные для производства ИЛП. Изучение онкогенности проводят в системе in vivo, как указано в разделе “Испытание туморогенности”, вводя экспериментальным животным клеточный лизат. Испытание проводят на:
– новорожденных бестимусных мышах (генотип Nu/Nu) не старше 24 ч; – новорожденных крысах или хомяках (не старше 24 ч); – новорожденных мышах линии NIH Swiss.
Для снижения риска потенциальной опасности остаточной ДНК необходимо: – контролировать методом ПЦР количество гетерогенной ДНК в препаратах, вводимых парентерально; – чтобы количество ДНК в одной человеческой дозе ИЛП составляло не более 10,0 нг; – проводить валидацию методов инактивации и очистки инактивированных препаратов, которые должны обеспечивать дефрагментацию и снижение количества гетерогенной ДНК в ИЛП; В препаратах, вводимых перорально, количество гетерогенной ДНК не определяют. Однако при разработке такого продукта следует учитывать особенности производственного процесса с целью уменьшения количества остаточной клеточной ДНК.

Испытание клеточных культур на присутствие посторонних агентов. Испытание ИЛП на присутствие посторонних вирусов проводят на клеточных культурах, лабораторных животных и куриных эмбрионах в соответствии с ОФС “Испытание вирусных вакцин на присутствие посторонних агентов”. Испытание клеточных культур на стерильность проводят в соответствии с ОФС “Стерильность”. Если субстратом производства является культура клеток птичьего происхождения, испытание на присутствие микобактерий туберкулеза проводят на адекватных питательных средах. Исследуемый материал высевают на среду Левенштейна-Йенсена в соответствии с ОФС “Испытание вирусных вакцин на присутствие посторонних агентов”. Выявление микоплазм проводят микробиологическим и цитохимическим методами (ОФС “Испытание на присутствие микоплазм”). В качестве дополнительного метода может быть применена ПЦР. Испытание на эндогенные ретровирусы проводят электронно-микроскопическим методом, с помощью ПЦР, а также методами иммунофлюоресценции или ИФА с использованием адекватных тест-систем в соответствии с инструкциями по применению после валидации методик. Если в испытуемых клетках проявляется активность обратной транскриптазы, необходимо провести испытание на определение инфекционной способности, связанной с реплицирующимся вирусом. Электронная микроскопия позволяет изучать ультратонкие срезы клеток и получать изображения вирусов-контаминантов. Сыворотка крови крупного рогатого скота и трипсин, применяемые при культивировании клеточных культур, должны быть проверены на присутствие вирусов, бактерий (включая микоплазмы) и грибов. Испытание проводят в соответствии с ОФС “Испытание вирусных вакцин на присутствие посторонних агентов”. Для инактивации потенциальных вирусов-контаминантов возможно использовать -облучение. Если используется облучение, дозы должны быть достаточно низкими и не изменять биологические свойства облучаемых материалов. Испытание сыворотки и трипсина на стерильность и присутствие микоплазм проводят с помощью методов, изложенных в ОФС “Стерильность” и ОФС “Испытание на присутствие микоплазм”. В качестве дополнительных методов для выявления вирусов (парвовируса свиней типа 1, цирковирусов свиней 1 и 2 типов, аденовирусов, вирусов, вызывающих гастроэнтериты, вирусов энцефалита свиней и др.) возможно использование иммуноферментного анализа (ИФА) и ПЦР в соответствии с инструкциями по применению после валидации методик. Для инактивации потенциальных вирусов-контаминантов возможно использовать -облучение. Если используется облучение, его дозы должны быть достаточно низкими и не изменять биологические свойства облучаемых материалов.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ

ПРИКАЗ
от 21 июля 2015 г. N 1017

О СОЗДАНИИ ЭКСПЕРТНОГО СОВЕТА ПО ПЕДИАТРИИ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ

Приказываю:
1. Создать Экспертный Совет по педиатрии Министерства здравоохранения Московской области. 2. Утвердить:
2.1. Состав Экспертного Совета по педиатрии Министерства здравоохранения Московской области (Приложение N 1 – не приводится). 2.2. Положение об Экспертном Совете по педиатрии Министерства здравоохранения Московской области (Приложение N 2). 3. Контроль исполнения данного приказа возложить на заместителя министра здравоохранения Московской области В.В.Гребенникову.

Министр здравоохранения
Московской области
Н.В.СУСЛОНОВА

Приложение N 2
к приказу Министерства
здравоохранения
Московской области
от 21 июля 2015 г. N 1017

ПОЛОЖЕНИЕ
ОБ ЭКСПЕРТНОМ СОВЕТЕ ПО ПЕДИАТРИИ
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ

Экспертный Совет Министерства здравоохранения Московской области по вопросам организации обеспечения лекарственными препаратами детского населения (далее – Экспертный Совет) является координационным органом, созданным в целях рассмотрения наиболее значимых вопросов обеспечения лекарственными препаратами детского населения на территории Московской области.
Основными задачами Экспертного Совета являются: 1) подготовка предложений по вопросам определения потребности в обеспечении лекарственными препаратами детского населения на территории Московской области; 2) подготовка предложений по вопросам формирования заявок на закупку лекарственных средств для детского населения на территории Московской области; 3) оказание организационно-методической помощи медицинским организациям на территории Московской области по вопросам обеспечения лекарственными препаратами детского населения; 4) разработка предложений и рекомендаций медицинским организациям на территории Московской области по повышению эффективности обеспечения лекарственными препаратами детского населения;
Для решения возложенных задач Экспертный Состав вправе: 1) создавать рабочие группы; 2) приглашать на заседания и заслушивать главных специалистов Министерства здравоохранения Московской области, представителей медицинских организаций по вопросам, отнесенным к компетенции Экспертного Совета по педиатрии; 3) запрашивать в установленном порядке от организаций и должностных лиц необходимые материалы и информацию по вопросам, отнесенным к компетенции Экспертного Совета;
В состав Экспертного Совета входят председатель Экспертного Совета, заместитель председателя Экспертного Совета, секретарь Экспертного Совета и члены Экспертного Совета.
Председатель Экспертного Совета осуществляет общее руководство работой Экспертного Совета, проводит заседания Экспертного Совета, распределяет обязанности между членами Экспертного Совета.
Заместитель председателя Экспертного Совета организует подготовку проведения заседаний Экспертного Совета, выполняет функции председателя Экспертного Совета в период его отсутствия, а также решает текущие вопросы деятельности Экспертного Совета.
Секретарь Экспертного Совета осуществляет подготовку материалов к заседанию Экспертного Совета, повестку ее заседаний, ведет протоколы заседаний Экспертного Совета, делопроизводство и архив Экспертного Совета.
Заседания Экспертного Совета проводятся по мере необходимости.
Решение Экспертного Совета принимается путем открытого голосования простым большинством голосов членов Экспертного Совета, присутствующих на заседании. При равенстве голосов решающим является голос председательствующего на заседании Экспертного Совета.
Решение Экспертного Совета оформляется протоколом, который подписывается всеми членами Экспертного Совета на заседании Экспертного Совета. При необходимости выписка из протокола заседания Экспертного Совета доводится до всех заинтересованных лиц.